CN114480679A - 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法 - Google Patents

基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114480679A
CN114480679A CN202111588265.4A CN202111588265A CN114480679A CN 114480679 A CN114480679 A CN 114480679A CN 202111588265 A CN202111588265 A CN 202111588265A CN 114480679 A CN114480679 A CN 114480679A
Authority
CN
China
Prior art keywords
salmonella
phage
culture
detection
bacteriophage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111588265.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480679B (zh
Inventor
王佳
邵彦春
李俊杰
丁一峰
黄晨曦
王小红
张静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202111588265.4A priority Critical patent/CN114480679B/zh
Publication of CN114480679A publication Critical patent/CN114480679A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480679B publication Critical patent/CN114480679B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法，所述试剂盒包括含有鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液，以及实时荧光定量PCR(qPCR)检测的引物对；噬菌体生物扩增联合qPCR方法对食品基质中的沙门氏菌的最低检出限为10CFU/mL，检测时间仅为3.5h，且能区分活菌和死菌。本发明为快速检测食品中沙门氏菌的污染提供了理论依据。

Description

基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏 菌的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella spp.)是引起食源性疾病的最常见的食源性致病菌之一，其感染人类造成的沙门氏菌病表现为呕吐、腹泻、发烧等症状，甚至导致死亡。研究表明，沙门氏菌主要通过食物感染人类，易污染肉、蛋、牛奶、水果、和蔬菜等食物。候海燕等人在2010-2016年间对江苏省淮安市的262份生牛肉样品进行沙门氏菌的检测，其中24份样品被检测出沙门氏菌，检出率高达9.16％。快速准确地检测食品基质中的沙门氏菌是防止食品污染的有效措施，能够显著降低沙门氏菌感染人类的几率。
传统培养法以其灵敏度高、检测结果准确、成本低等优势，被公认为检测病原菌的“金标准”，但是检测过程复杂繁琐且耗时，需要5-7d，难以满足病原菌快速检测的需求。基于噬菌体生物扩增的检测方法以其特有的优势用于病原微生物(包括沙门氏菌)检测的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法，该试剂盒利用鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156联合检测沙门氏菌，具有检测时间短、速度快、灵敏度高、成本低、特异性强、可以区分死菌和活菌的特点。
为实现上述目的，本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对STp；
其中，沙门氏菌噬菌体T156已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T156，于2020年7月6日将该噬菌体T156保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2020288。其中，该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体在申请号为202010712852.9、发明名称为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T156及其应用的中国发明专利公开；
其中，所述引物对STp为：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
进一步地，所述试剂盒还包括氯化钙溶液、阴性对照品、阳性对照品；其中，
氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，
阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，
阳性对照品为鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311。
本发明提供了一种利用上述试剂盒检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
1)噬菌体生物扩增法检测
a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液与待检测的样品混合，再加入氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物A；
b.将上述培养物置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物B；
2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：
a.分别取上述培养物A和培养物B提取噬菌体DNA，所述方法为热裂解法，操作步骤为：将样品在100℃下水浴加热10min后取出，在4℃、4000g下离心10min，吸取上清液并保存于-20℃下备用。
b.分别以培养物A和培养物B的DNA为模板，利用引物对STp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对STp为：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
c.根据两个PCR产物的Ct值的差值ΔCt定性判断样品中是否存在有活性的鼠伤寒沙门氏菌，判断依据为：
当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌；
d.以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，制作标准曲线，定量分析食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
进一步地，所述步骤1)第a小步中，沙门氏菌噬菌体T156悬液与前处理样品按体积1:1混合，再加入同等体积的氯化钙溶液，其工作浓度为20mmol/L，且沙门氏菌噬菌体T156悬液的浓度为105PFU/mL；
进一步地，所述步骤1)第b小步中，培养物A置于37℃恒温摇床中振荡培养，培养时间为60min；
再进一步地，所述步骤2)中第a小步中，将培养物A和培养物B用热裂解的方式提取DNA作为模板(即提取噬菌体与宿主菌混合培养前后样品中的DNA作为模板)。
再进一步地，所述步骤2)第b小步中中，所述PCR的反应体系如下：
Figure BDA0003428821930000031
本发明原理：
噬菌体生物扩增(Phage Amplification Assay，PAA)是一种通过检测细菌被裂解性噬菌体侵染后释放出的子代噬菌体，间接检测目标细菌的方法。其基本原理为：当噬菌体侵染细菌后，将其遗传物质注入宿主细胞，加入灭病毒剂，杀灭宿主体外的所有游离噬菌体后，由于受到细菌的保护，噬菌体遗传物质在宿主体内复制组装，通过裂解宿主菌释放子代噬菌体，在辅助细菌的帮助下测定子代噬菌体的滴度，从而实现对宿主菌的定向和定量分析。实时荧光定量PCR(qPCR)是检测和定量微生物的一种选择方法，具体步骤是当模板核酸变性后，与特定的寡核苷酸引物退火，并在DNA聚合酶的作用下延伸产生互补链，经过多次扩增循环，扩增产物呈指数增长，用荧光报告器进行实时监测，其Ct与靶核酸的初始浓度相关联，可以对微生物初始浓度进行定量分析。
本发明将噬菌体生物扩增法与qPCR联用检测噬菌体的DNA来替代噬菌斑的培养方法，可以有效缩短检测时间，区分活菌和死菌，实现病原菌的快速检测。
本发明的有益效果：
本发明建立了一种简便、快速、灵敏的检测食品样品中沙门氏菌的噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR(qPCR)的检测试剂盒，该试剂盒将检测沙门氏菌的噬菌体生物扩增法与检测子代噬菌体的qPCR结合，建立PAA-qPCR用于检测沙门氏菌，检测时间仅需要3.5h，与传统培养法5-7d相比，极大地缩短了检测时间，有效地提高了检测效率。该检测试剂盒对食品基质中的沙门氏菌能达到较好的定性检测结果，且能克服常规qPCR无法区分活菌死菌的缺点，采用差值法，有效区分活菌和死菌。
综上所述，本发明利用沙门氏菌噬菌体T156建立噬菌体生物扩增法结合实时荧光定量PCR方法来定性检测沙门氏菌，食品样品前处理简单，操作简单、适用于快速检测。本发明可为基于噬菌体生物扩增的沙门氏菌快速检测方法的建立提供实验依据和理论基础。
附图说明
图1为噬菌体T156的裂解曲线。
图2为噬菌体的最佳感染滴度。
图3为不同DNA扩增产物的凝胶电泳图。
图4为Ct值与DNA浓度的线性关系。
图5为ΔCt值与细菌浓度的线性关系。
图6为噬菌体生物扩增结合qPCR对不同菌株的检测结果(“**”表示差异显著，P＜0.01；“ns”表示无显著性差异，P＞0.05)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，以便本领域技术人员理解。
菌种及编号：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium ATCC 13311，ATCC14028，ATCC 13306)、李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19114)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus ATCC 33846)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)来源于美国ATCC生物标准品资源中心(ATCC)。大肠杆菌(Escherichia coli BL21)来源于国家标准菌库(NCTC)。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium SJTUF 13277)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium SJTUF 13350)来源于上海交通大学(SJTU)。
实施例1噬菌体对宿主菌裂解能力的测定
1.宿主菌的活化
从-80℃的冰箱中取出甘油管保藏的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311划线接种到XLD选择培养基上，在37℃恒温培养12h。挑取一个单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，在160r/min、37℃恒温摇床中培养6-8h。取100μL培养好的菌液，采用稀释涂布法对菌液浓度进行测定。
细菌浓度(CFU/mL)＝单菌落数量×稀释倍数×10。
2.噬菌体的活化
将实验室保藏的噬菌体T156甘油管从-80℃冰箱取出，溶解后与生长对数期的宿主菌混合，在160r/min、37℃摇床培养过夜，将培养液在4℃、8500r/min下离心15min，吸取上清液并用0.22μm的滤膜过滤，即得到噬菌体悬液，放置于4℃冰箱中备用。
3.噬菌体T156裂解能力的测定
调整噬菌体T156悬液的浓度，与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311(106CFU/mL)菌液按照感染复数(是噬菌体浓度与菌液浓度的比值，MOI)为100、10、1、0.1、0.01、0.001，阳性对照为ATCC 13311菌液(106CFU/mL)，阴性对照为LB培养基，每隔1h测定吸光值OD600nm，共测定10h。
结果如图1所示，阳性对照的OD600nm随时间不断升高，与宿主菌的生长趋势相符。噬菌体T156以不同的MOI值感染宿主菌时，均表现出较强的裂解能力，除MOI＝0.01和MOI＝0.001在3h时有轻微增加(随后又降低并与初始值持平)外，其余的吸光值在0-9h内几乎与阴性对照组持平，宿主菌的生长被完全抑制，但是在9h后吸光值稍有所增加，表明细菌没有被完全杀死。实验结果表明噬菌体T156对宿主菌有较强的裂解作用，可用于开发噬菌体生物扩增法以检测沙门氏菌。
实施例2噬菌体滴度的测定
通过最佳MOI的测定，确定扩增体系中所用噬菌体的滴度。将噬菌体T156悬液稀释至109、108、107、106、105、104、103PFU/mL，各取500μL与等体积的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311(106CFU/mL)混匀，置于160r/min、37℃摇床中培养3.5h，在4℃、8500r/min下离心15min，采用双层平板法测定噬菌体的滴度。
结果如图2所示。当噬菌体MOI＝0.1时，噬菌体效价达到最大，表明当宿主菌浓度为106CFU/mL时,噬菌体效价为105PFU/mL，可增殖更多的子代噬菌体，因此选用105PFU/mL作为噬菌体的感染滴度。
实施例3快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法
基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒包括，含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液、实时荧光定量PCR检测的引物对STp、阴性对照、阳性对照、氯化钙溶液；其中引物STp是以噬菌体T156末端酶大亚基的序列作为模板，序列为：
STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，
阴性对照为PBS缓冲液，其摩尔浓度为0.05mol/L，
阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311；
上述检测试剂盒的方法，包括以下步骤：
1)噬菌体生物扩增法检测
a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液(100μL)与待检测的样品100μL混合，加入100μL氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物①，其中，沙门氏菌噬菌体T156的滴度为105PFU/mL；
b.将上述培养物置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物②；
2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：
a.分别取上述培养物A和培养物B提取噬菌体DNA，即提取噬菌体与宿主菌混合培养前后样品中的DNA作为模板，采用热裂解法提取噬菌体T156的DNA，操作步骤为：将样品在100℃下水浴加热10min后取出，在4℃、4000g下离心10min，吸取上清液并保存于-20℃下备用。
b.分别以培养物A和培养物B的DNA为模板，利用引物对STp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对STp为：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
所述PCR的反应体系如下：
Figure BDA0003428821930000061
c.根据两个PCR产物的差值Ct的变化ΔCt值定性判断样品中是否存在有活性的鼠伤寒沙门氏菌，判断依据为：
当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌；
d.以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，制作标准曲线，定量分析食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
实施例4上述检测试剂盒方法的验证
1.噬菌体DNA的提取
采用热裂解法提取噬菌体T156的DNA：将样品在100℃下水浴加热10min后取出，在4℃、4000g下离心10min，吸取上清液并保存于-20℃下备用。
2.引物设计及其扩增体系
选取沙门氏菌噬菌体T156末端酶大亚基的一段碱基序列作为模板，使用软件Primer 5设计，引物序列为：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
该引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增产物长度为102bp。
依据
Figure BDA0003428821930000071
qPCR
Figure BDA0003428821930000072
Green Master Mix产品说明书设计qPCR程序，其反应体系为：
Figure BDA0003428821930000073
qPCR程序结束后，分析数据，以模板浓度为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线，计算扩增效率。
3.引物特异性检测
分别提取鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、单增李斯特菌ATCC 19114、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、副溶血性弧菌ATCC 33846、大肠杆菌BL21的DNA，进行qPCR扩增，程序结束后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定有无产物条带，用沙门氏菌噬菌体T156的DNA的扩增产物作阳性对照。
结果如图3所示，扩增产物的凝胶电泳图中只有沙门氏菌噬菌体T156DNA扩增产物的条带，表明引物的特异性较强，只能用于扩增噬菌体T156的DNA片段，可有效避免在检测过程中其它细菌DNA对实验结果的干扰。
4.引物扩增效率测定
将噬菌体T156的DNA连续10倍梯度稀释，将不同浓度的DNA进行qPCR扩增。qPCR程序结束后，分析数据，以模板浓度为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，计算扩增效率。
结果如图4所示，噬菌体生物扩增法结合qPCR方法检测沙门氏菌的标准曲线显示Ct值与噬菌体DNA的浓度呈线性相关，其R2＝0.9968，扩增效率为108％，扩增效率高，表明该qPCR反应体系可以用于检测。
5.标准曲线的建立
将100μL的噬菌体T156悬液(终浓度为105PFU/mL)分别与等体积不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311(终浓度为1×107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL)及100μL20mmol/L氯化钙溶液混匀，再加入700μL LB培养基于37℃摇床中振荡培养60min，采用热裂解法分别提取培养0min和60min后混合液中噬菌体T156的DNA，然后进行qPCR检测分析，计算ΔCt值，当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌。以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，绘制标准曲线。
结果如图5所示，当菌液浓度低于10CFU/mL时，沙门氏菌无法被检出，因此，噬菌体生物扩增结合qPCR法检测沙门氏菌的最低检出限为10CFU/mL。
6.特异性检验
将100μL的噬菌体T156悬液(终浓度为105PFU/mL)分别与100μL106CFU/mL的不同菌液(鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、单增李斯特菌ATCC19114、大肠杆菌BL21、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、副溶血弧菌ATCC33846、灭活的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311)及100μL氯化钙溶液(终浓度为20mmol/L)混合，再加入700μL LB培养基混匀，在37℃摇床中振荡(160r/min)培养60min后取出，采用热裂解法提取混合培养前后(0和60min)培养液中噬菌体T156的DNA，进行qPCR检测分析，计算Ct值。阴性对照组菌液用100μL的LB培养基代替。
结果见图6所示，除鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311活菌外，其余实验组的检测结果均与阴性对照组无显著性差异，表明噬菌体生物扩增结合qPCR法的特异性较强，且能区分活菌和死菌。
实施例5试剂盒检测食品中沙门氏菌的应用
1.检测试剂盒在牛奶样品中的应用
(1)样品处理：称取5g脱脂奶粉充分溶解于100mL蒸馏水中，在105℃下灭菌15min，备用。取30份牛奶样品，分别加标不同浓度的菌液模拟污染的牛奶样品。
(2)噬菌体生物扩增结合qPCR检测：分别向30份加标后的牛奶样品中加入100μL噬菌体T156(终浓度为105PFU/mL)和100μL氯化钙溶液(终浓度为20mmol/L)，混匀后在37℃摇床中振荡(160r/min)培养60min，采用热裂解法分别提取培养0min和60min后混合液中噬菌体T156的DNA，然后进行qPCR检测分析，计算ΔCt值，当ΔCt≥1时，认定为阳性，即样品中检测出沙门氏菌，否则为阴性。再将噬菌体生物扩增结合qPCR法与传统培养法的检测结果进行卡方检验分析，评估噬菌体生物扩增结合qPCR法的检测效果。
结果如表1所示，利用噬菌体生物扩增结合qPCR法对30份牛奶样品进行检测，30份牛奶样品中19份被检测出阳性，11份检测为阴性。卡方检验分析结果显示(表2)，经计算得噬菌体生物扩增结合qPCR法的敏感度为100％，特异度为100％，符合率为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为100％，P＞0.05。结果表明噬菌体生物扩增结合qPCR法对牛奶样品中沙门氏菌的检测效果较好，与传统培养法的检测结果无显著性差异，但是大大节省了检测时间，仅需3.5h，与传统培养法需5-7d相比，检测速度大幅度提升。
表1噬菌体生物扩增结合qPCR对牛奶样品中沙门氏菌的检测结果
Figure BDA0003428821930000101
表2卡方检验结果
Figure BDA0003428821930000102
(3)稳定性试验：利用噬菌体生物扩增结合qPCR法分别对1份阳性样品(鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311活菌：10CFU/mL)和1份阴性样品(鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311：灭活，10CFU/mL)进行检测，每天检测2次，重复3天，计算变异系数(CV)。
检测结果如表3所示，所有重复实验检测结果均显示加标ATCC 13311(101CFU/mL)的牛奶样品为阳性，加标ATCC 13311(灭活，101CFU/mL)的样品为阴性。经计算得：阳性样品检测结果的批内变异系数为8.10％，批间变异系数为11.02％，阴性样品批内变异系数为8.91％，批间变异系数为12.07％，变异系数均小于15％，说明该方法具有良好的重复性，检测结果较稳定，且能区分活菌和死菌。
表3噬菌体生物扩增结合qPCR对牛奶中沙门氏菌检测稳定性结果
Figure BDA0003428821930000111
2.检测试剂盒在生菜样品中的应用
(1)样品处理：用蒸馏水将购买的新鲜生菜冲洗干净并用75％的乙醇擦拭，然后用无菌打孔器在生菜的叶片部分打孔得到面积约1cm2的生菜样品并置于无菌培养皿上，用紫外线对叶片的正反两面各照射20min，以杀灭生菜样品表面的细菌。取30份生菜样品，分别在其表面滴加不同浓度的菌液模拟受污染的生菜样品。
(2)噬菌体生物扩增结合qPCR检测：将30份加标后的生菜样品分装于不同的无菌EP管中，加入800μL无菌水，然后用研磨棒研磨，使叶片中的细菌充分释放。待叶片充分研磨后，加入100μL噬菌体T156(终浓度为105PFU/mL)和100μL氯化钙溶液(终浓度为20mmol/L)混匀，在37℃摇床中振荡(160r/min)培养60min后取出，采用热裂解法分别提取培养0min和60min后混合液中噬菌体T156的DNA，然后进行qPCR检测分析，计算ΔCt值，将检测结果与传统培养法的检测结果进行卡方检验分析，评估噬菌体生物扩增结合qPCR法的检测效果。
利用噬菌体生物扩增结合qPCR法对30份生菜样品进行检测，结果见表4。由表4可知，30份生菜样品中17份被检测出阳性，13份检测为阴性。将噬菌体生物扩增结合qPCR法与传统培养法的检测结果进行卡方检验分析(见表5)，经计算得噬菌体生物扩增结合qPCR法的敏感度为89.5％，特异度为100％，符合率为93.3％，阳性预测值为100％，阴性预测值为84.6％，P＞0.05。结果表明噬菌体生物扩增结合qPCR法对生菜样品中沙门氏菌的检测效果较好，与传统培养法的检测结果无显著性差异，但是检测所需时间大幅度缩短，适用于快速检测。
表4噬菌体生物扩增结合qPCR对生菜样品中沙门氏菌的检测结果
Figure BDA0003428821930000121
表5卡方检验结果
Figure BDA0003428821930000131
(3)稳定性试验：利用噬菌体生物扩增结合qPCR法分别对1份阳性样品(鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311活菌：10CFU/mL)和1份阴性样品(鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311：灭活，10CFU/mL)进行检测，每天检测2次，重复3天，计算变异系数(CV)。
用该方法对一份阳性样品和一份阴性样品重复检测，结果见表6。如表6所示，所有重复实验检测结果均显示加标鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311的生菜样品为阳性，加标灭活鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311(灭活，101CFU/mL)的样品为阴性。经计算得：阳性样品检测结果的批内变异系数为8.13％，批间变异系数为9.83％，阴性样品批内变异系数为12.29％，批间变异系数为8.17％，变异系数均小于15％，说明该方法重复性良好，检测结果较稳定，且能区分活菌和死菌。
表6噬菌体生物扩增结合qPCR对生菜中沙门氏菌检测稳定性结果
Figure BDA0003428821930000132
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量PCR快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体T156的磷酸盐缓冲液和实时荧光定量PCR检测的引物对STp：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′。
2.根据权利要求1所述快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括氯化钙溶液、阴性对照品、阳性对照品；其中，
氯化钙溶液的使用浓度为20mmol/L，
阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，
阳性对照品为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311。
3.一种利用权利要求1所述试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)噬菌体生物扩增法检测
a.将沙门氏菌噬菌体T156悬液与待检测的样品混合，再加入氯化钙溶液，加入LB培养基补至1mL，得到培养物A；
b.将上述培养物A置于37℃恒温摇床培养60min，得到培养物B；
2)噬菌体的实时荧光定量PCR检测：
a.分别取上述培养物A和培养物B提取噬菌体DNA，并保存于-20℃；
b.以噬菌体的DNA为模板，利用引物对STp进行实时荧光定量PCR得到PCR产物，其中，引物对STp为：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
c.根据两个PCR产物的Ct值的差值ΔCt定性判断样品中是否存在有活性的鼠伤寒沙门氏菌，判断依据为：
当ΔCt≥1时，认定为检测出沙门氏菌；
d.以菌液浓度为横坐标，ΔCt为纵坐标，制作标准曲线，定量分析食品样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
4.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第a小步中，沙门氏菌噬菌体T156悬液与前处理样品按体积1:1混合，再加入同等体积的氯化钙溶液，其工作浓度为20mmol/L，且沙门氏菌噬菌体T156悬液的浓度为105PFU/mL。
5.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤1)第b小步中，培养物A置于37℃恒温摇床中振荡培养，培养时间为60min。
6.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第a小步中，将培养物A和培养物B用热裂解的方式提取DNA作为模板，即提取噬菌体与宿主菌混合培养前后样品中的DNA作为模板。
7.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤2)中第b小步中，PCR的反应体系如下：
Figure FDA0003428821920000021
CN202111588265.4A 2021-12-23 2021-12-23 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法 Active CN114480679B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111588265.4A CN114480679B (zh) 2021-12-23 2021-12-23 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111588265.4A CN114480679B (zh) 2021-12-23 2021-12-23 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480679A true CN114480679A (zh) 2022-05-13
CN114480679B CN114480679B (zh) 2024-02-13

Family

ID=81493986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111588265.4A Active CN114480679B (zh) 2021-12-23 2021-12-23 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480679B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114941041A (zh) * 2022-05-20 2022-08-26 华中农业大学 基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量pcr快速检测试剂盒及其方法和应用
CN117721085A (zh) * 2024-02-06 2024-03-19 江苏大方生物工程有限公司 一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944766A (zh) * 2020-07-22 2020-11-17 华中农业大学 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t156及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944766A (zh) * 2020-07-22 2020-11-17 华中农业大学 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t156及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEJANDRO GARRIDO-MAESTUA ET AL: "Specific detection of viable Salmonella Enteritidis by phage amplification combined with qPCR (PAA-qPCR) in spiked chicken meat samples", 《FOOD CONTROL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114941041A (zh) * 2022-05-20 2022-08-26 华中农业大学 基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量pcr快速检测试剂盒及其方法和应用
CN114941041B (zh) * 2022-05-20 2024-02-23 华中农业大学 基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量pcr快速检测试剂盒及其方法和应用
CN117721085A (zh) * 2024-02-06 2024-03-19 江苏大方生物工程有限公司 一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480679B (zh) 2024-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Elizaquível et al. Recent developments in the use of viability dyes and quantitative PCR in the food microbiology field
Rodríguez-Lázaro et al. Trends in analytical methodology in food safety and quality: monitoring microorganisms and genetically modified organisms
Odumeru et al. Salmonella detection methods for food and food ingredients
CN114480679A (zh) 基于噬菌体生物扩增结合实时荧光定量pcr快速检测沙门氏菌的试剂盒及其方法
Bhagwat Rapid detection of Salmonella from vegetable rinse-water using real-time PCR
Ripolles‐Avila et al. From hazard analysis to risk control using rapid methods in microbiology: A practical approach for the food industry
EP0663016B1 (en) Method and kits for detection of bacteria
Zadernowska et al. Detection of Salmonella spp. presence in food
JP2023166568A (ja) 治療薬の選択および有効性のモニタリングのためのインジケーターバクテリオファージならびにそれを使用するための方法
CN114480731B (zh) 快速检测金黄色葡萄球菌的噬菌体生物扩增-实时荧光定量pcr的联合试剂盒及其方法
WO2019140618A1 (zh) 一种定量检测vbnc状态细菌的方法
Willford et al. Luminescence based enzyme-labeled phage (Phazyme) assays for rapid detection of Shiga toxin producing Escherichia coli serogroups
Bhaduri et al. Sample preparation methods for PCR detection of Escherichia coli O157: H7, Salmonella typhimurium, andListeria monocytogenes on beef chuck shoulder using a single enrichment medium
Tan et al. Automated detection of Salmonella spp. in foods
Volpe et al. Development and evaluation of an ELIME assay to reveal the presence of Salmonella in irrigation water: Comparison with Real-Time PCR and the Standard Culture Method
CN108277289A (zh) 大肠埃希氏菌o157:h7干粉化lamp快速检测试剂盒
CN106841011A (zh) 流式细胞术快速检测大肠杆菌o157:h7的方法
Zhang et al. Specific detection of viable Cronobacter sakazakii in powdered infant formula by phage amplification combined with qPCR (PAA‐qPCR) assay
Chua et al. A rapid and simple DNA extraction procedure to detect Salmonella spp. and Listeria monocytogenes from fresh produce using real-time PCR
CN112063732B (zh) 一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物
Zhang et al. Real‐time loop‐mediated isothermal amplification assays combined with ethidium monoazide bromide and bentonite coated activated carbon for rapid and sensitive detection of viable Escherichia coli O157: H7 from milk without enrichment
Xu et al. MALDI-TOF MS-Based identification of bacteria and a survey of fresh vegetables with pathogenic bacteria in Beijing, China
CN114941041B (zh) 基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量pcr快速检测试剂盒及其方法和应用
Park et al. Comparison of phage-based magnetoelastic biosensors with taqman-based quantitative real-time PCR for the detection of salmonella typhimurium directly grown on tomato surfaces
CN112080475B (zh) 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant