CN117280020A - 用于细胞培养的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载体，所述载体适用于细胞的培养，并且优选是板状的载体，例如由玻璃、硅或者塑料或者其组合构成，在该载体中构造有至少一个第一凹部，该第一凹部在载体的第一厚度区段上延伸，其中，第二凹部的布置结构延伸到载体的与第一厚度区段邻接的第二厚度区段中。第一厚度区段的厚度可以是几微米到几厘米。从第一凹部出发延伸到第二厚度区段中并且分别构成第二布置结构的第二凹部构成适用于容纳细胞和/或合成颗粒、例如塑料或者玻璃的器皿。

Description

用于细胞培养的装置和方法

本发明涉及一种装置、用于细胞培养的装置的应用和一种通过该装置进行细胞培养的方法。该装置的特征在于具有用于容纳细胞的彼此分开的器皿，这些器皿与较大的容积连通，从而能够进行液体交换。器皿的深度与直径的深径比较大，从而使细胞保持在器皿内或者抑制细胞从器皿排出至与器皿连通的更大的容积中。该方法的优点在于可以将细胞保持在其器皿中，多个器皿与介质的一个共同容积连通，所述细胞可以是各个单独的细胞或者多个细胞。这种方法通过将细胞保持在具有较大深径比的器皿中而具有的优点为，能够根据装有细胞的器皿来识别细胞，并且能够在较长的培养期、例如1到10天之中进行观察。由于器皿的深径比较大，结合例如通过改变介质的流入和流出产生的扩散速率的变化，使得能够要么单独将代谢产物收集到每个器皿中，并且配属于器皿和包含在器皿中的细胞，要么通过快速地交换介质和输出代谢产物来创造特别恒定的条件。

传统上，将所谓的微量滴定盘(或称为微孔板)作为用于细胞培养和进行生物实验的装置。微量滴定盘的器皿(或称为孔)的容量例如约为300μL。每个器皿可以进行一次生物实验，因此每个器皿需要大量试剂。此外，微量滴定盘相对较大，并且通常仅提供用于96至1536个并行实验的位置空间。例如借助光学显微镜在这些器皿中寻找各个单独的细胞是费事的。

这给需要培养和研究确定的细胞类型的高通量实验、如细胞系研发、单克隆抗体研发、合成生物学、细胞疗法、免疫疗法、干细胞研究带来了重大挑战。

使用高度微型化的器皿、例如体积缩小10万倍的器皿，在技术上是可行的，但也带来了新的挑战，尤其是营养物质的输入、蒸发、代谢产物的浓缩和细胞迁移。细胞迁移是由于细胞在自身的力下的运动或者在补充试剂或者介质时的湍流、在移动载体时、由于加热和对流而产生的。

对于大多数生物医学研发而言，必须确保每个单独的实验的条件恒定不变。对于医疗产品的许可必须证明其单克隆性。因此，本发明所要解决的技术问题在于解决上述难题。

背景技术

在本申请的优先权日之后公布并且因此只能从新颖性方面进行考虑的DE102020209825A1描述了一种用于由预制造的塑料部件制造具有玻璃嵌件的塑料部件的方法，该预制造的塑料部件具有环绕的焊接板条和玻璃嵌件，该玻璃嵌件在沿着周向闭合的贴靠区域中具有相间隔地布置的通孔，还描述了加热焊接板条并且将玻璃嵌件以其贴靠区域压在塑料部件的焊接板条上以制造连接区域，在该连接区域中，塑料位于贴靠区域中并且穿过玻璃嵌件的通孔。

根据德国专利法第3条第2款只能考虑其新颖性的DE102019217466A1描述了由玻璃制造反应容器，该反应容器在一件式的玻璃板上或者在两块相互连接的玻璃板中形成深度至少为30μm的凹部。凹部可以具有仅在第一厚度区段中延伸到玻璃板中的区段，从该区段开始，其它较小的凹部可以延伸至更深的第二厚度区段中。

WO2016/041544A1大致描述了针对本发明优选的用于在玻璃中制造凹部的方法。

本发明的技术问题

本发明提出的技术问题在于，提供一种用于培养细胞的备选的方法和一种适用于在该方法中使用的具有用于细胞的凹部的载体，以便将细胞保持在其独立的器皿中并且还将多个器皿与一个共同的介质容积连通，该容积形成一个共同的介质存储。载体优选设置用于使液体、特别是细胞培养介质有针对性地从凹部中流出或者被取出。

发明内容

细胞的培养是一种离体方法，尤其是在使细胞保持存活和/或适用于细胞繁殖的介质中培养细胞。细胞例如是动物细胞、尤其是人类细胞、植物或者真菌或者酵母菌细胞或者细菌。培养例如可以用于分析和/或分离细胞，可选地在介质中添加活性物质。

本发明通过权利要求的特征、尤其是一种载体解决所述技术问题，所述载体适用于细胞的培养，并且优选是板状的载体，例如由玻璃、硅或者塑料或者其组合构成，在该载体中构造有至少一个第一凹部，该第一凹部在载体的第一厚度区段上延伸，其中，第二凹部的布置结构从第一凹部延伸到载体的与第一厚度区段邻接(交界)的第二厚度区段中。第一厚度区段的厚度可以是几微米到几厘米。第二凹部，即从第一凹部出发延伸到第二厚度区段中并且分别构成第二布置结构的第二凹部，构成适用于容纳细胞和/或合成颗粒、例如塑料或者玻璃的器皿。也被称为器皿的第二凹部具有深度与直径的较大的深径比，该直径在第一厚度区段与第二厚度区段邻接的平面中或者在第二厚度区段的高度的一半处确定。器皿的深度与直径的深径比例如至少为1:1、优选至少为2:1、优选至少为5:1、优选至少为10:1、优选至少为20:1、优选至少为40:1、优选至少为50:1，其中，器皿的直径最大为1000μm、优选最大为900μm、优选最大为800μm、优选最大为700μm、优选最大为600μm、优选最大为500μm、优选最大为400μm、优选最大为300μm、优选最大为200μm、优选最大为100μm、优选最大为90μm、优选最大为80μm、优选最大为70μm、优选最大为60μm、优选最大为50μm、优选最大为40μm、优选最大为30μm、优选最大为20μm、优选最大为10μm、优选最大为5μm。

器皿的直径可以与细胞的尺寸适配，以便例如能够将细胞堆叠地布置，或者使细胞相互接触。各个单独的器皿的横截面可以呈矩形、A形、V形或者束腰形。器皿的底部可以是平坦的、缩窄成尖部(锥形)或者是倒圆的。底部可以具有其它微结构。

第一厚度区段在第一凹部的横截面开口所处的平面中由载体的第一表面限定并且在与该平面相间隔的平面中由第二凹部限定。第二凹部的横截面开口由载体的表面区域间隔开，该载体尤其是第二子载体。这些表面区域进一步优选与第二凹部的横截面开口位于共同的平面中。第二凹部的横截面开口优选与第一凹部的横截面直接邻接。备选地，第二凹部可以与第一凹部相间隔，并且借助过渡管路与第一凹部连接。在一种优选的实施方式中，这种过渡管路构造为第一和第二子载体之间的区域性的间隔，其中，第一和第二凹部构造在第一子载体中，并且第一和第二凹部的底部分别由第二子载体构成。第二子载体具有凹部，该凹部针对过渡管路的横截面构成第一和第二子载体之间的区域性的间隔。

第二凹部的布置结构可以是任意的，然而优选是有规律的，例如布置成平行的排、布置在网格的节点和/或分别以相同的间隔布置，该网格例如为正方形或者六边形的网格。第二凹部的与第一布置结构邻接地延伸的布置结构例如可以具有至少1个、优选至少10个，优选至少20个，优选至少30个，优选至少40个，优选至少50个，优选至少60个，优选至少70个，优选至少80个，优选至少90个，优选至少100个，优选至少200个，优选至少300个，优选至少400个，优选至少500个、优选至少600、优选至少700、优选至少800、优选至少900、优选至少1000、优选至少2000、优选至少3000、优选至少4000、优选至少5000、优选至少6000、优选至少7000、优选至少8000、优选至少9000、优选至少10.000、优选至少50,000、优选至少100,000、优选至少500,000、优选至少1,000,000、优选至少10,000,000、优选至少50,000,000、优选至少100,000,000个第二凹部，这些第二凹部彼此间隔最大10mm、优选最大9mm、优选最大8mm，优选最大7mm，优选最大6mm，优选最大5mm，优选最大4mm，优选最大3mm，优选最大2mm，优选最大1mm，优选最大900μm，优选最大为800μm，优选最大700μm，优选最大600μm，优选最大500μm，优选最大400μm，优选最大300μm，优选最大200μm，优选最大100μm、优选最大90μm，优选最大80μm，优选最大70μm，优选最大60μm，优选最大50μm，优选最大40μm，优选最大30μm，优选最大20μm，优选最大10μm，优选最大9μm，优选最大8μm，优选最大7μm，优选最大6μm，优选最大5μm，优选最大4μm，优选最大3μm，优选最大2μm、优选最大1μm地布置。

第一凹部的横截面开口位于载体的第一表面的平面中，从而第一凹部通入载体的第一表面的平面中。载体的特征在于下述出口，该出口的横截面在第一厚度区段中或者与第一厚度区段邻接地通入，其中，出口的横截面优选与载体的第一表面的平面邻接或者朝向载体的第一表面的平面敞开，其中，出口与第一凹部连接。出口构造在载体中，例如构造为朝向载体的第一表面的平面敞开的沟槽的形式。备选地，出口可以是延伸至第一凹部中的管路。一般而言，出口设置用于从第一凹部中排出液体、尤其是介质。出口在此可以设置用于仅通过重力的作用和/或借助泵和/或通过以超压加载第一凹部来排出液体。出口可以具有下述横截面，该横截面可以延伸至载体内的下述深度，该深度为第一厚度区段的1％至95％。这种出口用于尤其是在第一凹部中的液面高度达到载体的第一表面的水平面时排出或者取出在第一凹部中延伸至出口的横截面中的液体。出口可以在周向上围绕至少一个、优选正好一个第一凹部延伸，从而出口在载体中围绕第一凹部形成周向的凹部，其中，周向的凹部由载体限定，该载体与该出口相间隔地延伸至该载体的第一表面的平面中。在出口设计为围绕第一凹部的凹部或者设计为亲水表面的实施方式中，可以有正好一个或者至少两个连接管路与该出口连接。出口可以选择性地附加地构成与第一凹部连接的入口、尤其是用于液体、例如介质或者气体的入口。

液体从出口排出或者取出的速率可以通过第一厚度区段的厚度、液体输入的速率或者载体的倾斜度来控制。出口可以通过多个开口、例如具有不同直径的孔实现。排出的液体可以收集起来进行分析或者再利用。

在另一实施方式中，载体可以具有亲水表面作为出口，所述亲水表面分别包括正好一个或者至少两个第一凹部，其中，该出口被载体的第一表面的疏水表面或者涂层包围。在该实施方式中，作为出口包括第一凹部的亲水表面可以与载体的第一表面处于相同的平面中，载体的第一表面优选邻接地是疏水性的。此外，在该实施方式中，连接管路可以布置在由载体上的亲水表面区段构成的出口中，在载体中可选地不具有凹部。在所述方法中，即使是在出口位于载体的第一表面的平面中的情况下，该出口的亲水表面也能使液体从第一凹部到达连接管路中，其中，液体在第一表面上的扩散受到与该出口邻接的第一表面的疏水性的限制。

通过出口、优选通过与出口连接的连接管路，载体设置用于细胞培养方法，在该方法中，液体、尤其是细胞培养介质可以有针对性地从凹部中排出或者取出。连接管路将出口与远离出口的取出位置连接，该取出位置例如是用于液体的容器或者分析装置。一般而言，连接管路可以设计为载体中的凹部，该凹部具有朝向载体的表面敞开的横截面、例如沟槽，或者该凹部具有沿着周向封闭的横截面、例如穿过载体的孔。

在一种实施方式中，在载体内和/或在载体的端面上构造有连接管路，该连接管路从载体的第一表面在载体的整个横截面上延伸至载体的第二表面。连接管路与载体的第二表面相对地与出口连接，从而尤其是当载体水平地布置，其第一表面布置在第二表面之上时，液体能够从出口通过连接管路流入载体的第二表面的平面中。

在各种实施方式中，连接管路导引下述液体，该液体在第一凹部中的液面高度达到出口的横截面并且通过出口流向载体的相对置的第二表面上。因此，在将液体输入第一凹部中时，液面高度达到出口横截面的液体受控制地被导出，并且液面不会超过出口的横截面、尤其是载体的第一表面。连接管路在载体的第二表面中的通入部使得能够将出现在那里的液体取出，以例如用于后续分析，而无需使附加的取出装置、例如移液管与第一凹部中的液体接触。

连接管路的表面和出口的表面优选是亲水性的，进一步优选地，载体的第一表面和/或载体的相对置的第二表面优选是疏水性的，例如配设有疏水涂层。可选地，在载体的第二表面中，间隔一距离地围绕连接管路的通入部形成包围通入部的槽。在载体的第二表面中包围着连接管路的通入部的槽降低了从通入部流出的液体在载体的第二表面上的扩散。

载体优选具有至少两个第一凹部，第二凹部的布置结构分别连接在第一凹部的第一厚度区段上，其中，每个第一布置结构借助至少一个出口与至少一个或者正好一个连接管路连接。在该实施方式中，至少两个第一凹部彼此独立地分别与连接管路连接，从而从第一凹部中流出的液体分别对于第二表面上的每个第一凹部单独地从连接管路流出并且能够单独地被取出和/或分析。

可选地，载体具有至少两个第一凹部，第二凹部的布置结构分别连接在第一凹部的第一厚度区段上，其中，与其中一个第一凹部连接的出口通入另一个第一凹部中，从而出口设置用于将从其中一个凹部流出的液体导引至另一个第一凹部中。

一般而言，可以可选地与载体的第一表面邻接地在载体中构造至少一个输入管路，该输入管路通入至少一个第一凹部中。输入管路例如可以构造为载体中的沟槽，其中，沟槽的横截面在载体的第一表面的平面中敞开。延伸至载体中的存储凹部在此可以与第一凹部相间隔地与输入管路连接。例如深度等于或者小于输入管路的深度的存储凹部可以用于容纳液体、例如细胞培养介质，该液体作为储备被计量地注入存储凹部。

第一凹部和第二凹部可以构造在一件式的载体、优选玻璃载体中。一件式的载体中的凹部可以通过从原始的一件式的载体去除材料来制造，例如通过激光照射和后续的蚀刻去除材料。备选地，第一凹部可以是第一子载体中的通孔，在第一子载体上布置有第二子载体，第二凹部构造在第二子载体中。在载体由至少两个子载体组成的情况下，载体为两件式，其中，子载体可以例如通过压接(Bonden)直接相互连接，或者通过连接物料、例如熔融的玻璃料或者粘合剂相互连接。第二凹部可以是第二子载体中的通孔或者第二子载体中的盲孔，所述通孔的横截面开口与第一子载体相对地由第三子载体覆盖。可选地，第二子载体由有色的玻璃构成，可选的第三子载体由透明的玻璃构成，并且第一子载体由无色的玻璃或者透明的玻璃构成。透明的玻璃对于入射到载体上的用于光学检测的光是可透过的，并且对可以从第二凹部发出的用于光学检测的光是可透过的。有色的玻璃对于入射到载体上的用于光学检测的光是不可透过的，或者对可以从第二凹部发出的用于光学检测的光是不可透过的。载体或者所有子载体优选由玻璃构成。

第二凹部的较大的深径比使得置入第二凹部中的细胞留在第二凹部中，并且使得能够进行用于细胞培养的方法，其中，将液体置入第一凹部或者使液体从第一凹部流出，而细胞留在第二凹部中。第二凹部的内部容积在此与第一凹部的内部容积连通，从而在第二凹部与第一凹部之间实现交换，例如代谢产物从第二凹部扩散至第一凹部中，并且营养物质、溶解的氧和必要时添加的活性物质从第一凹部扩散至第二凹部中。

传感器可选地布置在第一凹部、其中一个第二凹部、出口和/或入口中、例如布置在连接管路中。传感器可以是气体传感器、例如用于氧气或者二氧化碳的气体传感器、pH值传感器、温度传感器，或者是分析物的特定的化合分子、优选固定的化合分子、例如针对介质中的分析物的特定的抗体。进一步可选地可以在入口和出口中分别布置与分析单元连接的相同的传感器，该分析单元设置用于确定传感器信号的变化。

液体可通过使液滴滴落或者通过与第一凹部中的液体连通的管路进行注入而分别通过载体的第一表面平面中的第一凹部的横截面开口进入第一凹部中。备选地，载体可以具有从其第二表面直接延伸到第一凹部中的输入管路，从而输入管路设置用于将液体和/或气体从第二表面导引至第一凹部中。一般而言，在载体水平地布置时，载体的第二表面水平地布置并且布置在载体的第一表面以下，其中，第一表面和第二表面优选相互平行。备选地或者附加地，输入管路可以延伸通过第一厚度区段内的在其中构造有第一凹部的壁区段，从而能够将第一厚度区段中的液体、例如用于细胞培的介质通过输入管路引入第一凹部中。

在载体中，出口可以作为管路构造在第一厚度区段中，例如在与输入管路相对置的壁中构造在第一凹部中。

在一种实施方式中，在第一厚度区段上延伸并且具有或者包括第一凹部的壁可以由第一子载体构成，第一子载体与第二子载体邻接，第二凹部构造在第二子载体中。第一子载体在此可以安设在第二子载体上，方式例如为使第一子载体和第二子载体在边缘区域能平移并且液体密封地搭叠。可选地，第一子载体可以液体密封地垂直于第二子载体平移，从而能够通过第一子载体相对于第二子载体的可平移性调节第一厚度区段。在液体密封地并且相对于第二子载体能放置或者能平移地布置的第一子载体中的第一凹部在第二凹部中形成的情况下，载体设置用于根据第一子载体相对于第二子载体的位置调整第一凹部中的液面。由于出口尤其是在没有阀的情况下从第一凹部输出液体，因此液体的液面达到出口的横截面。第一子载体在此可以由塑料构成，并且第二子载体可以由玻璃构成，或者第一和第二子载体可以由玻璃构成，可选地在子载体的重叠区域中具有能平移的密封件。备选地，为了调节第一凹部中的液体液面，可以在入口和/或出口中布置阀，在所述方法中例如可以通过所述阀调节第一凹部中的液面。

在一种实施方式中，入口和/或出口可以具有一个或者多个用于调节一个或者多个连接管路的阀。通过多个阀和多个连接管路，能够使不同的液体受控制地计量地注入第一凹部中。

在一种实施方式中，载体可以由第二子载体和安设在该第二子载体处的第一子载体构成，所述第二子载体具有布置在其中的第二凹部，第一子载体具有正好一个在所有第二凹部上延伸的第一凹部。一般而言，尤其是在所述实施方式中，第一子载体可以由塑料或者玻璃构成，并且第二子载体可以由玻璃构成，该第二子载体在其中具有第二凹部。在第一子载体由塑料构成并且第二子载体由玻璃构成的实施方式中，第二子载体优选在与第一子载体连接的区域中具有通孔，并且第一子载体的塑料一件式地延伸穿过这些通孔，方式例如为在在连接区域中加热第一和/或第二子载体后，将第一子载体的塑料压入并且必要时穿过这些通孔。第一子载体优选与第二子载体所覆盖的区域间隔一距离地具有出口，在该出口上可选地连接有连接管路。

由玻璃构成的载体上的凹部优选通过激光辐射照射玻璃并且随后进行蚀刻来制造。

一般而言，在每种实施方式中，第一凹部均可以被膜划分，该薄膜优选垂直于载体的第一表面布置，从而当载体或者载体的第一表面水平地布置时，该膜垂直地布置。划分第一凹部的膜例如可以由框架撑开，该框架例如贴靠在位于第二凹部的横截面开口之间的载体的表面上。

在所述方法中，液体一般被引入第一凹部中，而包含至少一个细胞的液体则被引入第二凹部中。例如如下实现，即例如借助液滴产生器或者计量装置、尤其是喷嘴将具有细胞的液体引入第二凹部中。备选地可以将含有细胞的液体引入第一凹部中，从而使液体分布到第二凹部中。因此细胞例如可以从液体分布到第二凹部中。备选地随后可以将留在第一凹部中的含有细胞的液体移除。液体、优选细胞培养介质在此可以存在于其中悬浮细胞的混合物中，并且可以作为混合物或者悬浮液引入凹部中，或者含有细胞的液体可以在单独的步骤中借助单独的液滴产生器或者单独的计量装置引入凹部中，并且可以在单独的步骤中优选紧接着优选借助单独的计量装置将不含有细胞的细胞培养介质引入凹部中。

细胞培养介质在此包括一种能使细胞、尤其是植物细胞、酵母菌、细菌或者动物细胞、优选人体细胞例如在至少1小时、优选至少12小时或者至少24小时或者至少两天或者至少三天或者至少四天或者至少五天或者至少六天或者至少七天中保持生命力的介质(或称为培养基)。

在所述方法的一种实施方式中，载体可选地仅具有形式为第二凹部的凹部，并且进一步可选地具有至少一个出口，可选地包括至少一个与之连接的连接管路或者由连接管路构成，在该实施方式中，液体可以直接施加到第二凹部的位于载体的第一表面的平面中的横截面开口处。在一种实施方式中，载体仅具有第二凹部，并且介质突出于第二凹部的横截面开口的平面，介质的该突出的层构成第一凹部的容积，并且在第一厚度区段上延伸，从而该介质覆盖第二凹部。介质在此可以在第二凹部上方在例如1μm至3mm、例如10μm至200μm的第一厚度区段上延伸。突出于载体的第一表面的平面的液体可以通过载体的边缘排出，优选沿着至少一个出口并且可选地沿着连接管路排出。在此可以借助倾斜载体、通过以气体流和/或振动、例如超声波加载来激发该液体移动。尤其在该实施方式中，例如由于塑料或者结构化的、功能化的或者涂覆的玻璃表面，第一表面针对水性液体的可润湿性可能较差、例如是疏水性的。施加到第一表面或者第二凹部的横截面开口所在的平面上的液体液滴可能在移动经过该平面时与存在于那里的液体发生物质交换。介质的施加到该平面上的液滴例如可以作为滚动的液滴吸收和/或部分地取代已有的液体、例如使用过的介质。可选地，载体的处于第二凹部的横截面开口所在的平面内的表面可以具有开设到载体中的通道，通道的横截面朝向该平面敞开，以便使在平面上延伸的液体在移动时转向。液体在此可以成批地或者至少两滴一组地施加到载体的该平面上。在超过载体延伸所在的平面上方的液体的体积时，液体排出、尤其是有针对性地通过出口排出。

一般而言，在第一厚度区段上延伸的液体、优选介质防止介质从第二凹部中蒸发。第一厚度区段在此可以是几微米到几厘米。第一厚度区段的大的容积在此为足够的液体提供了空间，从而通过扩散作用减少第二凹部中营养物质的消耗和代谢产物的积累。第二凹部的较大的深径比的作用在于，使得液体在邻接的第一厚度区段或者第一凹部中的运动只能使第二凹部中的细胞发生不明显的移动并且细胞不会被从第二凹部冲出。

第一凹部例如可以与100000个第二凹部连接，其中，每个第二凹部的直径为54μm，深度为436μm，深度与直径的深径比为8:1，体积为1nl。凹部之间的距离例如为10μm。为了包括所有第二凹部，第一凹部必须具有至少410mm²的面积。传统上，器皿具有明显更小的深径比、例如0.16:1。在每个器皿的容积相同地为1nl并且直径为200μm的情况下，深度约为32μm。在这种情况下，100,000个凹部所占据的面积为4410平方mm²，是具有大深径比的器皿的面积的十倍。

由于在每个器皿的容积相同的情况下面积较小，因此可以通过光学显微镜并行地监测多个器皿中的内容物。

第二凹部的较大的深径比具有多个优点。例如，细胞产物、例如蛋白质或者抗体可以积聚在第二凹部中，而不需要或者仅需缓慢地清除细胞产物。这例如可以用于分析这些细胞产物和生产率，方式例如为附加荧光标记并且分析荧光强度。如果细胞产物、例如新陈代谢产物运走的速度比通过细胞产生的速度快，则能够创造出理想的培养条件。例如可以通过改变营养介质或者其它液体的流入和流出速度来实现运走细胞产物的速度的快慢变化。

第一凹部可以在塑料、金属、硅或者玻璃部件中形成，例如形式为微量滴定盘、培养皿、密封环或者框架，也可以通过不同的材料的连接形成。载体可以尤其是为了进行长期培养而在培养站中与现有的入口和出口连接。此外可以在入口处调节或者在出口处测量温度、气体环境、例如二氧化碳含量、液体的成分、生物分子或者其它物质的含量。在出口处可以安设用于测量pH值、荧光、浓度、温度、代谢产物、由细胞产生的生物分子等的传感器。

通过形式例如为毛细管的一个或者多个输入管路可以将不同的液体、例如营养介质、缓冲溶液、试剂、染料等加入第一凹部中。这些液体可能包含细胞。液体可以通过一个或者多个出口再次被取出，以确保连续地或者间歇性地或者根据需求地进行更换。输入管路可以布置为，使得细胞在输入液体时不受影响。在使用毛细管作为输入管路时，不含有细胞的液体尤其可以通过第二凹部输入。

可以从第一凹部中的液体中取样本，以便例如间隔时间地或者连续地检测细胞产物(蛋白质、抗体、代谢物)，以控制加入的试剂的浓度，或者分析由细胞产生的外泌体或者细胞外囊泡(EV)、尤其是蛋白质和核酸的种类和数量，以确定EV在生物和物理特性(尺寸、种类和数量的组成、密度、折射率)方面的异质性等特征参数。

如果使用多个入口，则其中一部分入口可以用于添加不含有细胞的液体、例如介质、水等，另一部分入口可以用于添加含有细胞的液体。

例如在将液体输入第一凹部或者第二凹部时，优选不能与含有细胞的液体相混合的具有比含有细胞的液体更低的密度的液体例如可以作为临时的蒸发保护。如果第一厚度区段足够小，则细胞可以穿过第一厚度区段的液体进入第二凹部中。在含有细胞的液体进入的同时，可以使用第二输入管路以补偿蒸发。选择性地可以持续地改变输出的液体的成分，以便在一时间段内替换细胞周围的介质。

在不同的实施方式中，载体设置为可以在第二凹部中培养细胞。此外可以执行用于对细胞进行分析的方法。尤其可以通过染色剂使细胞染色。通过确保细胞周围环境中的液体交换，使得染料可以随即被洗掉，而不会取出细胞或者使细胞受到其它影响。

可以采用不同的用于培养细胞的方法。尤其可以以非常少的液体将细胞压入第二凹部中并且接着输入介质。备选地可以先输入介质并且接着输入含有细胞的液体。备选地可以在一步骤中输入含有细胞的介质。为了确保细胞在第二凹部中沉降，可以在方法步骤之间等待。附加地可以通过离心或者搅拌、尤其是摇动或者振动载体来辅助细胞的沉降。由此能够附加地去除第二凹部中的气泡。接着可以取出含有细胞的介质，直到细胞基本上仅存在于第二凹部中。

现在根据示例并且参照附图更详细地描述本发明，在附图中示意性地：

图1示出了本发明的实施方式，

图2示出了本发明的实施方式，该实施方式在载体的第二表面处具有输入管路，

图3示出了本发明的实施方式，该实施方式在载体的第二表面处具有输入管路和出口，

图4在俯视图中示出了本发明的实施方式，

图5示出了本发明的具有输入管路和出口的实施方式，

图6示出了本发明的具有输入管路和出口的另一种实施方式，

图7示出了本发明的另一种实施方式，

图8示出了本发明的另一种实施方式，

图9A在横截面中并且图9B在载体的俯视图中示出了一种实施方式，

图9C在俯视图中示出了第一子载体，

图10示出了本发明的另一种实施方式，

图11A和11B示出了本发明的另一实施方式，并且

图12示出了另一实施方式。

图1在横截面中示出了载体1，该载体由第一子载体2和与第一子载体邻接的第二子载体3构成，其中，在第一子载体2中构造有第一凹部4，所述第一凹部覆盖邻接的第二凹部6的横截面开口5。因此，第二凹部6的内部容积沿着其横截面开口5与第一凹部4的内部容积连通，这使得在第一凹部和第二凹部之间能够尤其是通过扩散进行物质交换。第二凹部6在载体1的第二厚度区段8上延伸，在此在第二子载体3中的第二厚度区段8上延伸。在第一子载体2中，第一凹部4在第一厚度区段7上延伸，该第一厚度区段在此与第一子载体2的厚度相等。载体1在其第一厚度区段7中具有出口9，液面达到出口7横截面的液体F可以通过该出口流出，第一厚度区段在此相当于第一子载体2。输入管路10在出口9所在平面的上方间隔一距离地通入。输入管路10并非一定与载体连接，而是可以例如借助移动装置(未示出)独立于载体导引。

第二凹部6的较大的深径比使得液体能够在第一凹部4中运动，而不会使位于底部14或者第二凹部6的容积中的细胞Z从第二凹部中冲出，或者使得由于湍流而对细胞造成的影响最小化。

图2在横截面中示出了载体1，该载体1与图1所示的载体1相同地由具有第一凹部4的第一子载体2和安设在第一子载体上的第二子载体3构成，其中，第二凹部6与第一凹部4邻接地在第二厚度区段8上延伸。出口9构造在第一子载体2中。图1和图2所示的出口9沿着载体1的外侧的端面11延伸。输入管路10从载体1或者其第二子载体3的第二表面12延伸至第一凹部4中。输入管路10优选具有受控制的阀13，以便控制液体F进入第一凹部4的流入。

图3示出了载体1的一种实施方式，在该实施方式中，构成出口9并且在反向穿流时构成输入管路10的连接管路15从第一凹部4穿过载体1延伸至第二表面12。这种既构成输入管路10又构成出口9的连接管路15优选具有受控制的阀13，该受控制的阀进一步优选具有两个或者更多连接的管路，其中一个管路与介质的存储容器连接，并且另一个管路与用于从第一凹部4排出的液体F的收集容器连接。该实施方式也可以配设有覆盖第一凹部的盖子。盖子优选具有阀，通过该阀能够控制气体环境的成分。

图4在载体1的第一表面20的俯视图以及分别在第一凹部4的横截面开口的俯视图中示出了本发明的一件式的载体1的实施方式。在此呈矩形的第一凹部4在邻接的第二凹部6的横截面开口上延伸，这些第二凹部6针对每个第一凹部4构造为3x3个第二凹部6的布置结构(或称为阵列)。

在图4的实施方式A中，第一凹部4被穿过载体1的连接管路15包围，该连接管路与出口9连接或者构成出口9。连接管路15从第一凹部穿过载体1延伸至载体的与第一凹部4的横截面开口相对置的第二表面12。穿过载体1的连接管路15将从第一凹部中流出的液体有针对性地引导至载体1的相对置的第二表面12，从而液体能够有针对性地在那里被取出，并且不会污染构造在同一载体1中的另一个第一凹部4。

在图4的实施方式B中，第一凹部4与构造在载体1中的出口9连接，该出口9在载体1中构造为沟槽的形式，其横截面延伸至载体1中。出口9在载体1的外周上与连接管路15连接，连接管路15沿着载体1的周向的端壁延伸至载体的第二表面12。

在图4的实施方式C中，第一凹部4a被周向的出口9包围，该出口9通过管路区段9a构成进入其它第一凹部4b中的入口，从而液体F能够通过出口9及其管路区段9a从第一凹部4a流入其它第一凹部4b中。第一凹部4b被连接管路15包围，从第一凹部4b流出的液体F通过连接管路15被导引至载体1的相对置的第二表面12。该实施方式还示出了第一凹部4a作为存储凹部21的示例，该第一凹部与其它第一凹部4b通过输入管路10连接。

在图4的实施方式C中，可以在对应配属于第一凹部4的第二凹部6中培养用于产生确定的生物大分子、例如细胞因子、抗体、蛋白质的细胞。这些分子可以通过管路区段9a输送到其它第一凹部4中，并且在那里进行检测或者作用于其它细胞。

在图4的实施方式D中，如参照实施方式B所描述的，第一凹部4与构造在载体1中的出口9连接，该出口9在载体1中构造为沟槽的形式，其横截面延伸至载体1中。出口9在载体1的外周上与连接管路15连接，连接管路15沿着载体1的周向的端壁11延伸至载体的第二表面12。在第一凹部4的与出口9相对置的壁上，同样以沟槽的形式在载体1上构造有输入管路10。

载体1可以具有一个或者多个具有相同或者不同的形状、例如图4A至图4D所示的形状的第一凹部4。在存在多个第一凹部4的情况下，可以在不同的第一凹部4中包含不同的液体或者不同浓度的相同液体或者其组合。在属于不同的第一凹部4的第二凹部6中可以容纳不同的细胞类型。

图5示出了一种实施方式，其中，在第一厚度区段7上延伸并且具有或者包括第一凹部4的壁由与第二子载体3邻接的第一子载体2构成，第二凹部4的布置结构构造在第二子载体中。输入管路10可以在第一子载体2中通入，该输入管路优选与连接管路15连接，并且优选可以与输入管路10相对置地构成优选与连接管路15连接的出口9。在此示出的输入管路10和连接管路15分别配设有受控制的阀13，该受控制的阀用于控制液体F向第一凹部4输入或者从第一凹部4输出。

如图6所示，第一子载体2可以相对于第二子载体3平移，方式例如为第一子载体2和第二子载体3在其边缘区域中能平移地并且液体密封地搭叠。在第一子载体2和第二子载体3之间可以布置密封件16，该密封件例如可以是由塑料构成的第一子载体2或者第二子载体3上的脊部或者橡胶环。图6进一步示出了，第一子载体2可以覆盖第一凹部4。第一子载体2的覆盖的部分可以设计为能够循环使用的盖子。

图7示出了一种用于借助第一计量装置17将含有细胞的液体分别置入载体1的凹部4和6中，并且在这之前、之后或者同时地借助第二计量装置18置入不含有细胞的介质。

图7示出了载体1，该载体的凹部由第二凹部6的布置结构构成，覆盖该布置结构的液体层构成第一厚度区段7且通过表面张力保持。为此优选的是，第二凹部6的布置结构的包围部具有疏水性、例如具有疏水涂层。载体1例如具有亲水区域作为出口9，该亲水区域与沿着载体1的端面11向载体的第二表面12延伸的连接管路15邻接，该第二表面12与凹部6的横截面开口相对置。包括第二凹部6的疏水涂层优选设计为，使得液体的滴在载体上的液滴聚集起来形成连贯的层，然后才从出口9排出。备选地，出口9可以由载体1的表面的微结构构成。

在所述方法中，可以通过倾斜载体1或者使液体与具有毛细作用的装置接触来控制液体通过出口9排出。

图8示出了载体1，其中，第一子载体2可选地不设置出口9，而是入口10可同时用作计量装置17和出口9。备选地，入口和出口可以实现为两个计量装置17、18。第一凹部被优选半透过性的膜19与第一凹部横截面开口垂直地划分，由此使第一凹部4的共同的液体容积在第二凹部6的上方被划分。膜19也可以以类似的方式与其它实施方式结合，并且在那里划分第一凹部4或者第一厚度区段7。

图9A示出了载体1的两件式的实施方式，该载体由第一子载体2和液体密封地安设在第一子载体上的第二子载体3构成。在第一和第二子载体2、3由玻璃或者硅构成的情况下，可以例如通过压接方式将第一和第二子载体相互连接。在该实施方式中，第二凹部6与第一凹部4相间隔，并且借助过渡管路23与第一凹部连接。第一凹部4可以与第二凹部6无关地具有任意的直径。过渡管路23在此由底部凹部24构成，该底部凹部24在第一子载体2和第二子载体3之间形成区域性的间隔。第一凹部4和第二凹部6设计为第一子载体2中的通孔，第一凹部4和第二凹部6的底部分别由第二子载体3构成。第一厚度区段7在此优选与第二厚度区段8相同。第二子载体3具有底部凹部24，该底部凹部以过渡管路23的横截面的高度延伸至第二子载体中。第一子载体2沿着第二子载体3的突伸出底部凹部24的区域与第二子载体3连接。底部凹部24构成直径小于细胞的直径的连接管路，以便使细胞保持在第二凹部6中。通过底部凹部24进行液体的交换，由此使得对细胞的影响最小化。

该实施方式的优点在于，第二凹部6的横截面开口5直接地敞开并且可到达，并且第二凹部6还通过过渡管路23与第一凹部4处于液体连接中。

图9B在第二凹部6的横截面开口5和第一凹部4的横截面开口的俯视图中示出了载体1。在此以阴影线示出的过渡管路23被第一子载体2遮盖。沿着A-A剖切第一子载体2得到的横截面在图9A中在第一子载体2中示出。

图9C示出了第一子载体2的俯视图，其中，第一凹部4和第二凹部6均构造为相间隔的通孔。

第二子载体3具有一个或者多个底部凹部24，所述底部凹部延伸至恒定的深度并且被至少一个第一凹部4和至少两个第二凹部6的横截面覆盖并且构成连接第一凹部4与第二凹部6的过渡管路23。

图10示出了一种实施方式，其中，载体1由优选由塑料构成的第一子载体2和优选由玻璃构成的第二子载体3构成，其中，第一子载体2沿着第二子载体3的外周与第二子载体3连接。第一凹部4在构造在第二子载体3中的第二凹部6上延伸。第一子载体2的出口9与第一子载体2的第一凹部4的区域、优选被第二子载体3覆盖的区域间隔一距离。输入管路10在第一凹部4上方间隔一距离地通入，以便将液体F的液滴计量地滴入第一凹部4中。第一子载体2优选与第二子载体3相对地具有横截面开口，输入管路10朝向或者对着该横截面开口。连接管路15优选连接在出口9上。

图11A和11B示出以下实施方式，其中，第二子载体3至少部分地或者完全地布置在第一子载体2的第一凹部4内，其中，第一凹部4的横截面开口和第二凹部6的横截面开口相互平行地布置并且优选位于共同的平面中。在第一和第二子载体2、3水平地布置时，第一凹部4的横截面开口和第二凹部6的横截面开口是水平的并且向上敞开。第二凹部6在其底部6b中分别具有至少一个通孔6c，从而即使第二子载体3突伸出第一凹部4的横截面开口和/或第一凹部4中的液体F的液面，每个第二凹部6仍能够通过至少一个通孔6c与第一凹部4连接。构造在第二子载体3中的第二凹部6的底部6b与第一子载体2相间隔，优选在第二子载体6的底部6b和第一子载体2之间布置有间隔装置25。通孔6c优选分别具有小于细胞Z的横截面。可以对通孔6c进行涂覆、例如进行疏水性的涂覆，以防止或者辅助确定的液体的交换。

如图11B所示，第一子载体2可以具有出口9，其例如布置在第二子载体3的下方。连接管路15可以连接在出口9上。可选地，连接管路15也可以构成输入管路10。备选地或者附加地，输入管路10也可以在第一子载体2的上方通入，以便将液体F计量到第一凹部4中。

图11A和B中的实施方式特别适用于将细胞和细胞产物相互分离。

在所述方法中，第二凹部6和第一凹部4中充满液体F、尤其是介质，并且通过通孔6c相互连通。尤其在输入管路10在第二凹部6下方或者在第二子载体3下方在第一子载体2中通入的实施方式中，除了液体F之外，或者作为液体F的备选方案，还可以通过输入管路10输入气体、例如惰性气体或者空气、例如用于细胞培养的空气或者氧气，可选地可以输入含有5％CO₂的空气或者氧气。通过使气体的体积流足够低，能够无气泡地输入气体。备选地可以以足以形成气泡的体积流输入气体，其中，通过气泡G使液体F在第二凹部中移动，并且可选地借助气泡使细胞Z浮动。气泡备选地可以通过空化作用产生，该空化作用通过激光辐射触发。

通过压力变化能够使细胞Z移动远离通孔6c，以便辅助液体交换。

图12示意性地示出了一种实施方式，在该实施方式中，载体1由具有第二凹部6的第二子载体3构成，该第二子载体的横截面开口5和载体1、3的表面的位于这些横截面开口5之间的区域位于共同的平面E中。尤其是，如果横截面开口5之间的这些表面区域、例如由塑料或者功能化的、涂覆的或者疏水地结构化的玻璃构成的表面区域所具有的表面能量不允许或者仅以较低的程度允许通过液体F润湿，则在平面E上移动的例如形式为滚动的液滴Fr的液体F尤其能够从第二凹部6中吸取并且至少部分地取代使用过的介质。滚动的液滴Fr例如可以通过在平面E上或者在第二凹部6中施加形式为多个液滴的液体F，例如通过如图2所示的通入第二凹部6中的输入管路10来引入。突出于平面E的尤其是形式为滚动的液滴Fr的液体F可以通过使载体1相对于水平面倾斜、使载体加速和/或振动、通过以气体流加载而被驱动。

一般而言，在载体由具有第二凹部6的第二子载体3构成的实施方式中，第二子载体可以被称为其中具有凹部6的载体3。

附图标记列表

1 载体

2 第一子载体

3 第二子载体

4、4a、4b 第一凹部

5 第二凹部的横截面开口

6 第二凹部

6b 第二凹部的底部

6c 通孔

7 第一厚度区段

8 第二厚度区段

9 出口

9a 出口的管路区段

10 输入管路

11 端壁、端面

12 载体的第二表面

13 受控制的阀

14 第二凹部的底部

15 连接管路

16 密封件

17 第一计量装置

18 第二计量装置

19 膜

20 载体的第一表面

21 存储凹部

22 材料

23 过渡管路

24 第二子载体中的底部凹部

25 间隔装置

E 平面

F 液体

Fr 滚动的液滴

Z 细胞

G 气泡

Claims (23)

1.一种用于培养细胞(Z)的载体，所述载体具有至少一个第一凹部(4、4a、4b)，所述第一凹部在第一厚度区段(7)上从所述载体(1)的第一表面(20)延伸直到第二厚度区段(8)，所述第二厚度区段与所述第一厚度区段(7)邻接并且第二凹部(6)的布置结构从所述第一凹部(4、4a、4b)延伸到所述第二厚度区段中，其特征在于，所述第二凹部(6)的深度和直径的深径比为至少1:1并且直径为最大1mm，并且所述载体(1)具有出口(9)，所述出口的横截面在所述第一厚度区段(7)中或者与所述第一厚度区段邻接地通入。

2.根据权利要求1所述的载体(1)，其特征在于，所述出口(9)具有突伸到所述载体(1)中的横截面，所述横截面朝向所述载体(1)的第一表面(20)的平面敞开。

3.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于连接管路(15)，所述连接管路与所述出口(9)连接并且延伸至与所述载体(1)的第一表面(20)对置的第二表面(12)。

4.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述连接管路(15)沿着所述载体(1)的端壁(11)延伸或者延伸通过所述载体(1)。

5.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述出口(9)和连接在所述出口上的连接管路(15)具有亲水表面，并且所述载体(1)的第一表面(20)的区域和/或第二表面(12)的区域是疏水性的。

6.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述载体一件式地由玻璃构成。

7.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述载体由在所述第二厚度区段(8)上延伸的第二子载体(3)和在所述第一厚度区段(7)上延伸的第一子载体(2)构成，其中，所述第一子载体(2)和第二子载体(3)彼此液体密封地布置。

8.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述载体由在所述第二厚度区段(8)上延伸的第二子载体(3)和在所述第一厚度区段(7)上延伸的第一子载体(2)构成，其中，所述第一子载体(2)和第二子载体(3)彼此液体密封地并且能彼此平移地布置。

9.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述第一子载体(2)由玻璃、塑料和/或硅构成。

10.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述第二子载体由玻璃和/或硅构成。

11.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，在所述载体(1)的第一表面(20)或者第一厚度区段(7)中构造有输入管路(10)，所述输入管路通入所述第一凹部(4、4a、4b)中。

12.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，在所述载体(1)中构造有至少两个第一凹部(4、4a、4b)，所述至少两个第一凹部中的每个第一凹部均被周向地布置的连接管路(15)包围，所述连接管路延伸通过所述载体(1)。

13.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，在所述载体(1)中构造有至少两个第一凹部(4、4a、4b)，其中至少一个第一凹部被形式为沟槽的出口(9)包围，所述沟槽通入另一个第一凹部(4、4a、4b)中，所述另一个第一凹部被周向地布置的连接管路(15)包围，所述连接管路延伸通过所述载体(1)。

14.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，在出口(9)、连接管路(15)和/或输入管路(10)中分别布置有受控制的阀(13)。

15.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述第二子载体(3)至少部分地布置在所述第一子载体(2)的第一凹部(4)内，其中，所述第二凹部(6)在其底部(6b)中分别具有至少一个通孔(6c)，从而每个第二凹部(6)通过至少一个通孔(6c)与所述第一凹部(4)连接。

16.根据前述权利要求之一所述的载体(1)，其特征在于，所述第一凹部(4)和第二凹部(6)设计为所述第一子载体(2)中的相间隔的通孔并且通过过渡管路(23)相互连接，所述过渡管路由底部凹部(24)构成，所述底部凹部设计为所述第一子载体(2)和所述第二子载体(3)之间的区域性的间隔。

17.根据权利要求16所述的载体(1)，其特征在于，所述第一厚度区段(7)优选与所述第二厚度区段(8)相同，并且所述第二子区段(3)具有底部凹部(24)，所述底部凹部以所述过渡管路(23)的横截面的高度延伸至所述第二子载体(3)中，其中，所述第一子载体(2)沿着所述第二子载体(3)的突出于所述底部凹部(24)的区域与所述第二子载体(3)连接。

18.一种用于培养细胞的方法，其特征在于将悬浮有细胞(Z)的液体(F)引入根据前述权利要求之一所述的载体(1)的第二凹部(6)中，接着沿着所述出口(9)和所述连接管路(15)将液体从第一厚度区段(4、4a、4b)输出。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一子载体(2)仅由所述第二子载体(3)的使所述第二凹部(6)相间隔的表面构成，并且与所述第二凹部(6)的布置结构邻接的第一凹部(4、4a、4b)单独地由通过表面张力产生的液体层构成。

20.根据权利要求18至19之一所述的方法，其特征在于，所述第二子载体(3)的使所述第二凹部(6)相间隔的表面为疏水表面。

21.根据权利要求18至20之一所述的方法，其特征在于，所述载体(1)仅具有第二凹部(6)并且介质构成突出于所述第二凹部(6)的横截面开口的平面的层，所述层构成所述第一凹部的容积。

22.根据权利要求18至21之一所述的方法，其特征在于，在载体(1、3)中具有凹部(6)，所述凹部的横截面开口(6)通过所述载体(1、3)的表面区域相间隔，其中，所述表面区域和所述凹部(6)的横截面开口(5)处于共同的平面(E)中，其中，将液体(F)施加到所述平面(E)上，并且通过使所述载体(1、3)相对于水平面倾斜、使所述载体(1、3)振动和/或以压力气体加载所述平面(E)，来使所述液体(F)沿着所述载体(1、3)移动。

23.根据权利要求18至22之一所述的方法，其特征在于，借助在凹部(6)的底部(6c)中通入的输入管路(10)将所述液体(F)施加到所述平面(E)上。