CN105838603A - 用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片 - Google Patents

Abstract

用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片属于微流控技术领域，尤其涉及用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片。本发明可完成多种肿瘤细胞的同时在线筛选实验，可实现接种16种肿瘤细胞；还可实现多种药物的同时在线筛选，可完成8种抗肿瘤药物的同时在线筛选。其包括芯片体，芯片体包括三层，第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和玻璃底层，三部分从上至下依次经不可逆的等离子键合形成复合式一体结构。芯片体集成有四个结构相同的模块和一个废液口，每个模块集成有四列细胞培养通道、流体通道、一个细胞注入口、两个药物注入口、六个微阀，每列细胞培养通道下方还设有一与之连通的弯曲管道，所述弯曲管道顶端还设有一出口。

Description

用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，具体地是涉及用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片。

背景技术

药物筛选是新药研究的最初过程和关键步骤，是发现新药的必经之路。然而传统的96孔板技术应用在中药新药研发中时，因其消耗试剂量大、人工操作繁琐、人为实验误差大等缺点造成新药研发周期长、成本高、后期失败风险高等瓶颈问题，这在很大程度上限制了现代药物的筛选与开发。目前，微全分析系统(miniaturizedtotal analysis systems，μTAS)概念的提出，凭借其高通量、高灵敏性、高效性的优势在最近的十几年里，被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域，成为 21世纪最为热门的前沿技术，并已成为药物筛选的主要技术手段之一。可以看出，药物筛选技术的微型化、自动化和低成本化是未来发展的必然趋势。

微流控芯片（Microfluidics）是一种以芯片为操作平台，以分析化学为理论基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，将常规化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上的多学科交叉技术。若将微流控芯片的新原理、新技术、新方法等技术优势应用于新药筛选的相关研究中，一定会推动我国新药研发关键技术的原始创新和集成应用，并大幅度提高药物筛选效率，缩减动物试验的需求，最终为临床中药物的合理用药提供必要的前期基础。

由于微流控芯片系统在细胞水平药物筛选中的多种独特的优势，例如微流控芯片操作所需的细胞量很少，适合来源稀缺但又十分重要的细胞研究；再如芯片的多维网络结构，形成了相对独立、封闭的环境；这与体内环境类似，可以精确控制温度、成分等因素，从而高度模拟体内细胞外基质，使其更接近人体内部的微环境。而且还可以将药物的合成分离富集、细胞培养、药物刺激、药效实时检测等多步工序集成在单片的微系统中；通过设计有不同功能的芯片来培养细胞，对细胞施加药物刺激，并配合自动化的检测装置，采集药物与细胞相互作用的信号，收集数据，用以分析药物的作用，最后进行筛选并得到筛选结果。可以这么说，微流控芯片技术的出现，克服了传统中药复方药物筛选的局限性，为中药复方及候选新药研发带来新的希望。

目前，将微流控芯片技术用于细胞研究和药物筛选等方面已有不少报道，如Ye等人在文献（Ye N, Qin J, Shi W, et al. Cell-based high content screening using an integrated microfluidic device[J]. Lab on A Chip, 2007, 7(12):1696-704.）中构建了一种集成化细胞水平的药物筛选微流控芯片，实现了肝癌细胞多种参数测量的高内涵筛选。但就目前的技术发展来说，一种芯片实现多种功能的筛选依然是药物高通量筛选的瓶颈，成为一大难题而长期无法突破。因此，如何简易高效地进行高通量药物筛选及药物对肿瘤细胞特异性的筛选仍是亟待解决的问题。

发明内容

本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，提供用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片。其可完成多种肿瘤细胞的同时在线筛选实验，最多可以实现16列细胞培养通道中接种16种不同类型的肿瘤细胞；还可实现多种药物的同时在线筛选，最多可完成8种抗肿瘤药物的同时在线筛选。

为实现上述目的，本发明提供用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片，包括芯片体，所述芯片体包括三层，由上至下依次为，第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和为细胞贴壁生长提供平台的玻璃底层，其特征在于三部分从上至下依次经不可逆的等离子键合形成复合式一体结构；

所述芯片体集成有四个结构相同的模块和一个废液口，所述四个模块分别与该废液口相连；每个模块集成有四列细胞培养通道、流体通道、一个细胞注入口、两个药物注入口、六个微阀，其中有两个微阀为液阀、四个微阀为气阀，每列细胞培养通道下方还设有一与之连通的弯曲管道，所述弯曲管道顶端还设有一出口；

所述的四列细胞培养通道为：第一细胞培养通道、第二细胞培养通道、第三细胞培养通道和第四细胞培养通道。

所述的药物注入口为：第一药物注入口和第二药物注入口。

所述的四个气阀，两两一组，分为第一组气阀，第二组气阀，每组气阀又分为第一气阀、第二气阀。

所述的两个液阀为：第一液阀和第二液阀。

所述气阀包括气阀椭圆形结构、气体入口及气阀通道；所述气阀通道一端与椭圆形结构相连通，另一端与气体入口相连通。

所述液阀包括液阀椭圆形结构、液体入口及液阀通道；所述液阀通道与椭圆形结构及液体入口相连通。

所述的每列细胞培养通道上都等距离地设置有四个尺寸相同的复孔结构，第一细胞培养通道与第二细胞培养通道顶端相连并通过流体通道分别与第一药物注入口及细胞注入口相连通；第三细胞培养通道与第四细胞培养通道顶端相连并通过流体通道分别与第二药物注入口及细胞注入口相连通。

所述的气阀及液阀集成在第一PDMS薄膜层上。

所述的第二PDMS薄膜层为流体通道层，所述细胞培养通道、细胞注入口、药物注入口、弯曲管道、出口、废液口及流体通道均集成在第二PDMS薄膜层上。

第一PDMS薄膜层上的所述气阀的椭圆形结构与第二PDMS薄膜层的一细胞培养通道纵向相交，从气体入口注入充气，通过气阀通道在椭圆形结构处产生向下的压力，对细胞培养通道加压，进而控制流体在第二PDMS薄膜层的细胞培养通道上的流通。

所述第一PDMS薄膜层上的第一液阀的液阀通道为U型结构，第一液阀的椭圆形结构分别与第二PDMS薄膜层上的流体通道及弯曲管道纵向相交，从液体入口注入液体，通过液阀通道在椭圆形结构处产生向下的压力，对流体通道及弯曲管道加压；进而来控制流体在第二PDMS薄膜层上的流体通道、弯曲通道内的流通；第二液阀的液阀通道为一字型，分别在椭圆形结构处与第二PDMS薄膜层上的四列细胞培养通道纵向相交，从液体入口注入液体，在椭圆形结构处产生向下的压力，进而控制流体在第二PDMS薄膜层上的细胞培养通道上的流通。

所述的纵向相交并不是真实相交，而是说位置上处于相交位置，第一PDMS薄膜层与第二PDMS薄膜层在任何地方都是不连通的。

气阀与气阀间的开启、关闭以及交替闭合，完成多种肿瘤细胞同时在线筛选；在所述的每个模块上，第一组气阀的第一气阀、第二气阀与第二组气阀的第二气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第一气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第一种肿瘤细胞；第一组气阀的第一气阀、第二气阀与第二组气阀的第一气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第二气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第二种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀、第二气阀与第一组气阀的第一气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第二气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第三种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀、第二气阀与第一组气阀的第二气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第一气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第四种肿瘤细胞；最多可实现16种肿瘤细胞同时接种在同一块芯片上。其次，将每个模块的第二液阀关闭，此时第二液阀为无液压状态；关闭所有的气阀，所有气阀均处于无气压关闭状态；打开第一液阀，在液体入口注入液体，使其处于加压状态；从细胞注入口注入同一种药物进行药物对肿瘤细胞特异性的在线筛选。

气阀配合液阀的开启或关闭，完成多种药物同时在线筛选；所有气阀均处于无气压关闭状态时，分别打开各液阀组的第一液阀，此时第一液阀为有液压状态；关闭各液阀组的第二液阀，此时第二液阀为无液压状态；从细胞注入口注入同一种肿瘤细胞，待肿瘤细胞接种完毕至细胞贴壁后，将细胞注入口以及与弯曲通道相连的出口用玻璃柱堵住，关闭所有的液阀，在各药物注入口处分别通过精密注射泵实时灌注8种同一浓度的不同类药物，且流动给药，所有的废液统一有废液口汇集统一处理，完成最多8种药物的同时在线筛选。

作为本发明的一种优选方案，本发明所述气阀椭圆形结构的横截面为椭圆形，长、短轴尺寸为1.0 ×0.3 mm，高为40~60 μm；所述气阀的阀通道宽度为0.05~0.15mm。

作为本发明的另一种优选方案，本发明所述液阀椭圆形结构的横截面为椭圆形，长、短轴尺寸为1.0 ×0.4 mm，高为40~60 μm，所述液阀的阀通道宽度为0.05~0.15mm；经过前期实验检测结果发现，液阀的液压至少是流体通道横截面积的2倍才起到液压的作用，本发明之所以采用椭圆形结构符合流体力学特性，避免死体积，压力均衡。

作为本发明的另一种优选方案，本发明所述复孔结构为椭圆形，椭圆形长、短轴尺寸为1.0 ×1.3 mm，高为40~60 μm；该椭圆形根据流体力学性质计算出，更适用于细胞在微流体状态下的生长。

作为本发明的另一种优选方案，本发明所述细胞培养通道的间的间距为2.06 mm。

作为本发明的另一种优选方案，本发明所述的弯曲管道宽度为0.15mm；以防止液体倒流。

作为本发明的另一种优选方案，本发明所述的流体通道的宽度为0.20mm。

与现有技术相比本发明有益效果。

本发明所提供的一种用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的微流控芯片，通过调控所述微阀的开关与闭合, 气阀与气阀间的开启、关闭以及交替闭合从而实现单种或多种细胞在芯片中的接种及培养，同时给予药物等刺激可快捷的完成多种肿瘤细胞同时在线筛选实验，可以实现16列细胞培养通道中接种16种不同类型的肿瘤细胞，从而实现多种肿瘤细胞的同时在线筛选实验，完成药物对肿瘤细胞特异性的初步遴选。

另一方面，所述气阀配合所述液阀的开启或关闭使用，可以实现所有的细胞培养腔接种同一种肿瘤细胞，并最多可实现8种抗肿瘤类药物的同时在线筛选。与传统96孔板工艺相比，精密注射泵在细胞可承受的剪切力条件下以0.2 µL·min-1的流速进行动态灌注，作用48 h后的药液或者培养液的消耗量还不足10 µL，用量是传统96孔板技术的百分之一；此外，采用荧光染色技术较快捷，染色后20 min后便可以显微镜下观测，而传统的96孔板技术药物作用后还需加入MTT溶液进行37℃孵育4 h，吸走上清液后再加入DMSO试剂摇床上混合10 min，本发明大大节约了时间，并减少了多次繁琐操作产生的实验误差，总而言之，具有高效快速的实验优势。

本发明所述的共同的废液出处，统一收集。不仅摆脱了传统手动单一接口的繁琐操作，而且降低了细胞被污染的可能性，提高了实验的成功率。

本发明所述的细胞培养通道上的复孔结构传统上多为圆形结构，本发明采用椭圆形结构，其一，相同直径的椭圆形比圆形结构面积大，能够加大细胞的数量，提高样本量使得统计更有意义；其二，椭圆形结构更加符合流体力学特点，能够克服圆形区域存在的流体分布不均匀、细胞受力不均匀导致的给药时间不一致的问题。

本发明具有操作灵活简单、易于集成、实验成功率高、结果稳定、制作成本低及多功能等特点，具有较高的潜在生物学研究价值与经济价值。避免了传统96孔板的繁琐操作，可以为基于微流控芯片的实验提供较好的技术支撑，有望为以后抑制肿瘤细胞类药物的高通量筛选奠定一定的前期实验基础，并且为抗肿瘤类新药开发与利用提供一个崭新的平台。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。

图1本发明微流控芯片整体结构示意图。

图2 肺肿瘤细胞A549在实验中的生长状态图。

图3 液阀检测图。

图1中，A为第一液阀、B为第二液阀、a为第一组的第一气阀、a1为第一组的第二气阀、b1为第二组的第一气阀、b为第二组的第二气阀、O为废液口、Ⅰ为细胞注入口、①为第一药物注入口、②为第二药物注入口。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

如图1所示，微流控芯片，从上至下依次包括：第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和玻璃底层，三部分依次经不可逆的等离子键合形成复合式一体结构。

所述第一PDMS薄膜层上集成24个微阀，其中有气阀16个，液阀8个；所述气阀两两一组配合使用，共8组，每组包括两个气阀，分别为第一组的第一气阀a，第一组的第二气阀a1，第二组的第一气阀b1，第二组的第二气阀b； 所述液阀两两一组配合使用，共四组，每组包括两个液阀；第一液阀A和第二液阀B。

所述第二PDMS薄膜层为流体通道层，所述第二PDMS薄膜层上集成有四个结构相同的模块和一个废液口O，四个模块共用一个废液口O；每个模块集成有四列细胞培养通道、一个细胞注入口Ⅰ和两个药物注入口；细胞注入口Ⅰ和药物注入口设置在模块上、细胞培养单元的上方；药物注入口位于细胞注入口Ⅰ两侧；每个细胞培养通道上都等距离地设置有四个尺寸相同的复孔结构；所述复孔结构为椭圆形，替代了传统的圆形结构；每列细胞培养通道下方还设有一与之连通的弯曲管道，所述弯曲管道顶端还设有一出口；第一列细胞培养通道和第二列细胞培养通道共用第一药物注入口①，第三列细胞培养通道和第四列细胞通道共用第二药物注入口②；四列细胞培养通道共用一个细胞注入口Ⅰ；前两列细胞培养通道顶端相连后再分别与第一药物注入口①及细胞注入口Ⅰ相连；后两列细胞培养通道顶端相连后再分别与第二药物注入口②及细胞注入口Ⅰ相连。

所述第一PDMS薄膜层上的气阀的椭圆形结构与第二PDMS薄膜层的一细胞培养通道纵向相交，所述气阀通过气体入口进行充气，在椭圆形结构处产生压力对细胞培养通道加压，进而控制流体在第二PDMS薄膜层的细胞培养通道上的流通。

所述第一PDMS薄膜层上的第一液阀的液阀通道为U型结构，第一液阀的椭圆形结构分别与第二PDMS薄膜层上的流体通道及弯曲通道纵向相交，从液体入口注入液体，产生液压，进而来控制流体在第二PDMS薄膜层上的流体通道、弯曲通道内的流通；第二液阀的液阀通道为一字型，分别在椭圆形结构处与第二PDMS薄膜层上的四列细胞培养通道纵向相交，从液体入口注入液体，产生向下压力，进而控制流体在第二PDMS薄膜层上的细胞培养通道上的流通。

这里需指出的是，所述的纵向相交并不是真实相交，而是说位置上处于相交位置，第一PDMS薄膜层与第二PDMS薄膜层在任何地方都是不连通的。所述第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和玻璃底层，三部分依次经不可逆的等离子键合形成复合式一体结构。

气阀与气阀间的开启、关闭以及交替闭合，完成多种肿瘤细胞同时在线筛选；在所述的每个模块上，第一组气阀的第一气阀a、第二气阀a1与第二组气阀的第二气阀b均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第一气阀b1未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口Ⅰ接种第一种肿瘤细胞；第一组气阀的第一气阀a、第二气阀a1与第二组气阀的第一气阀b1均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第二气阀b未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口Ⅰ接种第二种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀b1、第二气阀b与第一组气阀的第一气阀a均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第二气阀a1未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口Ⅰ接种第三种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀b1、第二气阀b与第一组气阀的第二气阀a1均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第一气阀a未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口Ⅰ接种第四种肿瘤细胞；最多可实现16种肿瘤细胞同时接种在同一块芯片上。其次，将每个模块的第二液阀B以及所有的气阀均处于关闭状态，打开第一液阀A，从细胞注入口Ⅰ注入同一种药物进行药物对肿瘤细胞特异性的在线筛选，其余三个模块同理。

气阀配合液阀的开启或关闭，完成多种药物同时在线筛选；所有气阀均处于无气压关闭状态时，分别打开各液阀组的第一液阀A，此时第一液阀A为有液压状态；关闭各液阀组的第二液阀B，此时第二液阀B为无液压状态；从细胞注入口Ⅰ注入同一种肿瘤细胞，待肿瘤细胞接种完毕至细胞贴壁后，将细胞注入口Ⅰ以及细胞培养通道下方的出口用玻璃柱堵住，关闭所有的液阀组，在各药物注入口处分别通过精密注射泵实时灌注8种同一浓度的不同类药物，所有的废液统一有废液口O汇集统一处理，完成最多8种药物的同时在线筛选。

实施例子1。

材料与仪器。

SU-8 2075负性光刻胶；Sylgard184型聚二甲基硅氧烷（PDMS）；固化剂（美国Dow Corning公司）；JKG-2A 型光刻机（上海学泽光学机械有限公司）；HPDC-32G-2型等离子清洗机（美国Harrick Plasma公司）；匀胶机（SC-1B型，北京创世威纳科技有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；精密注射泵（LSP04-1A，保定兰格公司）；Nikon ECLIPSE TI倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）。

实验流程。

本实验所用的微流控芯片有本实验室自行设计与制作，芯片为三层不可逆键合而成。用进样针将浓度为1mg/mL 的鼠尾胶原I通入到各细胞培养通道，于37℃加热平台中烘干备用，使胶原蛋白包被细胞培养区域。放冷后将芯片置于紫外灯下照射30分钟除菌，然后以一定密度的肺肿瘤细胞A549悬液灌流入培养通道，待细胞贴壁后，用注射泵以0.2 μL/min的流速将完全培养基通入到细胞培养通道中，待细胞汇合成单层时（其细胞状态如图 2所示），用荆芥含药培养液对细胞进行药物刺激24 h后，用Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）染液对细胞进行双染，使用Nikon eclipse Ti倒置荧光显微镜对芯片进行拍照处理，结果证明荆芥提取物对于肺癌细胞具有一定的抑制作用。

实施例子2。

材料与仪器。

红色食用色素染料（Sigma公司）；绿色食用色素染料（Sigma公司）；精密注射泵（LSP04-1A，保定兰格公司）。

实验流程。

为了验证液阀控制系统对芯片的开关性能，我们将本发明的芯片与液阀控制系统系统连接，通过控制液阀的长时间闭合，观察液阀对周围通道中溶液的影响及液阀的回弹开启性能，同时判断液阀对两侧通道中溶液的长时间隔离作用效果。

将精密注射泵通过聚四氟乙烯管与芯片相连接，液阀通道中通入绿色食用色素染料，流体通道中通入绿色食用色素染料，将液阀加压后关闭，每12 h拍照观察微阀的闭合状态，48 h后将液阀重新开启观察其回弹开启性能。

结果显示：液阀适用性良好，液阀重新回弹性能良好，结果如图3所示，可用于后期实验研究。

以上所述实施例仅表达本发明的几种实施方式，其描述较具体详细，但并不能因此而理解为对本发明应用范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片，包括芯片体，所述芯片体包括三层，由上至下依次为，第一PDMS薄膜层、第二PMDS薄膜层和为细胞贴壁生长提供平台的玻璃底层，其特征在于三部分从上至下依次经不可逆的等离子键合形成复合式一体结构；

所述芯片体集成有四个结构相同的模块和一个废液口，所述四个模块分别与该废液口相连；每个模块集成有四列细胞培养通道、流体通道、一个细胞注入口、两个药物注入口、六个微阀，其中有两个微阀为液阀、四个微阀为气阀，每列细胞培养通道下方还设有一与之连通的弯曲管道，所述弯曲管道顶端还设有一出口；

所述的四列细胞培养通道为：第一细胞培养通道、第二细胞培养通道、第三细胞培养通道和第四细胞培养通道；

所述的药物注入口为：第一药物注入口和第二药物注入口；

所述的四个气阀，两两一组，分为第一组气阀，第二组气阀，每组气阀又分为第一气阀、第二气阀；

所述的两个液阀为：第一液阀和第二液阀；

所述气阀包括气阀椭圆形结构、气体入口及气阀通道；所述气阀通道一端与椭圆形结构相连通，另一端与气体入口相连通；

所述液阀包括液阀椭圆形结构、液体入口及液阀通道；所述液阀通道与椭圆形结构及液体入口相连通；

所述的每列细胞培养通道上都等距离地设置有四个尺寸相同的复孔结构，第一细胞培养通道与第二细胞培养通道顶端相连并通过流体通道分别与第一药物注入口及细胞注入口相连通；第三细胞培养通道与第四细胞培养通道顶端相连并通过流体通道分别与第二药物注入口及细胞注入口相连通；

第一PDMS薄膜层上的所述气阀的椭圆形结构与第二PDMS薄膜层的一细胞培养通道纵向相交，从气体入口注入充气，通过气阀通道在椭圆形结构处产生向下的压力，对细胞培养通道加压，进而控制流体在第二PDMS薄膜层的细胞培养通道上的流通；

所述第一PDMS薄膜层上的第一液阀的液阀通道为U型结构，第一液阀的椭圆形结构分别与第二PDMS薄膜层上的流体通道及弯曲管道纵向相交，从液体入口注入液体，通过液阀通道在椭圆形结构处产生向下的压力，对流体通道及弯曲管道加压；进而来控制流体在第二PDMS薄膜层上的流体通道、弯曲通道内的流通；第二液阀的液阀通道为一字型，分别在椭圆形结构处与第二PDMS薄膜层上的四列细胞培养通道纵向相交，从液体入口注入液体，在椭圆形结构处产生向下的压力，进而控制流体在第二PDMS薄膜层上的细胞培养通道上的流通。

2.一种利用权利要求1所述的用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片完成多种肿瘤细胞同时在线筛选的方法，在所述的每个模块上，第一组气阀的第一气阀、第二气阀与第二组气阀的第二气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第一气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第一种肿瘤细胞；第一组气阀的第一气阀、第二气阀与第二组气阀的第一气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第二组气阀的第二气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第二种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀、第二气阀与第一组气阀的第一气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第二气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第三种肿瘤细胞；第二组气阀的第一气阀、第二气阀与第一组气阀的第二气阀均充气加压时，压紧各自所在的细胞培养通道，阻止流体从中通过，第一组气阀的第一气阀未充气，使得该列细胞培养通道为打开状态，此时从细胞注入口接种第四种肿瘤细胞；最多可实现16种肿瘤细胞同时接种在同一块芯片上；其次，将每个模块的第二液阀关闭，（此时第二液阀为无液压状态）；关闭所有的气阀，所有气阀均处于无气压关闭状态；打开第一液阀，在液体入口注入液体，使其处于加压状态；从细胞注入口注入同一种药物进行药物对肿瘤细胞特异性的在线筛选。

3.一种利用权利要求1所述的用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片完成多种药物同时在线筛选的方法，令所有气阀均处于无气压关闭状态，分别打开各液阀组的第一液阀，（此时第一液阀为有液压状态）；关闭各液阀组的第二液阀，（此时第二液阀为无液压状态）；从细胞注入口注入同一种肿瘤细胞，待肿瘤细胞接种完毕至细胞贴壁后，将细胞注入口以及出口用玻璃柱堵住，关闭所有的液阀，在各药物注入口处分别通过精密注射泵实时灌注8种同一浓度的不同类药物，且流动给药，所有的废液统一有废液口汇集统一处理，完成最多8种药物的同时在线筛选。

4.根据权利要求1所述的用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片，其特征在于：所述气阀椭圆形结构的横截面为椭圆形，长、短轴尺寸为1.0 ×0.3，高为40~60；所述气阀的阀通道宽度为0.05~0.15。

5.根据权利要求1所述的用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片，其特征在于：所述液阀椭圆形结构的横截面为椭圆形，长、短轴尺寸为1.0 ×0.4，高为40~60，所述液阀的阀通道宽度为0.05~0.15。

6.根据权利要求1所述的复孔结构，其特征在于：所述复孔结构为椭圆形，其长、短轴尺寸为1.0 ×1.3 mm，高为40~60 um。

7.根据权利要求1所述的细胞培养通道，其特征在于：所述每列细胞培养通道的间距为2.06 mm。

8.根据权利要求1所述的用于多种肿瘤细胞同时在线筛选的多功能集成微流控芯片，其特征在于：所述弯曲通道宽度为0.15mm，所述的流体通道的宽度为0.20mm。