CN107988046A - 基于lamp的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层、反应层和支撑层；进样层包括进样层Ⅰ、防蒸发膜和进样层Ⅱ，所述的进样层中心设有进样口，进样层Ⅱ设有若干进样通道；反应层内设有若干反应室，圆形滤纸片设在反应室内；进样层Ⅰ、进样层Ⅱ和反应层为PDMS材料；以及微流控芯片在病原菌检测方面的应用；本发明优点在于：将微流控芯片技术与LAMP技术相结合，克服了传统LAMP反应难以进行多目标物同时检测的劣势；利用PDMS材料高气溶性的特质，实现了不借助任何仪器的自动进样，避免了手工进样引起的操作误差，简化了芯片的操作步骤；实现多重病原菌同时检测。

Description

基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片
技术领域
本发明属微生物检测领域，尤其涉及一种基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片及检测方法。
背景技术
病原菌性疾病时刻威胁着人类的健康。实现高效、准确地病原菌检测是控制该类疾病的关键所在。
目前，国内乃至国际上多采用的检测手段是平板培养法或聚合酶链式反应法（Polymerase Chain Reaction，PCR），但是由于耗时较长、依赖于仪器等特点，使其难以满足即时检测（Point of care testing）的要求。环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）是近年来兴起的核酸等温扩增技术。在无需传统PCR方法的热循环的前提下，LAMP能够实现目标序列的快速指数级扩增。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点；该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。但LAMP尚未尽善尽美。在LAMP反应中，针对每一个目标序列，需要4-6条与之匹配的引物才能完成反应。因而，在针对多种目标序列的LAMP反应中，反应体系内往往含有十余条引物。复杂引物间的非特异性杂交极大干扰了检测的准确度。这意味着单纯的LAMP技术难以实现多重病原菌同时检测。
为解决这一问题，许多研究将微流控芯片（Microfluidic chip）与LAMP技术结合起来。微流控芯片技术的引入不仅能够将针对每一个目标序列的LAMP反应分割成独立单元，而且实现了小型化，便携化。但目前存在的此类芯片往往需要反应液的手动注入，这极易造成操作误差，进而影响检测结果。一种基于PDMS材料高气溶性的自动进样方式为此提供了新的思路。在真空环境下，溶解于PMDS芯片中的气体能够被抽出。当芯片重新放置于正常大气压下，气体会重新溶入PDMS中。这个过程会产生较强的吸力，从而实现反应液的自动注入。而且气体溶回PDMS的过程会持续较长时间，足够反应液的完全注入。这种自吸式进样方式操作简单，且不需借助任何仪器，十分适用于在基层单位和缺乏专业人员的欠发达地区推广使用。目前，这一方法尚未被结合于基于LAMP的多通道病原菌检测微流控芯片。
发明内容
本发明目的是提供基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片及检测方法。
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层1、反应层2和支撑层3；
进样层1包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜8和进样层Ⅱ（13），所述的进样层1中心设有进样口4，进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道5；
反应层2内设有若干反应室6，圆形滤纸片7设在反应室6内；
进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层2为PDMS材料；
进样口4通过进样通道5与反应室6相通；
进样层1上设有封闭膜9；
防蒸发膜8为含氟聚合物Novec；
所述的进样通道5长3~5mm、宽200μm、高115μm；进样层1厚度约1.5mm，进样口的直径1mm，芯片尺寸为20×20×2.5mm3；
所述的封闭膜9为胶带；支撑层3为玻璃；
所述的反应室6为2-8个。
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片制备方法：
1）进样层的制备
加工进样通道的阳模，在该阳模上浇注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注PDMS，固化；将上述复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，制得进样层；
2)反应层的制备
在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反应室，将圆形滤纸片裁剪成放于其中；
3)芯片的组装
将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连。
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，它包括：
1）将引物滴加到圆形滤纸片7上，晾干；放入反应室6中；组装芯片；
2）使用封闭膜9密封进样口4；将芯片置于真空干燥机中，除气；
3）使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入封闭膜9，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用封闭膜9封闭进样口4；
4）处理后的芯片放置在加热板上，60-70℃恒温反应0.5-2小时。
所述的芯片为权利要求1所述的微流控芯片；
所述的引物为6条对应金黄色葡萄球菌SA特征序列的LAMP引物，
F3-nuc：TGGCTATCAGTAATGTTTCGA
B3-nuc：TTAATTAATGTCGCAGGTTCTT
LF-nuc：GTTAACACTAAGCAACTAG
LB-nuc：CGGCGTAAATAGAAGTGATTCTGAA
FIP-nuc：GAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGC
BIP-nuc：GCAAATGCATCACAAACAGGTAATTTTAGTTGAAGTTGCACTGTA；
所述的引物为6条对应副溶血性弧菌VP特征序列的LAMP引物，
F3-tlh：AGCTACTCGAAAGATGATCC
B3-tlh：GGTTGTATGAGAAGCGATTG
LF-tlh：ACCAGTAGCCGTCAATG
LB-tlh：TTAGATTTGGCGAACGAGA
FIP-tlh：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT
BIP-tlh：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG；
LAMP反应液为：8μL，含有如下成分：0.8M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，1.6 μL样品DNA提取液。
本发明提供了基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层1、反应层2和支撑层3；进样层1包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜8和进样层Ⅱ（13），所述的进样层1中心设有进样口4，进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道5；反应层2内设有若干反应室6，圆形滤纸片7设在反应室6内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层2为PDMS材料；进样口4通过进样通道5与反应室6相通；进样层1上设有封闭膜9；防蒸发膜8为含氟聚合物Novec；以及微流控芯片在病原菌检测方面的应用；本发明优点在于：将微流控芯片技术与LAMP技术相结合，克服了传统LAMP反应难以进行多目标物同时检测的劣势；利用PDMS材料高气溶性的特质，实现了不借助任何仪器的自动进样，避免了手工进样引起的操作误差，简化了芯片的操作步骤；实现多重病原菌同时检测。
附图说明
图1 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的立体示意图（以三通道芯片为例）；
图2基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的实物图（三通道芯片）；
图3 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的爆炸图（三通道芯片）；
图4 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的进样层的爆炸图（三通道芯片）；
图5 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的剖视示视图（四通道芯片）。
1、进样层；2、反应层；3、支撑层；4、进样口；5、进样通道；6、反应室；7、圆形滤纸片；8、防蒸发膜；9、封闭膜；11、进样层Ⅰ；13、进样层Ⅱ。
具体实施方式
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus，VP）是常见病原菌。因而以检测SA和VP为例，对本发明的具体实施方式作进一步的描述。
实施例1 SA和VP特征核酸序列的选择及对应LAMP引物的设计与筛选
根据种属特异性，SA的nuc基因中300bp保守核酸片段和VP的tlh基因中400bp保守核酸片段被选择为各自的特征序列。6条对应SA特征序列的LAMP引物（F3-nuc、B3-nuc、LF-nuc、LB-nuc、FIP-nuc、BIP-nuc）运用计算机软件自行设计；6条对应VP特征序列的引物（F3-tlh、B3-tlh、LF-tlh、LB-tlh、FIP-tlh、BIP-tlh）根据文献查阅获得（Yamazaki, W.,Ishibashi, M., Kawahara, R., Inoue, K., 2008. BMC Microbiol. 8, 163.）。所有的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成。特征序列及引物序列如表1所示。
表1. 特征序列及引物序列列表
实施例2 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的制备
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片立体示意图如图1所示，实物图如图2所示，爆炸图如图3所示，该芯片由上至下包括进样层1、反应层2和支撑层3；所述的进样层1包括进样口4、进样通道5和纳米级防蒸发膜8；所述的反应层2内包括反应室6和圆形滤纸片7；
所述的进样层1中，进样通道5位于该层底部，一端汇聚于进样口4，另一端与反应室6连通；进样通道5于进样层1内有三面通道壁，底部镂空；当进样层1与反应层2封接后，进样通道5除与进样口4和反应室6相通的两端外，其余部分形成闭合通道；纳米级防蒸发膜8位于进样层1内，进样通道5上方；
所述的反应层2中，圆形滤纸片7上载有待检测病原菌核酸序列对应引物，被放置于反应室6底部；反应室6与进样通道5末端对应后，反应层2一面与进样层1的进样通道5侧封接，另一面与支撑层3封接；封合后，反应室6除与进样通道5连通外，其余部分形成闭合腔室。
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它是由下述方法制备的：
1、进样层的制备
使用软光刻技术加工进样层中进样通道的阳模，在该阳模上浇注少量PDMS，进样通道长3~5mm、宽200μm、高115μm；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec EGC-1720形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注较厚PDMS，固化；将上述复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，形成直径1mm的进样口，制得进样层，该层厚度约1.5mm（爆炸图如图4所示）。
2、反应层的制备
在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，小心揭下；在合适的位置打孔，形成直径为3mm的反应室，将Whatman #1圆形滤纸片裁剪成直径3mm的圆形放于其中；使用去核酸酶水溶解引物至如下工作浓度：F3（3.75μM）、B3（3.75μM）、LF（7.5μM）、LB（7.5μM）、FIP（30μM）、BIP（30μM）；将这6种配套的引物等体积充分混合后，取1.92μL引物混合液滴加于反应室内的圆形滤纸片上；滴加有对应SA特征序列的LAMP引物的反应室标记为SA-primer室，滴加有对应VP特征序列的LAMP引物的反应室标记为VP-primer室，滴加去核酸酶水的反应室作为阴性对照（negative control），标记为NC室；晾干后，制得反应层，厚度约1.5mm。
3、芯片的组装
将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连；制得的芯片即为基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片；芯片尺寸约为20×20×2.5mm3；剖视示意图见图5。
实施例3 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的SA质粒模板检测
1、LAMP反应液的配置
每8μL LAMP反应液含有如下成分：0.8M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，430 copies/ μL 含有SA特征序列的质粒模板；若芯片上有N个反应室，则配置8×NμL反应液。
2、芯片的除气
使用透明胶带将制作好的芯片的进样口密封；将芯片置于真空干燥机中，10kPa气压下除气1小时。
3、自吸式进样
使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入上述步骤处理过的芯片的进样口，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用透明胶带封闭进样口。
4、LAMP 反应
将上述步骤处理后的芯片放置在加热板上，63℃恒温反应1小时。
5、结果读取
基于本实例中使用的荧光染料（SYBR Green I-羟基萘酚蓝复合染料）性质，反应结果在波长425nm的蓝光激发下判读；阴性反应发出橘红色荧光，阳性结果发出绿色荧光；结果如表2所示，SA质粒模板只有在载有匹配的LAMP引物的反应室内，即实施例2中所述的SA-primer室内，才会出现阳性扩增反应，发出绿色荧光；其他反应室内，即实施例2中所述的VP-primer室和NC室内，均未方发生扩增反应，因而发出橘红色荧光。未见假阳性和假阴性结果，说明所述检测方法特异性强。
表2. 对SA质粒模板的特异性检测结果
。
实施例4 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的VP质粒模板检测
1、LAMP反应液的配置
每8 μL LAMP反应液含有如下成分：0.8 M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，418 copies/ μL 含有VP特征序列的质粒模板。
2、芯片的除气
使用透明胶带将制作好的芯片的进样口密封；将芯片置于真空干燥机中，10kPa气压下除气1小时。
3、自吸式进样
使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入上述步骤处理过的芯片的进样口，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用透明胶带封闭进样口。
4、LAMP 反应
将上述步骤处理后的芯片放置在加热板上，63℃恒温反应1小时。
5、结果读取
基于本实例中使用的荧光染料（SYBR Green I-羟基萘酚蓝复合染料）性质，反应结果在波长425nm的蓝光激发下判读；阴性反应发出橘红色荧光，阳性结果发出绿色荧光；结果如表3所示，VP质粒模板也只有在载有匹配的LAMP引物的反应室内，即实施例2中所述的VP-primer室内，才会出现阳性扩增反应，发出绿色荧光，其他反应室内，即实施例2中所述的SA-primer室和NC室内，均未方发生扩增反应，因而发出橘红色荧光。未见假阳性和假阴性结果，证实所述方法特异性强。
。
实施例5 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的SA质粒模板和VP质粒模板同时检测
1、LAMP反应液的配置
每8 μL LAMP反应液含有如下成分：0.8 M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，430 copies/ μL 含有SA特征序列的质粒模板，418 copies/ μL 含有VP特征序列的质粒模板。
2、芯片的除气
使用透明胶带将制作好的芯片的进样口密封；将芯片置于真空干燥机中，10kPa气压下除气1小时。
3、自吸式进样
使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入上述步骤处理过的芯片的进样口，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用透明胶带封闭进样口。
4、LAMP 反应
将上述步骤处理后的芯片放置在加热板上，63℃恒温反应1小时。
5、结果读取
基于本实例中使用的荧光染料（SYBR Green I-羟基萘酚蓝复合染料）性质，反应结果在波长425nm的蓝光激发下判读；阴性反应发出橘红色荧光，阳性结果发出绿色荧光；结果如表4所示，未出现假阳性和假阴性，说明本发明所述芯片及操作方法可以实现双重病原菌质粒模板同时检测。
表4. 对SA、VP质粒模板的同时检测结果
。
实施例6 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的食品污染模拟样品检测
1、食品污染模拟样品制备
取新鲜虾肉捣成虾糜，置于紫外消毒灯下2小时，以去除虾肉中自然蓄积的病原菌干扰。取5g灭菌后的虾糜，加入50 mL 碱性胨水充分混匀，制成食品样品基质。将SA和VP接种于该基质，使它们的终浓度均为1000 CFU/ mL。提取上述模拟样品DNA，用于后续检测。
2、LAMP反应液的配置
每8 μL LAMP反应液含有如下成分：0.8 M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，1.6 μL 步骤一中所述DNA提取液。
3、芯片的除气
使用透明胶带将制作好的芯片的进样口密封；将芯片置于真空干燥机中，10kPa气压下除气1小时。
4、自吸式进样
使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入上述步骤处理过的芯片的进样口，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用透明胶带封闭进样口。
5、LAMP 反应
将上述步骤处理后的芯片放置在加热板上，63℃恒温反应1小时。
6、结果读取
基于本实例中使用的荧光染料（SYBR Green I-羟基萘酚蓝复合染料）性质，反应结果在波长425nm的蓝光激发下判读；阴性反应发出橘红色荧光，阳性结果发出绿色荧光；结果如表5所示，未出现假阳性和假阴性，说明本发明所述芯片及操作方法可以实现在实际样品中的双重病原菌同时检测，且结果准确，稳定性好。
表5. 对食品污染模拟样品中SA、VP的同时检测结果
。

Claims (9)

1. 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层（1）、反应层（2）和支撑层（3）；进样层（1）包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜（8）和进样层Ⅱ（13），所述的进样层（1）中心设有进样口（4），进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道（5）；反应层（2）内设有若干反应室（6），圆形滤纸片（7）设在反应室（6）内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层（2）为PDMS材料；进样口（4）通过进样通道（5）与反应室（6）相通；进样层（1）上设有封闭膜（9）。
2.根据权利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：防蒸发膜（8）为含氟聚合物Novec。
3.根据权利要求2所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的封闭膜（9）为胶带；支撑层（3）为玻璃。
4.根据权利要求1、2或3所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的反应室（6）为2-8个。
5.根据权利要求4所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的进样通道（5）长3~5mm、宽200μm、高115μm；进样层（1）厚度约1.5mm，进样口（4）的直径1mm，芯片尺寸为20×20×2.5mm3。
6.基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片制备方法：
1）进样层的制备
加工进样通道的阳模，在该阳模上浇注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注PDMS，固化；将上述复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，制得进样层；
2)反应层的制备
在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反应室，将圆形滤纸片裁剪成放于其中；
3)芯片的组装
将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连。
7.基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，它包括：
1）将引物滴加到圆形滤纸片（7）上，晾干；放入反应室（6）中；组装芯片；
2）使用封闭膜（9）密封进样口（4）；将芯片置于真空干燥机中，除气；
3）使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入封闭膜（9），在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用封闭膜（9）封闭进样口（4）；
4）处理后的芯片放置在加热板上，60-70℃恒温反应0.5-2小时。
8.根据权利要求7所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，其特征在于：所述的芯片为权利要求1所述的微流控芯片。
9. 根据权利要求8所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，其特征在于：所述的LAMP反应液为8μL，含有如下成分：0.8M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，1.6 μL样品DNA提取液；
所述的引物为对应金黄色葡萄球菌SA特征序列的LAMP引物：
F3-nuc：TGGCTATCAGTAATGTTTCGA
B3-nuc：TTAATTAATGTCGCAGGTTCTT
LF-nuc：GTTAACACTAAGCAACTAG
LB-nuc：CGGCGTAAATAGAAGTGATTCTGAA
FIP-nuc：GAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGC
BIP-nuc：GCAAATGCATCACAAACAGGTAATTTTAGTTGAAGTTGCACTGTA；
或对应副溶血性弧菌VP特征序列的LAMP引物，
F3-tlh：AGCTACTCGAAAGATGATCC
B3-tlh：GGTTGTATGAGAAGCGATTG
LF-tlh：ACCAGTAGCCGTCAATG
LB-tlh：TTAGATTTGGCGAACGAGA
FIP-tlh：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT
BIP-tlh：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG。
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