CN117721085A - 一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于噬菌体检测领域，具体涉及一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用。本发明成功分离出一种沙门菌噬菌体，进行荧光标记后，利用荧光噬菌体检测鸡粪样中鼠伤寒沙门菌，操作简便，特异性好，仅需10min左右就可完成检测。
Description
技术领域
本发明属于噬菌体检测领域，具体涉及一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用。
背景技术
鼠伤寒沙门菌是沙门菌的一种，具有广泛的宿主，是世界各国分离率最高的菌型之一。该菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类感染，具有重要的公共卫生意义。在禽上可引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和鸽等腹泻、体重减轻、产蛋下降甚至死亡等，是危害家禽养殖业健康的重要病原菌之一；在人类中主要引起腹痛、腹泻等症状，是一种重要的食源性病原菌；因此对鼠伤寒沙门菌的快速检测具有重要意义。目前鼠伤寒沙门菌的检测方法主要以玻片凝集法为主，该方法操作繁琐，耗时长。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种荧光噬菌体、包含荧光噬菌体的检测试剂及应用。
为了实现上述目标，本发明的第一方面采用如下的技术方案：一种沙门菌噬菌体，该沙门菌噬菌体于2023年12月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo: 63914-B1。
本发明的第二方面公开了一种荧光噬菌体，前述的沙门菌噬菌体经荧光标记后得到该荧光噬菌体。荧光噬菌体的具体制备步骤包括：将该沙门菌噬菌体纯裂解液与荧光染液按(900-1100):1的体积比混匀，0-5℃避光染色过夜。
本发明的第三方面是提供前述的荧光噬菌体的悬液。该悬液的具体制备步骤包括：将滤膜安装于抽滤装置中，加入染色过夜的荧光噬菌体，进行抽滤操作，然后冲洗滤膜，收集冲洗液，即获得荧光噬菌体悬液。
本发明的第四方面是公开包含前述的荧光噬菌体或前述的悬液的检测试剂。
在优选的实施方案中，所述的检测试剂用于检测样本是否存在鼠伤寒沙门菌。所述的样本为动物粪便。
本发明的第五方面是提供前述的荧光噬菌体或前述的悬液在制备检测鼠伤寒沙门菌的试剂中的应用。
本发明的第六方面是公开采用前述的荧光噬菌体或前述的悬液或前述的检测试剂检测鸡粪中鼠伤寒沙门菌的方法。
在优选的实施方案中，检测时，动物粪便样本上清与(0.8-1.2)*109 PFU/mL荧光噬菌体ØDF8悬液按照（1-2）：（1-2）的体积比混匀，在荧光下观察，以检测鸡粪是否存在鼠伤寒沙门菌。
所述的鼠伤寒沙门菌包括但不限于鼠伤寒沙门菌CVCC3757和鼠伤寒沙门菌CVCC3386。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明成功分离出一种新的噬菌体，利用荧光噬菌体检测鸡粪样中鼠伤寒沙门菌，操作简便，特异性好，仅需10min左右就可完成检测。
附图说明
图1 噬菌体ØDF8的透射电镜照片；
图2 荧光噬菌体检测沙门菌，A、荧光噬菌体检测鼠伤寒沙门菌CVCC3757；B、荧光噬菌体检测大肠杆菌CVCC1547；
图3 特异性检测，A、荧光噬菌体检测鼠伤寒沙门菌CVCC3757；B、荧光噬菌体检测鼠伤寒沙门菌CVCC3386、C、荧光噬菌体检测都柏林沙门菌 CVCC1808；D、荧光噬菌体检测猪霍乱沙门菌CVCC3754；E、荧光噬菌体检测大肠杆菌CVCC1547；F、荧光噬菌体检测金黄色葡萄球菌ATCC25923；
噬菌体ØDF8（Salmonella phageØDF8），于2023年12月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No: 63914-B1，保藏机构地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，分类命名为Salmonella phage。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 噬菌体ØDF8的分离和荧光噬菌体制备
a.噬菌体ØDF8的分离
噬菌体ØDF8由江苏大方生物工程有限公司卞金辉于2022年6月20日分离于湖北黄冈市某鸡场。采集该鸡场污水，10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤。将鼠伤寒沙门菌CVCC3757（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）接种于含5 mL无菌LB液体试管中，37 ℃，180 r/min条件下震荡培养过夜。取100 μL菌液与100 μL上述滤液混合，加入5mL半固体LB培养基（加热液化后置于55 ℃，10 min）中震荡混匀，倒于固体LB培养基上。待半固体培养基凝固后于37 ℃静置条件下倒置培养过夜。次日取出平板观察成斑情况。若出现透明空斑，则挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜，次日10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤，重复上述双层琼脂平板培养，再挑取单斑，重复三次，当最后一次挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜，随后10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤，所得滤液即为ØDF8噬菌体纯裂解液。
b. 噬菌体ØDF8的电镜观察
使用磷钨酸（PTA，2％）对噬菌体进行负染色。取10μL 步骤a中的ØDF8噬菌体纯裂解液转移至铜网格上，静置10 min待其吸附于铜网格上，滤纸去除多余液体，滴加10μL磷钨酸（PTA，2%，w/v），自然风干5 min后使用H7650透射电子显微镜（TEM；Hitachi，Japan）观察噬菌体形态。
经透射电镜观察，噬菌体ØDF8具有一个长型的多面体头部，头部长约为80nm，和一个可伸缩的尾部，长度约为110nm，属于肌尾噬菌体科，如图1所示。
c.荧光噬菌体ØDF8的制备
将步骤a中的噬菌体ØDF8纯裂解液与SYBR Green I染液按体积比1000:1混匀，4℃避光染色过夜。将直径25mm、孔径0.03μm的聚碳酸酯滤膜安装在玻璃抽滤装置上，往装置的漏斗中加入2 mL过夜染色的荧光噬菌体，启动真空泵，抽滤约15 min，直到液体抽滤完毕。加入1mL经0.22μm针式滤器过滤的SM缓冲液，继续抽滤至液体抽滤完毕，重复3次，以去除噬菌体液中的多余染料。取下聚碳酸酯滤膜，将其平铺于干净的平皿中，用移液枪吸取1 mLSM缓冲液反复冲洗滤膜，收集冲洗液，即获得荧光噬菌体悬液，浓度调整为109 PFU/mL，4℃避光保存。
实施例2 荧光噬菌体ØDF8检测鸡粪中鼠伤寒沙门菌CVCC3757
将待检鼠伤寒沙门菌CVCC3757和大肠杆菌CVCC1547培养至对数期，分别取100μL108 CFU/mL菌液加入0.5g鸡粪，并加入1mL PBS，涡旋混匀，制备模拟污染的鸡粪样品。取5μL粪样上清与5μL荧光噬菌体ØDF8悬液吹打混匀，于室温暗处孵育5min，5000 r/min离心5min，小心吸弃上清，用5μL去离子水重悬沉淀，取5 μL在盖玻片上涂抹成直径约1.5cm的圆形，风干后在荧光显微镜下观察。在1000×放大倍数下，在荧光模式下观察。
镜检结果显示（图2），鼠伤寒沙门菌CVCC3757能被检测到，呈现明显的杆状荧光，清晰地显示细菌的形态；而对照组大肠杆菌CVCC1547没有显示杆状荧光，仅有少量点状背景荧光，可清晰辨认非细菌形态。
实施例3 特异性检测
将鼠伤寒沙门菌CVCC3757、鼠伤寒沙门菌CVCC3386（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）、都柏林沙门菌 CVCC1808（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）、猪霍乱沙门菌CVCC3754（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）、大肠杆菌CVCC1547（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）、金黄色葡萄球菌ATCC25923（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）培养至对数期，分别取100μL 108 CFU/mL菌液加入0.5g鸡粪中，并加入1 mL PBS，涡旋混匀，制备模拟污染的鸡粪样品。分别取从以上模拟粪样中各取5μL上清，与荧光噬菌体ØDF8混匀，按照上文所述方法进行检测，并在荧光显微镜下观察。
显微镜镜检结果显示（图3），在模拟鸡粪中能够检出鼠伤寒沙门菌CVCC3757和CVCC3386，可清晰辨认出荧光环绕的细菌形态；而都柏林沙门菌 CVCC1808、猪霍乱沙门菌CVCC3754、大肠杆菌CVCC1547、金黄色葡萄球菌ATCC25923均未能检出，表明该方法特异性较好。
本发明中的噬菌体为新分离的噬菌体，可特异性的识别鼠伤寒血清型的沙门菌；利用本发明中的噬菌体可对鸡粪中鼠伤寒沙门菌进行特异性检测，检测时间缩短至10min左右、特异性高；本发明中所述荧光噬菌体可特异性检测鼠伤寒沙门菌，操作简便，仅需手持式荧光显微镜即可观察结果，比目前所报道的鼠伤寒沙门菌的检测方法更快速、简便。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种沙门菌噬菌体，其特征在于，该沙门菌噬菌体于2023年12月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 63914-B1。
2.一种荧光噬菌体，其特征在于，权利要求1所述的沙门菌噬菌体经荧光标记后得到该荧光噬菌体。
3.权利要求2所述的荧光噬菌体的悬液。
4.包含权利要求2所述的荧光噬菌体或权利要求3所述的悬液的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂用于检测样本是否存在鼠伤寒沙门菌。
6.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的样本为动物粪便。
7.权利要求2所述的荧光噬菌体或权利要求3所述的悬液在制备检测鼠伤寒沙门菌的试剂中的应用。
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