TW201940880A - 用於濃縮和檢測液體中的細菌群體的微流體平臺 - Google Patents

用於濃縮和檢測液體中的細菌群體的微流體平臺 Download PDF

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斯派西 加林
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山姆 拉斯馬森 紐金
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Abstract

本發明係關於一種用於濃縮和檢測液體中的細菌的微流體設備及相關方法。該設備包括用於捕獲細菌並用一種或多種試劑進行細菌培育的第一過濾室，以及用於捕獲和濃縮可檢測材料的第二過濾室，第一過濾器很少或沒有結合可檢測材料。在一個方面，將細菌用生長培養基和工程化噬菌體培育，所述噬菌體使細菌產生酶。在一個方面，酶在第二過濾室中捕獲並暴露於底物以產生可檢測的信號。

Description

用於濃縮和檢測液體中的細菌群體的微流體平臺
本發明係有關一種檢測技術領域，尤指一種用於濃縮和檢測液體中的細菌群體的微流體平臺。
在現有技術中，檢測領域以及相關的微流體設備存在改進的空間，正是在這種背景下提出了本發明。
在一個方面，一種微流體設備，包括但不限於：適於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠；位於所述樣品入口埠的下游的第一過濾室，所述第一過濾室包含第一過濾器，所述第一過濾器具有第一區域並由第一多孔材料形成，所述第一多孔材料具有適於捕獲所述目標細菌的孔徑；樣品入口通道，其將所述樣品入口埠連接至所述第一過濾室的上游端；在所述樣品入口通道中的樣品控制閥，所述樣品控制閥適於控制從所述樣品入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述樣品流體流；至少一個第一試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並且與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個第一試劑入口埠適於向第一過濾室輸送含有特異於所述目標細菌並適於使所述目標細菌釋放報告酶的噬菌體的第一試劑；至少一個第一試劑控制閥，其適於控制從所述第一試劑入口埠流向第一過濾室的上游端的所述第一試劑流；和第二過濾室，其位於所述第一過濾室的下游，所述第二過濾室包含第二過濾器，所述第二過濾器具有第二區域並且由適於特異性結合所述報告酶的第二多孔材料形成，其中所述第二區域小於所述第一區域；和檢測室控制閥，其位於所述第一過濾室的下游，並且適於控制流向所述第二過濾室的流體流；其中所述第一過濾器適於不結合所述報告酶。除了前述內容之外，在形成本文所述公開內容的一部分的請求項、附圖和文本中描述了其他方面。
在一個方面，一種濃縮細菌用於檢測的方法，包括但不限於：將含有在載體流體中的目標細菌的流體樣品引入微流體設備的樣品入口埠中；將載體流體抽吸通過所述微流體設備的第一過濾室中的第一過濾器並通過所述第一過濾室的下游的廢物埠，同時由所述第一過濾器捕獲所述目標細菌；從第一試劑入口埠將包含用於所述目標細菌的生長培養基的第一試劑抽吸到所述第一過濾室內；在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期；將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲；將包含對所述目標細菌有特異性的噬菌體的第二試劑從第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內；在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育第二培育期，所述第二培育期足以通過所述目標細菌產生報告酶的表達；將含有所表達的所述報告酶的流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的第二過濾室中的第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶；以及在所述第二過濾室內用第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育第三培育期，所述第三培育期足以在檢測室中產生可檢測的信號。除了前述內容之外，在形成本文所述公開內容的一部分的請求項、附圖和文本中描述了其他方法方面。
在一個方面，一種用於細菌檢測的微流體設備，包括但不限於：用於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠；包含第一過濾器的第一過濾室，所述第一過濾器適於從所述流體樣品中捕獲目標細菌；第一微流體裝置，其用於將細菌生長培養基引入所述第一過濾室；第二微流體裝置，其用於將對所述目標細菌有特異性的噬菌體引入所述第一過濾室，所述噬菌體適於使所述目標細菌產生能夠反應以產生可檢測信號的反應性物質；第三微流體裝置，其用於從所述第一過濾室沖洗反應性物質，所述反應性物質響應於所述噬菌體的引入從所述目標細菌釋放；和包括第二過濾器的第二過濾室，所述第二過濾器用於特定地捕獲從所述第一過濾室沖洗掉的所述反應性材料，其中所述第二過濾器小於所述第一過濾器以放大所述可檢測信號；其中所述第一過濾器適於不捕獲所述反應性材料。除了前述內容之外，在形成本文所述公開內容的一部分的請求項、附圖和文本中描述了其他方面。
前述發明內容僅是說明性的，並且不旨在以任何方式進行限制。除了上述說明性方面、實施方式和特徵之外，通過參考附圖和以下詳細描述，其他方面、實施方式和特徵將變得顯而易見。
在下面的詳細描述中，參考形成其一部分的附圖。在附圖中，類似的符號通常標識相似的元件，除非上下文另有規定。在詳細描述、附圖和請求項中描述的說明性實施方式不意味著限制。在不脫離本文提出的主題的精神或範圍的情況下，可以利用其他實施方式，並且可以進行其它改變。
本發明涉及用於檢測在液體中存在諸如細菌之類的污染物的方法和系統。特別地，本發明涉及用於濃縮和檢測在液體中的細菌的微流體設備。
圖1A至1H以簡化形式示出了用於濃縮和檢測細菌的過程，其適用於微流體設備中的執行。在圖1A中，將含有在流體104中的細菌102的樣品100添加到第一過濾器106中。例如，檢測飲用水中大腸桿菌（E.coli ）的存在是有意義的。在圖1B中，流體104通過第一過濾器106，而細菌102被第一過濾器106捕獲。如圖1C所示，添加生長培養基110，並且在第一培育期間將細菌102在第一過濾器106上的生長培養基110中培育。在一個方面，存在於環境樣品中的細菌處於靜止生長期。在第一培育期間，隨著細菌暴露於生長培養基，細菌的代謝速率增加。例如，代謝率的恢復可能需要約2小時。在一個方面，使細菌在代謝恢復後能夠複製，以增加它們的數量。例如，在預期低細菌濃度的情況下，可以使細菌能複製以產生更大的可檢測信號。細菌複製可以通過將細菌在生長培養基中在其代謝率恢復後培育足夠長的時間來獲得（例如，具體取決於細菌的類型，在代謝率已經恢復後約20分鐘可能足以使細菌群體加倍）。在圖1D中，生長培養基110從第一過濾器106移除，而細菌102由過濾器106捕獲。如圖1E所示，將含有工程化的噬菌體的試劑112添加到第一過濾器106中。工程化的噬菌體使細菌102產生酶114以及複製噬菌體。在一方面，噬菌體釋放的裂解蛋白引起細菌裂解，從而在第二培育期間釋放噬菌體和酶。在圖1F中，在第二次培育後，將酶114沖洗通過第一過濾器106到達第二過濾器116，酶114由試劑112攜帶。可以使用另外的流體（例如生長培養基的額外洗滌）來確保完全轉移。裂解的細菌122保留在第一過濾器106中。如圖1G所示，在第三培育期間，將第二過濾器116中捕獲的酶114用酶底物124培育。在一個方面，將酶底物124加入第二過濾器116中，隨即進行在第三次培育。在第三次培育後，如圖1H所示，利用檢測器128從第二過濾器116檢測酶114與酶底物124反應產生的可檢測信號126。
在圖1A至1H中示出的該過程的重要方面是第一過濾器106捕獲細菌102而不捕獲酶114，第二過濾器116捕獲酶114。第一過濾器106捕獲並濃縮來自液體樣品100的細菌102。第二過濾器116具有比第一過濾器小的區域，以便濃縮酶114以產生更大的可檢測信號126。在一個方面，第一過濾器或第二過濾器的“區域”是過濾器的“結合區域”或“有效過濾區域”，其與過濾器的表面積有關，但不一定與過濾器的表面積相同。第一過濾器和第二過濾器針對它們各自的功能獨立地進行優化。
圖2是用於執行如圖1A-1H中概述的過程的微流體設備200的示意圖。微流體設備200包括適於接收包含目標細菌的流體樣品的樣品入口埠202，以及位於樣品入口埠202下游的第一過濾室204。例如，在一方面，微流體設備200適於處理體積至少約為100毫升的流體樣品。第一過濾室204包含第一過濾器206，第一過濾器206具有第一區域並由第一多孔材料形成，第一多孔材料具有適於捕獲目標細菌的孔徑。例如，在一個方面，第一多孔材料具有約0.45μm的孔徑。在一個方面，第一多孔材料具有小於約0.45μm的孔徑。在一個方面，第一過濾器用於過濾來自樣品流體的細菌，樣品流體可以是例如環境樣品。在一方面，第一多孔材料是非纖維素材料。例如，在各個方面，第一多孔材料由聚乙烯基氟化物（PVDF）、聚碳酸酯（PC）、跟蹤蝕刻的聚碳酸酯（PCTE）、聚醚碸（PES）和跟蹤蝕刻的聚酯形成。當報告酶包括纖維素結合區（如本文其他地方所討論的）時，在第一過濾器中使用非纖維素材料防止或最小化報告酶與第一過濾器的結合。通常，選擇第一過濾材料使得其捕獲目標細菌而不顯著結合報告酶（或其他報導分子或材料）。在一個方面，第一多孔材料具有低蛋白結合活性。
樣品入口通道208將樣品入口埠202連接到第一過濾室204的上游端210，並且樣品入口通道208中的樣品控制閥212適於控制從樣品入口埠202流向第一過濾室204的上游端210的樣品流體流。微流體設備200包括至少一個第一試劑入口埠214，其位於第一過濾室204的上游並與第一過濾室204的上游端210流體連通。第一試劑入口埠214適於將含有對目標細菌有特異性的噬菌體的第一試劑輸送到第一過濾室204，並適於使目標細菌釋放報告酶。第一過濾器206適於結合目標細菌，但不結合報告酶。至少一個第一試劑控制閥216適於控制從第一試劑入口埠214流向第一過濾室204的上游端210的第一試劑流。用作檢測室（從其可以檢測到可檢測的信號）的第二過濾室220位於第一過濾室204的下游。第二過濾室220包含第二過濾器222，第二過濾器222具有第二區域並由適於特異性結合報告酶的第二多孔材料形成。在一方面，第二區域小於第一區域。例如，在一方面，第一區域為約315mm2 ，第二區域為約3.14mm2 。
第二膜的功能是捕獲酶，其在一個方面含有纖維素結合結構域。因此，第二多孔材料包括纖維素基材料，例如再生纖維素、乙酸纖維素、纖維素酯和硝化纖維素。選擇膜的大小以將化學發光反應集中在較小的表面積上以增加輸出信號。
在一方面，第二多孔材料具有例如約0.2μm的孔徑。然而，基於纖維素的多孔材料可具有各種孔徑，並且可以使用具有其他孔徑的材料，適合於特定應用。在一個方面，第二過濾室220包括檢測區224，其被配置為能夠從微流體設備的外部檢測由報告酶產生的信號。在一個方面，檢測區224包括由微流體設備200中的透明材料形成的窗，使得能從微流體設備200外部檢測由報告酶與酶底物的反應產生的信號。
檢測室控制閥226位於第一過濾室204的下游，並適於控制流向第二過濾室220的流體流。
通常，連接微流體設備200的部件的流體通道具有約100μm高和一毫米或兩毫米寬的尺寸。例如，在各個方面，樣品入口埠202、至少一個第一試劑入口埠214、第一過濾室204和第二過濾室220中的兩個或更多個通過寬度約為2mm且高度約為100μm的至少一個流體通道流體連接。在一些方面，流體通道可以在約1mm寬和約3mm寬之間並且高達約200μm高。可以使用不同的通道幾何形狀，具體取決於所處理的流體的體積和類型。
在一方面，微流體設備200中的各種閥（包括但不限於第一試劑控制閥216和檢測室控制閥226）包括氣動控制閥。在這種情況下，微流體設備200還包括至少一個空氣通道（例如，如下文在圖18中所示），其用於將至少一個氣動壓力源連接到每個這樣的氣動控制閥。在一個方面，用於控制氣動控制閥的空氣通道具有約1mm寬和100μm高的尺寸。在一個方面，微型閥是隔膜閥。氣動控制隔膜閥可以是例如Yuan的美國專利7,607,641或Hayenga等人的美國專利6,431,212中所描述的，這兩個專利都通過引用併入此處。也可以使用其他類型的微型閥，並且如本文所述的微流體設備不限於與任何特定類型的微型閥一起使用。
在一個方面，微流體設備200包括至少一個空氣埠230，該空氣埠230流體連接到第一過濾室204的上游端210並且適於連接到負壓（真空）源（未示出），例如，以將流體抽吸到第一過濾室204內。如本文所用，第一過濾室204的“上游端”是指第一過濾器206的上游，但不是過濾室入口埠的上游。關於第一過濾室204的配置的進一步的細節在下文中提供。在一個方面，排放控制閥232控制通過空氣埠230的空氣流。在一些方面，空氣埠230可以朝向大氣打開以釋放第一過濾室204內的過壓。替代地，可以將正壓源連接到空氣埠230以增加第一過濾室204內的壓力和/或驅動流體離開第一過濾室204。用於排放和/或改變壓力的相同方法可以與第二過濾室一起使用，但在此未具體描繪或描述。
在一個方面，微流體設備200包括：至少一個廢物埠234，其位於第一過濾室204的下游並適於接收來自第一過濾室204的下游端236的流體廢物；以及至少一個廢物控制閥238，其適於控制從第一過濾室204的下游端236流向至少一個廢物埠234的流體廢物流。例如，在一個方面，至少一個廢物埠234適於連接到至少一個負壓源（未示出）。
在一個方面，微流體設備200包括至少一個廢物埠234，其位於第二過濾室220的下游並適於從第二過濾室220的下游端240接收流體廢物。如圖2所示，廢物埠可以與用於從第一過濾室204（即廢物埠234）接收廢物流體的廢物埠相同。替代地，可以使用單獨的廢物埠。在一個方面，這種廢物埠適於連接到負壓源，以用於將廢物流體吸入廢物埠。
在一個方面，第一試劑入口埠214適於從試劑源接收第一試劑，所述試劑源可以是例如微流體設備外部的液體試劑貯存器。在一個方面，微流體設備200包括含有凍幹試劑的貯存器，所述凍幹試劑與所述至少一個試劑入口埠（例如圖2中所示的貯存器242）流體連通，其中所述至少一個第一試劑入口埠214適於接收適於使凍幹試劑再水化以產生用於輸送到第一過濾室第一試劑的流體。
在一個方面，微流體設備200包括：位於第一過濾室204的上游並且與第一過濾室204的上游端210流體連通的至少一個第二試劑入口埠250，所述至少一個所述第二試劑入口埠250適於將第二試劑輸送到第一過濾室；和至少一個第二試劑控制閥252，其適於控制從第二試劑入口埠250流向第一過濾室204的上游端210的第二試劑流。
在一個方面，微流體設備200包括貯存器（未示出，但是類似貯存器242），其包含與第二試劑入口埠250流體連通的凍幹的第二試劑，其中第二試劑入口埠250適於接收流體，該流體適於使凍幹的第二試劑再水化，以產生用於輸送到第一過濾室204的第二試劑。
在一個方面，微流體設備200包括：位於第一過濾室204的上游並且與第一過濾室204的上游端210流體連通的至少一個第三試劑入口埠256，所述至少一個所述第三試劑入口埠256適於向第一過濾室204輸送第三試劑；和至少一個第三試劑控制閥258，其適於控制從第三試劑入口埠256流向第一過濾室204的上游端210的第三試劑流。在一個方面，微流體設備200包括貯存器（未示出，但是類似貯存器242），其包含與至少一個第三試劑入口埠256流體連通的凍幹的第三試劑，其中至少一個第三試劑入口埠256適於接收流體，該流體能夠將凍幹的第三試劑再水化以產生用於輸送到第一過濾室204的第三試劑。
在一個方面，微流體設備200還包括：旁路通道260，其將第三試劑入口埠256流體地連接到第一過濾室204的下游端236和第二過濾室220的上游端262；以及旁路閥264，其適於控制從第三試劑入口埠256流向第一過濾室204的下游端236和第二過濾室220的上游端262的第三試劑流。
在替代的配置中，第三試劑入口埠與第一過濾室的下游端和第二過濾室的上游端流體連通，使得第三試劑可以從第三試劑入口埠輸送到第二過濾室，並且第三試劑控制閥適於控制從第三試劑入口埠流向第二過濾室的上游端的第三試劑流。這是通過修改圖2中描繪的流體循環，通過移除第三試劑控制閥和將第三試劑入口埠256連接到第一過濾室204的上游端210的流體通道而獲得的回路配置。這種配置的示例可以例如在圖18和21所描繪的設備中看到。
圖3是濃縮細菌用於檢測的方法300的流程圖，包括其可以使用如圖2所示的微流體設備進行。方法300包括在302處將含有在載體流體中的目標細菌的流體樣品引入微流體設備的樣品入口埠；在304處，將載體流體抽吸通過微流體設備的第一過濾室中的第一過濾器並通過第一過濾室下游的廢物埠，同時第一過濾器捕獲目標細菌；如在306所示，從第一試劑入口埠將包括用於目標細菌的生長培養基的第一試劑抽吸到第一過濾室內；在308處，在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期；在310處，將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲；在312處，將包含對所述目標細菌有特異性的噬菌體的第二試劑從第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內；在314處，在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育第二培育期，所述第二培育期足以通過所述目標細菌產生報告酶的表達；在316處，將含有所表達的所述報告酶的流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的第二過濾室中的第二過濾器並通過廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶；以及在318處，在所述第二過濾室內用第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育第三培育期，所述第三培育期足以在檢測室中產生可檢測的信號。
其他方法方面示於圖4-9中。在這些圖中，步驟302-318如結合圖3所述。任選步驟和替代步驟用虛線列出。
圖4描繪了方法400，其包括涉及細菌樣品和第一次培育的其他方面。在一個方面，流體樣品是水樣品，如402所示。在各個方面，目標細菌是大腸桿菌，如404所示，或更一般地，大腸型細菌，如406所示。在一個方面，第一試劑包括Luria-Bertani培養基，如408所示。可以使用各種其他細菌生長培養基，如本領域普通技術人員已知的。第一培育期在約37攝氏度的溫度下持續約2小時，例如分別如410和412所示。更一般地，第一培育期可持續約1.5小時至約2.5小時，如414所示，並且在約25攝氏度和約45攝氏度之間，如416所示。
圖5描繪了方法500，其包括涉及第二試劑和培育期的其他方面。在各個方面，噬菌體包括工程化的報告噬菌體，如502所示和/或對目標細菌有特異性的報告噬菌體，如504所示。在一個方面，噬菌體適於裂解目標細菌以釋放報告酶，如506所示。在另一個方面，第二試劑包括含有報告噬菌體混合物的流體，如508所示。在一些方面，第二試劑包括含有報告酶的流體，如510所示。例如，第二試劑包括T7-NanoLuc®-CBM（纖維素結合模組），如512所示。
方法500包括314在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育第二培育期，所述第二培育期足以通過所述目標細菌產生報告酶的表達，如上文所述。在一個方面，報告酶具有纖維素結合結構域，如514所示。在一個方面，第二培育期持續約1小時，如520所示，並且在約37攝氏度下進行，如522所示。更一般地，第二培育期可持續約0.5至約2.0小時，如524所示，並且可在約25攝氏度至約45攝氏度之間進行，如526所示。
圖6描繪了方法600，包括涉及第三次培育的其他方面。在各個方面，將用第三試劑培育所表達的報告酶產生化學發光信號（如602所示）、螢光信號（如604所示）或比色信號（如606所示）。在一個方面，可檢測的信號對應於由第二過濾器捕獲的所表達的報告酶的量，如608所示。可以用發光計檢測可檢測信號，如610所示，或者用能夠檢測光信號的其他設備檢測可檢測信號。在一個方面，可檢測信號可以在電磁波譜的不可見部分中，並且可以使用適合於檢測其他電磁信號的設備。
圖6還包括與過量流體通過廢物埠後處理該過量流體有關的步驟。在一些方面，方法600包括將第一試劑、第二試劑和第三試劑中的至少一種抽吸通過廢物埠並進入廢物貯存器，如612所示。在其他方面，方法600包括將第一試劑、第二試劑和第三試劑中的至少一種抽吸通過廢物埠並進入試劑貯存器，如614所示。如上所述，廢物試劑可以收集在試劑貯存器中並重複使用。特別地，在一個方面，先前已通過第一過濾器的水樣品可用於使凍幹試劑再水化以產生用於引入第一過濾器的第二試劑。替代地，不是回收試劑的溶劑（水）組分，而是可以收集試劑的溶質組分，以便重複使用或在其包含有害物質的情況下防止其釋放到環境中。
圖7描繪了方法700，其提供了微流體設備中的流體處理方面的進一步的細節。利用微流體設備200執行方法700在圖2中示出。在圖2和在下文中討論的圖10-17中，流體流由粗黑線表示，空氣流由粗虛線表示，打開的閥用黑色表示，而關閉的閥門用白色表示。由圖10-17中的附圖標記標識的部件結合圖2描述。如圖7中的702所示，並且如圖2所示，將載體流體從202抽吸通過所述微流體設備的第一過濾室204中的第一過濾器206並通過所述第一過濾室204的下游的廢物埠234，同時由所述第一過濾器206捕獲所述目標細菌包括：打開所述樣品入口埠202和所述第一過濾室204之間的樣品控制閥212，打開所述第一過濾室204的下游的廢物控制閥238，並在所述過濾室的下游的所述廢物埠234處施加負壓，如圖7中的702所示。
另外，如圖7中的704所示，並且如在圖10中所圖解的，在一個方面，從所述第一試劑入口埠214將包含用於所述目標細菌的生長培養基的所述第一試劑抽吸到所述第一過濾室204內包括：關閉所述樣品控制閥212和廢物控制閥238，打開在所述第一試劑入口埠214和所述第一過濾室204之間的第一試劑控制閥216，打開在所述過濾室204和排放出口（空氣埠230）之間的排放控制閥232，並向所述排放出口（空氣埠230）施加負壓。
在另一方面，如圖7中的706所示，並且如在圖11中所圖解的。在所述第一過濾室204內用所述第一試劑將由所述第一過濾器206捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期包括：關閉第一試劑控制閥216和排放控制閥232。
圖8是涉及進一步的流體處理方面的方法800的流程圖。在另一方面，如圖8中的802所示，以及如圖12所圖解的，將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器206並通過所述廢物埠234，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器206捕獲包括：打開排放控制閥232和廢物控制閥238並在所述廢物埠234處施加負壓。
在另一方面，如圖8中的804所示以及如圖13所圖解的，將包含對所述目標細菌有特異性的噬菌體的所述第二試劑從所述第二試劑入口埠250抽吸到所述第一過濾室204內包括：關閉廢物控制閥238，打開在所述第二試劑入口埠250和所述第一過濾室204之間的第二試劑控制閥252，並向所述排放出口（空氣埠230）施加負壓。
在另一方面，如圖8中的806所示以及如圖14所圖解的，在所述第一過濾室204內用所述第二試劑將由所述第一過濾器206捕獲的所述目標細菌培育包括：關閉第二試劑控制閥252和排放控制閥232。
圖9是顯示濃縮細菌用於檢測的方法900的進一步的方面的流程圖。在一個方面，如圖9中的902所示以及如圖15所圖解的，含有所表達的報告酶的流體包括第三試劑，其中第三試劑從第三試劑入口埠256抽吸到第一過濾室204內，如902所示。例如，在一個方面，將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器206、通過所述微流體設備的所述第二過濾室220中的所述第二過濾器222並通過所述廢物埠234，同時通過所述第二過濾器222捕獲所表達的所述報告酶包括：打開在第三試劑入口埠256和所述第一過濾室204之間的第三試劑控制閥258，打開所述第一過濾室204的下游的檢測室控制閥256，並在所述廢物埠234處施加負壓，其中所述第二過濾室220被流體連接在所述檢測室控制閥226和所述廢物埠234之間，如圖9中的904所示。
替代地，如圖9中的906所示的，含有所表達的報告酶的流體包括第二試劑（這裡指，第二次培育後留在第一過濾室中的流體），並且其中第三試劑從第三試劑入口埠256抽吸到第二過濾室220內。例如，如圖9中的908所示，在一個方面，這可以通過以下方式來實現：將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的所述第二過濾室中的所述第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶。這可以通過以下方式進行：打開第一過濾室204的上游的排放控制閥232，打開流體連接在所述第一過濾室204的下游端236和所述第二過濾室220的上游端262之間的檢測室控制閥226，並在廢物埠234處施加負壓。如圖9中的908所示以及如圖16所圖解的，在第三培育期之前，將第三試劑從第三試劑入口埠256抽吸到第二過濾室220通過以下方式進行：關閉排放控制閥232，打開流體連接在第三試劑入口埠256和第一過濾室204的下游端236之間的第三試劑控制閥（這裡指，旁通閥264），打開檢測室控制閥226，並在廢物埠234處施加負壓，其中第二過濾室220流體連接在檢測室控制閥226和廢物埠234之間。
在另一方面，如圖8中的808所示以及如圖17所圖解的，在所述第二過濾室220內用第三試劑將由所述第二過濾器222捕獲的所表達的所述報告酶培育所述第三培育期包括：關閉所述第三試劑控制閥258和所述檢測室控制閥226。在培育期後，從第二過濾室220檢測可檢測信號。
圖18是包含流體回路的微流體設備1800的實例的照片，所述流體回路用於執行如結合圖2和圖4-9所述的方法。在一方面，微流體設備1800用於檢測水樣品中的大腸桿菌。圖18是微流體設備1800的頂視圖。在一個方面，在使用中，微流體設備1800放置在水準表面上，該表面在圖18中朝上可見。替代地，在一些方面，如本文所述的微流體設備可以豎直取向，例如，以減少占地面積和/或並行處理更多樣品。微流體設備1800由層壓聚合物基材1802形成。在圖18的示例中，微流體設備1800由夾在丙烯酸層之間的聚碳酸酯形成。通過壓敏粘合劑將這些層粘附在一起。這些層對齊並粘附在一起。微流體設備1800的構造在下文中更詳細地描述。
樣品入口埠1804包括附接的魯爾鎖，其使得含有樣品流體的注射器過濾器或杯與微流體設備1800接合。樣品流體從樣品入口埠1804穿過流體通道1806行進到第一過濾室1808。樣品流體流是由樣品控制閥1810控制，樣品控制閥1810是氣動控制閥。空氣通道1812連接到空氣埠1814，空氣埠1814被配置用於連接氣動壓力源以控制樣品控制閥1810。在微流體設備1800中，空氣埠1814包括軟管倒鉤，其可連接到通向氣動壓力源的管線。或者，空氣埠可以構造成通過在空氣埠周圍具有光滑表面來連接到氣動壓力源，O形環或其他密封形成元件可以被壓到或夾緊以形成密封連接。
第一試劑入口埠1816包括魯爾鎖。第一試劑入口埠1816通過通道1818連接到流體通道1806。第一試劑控制閥1820經由連接到空氣埠1824的空氣通道1822控制。第二試劑入口埠1830也包括魯爾鎖。第二試劑入口埠1830通過通道1832連接到流體通道1806。第二試劑控制閥1834經由連接到空氣埠1838的空氣通道1836控制。第一試劑入口埠1816和第二試劑入口埠1830流體連接到第一過濾室1808的上游端1840。第三試劑入口埠1850流體連接到第一過濾室1808的下游端1852。這允許以圖16所示的方式輸送第三試劑。通過通向空氣埠1858的空氣通道1856控制第三試劑控制閥1854。可以在廢物控制閥1862的控制下將流體從第一過濾室1808的下游端1852輸送到廢物埠1860或在檢測室控制閥1866的控制下從第一過濾室1808的下游端1852輸送到第二過濾室1864。經由通向空氣埠1872的空氣通道1870控制廢物控制閥1862，並且經由通向空氣埠1876的空氣通道1874控制檢測室控制閥1866。通道1878使得能將廢物流體和/或空氣從第二過濾室1864的下游端抽吸到廢物埠1860。
空氣埠1824、1838、1858、1872和1876包括用於連接到氣動壓力源以控制閥操作的軟管倒鉤。廢物埠1860還包括軟管倒鉤，其用於連接到負壓源。如上所述，流體貯存器（未示出；微流體設備1800外部）可與廢物埠1860相關聯，以收集離開廢物埠1860的流體。樣品入口埠1804和試劑入口埠1816、1830和1850包括與流體源介面的魯爾鎖。
第一過濾室1808具有扁平的圓柱形狀以容納過濾器1890，過濾器1890是圓盤形的，具有中心孔1892。過濾器1890由聚乙烯基二氟化物形成，厚度為110-150μm，孔徑為約0.45μm（可從Sterlitech Corporation, Kent, WA獲得）。過濾器1890從流體樣品中捕獲大腸桿菌。第一過濾室1808的上表面中的螺旋通道1894在過濾器1890的頂表面上快速分配流體，在螺旋通道1894內，然後其通過過濾器1890橫向和向下擴散。第一過濾器的功能是過濾來自環境樣品的細菌。在一個方面，期望在相對短的時間段（例如，幾分鐘）內處理至少100mL。過濾時間受膜孔徑（此處為，0.45μm或更小）、通道縱橫比、通道長度-膜尺寸和有效過濾面積的影響，其中有效過濾面積取決於螺旋通道幾何形狀。同時，期望減少不利的蛋白相互作用（酶結合）和最小化設備占地面積，以增強設備的便攜性。
在一方面，第一過濾器的面積為315mm2 。第一過濾器上方的螺旋通道面積為200 mm2 。通道高200μm高，通道體積為40μl。假設，過濾器上方的通道面積可以在單層中容納約0.2mm3 或0.2mg的細菌（假設細菌是大腸桿菌，則每個具有0.5μm×2μm的尺寸和1pg的品質）。
可以參考圖19A理解第一過濾室1808的結構，圖19A是沿圖18中的剖面線A-A截取的第一過濾室1808的橫截面側視圖。微流體設備1800的頂部表面用1900表示，底部表面用1902表示。流體從流體通道1806的上游端1840處從流體通道1806進入第一過濾室1808的頂部，並在下游端1852離開。流體流動的方向由圖19A中的箭頭表示。可以看出，流體通道1806形成在微流體設備1800的第二層中。流體通過通孔1906從流體通道1806行進到螺旋通道1894。在圖19A中，流出頁面平面的流體由包含點的圓圈表示，流入頁面平面的流體由包含X的圓圈表示。流體在螺旋通道1894中順序流過區段1894a、1894b、1894c和1894d。同時，流體穿過過濾器1890到達過濾室1808的下表面上的相應通道1908，在這裡它流過區段1908a、1908b、1908c、1908d和1908e。通道1908收集已經通過過濾器1890的流體。然後流體通過中心孔1892到達通道1912，通道1912在第一過濾室1808的中心處在過濾器的下游離開。如在圖19A所能看到的，儘管通道1912在過濾器1890上方的層中離開第一過濾室1808，但是流體僅在其通過過濾器1890之後才進入通道1912。
圖19B是第二過濾室1864的橫截面側視圖，其沿圖18中的剖面線B-B截取。微流體設備1800的頂部表面用1900表示，底部表面用1902表示。流體從入口1920進入第二過濾室1864的頂部，入口1920流體連接到第一過濾室1808的下游端1852，如圖18所示。其穿過第二過濾器1922並經由通道1878離開，如上所述，通道1878通向廢物埠1860，如圖18所示。第二過濾器1922由硝化纖維素形成，所述硝化纖維素的孔徑為約0.2μm，厚度為介於約101.6和約190.5μm之間（由Pall Industries，Port Washington，NY製造）。第二過濾器1922結合酶上的纖維素結合模組標籤。第二過濾器1922可以具有不同的孔徑，使其捕獲報告酶，例如，通過結合纖維素結合模組標籤而捕獲報告酶。形成微流體設備1800的結構的材料基本上是透明的，因此可以通過頂表面1900檢測由第二過濾室1864中的材料產生和/或由第二過濾器1922捕獲的可檢測信號。在微流體設備的主要結構由不傳輸可檢測信號的材料形成的實施方案中，第二過濾室的至少一個表面可由對可檢測信號透明的材料形成，以使得能從微流體設備的外部檢測可檢測信號。
圖20描繪了用於執行流體處理步驟的微流體設備2000的替代佈局，該流體處理步驟基本上類似於由圖18的微流體設備執行的流體處理步驟。微流體設備2000包括連接到通道2008的樣品入口埠2002、第一試劑入口埠2004和第二試劑入口埠2006，通道2008通向第一過濾室2012的入口2010。樣品控制閥2014、第一試劑控制閥2016和第二試劑控制閥2018分別通過空氣埠2020、2022和2024控制。螺旋通道2026從入口2010延伸到出口2030。如結合圖18所述，螺旋通道2026位於第一過濾室2012的上游側（即，在過濾器的第一側上，其未在圖20中示出，但如結合圖18所述）。相應的螺旋通道（未示出）位於第一過濾室的下游側（即，在過濾器的第二側）。出口2030位於第一過濾室2012的下游側，並接收已經過第一過濾器並進入過濾器下游側的螺旋通道的流體。通風口2032位於第一過濾室的第一（上游）側，位於螺旋通道2026的遠端，使得（通過空氣埠2034）施加到排放口2032的真空使流體流入螺旋通道2026，如結合圖8的步驟806所描述的。另外，可以打開空氣埠2034以使得流體能被抽吸通過第一過濾器並進入第二過濾室，例如，如結合圖9的步驟908所述。微流體設備2000還包括第三試劑入口埠2040、第二過濾室2042、出口埠2044和排放口2046。第一過濾室2012下游的流體流由分別經由空氣埠2060、2062和2064控制的第三試劑控制閥2050、檢測室控制閥2052和廢物控制閥2054控制。空氣埠2066連接到排放口2046。應當理解，圖18和20中描繪的微流體設備提供了用於執行基本相同的流體處理功能的兩種不同的佈局。這些設備在設備上的空氣口和流體入口與出口的佈置方面不同，並且在通風佈置方面略有不同。例如，可以使用其他配置來優化設備性能的特定方面或減少設備佔用面積。
如本文所述的微流體設備可附接到供應樣品和試劑流體的流體源，附接到用於控制氣動閥的操作的氣動控制線，以及具有用於收集已通過所述設備的流體的相關廢物或試劑貯存器的一個或多個負壓源。在一個方面，微流體設備包括附接的軟管倒鉤和/或魯爾鎖，其用於連接到空氣或流體源，如圖18所示。在其他方面，空氣或流體源包括O形環或其他密封形成元件，其被壓靠或夾緊在微流體設備上以與設備中的相應空氣或流體入口開口形成密封連接。空氣或流體源可以單獨連接到微流體設備，或者多個空氣和/或流體源可以經由歧管設備連接到微流體設備，該歧管設備同時提供與多個空氣或流體入口開口的連接。流體廢物或空氣排放管線可以以相同的方式連接到微流體設備。
氣動微型閥可以通過例如ADEPT（ALine Development Platform，來自美國加利福尼亞州Rancho Dominguez的ALINE，Inc.的12 通道氣動控制器）來控制。ADEPT是一種可程式設計的微流體控制器，其可在軟體控制下，通過電腦介面進行程式設計，也可通過手動開關，操作多達16個獨立的氣動閥。
可以通過將微流體設備放入培育箱中來進行如本文所述的培育步驟。替代地，在一個方面，微流體設備可包括一個或多個機載加熱元件（例如電阻元件）。在另一方面，微流體設備可通過鐳射施加能量、聚焦RF或超聲能量等進行局部加熱。
在一個方面，可以通過使用適於同時與多個微流體設備介面的定制設備並行處理多個微流體設備。這種設備可以包括，例如，用於控制閥和驅動流體流過設備的正壓和負壓源，試劑源和用於捕獲（和任選地再迴圈）廢物流的貯存器。在一個方面，試劑源可包括貯存器或液體試劑。
如上所述，如本文所述的微流體設備可由層壓聚合物基材形成。例如，在一些方面，微流體設備由夾在丙烯酸層之間的聚碳酸酯層形成。用於本文所述的微流體設備的材料可以針對不同的性質選擇，所述不同的性質包括生物相容性、光學透明度（用於檢測區）和低蛋白結合。在一些方面，通道和室通過鐳射蝕刻形成；替代地，通道和室可以是模切（die cut）的或通過其他製造方法形成。在一個方面，層對齊並用壓敏粘合劑（例如矽氧烷加增粘劑）粘附在一起。替代地，可以使用其他粘合材料，例如熱敏粘合劑。如本文所述的微流體設備可以用不同數量和類型的層形成。
如本文所述的微流體設備可以通過不同的工藝製造，所述工藝例如如在Levine, Leanna, M. “Developing Diagnostic Products Using Polymer Laminate Technology,” Aline, Inc., Redondo Beach, CA; 和Fiorini, Gina S., Chiu, Daniel T., 2005, “Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application,” BioTechniques 38: 429-446, March 2005中所描述的，其中的每一個都通過引用併入本文。在一個方面，微流體設備可以由鑄塑材料（例如聚二甲基矽氧烷（PDMS））製造，例如，如在Friend, James and Yeo, Leslie (2010) “Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane,” BIOMICROFLUIDICS 4, 026502, doi:10.1063/1.3259624中所述，其通過引用併入本文。例如，可以通過例如在Klingbeil等人的美國公開專利申請No.2009/0173428和Bentsen等人的美國專利No.6,375,871中描述的類型的卷到卷工藝（reel-to-reel process）由層壓聚合物片材製造，這兩者都通過引用併入本文。設備也可以通過注塑工藝製造。
可以使用不同的試劑組合來執行對在被污染的流體樣品中的細菌的檢測。在本文所述的示例中，工程化噬菌體使細菌產生酶，當酶與底物相互作用時產生發光。在一個方面，噬菌體可以被工程化以產生包含纖維素結合模組標籤的NanoLuc®報告酶，纖維素結合模組標籤使其結合第二過濾器的硝化纖維素材料。 NanoLuc®報告酶與Nano-Glo®螢光素酶測定試劑（第三試劑）（均來自Promega Corporation，Madison，WI）組合使用，以產生λ= 460nm的可檢測信號。可以用發光計檢測發光。應當理解，如本文所述的微流體設備可以（通過適當選擇過濾材料）配置成與除了本文具體描述的那些之外的細菌和測定試劑組合工作。
在本文提供的示例中，細菌通過用於誘導報告酶產生的工程化噬菌體裂解。替代地，可以修改微流體設備以通過一些其他機制使細菌裂解。例如，用於裂解細菌的措施可包括但不限於諸如酶之類的試劑、改變設備溫度、超聲處理或壓力。在一個方面，微流體設備包括用於裂解目標細菌以釋放反應性材料的裂解裝置。例如，在各個方面，裂解裝置包括加熱裝置、聲學裝置（例如超聲波儀）、壓力源、試劑源或酶源。在一個方面，微流體設備配置成與外部裂解裝置配合，例如與外部熱源或用於提供超聲處理的外部聲源配合。
本文所述的微流體設備利用微流體裝置，例如微通道、微型閥、過濾器、流體或空氣埠、相關流體源、試劑貯存器（包含液體或凍幹試劑材料）以及正壓和負壓源的各種組合，以執行各種功能，包括但不限於從流體樣品中捕獲目標細菌，引入細菌生長培養基，引入對目標細菌有特異性的噬菌體，沖洗響應於引入噬菌體從目標細菌釋放的反應性物質（例如酶），捕獲從第一過濾室沖洗的反應性材料，並執行可檢測信號的讀出。應當理解，各種不同的微流體回路配置可以提供等同的功能，並且本發明不限於本文描述的特定的流體回路配置。
本文描述的主題之各方面在以下做闡述：
1.一種微流體設備，其包括：適於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠；位於所述樣品入口埠的下游的第一過濾室，所述第一過濾室包含第一過濾器，所述第一過濾器具有第一區域並由第一多孔材料形成，所述第一多孔材料具有適於捕獲所述目標細菌的孔徑；樣品入口通道，其將所述樣品入口埠連接至所述第一過濾室的上游端；在所述樣品入口通道中的樣品控制閥，所述樣品控制閥適於控制從所述樣品入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述樣品流體流；至少一個第一試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並且與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個第一試劑入口埠適於向第一過濾室輸送含有特異於所述目標細菌並適於使所述目標細菌釋放報告酶的噬菌體的第一試劑；至少一個第一試劑控制閥，其適於控制從所述第一試劑入口埠流向第一過濾室的上游端的所述第一試劑流；和第二過濾室，其位於所述第一過濾室的下游，所述第二過濾室包含第二過濾器，所述第二過濾器具有第二區域並且由適於特異性結合所述報告酶的第二多孔材料形成，其中所述第二區域小於所述第一區域；和檢測室控制閥，其位於所述第一過濾室的下游，並且適於控制流向所述第二過濾室的流體流；其中所述第一過濾器適於不結合所述報告酶。
2.根據前述1所述的微流體設備，其中所述微流體設備適於處理體積為至少約100ml的流體樣品。
3.根據前述1所述的微流體設備，其中所述樣品入口埠、所述至少一個試劑入口埠、所述第一過濾室和所述第二過濾室中的兩個或更多個通過至少一個寬度為約2 mm且高約100µm的流體通道流體連接。
4.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料包括聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚碳酸酯（PC）、跟蹤蝕刻的聚碳酸酯（PCTE）、聚醚碸（PES）和跟蹤蝕刻的聚酯中的至少一種。
5.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有低蛋白結合活性。
6.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料是非纖維素材料。
7.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有約0.45μm的孔徑。
8.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有小於約0.45μm的孔徑。
9.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料包括基於纖維素的材料。
10.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料包括再生纖維素、乙酸纖維素、纖維素酯和硝酸纖維素中的至少一種。
11.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料具有約0.2μm的孔徑。
12.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第二過濾室包括檢測區，所述檢測區被配置為使得能夠從所述微流體設備的外部檢測由所述報告酶產生的信號。
13.根據前述1所述的微流體設備，其中所述第一區域為約315mm2 ，並且所述第二區域為約3.14mm2 。
14.根據前述1所述的微流體設備，其中所述樣品控制閥、所述第一試劑控制閥和檢測室控制閥中的至少一個包括隔膜閥。
15.根據前述1所述的微流體設備，其中所述樣品控制閥、所述第一試劑控制閥和所述檢測室控制閥中的至少一個包括氣動控制閥。
16.根據前述15所述的微流體設備，其包括用於將至少一個氣動壓力源連接到所述氣動控制閥的至少一個空氣通道。
17.根據前述1所述的微流體設備，其包括至少一個空氣埠，所述空氣埠流體連接到所述第一過濾室的所述上游端並適於連接到負壓源。
18.根據前述1所述的微流體設備，其包括：至少一個廢物埠，其位於所述第一過濾室的下游，並適於從所述第一過濾室的所述下游端接收流體廢物；和至少一個廢物控制閥，其適於控制從所述第一過濾室的所述下游端流向所述至少一個廢物埠的流體廢物流。
19.根據前述18所述的微流體設備，其中所述至少一個廢物埠適於連接到至少一個負壓源。
20. 根據前述1所述的微流體設備，其包括：至少一個廢物埠，其位於所述第二過濾室的下游，並適於從所述第二過濾室的所述下游端接收流體廢物。
21.根據前述20所述的微流體設備，其中所述至少一個廢物埠適於連接到至少一個負壓源。
22.根據前述1所述的微流體設備，其中所述至少一個第一試劑入口埠適於從試劑源接收所述第一試劑。
23.根據前述1所述的微流體設備，其包括貯存器，所述貯存器包含與所述至少一個試劑入口埠流體連通的凍幹試劑，其中所述至少一個第一試劑入口埠適於接收適於使所述凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第一試劑的流體。
24.根據前述1所述的微流體設備，其包括：至少一個第二試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第二試劑入口埠適於向所述第一過濾室輸送第二試劑；至少一個第二試劑控制閥，其適於控制從所述第二試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述第二試劑流。
25.根據前述24所述的微流體設備，其包括貯存器，所述貯存器包含與所述至少一個第二試劑入口埠流體連通的第二凍幹試劑，其中所述至少一個第二試劑入口埠適於接收適於使所述第二凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第二試劑的流體。
26.根據前述24所述的微流體設備，其包括：至少一個第三試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第三試劑入口埠適於向所述第一過濾室輸送第三試劑；以及至少一個第三試劑控制閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
27.根據前述26所述的微流體設備，其包括包含第三凍幹試劑的貯存器，所述貯存器與所述至少一個第三試劑入口埠流體連通，其中所述至少一個第三試劑入口埠適於接收能夠使所述第三凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第三試劑的流體。
28.根據前述26所述的微流體設備，其包括：旁通通道，其將所述第三試劑入口埠流體連接至所述第一過濾室的所述下游端和所述第二過濾室的所述上游端， 以及旁通閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述下游端以及所述第二過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
29.根據前述24所述的微流體設備，其包括：至少一個第三試劑入口埠，其與所述第一過濾室的所述下游端以及所述第二過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第三試劑入口埠適於向所述第二過濾室輸送第三試劑；以及至少一個第三試劑控制閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第二過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
30.根據前述1所述的微流體設備，其通過卷到卷工藝由層壓聚合物片材形成。
31.根據前述1所述的微流體設備，其由鑄塑聚合物材料形成。
32.根據前述1所述的微流體設備，其通過注射成型形成。
33.一種濃縮細菌用於檢測的方法，其包括：將含有在載體流體中的目標細菌的流體樣品引入微流體設備的樣品入口埠中；將載體流體抽吸通過所述微流體設備的第一過濾室中的第一過濾器並通過所述第一過濾室的下游的廢物埠，同時由所述第一過濾器捕獲所述目標細菌；從第一試劑入口埠將包含用於所述目標細菌的生長培養基的第一試劑抽吸到所述第一過濾室內；在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期；將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲；將包含對所述目標細菌有特異性的噬菌體的第二試劑從第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內；在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育第二培育期，所述第二培育期足以通過所述目標細菌產生報告酶的表達；將含有所表達的所述報告酶的流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的第二過濾室中的第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶；以及在所述第二過濾室內用第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育第三培育期，所述第三培育期足以在檢測室中產生可檢測的信號。
根據前述33所述的方法，其中含有所表達的所述報告酶的所述流體包含所述第三試劑，其中將所述第三試劑從第三試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內。
根據前述33所述的方法，其中含有所表達的所述報告酶的所述流體包含所述第二試劑，並且其中將所述第三試劑從第三試劑入口埠抽吸到所述第二過濾室內。
36.根據前述33所述的方法，其包括用發光計檢測所述可檢測信號。
37.根據前述33所述的方法，其中所述流體樣品是水樣品。
38.根據前述33所述的方法，其中所述目標細菌是大腸桿菌（Escherichia coli ）。
39.根據前述33所述的方法，其中所述目標細菌是大腸型細菌。
40.根據前述33所述的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生化學發光信號。
41.根據前述33所述的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生螢光信號。
42.根據前述33所述的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生比色信號。
43.根據前述33所述的方法，其中所述報告酶具有纖維素結合結構域。
44.根據前述33所述的方法，其中所述可檢測信號對應於由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶的量。
45.根據前述33所述的方法，其中所述第一培育期持續約2小時。
46.根據前述33所述的方法，其中所述第一培育期持續介於約1.5小時和約2.5小時之間。
47.根據前述33所述的方法，其中所述第一培育期在約37攝氏度下進行。
48.根據前述33所述的方法，其中所述第一培育期在約25攝氏度和約45攝氏度之間進行。
49.根據前述33所述的方法，其中所述第二培育期持續約1小時。
50.根據前述33所述的方法，其中所述第二培育期持續介於約0.5小時和約2小時之間。
51.根據前述33所述的方法，其中所述第二培育期在約37攝氏度下進行。
52.根據前述33所述的方法，其中所述第二培育期在約25攝氏度和約45攝氏度之間進行。
53.根據前述33所述的方法，其中將所述載體流體抽吸通過所述微流體設備的所述第一過濾室中的所述第一過濾器並通過所述第一過濾室的下游的所述廢物埠，同時由所述第一過濾器捕獲所述目標細菌包括：打開所述樣品入口埠和所述過濾室之間的樣品控制閥，打開所述過濾室的下游的廢物控制閥，並在所述過濾室的下游的所述廢物埠處施加負壓。
54.根據前述33所述的方法，其包括將所述第一試劑、所述第二試劑和所述第三試劑中的至少一種抽吸通過所述廢物埠並進入廢物貯存器。
55.根據前述33所述的方法，其包括將所述第一試劑、所述第二試劑和所述第三試劑中的至少一種抽吸通過所述廢物埠並進入試劑貯存器中。
56.根據前述33所述的方法，其中從所述第一試劑入口埠將包含用於所述目標細菌的生長培養基的所述第一試劑抽吸到所述過濾室內包括：關閉所述樣品控制閥和廢物控制閥，打開在所述第一試劑入口埠和所述過濾室之間的第一試劑控制閥，打開在所述過濾室和排放出口之間的排放控制閥，並向所述排放出口施加負壓。
57.根據前述33所述的方法，其中所述第一試劑包括Luria-Bertani培養基。
58.根據前述33所述的方法，其中在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期包括：關閉第一試劑控制閥和排放控制閥。
59.根據前述33所述的方法，其中，將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲包括：打開排放控制閥和廢物控制閥並在所述廢物埠處施加負壓。
60.根據前述33所述的方法，其中所述噬菌體包括工程化的報告噬菌體。
61.根據前述33所述的方法，其中所述噬菌體包括對所述目標細菌有特異性的報告噬菌體。
62.根據前述33所述的方法，其中所述噬菌體適於裂解所述目標細菌以釋放報告酶。
63.根據前述33所述的方法，其中所述第二試劑包括含有報告噬菌體混合物的流體。
64.根據前述33所述的方法，其中所述第二試劑包括含有報告酶的流體。
65.根據前述33所述的方法，其中所述第二試劑包括T7-NanoLuc®-纖維素結合模組（T7-NanoLuc®- Cellulose Binding Module）。
66.根據前述33所述的方法，其中將包含對所述目標細菌有特異性的所述噬菌體的所述第二試劑從所述第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內包括：關閉廢物控制閥，打開在所述第二試劑入口埠和所述第一過濾室之間的第二試劑控制閥，並向所述排放出口施加負壓。
67.根據前述33所述的方法，其中在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育包括：關閉第二試劑控制閥和排放控制閥。
68.根據前述34所述的方法，其中將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的所述第二過濾室中的所述第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶包括：打開在第三試劑入口埠和所述第一過濾室之間的第三試劑控制閥，打開所述第一過濾室的下游的檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓，其中所述第二過濾室流體連接在所述檢測室控制閥和所述廢物埠之間。
69.根據前述33所述的方法，其中在所述第二過濾室內用所述第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育所述第三培育期包括：關閉所述第三試劑控制閥和所述檢測室控制閥。
70.根據前述35所述的方法，其包括：將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的所述第二過濾室中的所述第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶通過以下方式進行：打開所述第一過濾室的上游的排放控制閥，打開流體連接在所述第一過濾室的所述下游端和所述第二過濾室的上游端之間的檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓，其中所述第二過濾室被流體連接在所述檢測室控制閥和所述廢物埠之間；以及在所述第三培育期之前，將所述第三試劑抽吸到所述第二過濾室內通過以下方式進行：關閉所述第一過濾室的上游的所述排放口，打開流體連接在第三試劑入口埠和所述第一過濾室的下游端之間的第三試劑控制閥，打開檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓。
71.一種用於細菌檢測的微流體設備，其包括：用於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠；包含第一過濾器的第一過濾室，所述第一過濾器適於從所述流體樣品中捕獲目標細菌；第一微流體裝置，其用於將細菌生長培養基引入所述第一過濾室；第二微流體裝置，其用於將對所述目標細菌有特異性的噬菌體引入所述第一過濾室，所述噬菌體適於使所述目標細菌產生能夠反應以產生可檢測信號的反應性物質；第三微流體裝置，其用於從所述第一過濾室沖洗反應性物質，所述反應性物質響應於所述噬菌體的引入從所述目標細菌釋放；和包括第二過濾器的第二過濾室，所述第二過濾器用於特定地捕獲從所述第一過濾室沖洗掉的所述反應性材料，其中所述第二過濾器小於所述第一過濾器以放大所述可檢測信號；其中所述第一過濾器適於不捕獲所述反應性材料。
72.根據前述71所述的微流體設備，其包括用於裂解所述目標細菌以釋放所述反應性材料的裂解裝置。
73.根據前述71所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括加熱裝置。
74.根據前述71所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括聲學裝置。
75.根據前述71所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括壓力源。
76.根據前述71所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括試劑源。
77.根據前述71所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括酶源。
78.根據前述71所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括含有凍幹試劑的貯存器。
79.根據前述71所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括用於與外部流體源連接的埠。
80.根據前述71所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括至少一個微通道和至少一個閥。
81.根據前述79所述的微流體設備，其中，所述至少一個閥包括至少一個氣動致動閥和適於連接到壓力源的至少一個空氣通道。
82.根據前述79所述的微流體設備，其包括位於所述至少一個閥的下游的至少一個負壓源。
83.根據前述81所述的微流體設備，其中，所述至少一個負壓源位於第一過濾室的下游。
84.根據前述71所述的微流體設備，其中所述第一過濾器包括孔徑為約0.45μm的多孔非纖維素材料，並且其中所述第二過濾器包括基於纖維素的材料。
85.根據前述71所述的微流體設備，其中所述第二過濾室包括檢測區，所述檢測區被配置成使得能夠從所述微流體設備的外部檢測所述可檢測的信號。
本文描述的主題有時說明包含在不同的其它部件中或與不同的其它部件連接的不同部件。要理解的是，這些描述的架構僅為示例性的並且事實上可採用實現相同功能的許多其它結構。在構思意義上，實現相同功能的任何部件佈置是效果上“關聯的”以便實現期望的功能。因此，本文中組合以實現特定功能的任意兩個組件可被視為是彼此“關聯的”以便實現期望的功能，而不管架構或中間部件如何。同樣，如此關聯的任意兩個部件也可被視為是彼此“可操作地連接的”或“可操作地耦合的”以實現期望的功能，並且能夠如此關聯的任意兩個部件也可被視為是彼此“可操作地耦合的”以實現期望的功能。可操作地耦合的特定示例包括但不限於可物理匹配和/或物理相互作用的部件、和/或可無線相互作用、和/或無線相互作用的部件、和/或邏輯相互作用、和/或可邏輯相互作用的部件。
在一些情況下，一個或多個部件在本文中可被稱為“被配置為”、“通過…配置”，“可配置為”、“可操作/操作以”、“適應/可適應”、“能夠”，“可符合/符合於”。本領域技術人員將認識到，除非上下文另有要求，否則這些術語（例如，“配置為”）通常可以包括活動狀態部件和/或非活動狀態部件和/或待機狀態部件。
為了概念清楚起見，本文描述的部件（例如，操作）、設備、物件以及伴隨它們的討論被用作示例，並且可以預期各種配置修改。因此，如本文所使用的，所闡述的具體示例和所伴隨的討論旨在表示其更一般的類別。一般來說，本文中任何特定示例的使用也旨在表示其類別，並且不包括這樣的特定部件（例如，操作）、設備和物件不應被視為限制。
雖然本文公開了各種方面和實施方案，其他方面和實施方案對於本領域技術人員而言是顯而易見的。本文公開的各種方面和實施方案是為了說明的目的，而不意在限制，真正的範圍和精神由所附請求項指示。
100‧‧‧樣品
102‧‧‧細菌
104‧‧‧流體
106‧‧‧第一過濾器
110‧‧‧生長培養基
112‧‧‧試劑
114‧‧‧酶
116‧‧‧第二過濾器
122‧‧‧細菌
124‧‧‧酶底物
126‧‧‧可檢測信號
128‧‧‧檢測器
200‧‧‧微流體設備
202‧‧‧樣品入口埠
204‧‧‧第一過濾室
206‧‧‧第一過濾器
208‧‧‧樣品入口通道
210‧‧‧上游端
212‧‧‧樣品控制閥
214‧‧‧第一試劑入口埠
216‧‧‧第一試劑控制閥
220‧‧‧第二過濾室
222‧‧‧第二過濾器
224‧‧‧檢測區
226‧‧‧檢測室控制閥
230‧‧‧空氣埠
232‧‧‧排放控制閥
234‧‧‧廢物埠
236‧‧‧下游端
238‧‧‧廢物控制閥
240‧‧‧下游端
242‧‧‧貯存器
250‧‧‧第二試劑入口埠
252‧‧‧第二試劑控制閥
256‧‧‧第三試劑入口埠
258‧‧‧第三試劑控制閥
260‧‧‧旁路通道
262‧‧‧上游端
264‧‧‧旁路閥
1800‧‧‧微流體設備
1802‧‧‧層壓聚合物基材
1804‧‧‧樣品入口埠
1806‧‧‧流體通道
1808‧‧‧第一過濾室
1810‧‧‧樣品控制閥
1812‧‧‧空氣通道
1814‧‧‧空氣埠
1816‧‧‧第一試劑入口埠
1818‧‧‧通道
1820‧‧‧第一試劑控制閥
1822‧‧‧空氣通道
1824‧‧‧空氣埠
1830‧‧‧第二試劑入口埠
1832‧‧‧通道
1834‧‧‧第二試劑控制閥
1836‧‧‧空氣通道
1838‧‧‧空氣埠
1840‧‧‧上游端
1850‧‧‧第三試劑入口埠
1852‧‧‧下游端
1854‧‧‧第三試劑控制閥
1856‧‧‧空氣通道
1858‧‧‧空氣埠
1860‧‧‧廢物埠
1862‧‧‧廢物控制閥
1864‧‧‧第二過濾室
1866‧‧‧檢測室控制閥
1870‧‧‧空氣通道
1872‧‧‧空氣埠
1874‧‧‧空氣通道
1876‧‧‧空氣埠
1878‧‧‧通道
1890‧‧‧過濾器
1892‧‧‧中心孔
1894‧‧‧螺旋通道
1894a-d‧‧‧區段
1900‧‧‧頂部表面
1902‧‧‧底部表面
1906‧‧‧通孔
1908‧‧‧通道
1908a-e‧‧‧區段
1912‧‧‧通道
1920‧‧‧入口埠
1922‧‧‧第二過濾器
2000‧‧‧微流體設備
2002‧‧‧樣品入口埠
2004‧‧‧第一試劑入口埠
2006‧‧‧第二試劑入口埠
2008‧‧‧通道
2010‧‧‧入口
2012‧‧‧第一過濾室
2014‧‧‧樣品控制閥
2016‧‧‧第一試劑控制閥
2018‧‧‧第二試劑控制閥
2020‧‧‧空氣埠
2022‧‧‧空氣埠
2024‧‧‧空氣埠
2026‧‧‧螺旋通道
2030‧‧‧出口
2032‧‧‧排放口
2034‧‧‧空氣埠
2040‧‧‧第三試劑入口埠
2042‧‧‧第二過濾室
2044‧‧‧出口埠
2046‧‧‧排放口
2050‧‧‧第三試劑控制閥
2052‧‧‧檢測室控制閥
2054‧‧‧ 廢物控制閥
2060‧‧‧空氣埠
2062‧‧‧空氣埠
2064‧‧‧空氣埠
2066‧‧‧空氣埠
300~900‧‧‧方法
302~318‧‧‧步驟
402~416‧‧‧步驟
502~526‧‧‧步驟
602~614‧‧‧步驟
702~706‧‧‧步驟
802~808‧‧‧步驟
902~908‧‧‧步驟
圖1A-1H 示出了濃縮和檢測細菌的過程。
圖2 是微流體回路的示意圖。
圖3 是濃縮細菌用於檢測的方法的流程圖。
圖4 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖5 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖6 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖7 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖8 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖9 是示出了圖3的方法的其他方面的流程圖。
圖10 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖11 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖12 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖13 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖14 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖15 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖16 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖17 描繪了圖2的微流體回路的操作。
圖18 是微流體設備的俯視照片。
圖19A 是沿圖18中的剖面線A-A截取的過濾室的橫截面圖。
圖19B 是沿圖18中的剖面線B-B截取的過濾室的橫截面圖。
圖20 是替代性的微流體設備設計的俯視圖。

Claims (85)

  1. 一種微流體設備，其包括： 適於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠； 位於所述樣品入口埠的下游的第一過濾室，所述第一過濾室包含第一過濾器，所述第一過濾器具有第一區域並由第一多孔材料形成，所述第一多孔材料具有適於捕獲所述目標細菌的孔徑； 樣品入口通道，其將所述樣品入口埠連接至所述第一過濾室的上游端； 在所述樣品入口通道中的樣品控制閥，所述樣品控制閥適於控制從所述樣品入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述樣品流體流； 至少一個第一試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並且與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個第一試劑入口埠適於向第一過濾室輸送含有特異於所述目標細菌並適於使所述目標細菌釋放報告酶的噬菌體的第一試劑； 至少一個第一試劑控制閥，其適於控制從所述第一試劑入口埠流向第一過濾室的上游端的所述第一試劑流；和 第二過濾室，其位於所述第一過濾室的下游，所述第二過濾室包含第二過濾器，所述第二過濾器具有第二區域並且由適於特異性結合所述報告酶的第二多孔材料形成，其中所述第二區域小於所述第一區域；和 檢測室控制閥，其位於所述第一過濾室的下游，並且適於控制流向所述第二過濾室的流體流； 其中所述第一過濾器適於不結合所述報告酶。
  2. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述微流體設備適於處理體積為至少約100ml的流體樣品。
  3. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述樣品入口埠、所述至少一個試劑入口埠、所述第一過濾室和所述第二過濾室中的兩個或更多個通過至少一個寬度為約2 mm且高約100µm的流體通道流體連接。
  4. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料包括聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚碳酸酯（PC）、跟蹤蝕刻的聚碳酸酯（PCTE）、聚醚碸（PES）和跟蹤蝕刻的聚酯中的至少一種。
  5. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有低蛋白結合活性。
  6. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料是非纖維素材料。
  7. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有約0.45μm的孔徑。
  8. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一多孔材料具有小於約0.45μm的孔徑。
  9. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料包括基於纖維素的材料。
  10. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料包括再生纖維素、乙酸纖維素、纖維素酯和硝酸纖維素中的至少一種。
  11. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第二多孔材料具有約0.2μm的孔徑。
  12. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第二過濾室包括檢測區，所述檢測區被配置為使得能夠從所述微流體設備的外部檢測由所述報告酶產生的信號。
  13. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述第一區域為約315mm2 ，並且所述第二區域為約3.14mm2 。
  14. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述樣品控制閥、所述第一試劑控制閥和檢測室控制閥中的至少一個包括隔膜閥。
  15. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述樣品控制閥、所述第一試劑控制閥和所述檢測室控制閥中的至少一個包括氣動控制閥。
  16. 如請求項15所述的微流體設備，其包括用於將至少一個氣動壓力源連接到所述氣動控制閥的至少一個空氣通道。
  17. 如請求項1所述的微流體設備，其包括至少一個空氣埠，所述空氣埠流體連接到所述第一過濾室的所述上游端並適於連接到負壓源。
  18. 如請求項1所述的微流體設備，其包括：至少一個廢物埠，其位於所述第一過濾室的下游，並適於從所述第一過濾室的所述下游端接收流體廢物；和至少一個廢物控制閥，其適於控制從所述第一過濾室的所述下游端流向所述至少一個廢物埠的流體廢物流。
  19. 如請求項18所述的微流體設備，其中所述至少一個廢物埠適於連接到至少一個負壓源。
  20. 如請求項1所述的微流體設備，其包括：至少一個廢物埠，其位於所述第二過濾室的下游，並適於從所述第二過濾室的所述下游端接收流體廢物。
  21. 如請求項20所述的微流體設備，其中所述至少一個廢物埠適於連接到至少一個負壓源。
  22. 如請求項1所述的微流體設備，其中所述至少一個第一試劑入口埠適於從試劑源接收所述第一試劑。
  23. 如請求項1所述的微流體設備，其包括貯存器，所述貯存器包含與所述至少一個試劑入口埠流體連通的凍幹試劑，其中所述至少一個第一試劑入口埠適於接收適於使所述凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第一試劑的流體。
  24. 如請求項1所述的微流體設備，其包括：至少一個第二試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第二試劑入口埠適於向所述第一過濾室輸送第二試劑；至少一個第二試劑控制閥，其適於控制從所述第二試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述第二試劑流。
  25. 如請求項24所述的微流體設備，其包括貯存器，所述貯存器包含與所述至少一個第二試劑入口埠流體連通的第二凍幹試劑，其中所述至少一個第二試劑入口埠適於接收適於使所述第二凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第二試劑的流體。
  26. 如請求項24所述的微流體設備，其包括：至少一個第三試劑入口埠，其位於所述第一過濾室的上游並與所述第一過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第三試劑入口埠適於向所述第一過濾室輸送第三試劑；以及至少一個第三試劑控制閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
  27. 如請求項26所述的微流體設備，其包括包含第三凍幹試劑的貯存器，所述貯存器與所述至少一個第三試劑入口埠流體連通，其中所述至少一個第三試劑入口埠適於接收能夠使所述第三凍幹試劑再水化以產生用於輸送到所述第一過濾室的所述第三試劑的流體。
  28. 如請求項26所述的微流體設備，其包括：旁通通道，其將所述第三試劑入口埠流體連接至所述第一過濾室的所述下游端和所述第二過濾室的所述上游端；以及旁通閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第一過濾室的所述下游端以及所述第二過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
  29. 如請求項24所述的微流體設備，其包括：至少一個第三試劑入口埠，其與所述第一過濾室的所述下游端以及所述第二過濾室的所述上游端流體連通，所述至少一個所述第三試劑入口埠適於向所述第二過濾室輸送第三試劑；以及至少一個第三試劑控制閥，其適於控制從所述第三試劑入口埠流向所述第二過濾室的所述上游端的所述第三試劑流。
  30. 如請求項1所述的微流體設備，其通過卷到卷工藝由層壓聚合物片材形成。
  31. 如請求項1所述的微流體設備，其由鑄塑聚合物材料形成。
  32. 如請求項1所述的微流體設備，其通過注射成型形成。
  33. 一種濃縮細菌用於檢測的方法，其包括： 將含有在載體流體中的目標細菌的流體樣品引入微流體設備的樣品入口埠中； 將載體流體抽吸通過所述微流體設備的第一過濾室中的第一過濾器並通過所述第一過濾室的下游的廢物埠，同時由所述第一過濾器捕獲所述目標細菌； 從第一試劑入口埠將包含用於所述目標細菌的生長培養基的第一試劑抽吸到所述第一過濾室內； 在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期； 將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲； 將包含對所述目標細菌有特異性的噬菌體的第二試劑從第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內； 在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育第二培育期，所述第二培育期足以通過所述目標細菌產生報告酶的表達； 將含有所表達的所述報告酶的流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的第二過濾室中的第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶；以及 在所述第二過濾室內用第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育第三培育期，所述第三培育期足以在檢測室中產生可檢測的信號。
  34. 如請求項33所述的方法，其中含有所表達的所述報告酶的所述流體包含所述第三試劑，其中將所述第三試劑從第三試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內。
  35. 如請求項33所述的方法，其中含有所表達的所述報告酶的所述流體包含所述第二試劑，並且其中將所述第三試劑從第三試劑入口埠抽吸到所述第二過濾室內。
  36. 如請求項33所述的方法，其包括用發光計檢測所述可檢測信號。
  37. 如請求項33所述的方法，其中所述流體樣品是水樣品。
  38. 如請求項33所述的方法，其中所述目標細菌是大腸桿菌（Escherichia coli ）。
  39. 如請求項33所述的方法，其中所述目標細菌是大腸型細菌。
  40. 如請求項33的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生化學發光信號。
  41. 如請求項33所述的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生螢光信號。
  42. 如請求項33所述的方法，其中用所述第三試劑培育所表達的所述報告酶產生比色信號。
  43. 如請求項33所述的方法，其中所述報告酶具有纖維素結合結構域。
  44. 如請求項33所述的方法，其中所述可檢測信號對應於由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶的量。
  45. 如請求項33所述的方法，其中所述第一培育期持續約2小時。
  46. 如請求項33所述的方法，其中所述第一培育期持續介於約1.5小時和約2.5小時之間。
  47. 如請求項33所述的方法，其中所述第一培育期在約37攝氏度下進行。
  48. 如請求項33所述的方法，其中所述第一培育期在約25攝氏度和約45攝氏度之間進行。
  49. 如請求項33所述的方法，其中所述第二培育期持續約1小時。
  50. 如請求項33所述的方法，其中所述第二培育期持續介於約0.5小時和約2小時之間。
  51. 如請求項33所述的方法，其中所述第二培育期在約37攝氏度下進行。
  52. 如請求項33所述的方法，其中所述第二培育期在約25攝氏度和約45攝氏度之間進行。
  53. 如請求項33所述的方法，其中將所述載體流體抽吸通過所述微流體設備的所述第一過濾室中的所述第一過濾器並通過所述第一過濾室的下游的所述廢物埠，同時由所述第一過濾器捕獲所述目標細菌包括：打開所述樣品入口埠和所述過濾室之間的樣品控制閥，打開所述過濾室的下游的廢物控制閥，並在所述過濾室的下游的所述廢物埠處施加負壓。
  54. 如請求項33所述的方法，其包括將所述第一試劑、所述第二試劑和所述第三試劑中的至少一種抽吸通過所述廢物埠並進入廢物貯存器。
  55. 如請求項33所述的方法，其包括將所述第一試劑、所述第二試劑和所述第三試劑中的至少一種抽吸通過所述廢物埠並進入試劑貯存器中。
  56. 如請求項33所述的方法，其中從所述第一試劑入口埠將包含用於所述目標細菌的生長培養基的所述第一試劑抽吸到所述過濾室內包括：關閉所述樣品控制閥和廢物控制閥，打開在所述第一試劑入口埠和所述過濾室之間的第一試劑控制閥，打開在所述過濾室和排放出口之間的排放控制閥，並向所述排放出口施加負壓。
  57. 如請求項33所述的方法，其中所述第一試劑包括Luria-Bertani培養基。
  58. 如請求項33所述的方法，其中在所述第一過濾室內用所述第一試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育足以增加所述目標細菌的代謝活性或細胞數中的至少一者的第一培育期包括：關閉第一試劑控制閥和排放控制閥。
  59. 如請求項33所述的方法，其中，將所述第一試劑抽吸通過所述第一過濾器並通過所述廢物埠，同時將所述目標細菌保持被所述第一過濾器捕獲包括：打開排放控制閥和廢物控制閥並在所述廢物埠處施加負壓。
  60. 如請求項33所述的方法，其中所述噬菌體包括工程化的報告噬菌體。
  61. 如請求項33所述的方法，其中所述噬菌體包括對所述目標細菌有特異性的報告噬菌體。
  62. 如請求項33所述的方法，其中所述噬菌體適於裂解所述目標細菌以釋放報告酶。
  63. 如請求項33所述的方法，其中所述第二試劑包括含有報告噬菌體混合物的流體。
  64. 如請求項33所述的方法，其中所述第二試劑包括含有報告酶的流體。
  65. 如請求項33所述的方法，其中所述第二試劑包括T7-NanoLuc®-纖維素結合模組。
  66. 如請求項33所述的方法，其中將包含對所述目標細菌有特異性的所述噬菌體的所述第二試劑從所述第二試劑入口埠抽吸到所述第一過濾室內包括：關閉廢物控制閥，打開在所述第二試劑入口埠和所述第一過濾室之間的第二試劑控制閥，並向所述排放出口施加負壓。
  67. 如請求項33所述的方法，其中在所述第一過濾室內用所述第二試劑將由所述第一過濾器捕獲的所述目標細菌培育包括：關閉第二試劑控制閥和排放控制閥。
  68. 如請求項34所述的方法，其中將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的所述第二過濾室中的所述第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶包括：打開在第三試劑入口埠和所述第一過濾室之間的第三試劑控制閥，打開所述第一過濾室的下游的檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓，其中所述第二過濾室流體連接在所述檢測室控制閥和所述廢物埠之間。
  69. 如請求項33所述的方法，其中在所述第二過濾室內用所述第三試劑將由所述第二過濾器捕獲的所表達的所述報告酶培育所述第三培育期包括：關閉所述第三試劑控制閥和所述檢測室控制閥。
  70. 如請求項35所述的方法，其包括：將含有所表達的所述報告酶的所述流體抽吸通過所述第一過濾器、通過所述微流體設備的所述第二過濾室中的所述第二過濾器並通過所述廢物埠，同時通過所述第二過濾器捕獲所表達的所述報告酶通過以下方式進行：打開所述第一過濾室的上游的排放控制閥，打開流體連接在所述第一過濾室的所述下游端和所述第二過濾室的上游端之間的檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓，其中所述第二過濾室被流體連接在所述檢測室控制閥和所述廢物埠之間；以及在所述第三培育期之前，將所述第三試劑抽吸到所述第二過濾室內通過以下方式進行：關閉所述第一過濾室的上游的所述排放口，打開流體連接在第三試劑入口埠和所述第一過濾室的下游端之間的第三試劑控制閥，打開檢測室控制閥，並在所述廢物埠處施加負壓。
  71. 一種用於細菌檢測的微流體設備，其包括： 用於接收含有目標細菌的流體樣品的樣品入口埠； 包含第一過濾器的第一過濾室，所述第一過濾器適於從所述流體樣品中捕獲目標細菌； 第一微流體裝置，其用於將細菌生長培養基引入所述第一過濾室； 第二微流體裝置，其用於將對所述目標細菌有特異性的噬菌體引入所述第一過濾室，所述噬菌體適於使所述目標細菌產生能夠反應以產生可檢測信號的反應性物質； 第三微流體裝置，其用於從所述第一過濾室沖洗反應性物質，所述反應性物質響應於所述噬菌體的引入從所述目標細菌釋放；和 包括第二過濾器的第二過濾室，所述第二過濾器用於特定地捕獲從所述第一過濾室沖洗掉的所述反應性材料，其中所述第二過濾器小於所述第一過濾器以放大所述可檢測信號； 其中所述第一過濾器適於不捕獲所述反應性材料。
  72. 如請求項71所述的微流體設備，其包括用於裂解所述目標細菌以釋放所述反應性材料的裂解裝置。
  73. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括加熱裝置。
  74. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括聲學裝置。
  75. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括壓力源。
  76. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括試劑源。
  77. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述裂解裝置包括酶源。
  78. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括含有凍幹試劑的貯存器。
  79. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括用於與外部流體源連接的埠。
  80. 如請求項72所述的微流體設備，其中所述第一微流體裝置、所述第二微流體裝置和所述第三微流體裝置中的至少一個包括至少一個微通道和至少一個閥。
  81. 如請求項80所述的微流體設備，其中，所述至少一個閥包括至少一個氣動致動閥和適於連接到壓力源的至少一個空氣通道。
  82. 如請求項80所述的微流體設備，其包括位於所述至少一個閥的下游的至少一個負壓源。
  83. 如請求項82所述的微流體設備，其中，所述至少一個負壓源位於第一過濾室的下游。
  84. 如請求項71所述的微流體設備，其中所述第一過濾器包括孔徑為約0.45μm的多孔非纖維素材料，並且其中所述第二過濾器包括基於纖維素的材料。
  85. 如請求項71所述的微流體設備，其中所述第二過濾室包括檢測區，所述檢測區被配置成使得能夠從所述微流體設備的外部檢測所述可檢測的信號。
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TWI751736B (zh) * 2020-10-14 2022-01-01 洛科儀器股份有限公司 樣品濃縮機

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