CN112275335B - 一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法 - Google Patents

一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，属于芯片制备领域。该芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口。本发明还提供一种自吸阀区隔式芯片的制备方法。本发明还提供一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，可在10min内完成检测,变异系数小，最低检测浓度为46.8CFU/mL，加标回收率达到98.08％，灵敏度高，稳定性好。

Description

一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测 方法
技术领域
本发明属于芯片制备领域，具体涉及一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)为革兰氏阳性小杆菌，无芽孢，属兼性细胞内细菌，是导致食源性疾病爆发的最常见病原体之一。对理化因素抵抗力较强，常通过受污染的食物传播，如鸡蛋、果蔬、肉类和牛奶等。感染后能引起人、畜的李氏特菌病，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症。是最致命的食源性病原体之一，可造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌。此外，单核细胞增生李斯特菌不仅可以生存，而且还可以在冰箱中生长，这使食物储存和冷链运输变得困难。考虑到单核细胞增生李斯特氏菌对公共卫生的巨大威胁，迫切需要一种高度灵敏，特异的方法在食品中进行检测。
目前对单增李斯特菌的常见检测方法包括国家标准GB 4789.30-2016规定的传统分离培养鉴定法，分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。(1)传统分离培养鉴定法是单增李斯特菌检测的“金标准”，该方法计数可靠，可以准确的鉴定单增李斯特菌并确定其浓度，具有成本较低的优势，便于普及应用，但检测周期过长，一般需要一周左右，无法满足副溶血性弧菌快速、灵敏的检测要求；(2)分子生物学检测方法中，常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法应用最为广泛，该方法通过扩增目标菌的基因序列实现对致病菌的检测，具有高灵敏度和特异性，在一定程度上能够满足灵敏检测的要求，但该方法同样需要较长时间的前增菌过程，且所需仪器设备昂贵，检测成本高，易出现假阳性结果；(3)免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno SorbentAssay，ELISA)方法最为常见，该方法通过抗原与抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术实现对致病菌的检测，该方法与传统培养鉴定法相比提高了检测灵敏度和检测效率，但仍需要增菌和反复的孵育过程，检测步骤复杂，易出现交叉反应导致假阳性结果。因此，如何在短时间内实现对病原菌的灵敏检测，又不过分依赖设备就成为新一代检测技术发展的重点。
发明内容
本发明目的是提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，该芯片基于整体的负压环境及氧化石墨烯和FAM标记特异性适配体和HNB染料，能够快速、灵敏、简便地检测单增李斯特菌。
本发明首先提供一种自吸阀区隔式芯片，该芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口。
本发明首先提供一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，包括：
步骤一：模具的制备
使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的制作
使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片。
优选的是，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。
优选的是，所述步骤二中三甲基氯硅烷处理时间是10～20min。
优选的是，所述步骤二中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。
优选的是，所述步骤二中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是1500～2000rpm旋转1～2min。
优选的是，所述步骤二中烘烤固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
优选的是，所述步骤二中芯片加热固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
本发明还提供一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，包括：
步骤一：氧化石墨烯的制备
将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌，剧烈搅拌下，将高锰酸钾缓慢加入上述混合物，继续在30～40℃搅拌，然后加热至140～150℃搅拌，加入去离子水终止反应体系，在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋中透析2～3天去除盐分，得到氧化石墨烯；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的前处理
使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理；
步骤三：检测
将步骤一得到氧化石墨烯、FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体和HNB混合，作为阴性对照，通过底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中，随后将透明胶带揭除，置于加热板上加热，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空处理，将待测样品以及石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个检测小室分开，反应后，将芯片置于小动物成像仪中拍摄荧光图像。
优选的是，所述步骤三的氧化石墨烯浓度为0.4～0.5mg·mL-1,FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体浓度为1～1.2μM,HNB的浓度为12.5μM。
本发明的有益效果
本发明提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，该方法首先是制作芯片的模具，然后利用聚二甲基硅氧烷的可塑性通过加热固化，打孔，等离子体处理等过程，依托模具制作自吸阀区隔式芯片，在芯片表面贴附透明胶带，置于真空泵中抽真空使得芯片内部形成负压环境。而后将HNB、FAM染料标记的单增李斯特菌特异性适配体和氧化石墨烯按一定比例混合，通过底物进样孔注入芯片中，由于大气压的作用使得混合物将均匀分布到各检测小室中。由于氧化石墨烯的荧光共振能量转移效应使得FAM的绿色荧光被淬灭，此时混合物只剩HNB的红色荧光。揭去表面的胶带，将含有底物的芯片置于加热板上干燥，待小室内底物完全干燥后，重新于芯片表面贴附胶带，置于真空泵中抽真空使得芯片内部形成负压环境。将含有病原菌的待检测样品通过进样孔注入芯片中，当存在目标细菌时，6-FAM标记的适体会捕获目标细菌，远离氧化石墨烯表面使得绿色荧光恢复，混合物显示绿色，没有目标细菌存在时，6-FAM的荧光仍处于淬灭状态，混合物显示红色，因此通过红绿色可以区分有无目标菌存在，而根据绿色荧光的强度可以进一步对病原菌进行定量分析。
本发明设计制作了自吸阀区隔式芯片，并以该芯片为载体，将HNB染料引入到FAM染料标记的单增李斯特菌特异性适配体和氧化石墨烯的混合物中，建立了双荧光淬灭-恢复体系用于检测单增李斯特菌，操作简单，极大的缩短了检测时间，定量检测时变异系数小，最低检测浓度为46.8CFU/mL，加标回收率达到98.08％,灵敏度高,稳定性好。
附图说明
图1为实施例3中单增李斯特菌检测标准曲线图。
图2为实施例3中单增李斯特菌与副溶血性弧菌和沙门氏菌检测的特异性结果图。
图3本发明实施例4中单增李斯特菌检测标准曲线图。
图4为本发明自吸阀区隔式芯片的制备及基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法流程图。
图5为本发明自吸阀区隔式芯片的结构示意图。
图中，1、反应微腔室，2、进样口，3、反应层，4、支撑层。
具体实施方式
本发明首先提供一种自吸阀区隔式芯片，如图5所示，该芯片包括支撑层4和设置在支撑层4上的反应层3，所述的反应层3上设有若干流体微通道和反应微腔室1，反应层3的中间还设有进样口2。为了在芯片脱气处理时起到密闭作用，优选在反应层上设有密封层，所述的密封层优选为胶带。
所述的反应层的材料优选为PDMS材料，支撑层的下方设有玻璃基底，尺寸优选为40mm*60mm；所述的进样口是将一组螺栓和螺母作为阀门开关。
本发明还提供一种自吸阀区隔式芯片的制备，包括：
步骤一：模具的制备
使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，考虑到腔室的高度，优选于硅晶片上涂覆两层负性光刻胶，使用Spincoat G3P-8旋涂机，将负性光刻胶涂布于干净的干燥硅晶片上，旋涂机的使用条件优选为2000～3000rpm，时间为30s-1min，然后再次重复此步骤以形成第二层，随后将硅晶片放在掩模下方的“h49-25c 4型”单面光刻机上，在曝光之前，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，以便后续的芯片制作，所述的曝光时间优选为25s～40s，将硅晶片优选在60～70℃烘烤1～3min，随后在85～95℃下烘烤10min，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止；所述的显影剂优选为SU-8，为了使模具具有更佳的机械性能，优选在300℃下烘烤20-40min，至此模具制备完成；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的制作
使用三甲基氯硅烷处理模具，优选处理时间为10-20min，以防聚二甲基硅氧烷粘附，然后将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合，优选混合质量比为10：1，优选1500～2000rpm旋转1～2min去除混合时产生的气泡并倒入模具中，待芯片静止约1min后，除去聚二甲基硅氧烷中的气泡，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，注意避免将气泡引入聚二甲基硅氧烷中，以免影响芯片性能，随后优选于70～90℃加热板上烘烤30～40min，待聚二甲基硅氧烷层完全固化后小心从模具上剥离，优选1.0/1.2mm打孔器对加样孔进行打孔；最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子预处理，所述的等离子预处理的条件优选为200V处理1min，将被处理的平面相互贴合后优选90℃烘烤30min形成牢固稳定的芯片；随后使用透明胶带覆盖芯片顶部，获得自吸阀区隔式芯片。
本发明还提供一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，包括：
步骤一：氧化石墨烯的制备
将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌25～30min，剧烈搅拌下，将3.0～4.0g高锰酸钾缓慢加入上述混合物(将温度保持0℃，但是在10min内完成)，搅拌1.5～2h，继续在30～40℃搅拌1.5～2h，然后加热至140～150℃搅拌2～3h，加入去离子水终止反应体系，然后在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过0.22μm的离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋(MWCO 1000da)中透析2～3天去除盐分，获得氧化石墨烯；所述石墨粉和硝酸钠质量比优选为1.0～1.5：40～46，H2SO4体积mL：硝酸钠的质量g优选为80～100:40～46；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的前处理
使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理，优选处理时间为40～50min；
步骤三：检测
将步骤一的氧化石墨烯，6-FAM标记的单增李斯特菌特异性适配体和HNB混合，作为阴性对照，通过底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中；所述还原氧化石墨烯浓度优选为0.4～0.5mg·mL-1，FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体浓度优选为1～1.2μM，HNB的浓度优选为12.5μM；随后将透明胶带揭除，以增加透气性方便干燥，置于45℃加热板上加热2～2.5h，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空，处理时长优选为40～50min，将待测样品以及随后的石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个检测小室分开，反应10min后，将芯片置于小动物成像仪中，在455nm蓝光激发条件下拍摄荧光图像，通过红色与绿色荧光的区别来鉴定阴/阳性，通过绿色荧光的荧光强度对目标菌进行定量。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得
实施例1自吸阀分隔式芯片的制备
首先制备模具，使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，考虑到腔室的高度，于硅晶片上涂覆两层负性光刻胶。使用Spincoat G3P-8旋涂机，将负性光刻胶以2700rpm的速度作为第一层涂布于干净的干燥硅晶片上，时长为30s，然后再次重复此步骤以形成第二层。随后将硅晶片放在掩模下方的“h49-25c 4型”单面光刻机上。在曝光之前，调整掩模的位置，以使图案大致位于晶片的中间，以便后续的芯片制作。曝光25s后，将硅晶片在65℃烘烤1min，然后在95℃下烘烤10min。最后，用SU-8显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止。为了使模具具有更佳的机械性能，在300℃下烘烤20min，至此模具制备完成。
使用三甲基氯硅烷处理模具10min，以防聚二甲基硅氧烷粘附。然后将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B以10：1的质量比混合，2000rpm旋转1min去除混合时产生的气泡并倒入模具中。待芯片静止约1min后，除去PDMS中的气泡。将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，注意避免将气泡引入聚二甲基硅氧烷中，以免影响芯片性能。随后置于90℃加热板上烘烤40min，待聚二甲基硅氧烷层完全固化后小心从模具上剥离，使用1.2mm打孔器对加样孔进行打孔。最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体预处理，将被处理的平面相互贴合后于90℃烘烤30min形成牢固稳定的芯片。随后使用透明胶带覆盖芯片顶部，使之可以更好地脱气以便后续使用。
实施例2水热法合成氧化石墨烯
将1.0g石墨粉加入100mL H2SO4和46g硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌30min。剧烈搅拌下，将3.0g高锰酸钾缓慢加入上述混合物(将温度保持0℃，但是在10min内完成)，搅拌2h。继续在40℃搅拌2h，然后加热至150℃搅拌3h。加入200mL去离子水终止反应体系。然后在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至6。得到的浅黄色溶液经过0.22μm的离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋(MWCO 1000da)中透析3天去除盐分，获得氧化石墨烯。
实施例3基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法
检测流程如图4，取一自吸阀分隔式芯片，表面贴附透明胶带并置于真空泵中抽真空，处理时长为40min，而后将0.4mg·mL-1的氧化石墨烯，1μM的6-FAM标记的单增李斯特菌特异性适配体和12.5μM HNB混合(0.4mg·mL-1的氧化石墨烯，1μM的6-FAM标记的另一段核酸序列和12.5μM HNB混合作为阴性对照)，通过底物进样口进样，上样量为28μL。随后将透明胶带揭除，以增加透气性方便干燥。置于45℃加热板上加热，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空，处理时长为40min。将总共26μL的待测样品以及随后的石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个孔室分开。反应10min后，将芯片置于小动物成像仪中，在455nm蓝光激发条件下拍摄荧光图像。通过红色与绿色的区别来鉴定阴/阳性，通过绿色的荧光强度对目标军进行定量。参考所作的标准曲线图2，确定样品中单增李斯特菌的数量。定量检测该菌的浓度范围在10-107CFU/mL。
所述的使用的单增李斯特菌的适配体序列为：5’-6-FAM-TTTTTTTTTTATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAGGGCGGGTACCCGGTTGAT-3’，由上海生工生物公司合成。
图1为实施例3中单增李斯特菌检测标准曲线图，其中横坐标为单增李斯特菌的浓度对数值，纵坐标为荧光强度。检测浓度范围：10-107CFU/mL。
本发明方法检测稳定，检测限可低至46.8CFU/mL，检测时间短，操作简单，检测效果好。对单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157:H7等进行检测，只有单增李斯特菌的检测结果呈阳性(绿色)，其余均为阴性(红色)，该方法特异性强，未见假阳性和假阴性结果，结果如图2和表1。
表1对单增李斯特菌的特异性检测结果
Figure BDA0002727570100000091
注：<+>表示单核细胞增生性李斯特菌阳性，<—>表示单核细胞增生性李斯特菌阴性。
模拟样品的检测
制备猪肉模拟样品：取5g新鲜猪肉切成碎末，然后在15mL无菌生理盐水中于4℃浸泡过夜。第二天用0.22μm滤膜对滤出液进行抽滤；取5*102、5*106CFU/mL的单增李斯特菌接种于猪肉浸出液中，用本发明检测方法对其进行检测，具体为：
取一自吸阀分隔式芯片，表面贴附透明胶带并置于真空泵中抽真空，处理时长为40min，而后将0.4mg·mL-1的氧化石墨烯，1μM的6-FAM标记的单增李斯特菌特异性适配体和12.5μM HNB混合(0.4mg·mL-1的氧化石墨烯，1μM的6-FAM标记的另一段核酸序列和12.5μMHNB混合作为阴性对照)，通过底物进样口进样，上样量为28μL。随后将透明胶带揭除，以增加透气性方便干燥。置于45℃加热板上加热，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空，处理时长为40min。将待测猪肉模拟样品26μL及石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个孔室分开。反应10min后，将芯片置于小动物成像仪中，在455nm蓝光激发条件下拍摄荧光图像。通过红色与绿色的区别来鉴定阴/阳性，通过绿色的荧光强度对目标军进行定量。参考所做的标准曲线图2，确定样品中单增李斯特菌的数量，定量检测该菌的浓度范围在10-107CFU/mL。本发明方法检测稳定，加标回收率达98.08％。
图3本发明实施例4中单增李斯特菌检测标准曲线图。横坐标为猪肉模拟样品中单增李斯特菌的浓度对数值，纵坐标为归一化荧光强度。检测浓度范围：10-107CFU/mL。

Claims (8)

1.一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，所述的自吸阀区隔式芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口；
该方法包括：
步骤一：氧化石墨烯的制备
将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌，剧烈搅拌下，将高锰酸钾缓慢加入上述混合物，继续在30～40℃搅拌，然后加热至140～150℃搅拌，加入去离子水终止反应体系，在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋中透析2～3天去除盐分，得到氧化石墨烯；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的前处理
使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理；
步骤三：检测
将步骤一得到氧化石墨烯、FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体和HNB混合，含有FAM修饰的核酸序列的上述混合物作为阴性对照，通过底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中，随后将透明胶带揭除，置于加热板上加热，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空处理，将待测样品以及石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个检测小室分开，反应后，将芯片置于小动物成像仪中拍摄荧光图像；
所述步骤三的氧化石墨烯浓度为0.4～0.5mg·mL-1,FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体浓度为1～1.2μM,HNB的浓度为12.5μM。
2.根据权利要求1所述的一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，所述的自吸阀区隔式芯片的制备方法包括：
步骤一：模具的制备
使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；
步骤二：自吸阀区隔式芯片的制作
使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中三甲基氯硅烷处理时间是10～20min。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是1500～2000rpm旋转1～2min。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中烘烤固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤二中芯片加热固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
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