CN104877900A - 用于致病微生物高通量快速检测的微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学检测分析技术领域,涉及一种针对多种致病微生物的高通量快速检测微流控芯片及其制备方法。该芯片以光学透明的聚二甲基硅氧烷为材料,采用模塑法制造,芯片内含有样品反应液微通道和半球形LAMP扩增微反应室,每个微反应室内分别固定针对不同病原微生物的特异性引物,可以实现一次针对多种微生物的并行分析。本发明具有高通量、速度快、价格低、便携性强和制造简单的特点,可用于在医疗卫生检测工作中对微生物的现场快速分析。
Description
技术领域
本发明属于医疗卫生检测技术领域,涉及一种可以同时针对多种病原微生物进行高通量快速检测分析的微流控芯片,并提供了该芯片制备方法。
背景技术
公共场所存在的病原微生物会造成各种疾病在人群中传播和扩散。随着我国城市化进程的不断加快,人流密集的城市公共场为病原微生物的滋生提供了条件,很多传染性疾病具有较强的隐蔽性,危害很大,对公民健康造成了严重威胁。因此,开发快速检测致病微生物的新技术,对于保障我国公共卫生安全具有重要的现实意义。对于我国公共卫生监测部门来说,能够快速检测出这些病原微生物,并向公众提出流行性疾病的预警信息,是极为重要的一项工作内容。但是,受限到传统检测技术的限制,目前尚缺乏对公共场所病原微生物的快速检测方法,监测结果缺乏时效性。尤其是在偏远地区,此类快速检测更是难以开展。
目前,针对致病微生物的主流检测方法主要有:(1)培养镜检法,即通过样本的采集并使用不同的选择性培养基进行扩繁,再挑取培养基上的菌落进行显微镜下分析。但该方法需要研究人员有极其丰富的经验,耗时较长,培养所需的时间往往从数天到数周,工作效率很低。(2)免疫分析法,即通过免疫高等动物,产生相应的特异性抗体,再利用抗体和抗原的特异性识别反应来捕获待测物,但传统的酶联免疫法(ELISA)或免疫荧光法(IFA/DFA)的分析耗时较长,且受到抗体供应的限制,对于大量尚无商业化抗体的微生物则无法检测到。(3)分子生物学检测法,包括实时定量PCR和DNA微阵列技术等,都是利用了特异性核酸探针,可以准确地鉴定目标微生物,且具有灵敏度高和快速方便的特点,也是目前常用的检测手段,但往往依赖庞大昂贵的设备和专业的操作人员。因此,当前在针对致病微生物的实际卫生检测工作中,存在的一个严重问题是:在现场采集样品后,依据现有的分析技术均无法快速得出结果,往往需要送到省会城市的实验室进行分析测试,不但需要耗时数天乃至数周,而且价格昂贵,不利于卫生执法工作的现场开展。因此亟需一种具有便携、快速和低成本特性的检测技术,能够在现场得出结果。近年来世界卫生组织(WHO)也开始提倡建立一种新的快速诊断概念:现场快速检测(Point-of-care test,POCT),即便携性强、成本低廉、样本需求量低和操作简单,目标是在现场快速得出诊断结论。POCT的实现则依赖于将传统的免疫学和分子生物学等分析方法在新的技术平台上加以改进和整合。
因此,未来的技术发展主要集中在检测仪器的微型化、便携性和高通量上。当前的微生物检测的发展趋势是:(1)便携性强,以满足现场快速布置的需要;(2)检测通量高,以满足针对多种微生物并行分析的需要;(3)制造简单且成本低,以满足大范围普及应用的需要。
仪器设备的微型化集中体现在微流控芯片技术平台,该技术在医学、生物和环境检测分析领域有着巨大的应用潜力,以微流控芯片为基础的微型生物分析仪和传感器是未来公共卫生快速检测技术的一大发展趋势。
微流控芯片技术,或称微机电技术(MEMS),兴起于上世纪末期,该技术集成了生物学、化学、医学、微机电和微加工技术,通过在聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、单晶硅和玻璃等材料上构建精密尺寸的微管道、阀门和腔室,由于芯片内部管道和腔室的尺寸通常在微米甚至纳米尺度,因此反应所需的样本量和试剂消耗量都极低(比常规检测方法降低数倍至数百倍),适合于对稀少样本的检测。试剂和样本的消耗量可比常规方法降低数十倍。此外,微小体系中的流体具有很多新的特性,例如芯片内的化学反应速率往往比常规反应高一至两个数量级,很多常规方法需要数小时的反应,在芯片内部仅需数分钟或数秒钟。可见,微流控芯片是一种能将传统检验分析技术微缩化的新型平台,这些芯片的体积往往只有数平方厘米,重量约数十克,特别便于携带,适合于现场快速检测分析、现场得出结果。
相比于常规技术,微流控芯片的优势主要有:
(1)体积小。微型化的反应单元所需的试剂和样品消耗量很低,能够极大地降低成本;同时,微小的芯片便于携带,有利于现场检测的应用;
(2)成本低。芯片聚合物材料成本低廉,且应用模板技术制造,适合大规模生产;
(3)速度快。在微流控芯片中进行微升乃至纳升级的生物化学反应,传质和传热效率更高,分子碰撞的概率更大,反应速度更快;
(4)集成化和自动化程度高。通过微加工技术,可以方便地在芯片内整合多个反应单元,从而有利于实现高通量并行检测;
(5)兼容性好。易于与其它分析技术,如微电极、生物传感器技术相整合。
可见,以微流控芯片技术为基础的微型且快速高效的生物医学检测设备,不但可以替代昂贵的常规仪器,而且具有更高的检测灵敏度,更有利于简化繁琐的操作步骤。以核酸作为检测对象的环介导恒温扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下对目标DNA进行109-1010倍扩增。在微流控芯片内部进行微小体系的LAMP扩增反应,不但对样品的需求量极低(通常为微升或纳升),而且往往可以在一个小时内完成从样品的采集到检测结果的得出。如果将LAMP扩增技术与微流控芯片技术相融合,进而开发出一种新型微生物检测分析系统,则具有速度快、消耗低和便携性强的优势,可以满足现场快速检测的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高通量、便携低价和制造简单的特点的用于对多种病原微生物(可针对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克莱伯氏杆菌和克氏柠檬酸杆菌等)并行检测的微流控芯片,并提供该芯片的制备方法。
本发明提供一种基于LAMP扩增原理的高通量微生物检测芯片,以光学透明材料为基材,由样品流动管道和半球形LAMP扩增反应室组成。
上述微流控芯片含有五条样品流动管道(宽度为200μm,深度为30μm,长度为2cm),并汇聚于芯片的中心进样孔;每条样品流动管道均分别与一个半球形的微腔室(半径为1mm)相连接。
本发明中微流控芯片的基材为光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。
本发明的样品进液管道及LAMP扩增微室的个数可由实际情况确定,可根据实际需求增加或减少管道和扩增微室的数量。
本发明的半球形LAMP扩增微室可以极大减少气泡的产生。此外,半球形LAMP扩增微室的制备方法非常简单且成本低廉。
整个系统的硬件控制部分包括计算机、操作系统(数控界面和集成化微流控芯片)以及数据采集和数据分析部分(计算机)。
本发明提供上述微流控芯片的制备方法:
(1)基片制备:利用Prianha溶液对单晶硅片进行清洗,用氮气吹干后采用AZ-50XT系列正光刻胶经旋涂机甩涂后,在恒温加热板上烘烤固化;
(2)曝光和烘焙:将设计好的样品通道层和阀门控制层掩膜板分别置于硅片表面,利用紫外曝光机进行曝光;
(3)显影:将硅片置于显影液中显影,再利用去离子水清洗干净,氮气吹干;
(4)软烘:在加热板上缓慢加热固定;
(5)浇注:将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在5:1至20:1混匀,分别倾倒在硅基模具上,在烘箱内固化、剥离;
(6)键合:将样品通道层和阀门控制层两层PDMS芯片校准后进行键合,再与基片层键合,并进行高温烘焙,从而完成芯片的构建。
本发明的微流控芯片可以用于针对五种微生物的并行检测,其方法是将微生物样本通过位于芯片中央的进样孔注入芯片,样品分散进入五条样品流通管道,并分别进入和充满事先固定有特异性引物的半球形扩增微室;将芯片置于聚酰亚胺加热膜上方,在63℃反应35分钟后,可进行结果读取。
该芯片可内置或外接专用的微泵和微阀,精确控制进样和扩增反应过程;利用光敏器件阵列进行光学数据采集,并传至微处理器中与数据库相比较,从而分析样品所含的微生物浓度。
本发明的微流控芯片能够快速高通量地检测五种致病微生物,芯片体积小,便于携带,制造简单,且易于与其它微型快速检测装置兼容,利于现场快速检测的应用。
附图说明
附图本发明的微流控芯片设计图。
图中:1引物溶液进样孔;2半球形LAMP扩增微室;3样品溶解进样孔;4阀门控制层;5阀门控制层管道进气孔。
具体实施方式
1.基片制备:将单晶硅片置于Piranha溶液(98%浓硫酸:30%双氧水=7:3,体积比),煮沸清洗15分钟。用去离子水清洗5次,再用氮气吹干硅片表面,置于200℃烘焙30分钟。
2.甩涂:将AZ-50XT系列正光胶倾倒在硅片表面中央位置,倾斜硅片边缘,使得正光胶覆盖硅片的大部分区域,静置10分钟后,用旋涂机(Spin-Coatemr KW-4A型)进行2000转/分钟甩涂1分钟。
3.软烘:将甩涂后的硅片置于恒温加热板上进行烘烤,在65℃、115℃和65℃温度下分别静置1分钟、4分钟和1分钟。
4.曝光:将掩膜置于硅片表面固化后的正光胶表面,利用紫外曝光机进行曝光(曝光波长365nm)。
5.显影:将硅片置于正光胶显影液中,静置10分钟,之后用水清洗干净,氮气吹干。
6.半球形微室阳模:将半径为1mm的金属半球粘在单晶硅片表面的对应位置,作为半球形LAMP反应微室的阳模。
7.通道层构建:PDMS单体及固化剂按照5:1的比例混合均匀,用真空泵除去其中的气泡,分别倾倒在经过三甲基氯硅烷处理后的样品通道和扩增微室的硅片模具上,在恒温加热器上于80℃进行烘烤固化,形成反应微通道层。
8.控制层构建:在硅片上甩涂SU-82025系列负光胶,采用PDMS单体与固化剂20:1的比例混匀,在旋涂机上以2000转/分钟的速度甩涂1分钟,经过紫外曝光和显影后,形成硅基阳模,于120℃烘焙30分钟使其固化。将阳模置于三甲基硅氧烷熏蒸5分钟,使其表面硅烷化。
9.键合:将固化后的两层PDMS分别与硅片模具剥离,在微通道层进行打孔后,将通道层和控制层对合,再与玻璃基片贴合,80℃过夜固化,可形成键合牢固的完整芯片。
单个LAMP反应微室的容积为2.09μL。
将样品溶液通过附图所示的3号孔注入芯片,并分散于五个半球形LAMP扩增微室,待微室充满后,通过5号孔控制阀门增加气压(不超过20psi),使得半球形反应微室的内侧和外侧均被阀门封闭(附图中标注为4号)。而后将芯片置于63℃并保持35分钟,进行LAMP扩增;反应产生的荧光信号被光敏器件阵列采集并传至微处理器中与数据库相比较,从而分析样品中的微生物含量。
Claims (4)
1.一种用于致病微生物高通量快速检测的微流控芯片,其特征在于,该微流控芯芯片由样品通道层、阀门控制层和基片层构成;其中,样品通道层中含有五个半径为1mm的半球形LAMP扩增微室,半球形LAMP扩增微室内分别通过蒸发法固定有针对不同病原微生物的特异性检测引物,以进行特异性扩增反应;阀门控制层含有气压控制阀门,以控制样品管道层的相关通道的开启和闭合;
样品通道层中,样品流通管道的宽度为200μm,深度为30μm,长度为1cm,为光滑平直的凹槽;所述样品流通管道与半球形扩增微室相连通,样品流通管道的一端是引物溶液进样孔,另一端是芯片中央的样品溶解进样孔;样品流通管道从分散进入LAMP反应微室;
微生物样本通过位于芯片中央的样品溶解进样孔注入芯片,分散进入五条样品流通管道,并分别进入和充满事先固定有特异性引物的五个独立的半球形LAMP扩增微室。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于所述的光学透明材料为弹性聚合物:聚二甲基硅氧烷。
3.权利要求1或2所述微流控芯片的制备方法,其特征在于采用模塑法进行芯片制造;具体步骤为:
(1)基片制备:利用Prianha溶液对单晶硅片进行清洗,用氮气吹干后采用AZ-50XT系列正光刻胶经旋涂机甩涂后,在恒温加热板上烘烤固化;
(2)曝光和烘焙:将设计好的样品通道层和阀门控制层掩膜板分别置于硅片表面,利用紫外曝光机进行曝光;
(3)显影:将硅片置于显影液中显影,再利用去离子水清洗干净,氮气吹干;
(4)软烘:在加热板上缓慢加热固定;
(5)浇注:将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在5:1至20:1混匀,分别倾倒在硅基模具上,在烘箱内固化、剥离;
(6)键合:将样品通道层和阀门控制层两层PDMS芯片校准后进行键合,再与基片层键合,并进行高温烘焙,从而完成芯片的构建。
4.权利要求1或2所述微流控芯片在微生物检测中的应用,其特征在于,将样品通过位于芯片中央的微孔进入芯片,样品分散进入五个独立的LAMP反应微室;经过63℃恒温扩增反应后,产生荧光信号;光信号的采集模块由紫外LED和荧光光敏器件阵列组成,并传至微处理器,与数据库中的标准曲线相比较,从而分析样品所含的微生物浓度。
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