CN112358968B - 一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学及微流控技术领域，具体涉及一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法。其用于抗肿瘤细胞迁移的药物筛选。包括从上至下依次设置的PDMS微阀控制通道层（a）、PDMS流体通道层（b）及玻璃基底层（c）；所述流体通道层与微阀控制通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体；其中，流体通道单元包括四个相同的结构模块一、二、三、四，可以同时在线筛选多种抗肿瘤细胞迁移候选药物。

Description

一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学及微流控技术领域，具体涉及一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法。
背景技术
癌细胞由原发瘤部位脱离，浸润并降解周围组织及器官进而进入淋巴管、血管或体腔，部分癌细胞被淋巴流或血流带到机体各处，继而生成新生血管并繁殖生长，形成与原发瘤同样类型的继发瘤，该过程称为转移。癌细胞的转移是癌症预后较差及易复发的主要原因之一，癌细胞的转移包括一系列复杂的生物学变化，涉及癌细胞上皮-间质转化(EMT)、癌细胞的黏附和迁移等。细胞迁移运动是肿瘤细胞发生转移的首要条件，肿瘤从原位癌转变为侵袭性转移癌的过程中，需要癌细胞具有间质细胞的趋化性移行和迁移能力，才能降解并穿透基底膜等组织屏障，侵袭转移到周围正常的组织器官，其中影响肿瘤细胞迁移能力的关键因子有E-cadherin、N-cadherin等。
目前最常用的体外肿瘤细胞迁移的方法为基于6/12/24孔板的“划痕-愈合”法，其虽然操作简单，但涉及多次“划痕”操作，这种操作一般需要借助枪头、牙签以及直尺等工具进行，需要操作者每次划痕时枪头的垂直角度、划痕起始点、终止点严格一致，否则难以保证各孔的实验数据具有较好的齐同可比性，此外，每孔面积较大，进行数据采集时如何选取视野暂时没有统一的标准，会因个人习惯带来较大的区别，因此其实验结果实际意义相对较低。
除了常见的划痕实验，近年来基于微流控芯片的细胞迁移模型研究也有报道，如一些学者通过在芯片内额外加入合适于通道大小的阻隔物，并在细胞贴壁生长后再取出，而得到“划痕”，但是在这种对培养有细胞的芯片中反复多次嵌入，取出外界物质的过程中，使细胞处于暴露环境的时间较长，与外界接触过多可能会有染菌的危险，而嵌入取出外界物质时，其对附近流体以及细胞会产生一定的力学作用，这种作用所带来的影响是复杂且未知的；还有学者采用外加铂电极从而避免对细胞的物理损伤，靠直流电趋化细胞迁移行为的，这种芯片中细胞的迁移趋向比较好控制，数据分析也相对简单，但是其制作流程相对复杂，需要实验人员有较好的多学科交叉知识储备以及更多复杂的仪器设备。因此，基于以上几点，限制了上述细胞迁移芯片的实际应用。
发明内容
本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其用于抗肿瘤细胞迁移的药物筛选。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，包括从上至下依次设置的PDMS微阀控制通道层（a）、PDMS流体通道层（b）及玻璃基底层（c）；所述流体通道层与微阀控制通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体；其中，流体通道单元包括四个相同的结构模块一、二、三、四，可以同时在线筛选多种抗肿瘤细胞迁移候选药物。
微阀控制通道层包括两组微阀：第一微阀组及第二微阀组；所述两组微阀结构均包括由微阀控制通道层的 PDMS 与流体通道层的 PDMS 薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连；第一微阀组用于形成划痕，第二微阀组用于操控各结构模块单元间的阻断与连通；第一微阀组和第二微阀组可独立控制或通过管路连接（经微阀闭合性考察，无漏液现象，微阀闭合性良好，可较好地实现对细胞的隔离作用。）。
进一步地，所述第一微阀组及第二微阀组均为液动控制微阀。
进一步地，所述流体通道层的结构模块分为两大功能区：细胞培养区，划痕生成区；所述细胞培养区包括注液口、出液口、一条主流体通道、两条对称设置的分支流体通道及椭圆形培养腔，其中，主流体通道及分支流体通道分别与培养腔相连通；培养腔两侧分别设计若干圆形支柱结构；所述划痕生成区为两侧支柱结构所形成的中间区域；四组结构模块通过第一微通道和第二微通道连接，共用一个细胞注入口（结构模块与细胞注入口之间的第一微通道宽度为第二微通道宽度的2倍）。
进一步地，培养腔一侧设置有注液口，培养腔另一侧设置有出液口，且注液口和出液口均位于主流体通道上。
进一步地，所述压力施加装置采用注射器或微量注射泵。
进一步地，流体通道与玻璃基形成的腔道的高度为120-150μm。
进一步地，所述第一微阀组包括流体通道及位于流体通道两侧的注液口及出液口，所述注液口及出液口均为圆形，该圆形半径为0.5mm；所述流体通道尺寸为1.44×5.67mm。
进一步地，第二微阀组包括螺旋形的流体通道、与该流体通道相连通的注液口；所述注液口为圆形，半径为0.8mm；所述流体通道的宽度为300μm。
进一步地，所述细胞培养区的注液口与出液口形状均为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；主流体通道的宽度为400μm，分支流体通道的宽度为300μm；培养腔为椭圆形，尺寸为6.0×8.0mm；圆形支柱，半径为0.2mm，高为0.2mm；四个结构模块，分为上下两组，上组两个结构模块之间的夹角为40度，下组两个结构模块之间的夹角为40度。
进一步地，圆形支柱用于支撑通道层，防止长时间使用而引起的通道塌陷；划痕区内置于细胞培养区中，位于双侧圆形支柱结构中间，形状为长椭圆形；其形成的过程为，关闭第一微阀组，在第一微阀组对应位置，阀层流体通道形成划痕；从细胞注入口注入细胞悬液，细胞平行地缓慢进入细胞培养区，由于第二微阀组关闭，细胞不能进入划痕区，待细胞完全贴壁后，打开第二微阀，此时划痕形成。
与现有技术相比本发明有益效果。
1、本发明通过操控芯片中的微阀结构的关闭，得到“划痕”，这种划痕与常规划痕相比，不会对细胞构成机械性损伤。
2.本芯片包含四个完全相同的结构单元，可以同时在线筛选多种药物。
3.由于芯片整体尺寸较小，在使用倒置荧光显微镜对芯片内细胞培养区域进行拍照时，拍照视野相对固定，有利于实验后对划痕愈合区域的统计分析，保证结果的精确性，提高实验结果的可信度。该芯片操控简单，不需要复杂的外部设备，即能实现所述功能。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图 1 微流控芯片整体结构示意图。
图2-1微流控芯片拆分—微阀控制通道层示意图。
图2-2微流控芯片拆分—流体通道层示意图。
图2-3为图2-2中A处放大示意图。
图 3 微流控芯片实物图，俯视图（A）、侧视图（B）。
图 4 微阀闭合时，空白组（A）与给药组（B）肝肿瘤细胞芯片中生长状态图。
图 5 微阀开启后，空白组（A）与给药组（B）肝肿瘤细胞在芯片中迁移状态图。
具体实施方式
如图1-5所示，本发明为一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片，从上至下依次包括：PDMS微阀控制通道层（a）、PDMS流体通道层（b）及玻璃基底层（c）；所述流体通道层与微阀控制通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体，流体通道单元包括四个完全相同的结构模块一、二、三、四，可以同时在线筛选多种抗肿瘤细胞迁移候选药物。芯片结构示意图，见图1。
所述流体通道层的结构模块分为两大功能区，分别是：细胞培养区，划痕生成区。
微阀控制通道层包括两组微阀，分别为：第一微阀组1’及第二微阀组2’；所述第一微阀组及第二微阀均为液动控制微阀；两组控制微阀的结构均是由微阀控制通道层的PDMS 与流体通道层的 PDMS 薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连；第一微阀组用于形成“划痕”，第二微阀组用于操控各结构模块单元间的阻断与连通，所述第一微阀和第二微阀可独立控制或通过管路连接，经微阀闭合性考察，无漏液现象，微阀闭合性良好，可较好地实现对细胞的隔离作用。微流控芯片拆分示意图，见图2-1到图2-3。
从芯片俯视图来看，微阀控制通道层中第一微阀组，包括四个完全相同的结构1’-1，1’-2，1’-3，1’-4,第二微阀为螺旋形结构2’。
从芯片俯视图来看，流体通道层包括注入口2，3，4，5，细胞培养区，出液口6，7，8，9，细胞培养区中设计多个大小相同的圆形“支柱”结构13，在实际应用过程中，用以支撑通道层，防止长时间使用而引起的通道塌陷；划痕区a-1，a-2，a-3，a-4内置于细胞培养区中，位于双侧支柱结构中间，形状为长椭圆形。其形成的过程为，通过关闭第一微阀组，在第一微阀组对应位置，阀层流体通道形成“划痕”。从细胞注入口1注入细胞悬液，细胞平行地缓慢进入细胞培养区，由于第二微阀关闭，细胞不能进入划痕区，待细胞完全贴壁后，打开第二微阀，此时“划痕”形成。
为了使第二微阀有良好的闭合效果，本发明在结构中，首先设计了将第二微阀设计为螺旋形2’，即可实现对相应位置的流体通道多次挤压，提高阀控效果，其次将对应流体通道宽度缩小为微阀通道的1/2。经前期系统适应性考察，当阀控通道的宽度为流体通道的1.5倍或2倍，这样可实现以最小的压力来达到微阀的最佳闭合效果。
所述细胞培养区的注液口与出液口形状均为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；主流体通道的宽度为400μm，分支流体通道的宽度为300μm；培养腔为椭圆形，尺寸为6.0×8.0mm；圆形支柱，半径为0.2mm，高为0.2mm；四个结构模块，分为上下两组，上组两个结构模块之间的夹角为40度，下组两个结构模块之间的夹角为40度。流体通道14尺寸为200μm，流体通道15尺寸为100μm。
参阅图1至图4，在一种实施例中，一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片，自上而下依次是PDMS微阀控制通道层、流体通道层和玻璃基片层，通过等离子清洗技术的键合工艺组装成一体；其中，芯片上优选四个相同的结构单元，每个结构单元具有细胞培养区及划痕生成区。每个结构单元可实现一种药物的筛选，具体操作结合实施例子进行详细说明。
实施例子1。
一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片的制作方法。
采用SU-8负性光刻胶工艺、多层 PDMS 热键合技术及等离子键合技术，并采用具有良好透光透气性和生物相容性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及常规玻璃基片作为材料，制作了具有多层结构的集成化微流控芯片，具体步骤如下。
1. 单晶硅片的清洗：将切割成合适大小的单晶硅片放入食人鱼溶液（浓H2SO4:H2O2=3:1 体积比）浸泡过夜，用丙酮、无水乙醇和去离子水分别清洗后，放在加热板上 120℃烘干 30min，使硅片完全干燥。
2. SU-8 硅片阳模制作 ：SU8-2075光刻胶适量沿步骤1中的硅片边角倾倒，轻轻摇晃硅片，使得光刻胶均匀铺在表面，使用匀胶机对光刻胶进行旋涂，参数为（Ⅰ档-750rpm-10s；Ⅱ档-2500rpm-50s），之后放到加热台加热，程序：（65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→30min；95℃-65℃→10min，65℃→室温），前烘完毕后，将设计好的掩模（阀层、通道层）置于其上，磁石固定，使用光刻机进行光刻，设定能量值（220 mJ·cm2），光刻后，进行中烘，程序（65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃→室温），中烘完成后，室温条件下使用配套的SU8-2075光刻胶显影液进行显影，氮气吹干，110℃→30min后烘，即得，阳模厚度为120-150μm。
3. PDMS微阀控制通道层制备：将 PDMS 预聚物与固化剂按重量比 10:1 均匀混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中脱气 30min，然后浇注到微阀控制通道层 SU-8 阳模板上，将PDMS缓慢倾倒于通道层阳膜上，匀胶机旋涂，参数：（Ⅰ档-750rpm-5s；Ⅱ档-1000rpm-10s），之后置于加热台加热程序：（65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→5min；95℃-65℃→5min，65℃→室温）。冷却后将其从模板上缓慢揭下，并经切割打孔得到 PDMS 微阀控制通道层。
4.PDMS流体通道层制备：将PDMS 预聚物与固化剂按重量比12:1 均匀混合，搅拌混合均匀后，置于真空箱中进行脱气30min，然后浇注到微阀控制通道层 SU-8 阳模板上，加热程序：（65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃-65℃→5min，65℃→室温）。并经切割打孔得到 PDMS 微阀控制通道芯片层。
5.芯片键合：将从模板上剥离并切割打孔的 PDMS 微阀控制通道层，与贴附于SU-8阳模板上的 PDMS 流体通道层，在显微镜下将两部分对准贴合在一起，置于110℃加热台上加热1h，完成两层 PDMS的键合。将键合成整体的芯片从SU-8阳模板上剥离后，使用等离子清洗机与清洗干净的玻璃片进行氧等离子处理，完成双层PDMS 与清玻璃片的键合，最终芯片制作完成。芯片实物图，见如图3。
实施例子2。
迁移实验，包括如下步骤:
仪器与试剂。
光刻机（北京中科同志科技有限公司，型号：TG-2U）；等离子清洗机（美国HarrickPlasma公司，型号：HPDC-32G-2）；台式匀胶机（昆山力电精密机械有限公司，型号：KW-4A）；环保恒温平台（深圳市精良和科技有限公司，型号：D15）；精密注射泵（保定兰格公司，型号：LSP04-1A）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DZF-6020）；SU-8 2075负性光刻胶及显影液（美国Mirco-Chem公司）；Sylgard 184 SiliconeElastomer Kit（美国Dow-Corning公司）；10×多聚赖氨酸（北京索莱宝科技有限公司）；茜草醇提物。
芯片内细胞培养。
实验过程中芯片注入口处通过聚四氟乙烯管与精密注射泵相连接。通过精密注射泵，关闭微阀1’，打开微阀2’，以软胶带封闭出液口6、7、8、9，使用精密微量注射泵从细胞注入口1，以流速0.1μl/min将浓度为1×105/ml细胞悬液注入芯片细胞培养区1、2、3、4。待细胞贴壁后，以流速0.2μl/min继续从注入口1通入DMEM完全培养液培养24h。显微镜观察观察，并拍照记录给药组与空白对照组芯片内细胞状态图，细胞生长状态良好，基本达到芯片90%如图4所示。
药效筛选。
HepG2细胞在芯片中培养24h后，基本汇合至单层，此时，将DMEM完全培养基更换为无血清的培养液饥饿细胞12h，随后打开微阀1’及出液口6、7、8、9，关闭微阀2’，从注入口2、3以流速0.2μl/min分别注入DMEM完全培养基、茜草醇提物（0.25mg/ml）进行干预，24h后显微镜拍照观察空白组细胞的迁移状态及给药组细胞迁移状态，如图5所示。并计算细胞迁移率，经计算空白组肝肿瘤细胞迁移率为40.97%±2.65，给药组肝肿瘤细胞迁移率为20.14%±4.36，空白对照组与给药组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于，包括从上至下依次设置的PDMS微阀控制通道层、PDMS流体通道层及玻璃基底层；所述流体通道层与微阀控制通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体；其中，流体通道单元包括四个相同的结构模块一、二、三、四，可以同时在线筛选多种抗肿瘤细胞迁移候选药物；
微阀控制通道层包括两组微阀：第一微阀组及第二微阀组；所述两组微阀结构均包括由微阀控制通道层的 PDMS 与流体通道层的 PDMS 薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连；第一微阀组用于形成划痕，第二微阀组用于操控各结构模块单元间的阻断与连通；第一微阀组和第二微阀组可独立控制或通过管路连接；
所述流体通道层的结构模块分为两大功能区：细胞培养区，划痕生成区；所述细胞培养区包括注液口、出液口、一条主流体通道、两条对称设置的分支流体通道及椭圆形培养腔，其中，主流体通道及分支流体通道分别与培养腔相连通；培养腔两侧分别设计若干圆形支柱结构；所述划痕生成区为两侧支柱结构所形成的中间区域；四组结构模块通过第一微通道和第二微通道连接，共用一个细胞注入口；
第二微阀组包括螺旋形的流体通道、与该流体通道相连通的注液口；所述注液口为圆形，半径为0.8mm；所述流体通道的宽度为300μm；
所述细胞培养区的注液口与出液口形状均为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；主流体通道的宽度为400μm，分支流体通道的宽度为300μm；培养腔为椭圆形，尺寸为6.0×8.0mm；圆形支柱，半径为0.2mm，高为0.2mm；四个结构模块，分为上下两组，上组两个结构模块之间的夹角为40度，下组两个结构模块之间的夹角为40度；
圆形支柱用于支撑通道层，防止长时间使用而引起的通道塌陷；划痕区内置于细胞培养区中，位于双侧圆形支柱结构中间，形状为长椭圆形；其形成的过程为，关闭第一微阀组，在第一微阀组对应位置，阀层流体通道形成划痕；从细胞注入口注入细胞悬液，细胞平行地缓慢进入细胞培养区，由于第二微阀组关闭，细胞不能进入划痕区，待细胞完全贴壁后，打开第二微阀，此时划痕形成。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于：所述第一微阀组及第二微阀组均为液动控制微阀。
3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于：培养腔一侧设置有注液口，培养腔另一侧设置有出液口，且注液口和出液口均位于主流体通道上。
4.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于：所述压力施加装置采用注射器或微量注射泵。
5.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于：流体通道与玻璃基形成的腔道的高度为120-150μm。
6.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤细胞迁移研究的微流控芯片及其制备方法，其特征在于：所述第一微阀组包括流体通道及位于流体通道两侧的注液口及出液口，所述注液口及出液口均为圆形，该圆形半径为0.5mm；所述流体通道尺寸为1.44×5.67mm。
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Title
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