CN109266584A - 一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途 - Google Patents

一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途，本发明的鼠李糖乳杆菌LRYZU021（Lactobacillus rhamnosus LRYZU021），于2017年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号：CCTCC NO：M 2017640。本发明的鼠李糖乳杆菌LRYZU021具有纤毛表型，具有独特的16S核糖体DNA序列特征、同时具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力，以及突出的肠上皮细胞粘附能力；同时该菌株与致敏肥大细胞接触，对抗原诱导的脱颗粒和组胺释放具有显著抑制作用，有利于缓解变态反应的效应阶段因肥大细胞激活引起的血管扩张和血压下降。利用该菌株制备的微生态制剂在预防食物过敏发生和缓解过敏症状方面具有广阔应用前景。

Description

一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其 用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其在过敏调节微生态制剂中的应用。
背景技术
近年来，随着致敏食物品种的日趋复杂，食物过敏和相关疾病在全球范围内迅速增加，目前普通人群食物过敏的实际患病率，婴幼儿达到5%-10%，成人约为1%-2%，已经成为对社会、经济巨大影响的疾病。肥大细胞在变态反应性疾病发病机制中具有核心作用，食物过敏中产生的过敏原特异性IgE抗体与肥大细胞结合，导致肥大细胞脱颗粒释放组胺等介质，从而启动针对特异性抗原的过敏反应。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是公认的具有安全性的微生物，在建立和维持宿主肠道免疫平衡方面有广泛的应用。构建基于鼠李糖乳杆菌的微生态制剂是预防和缓解食物过敏疾病的有效途径。然而，目前具有调节肥大细胞脱颗粒和组胺释放作用的菌株国内外尚无报道。另一方面，鼠李糖乳杆菌在免疫调节效应方面存在巨大菌株差异性。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种具有肥大细胞脱颗粒和组胺释放调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌菌株LRYZU021，该菌株具有突出的耐酸、耐胆汁酸盐、细胞黏附能力，对致敏肥大细胞脱颗粒和组胺释放具有显著抑制作用，为构建过敏调节功能的微生态制剂提供新型益生菌菌株。
本发明从西藏采集的传统发酵乳制品中分离获得一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌LRYZU021（Lactobacillus rhamnosus LRYZU021）。
为了实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案：
一株纤毛型鼠李糖乳杆菌，所述的纤毛型鼠李糖乳杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2017640；保藏日期：2017年10月30日，菌种的分类命名为鼠李糖乳杆菌LRYZU021，Lactobacillus rhamnosusLRYZU021。其采用免疫磁珠富集联合菌落免疫印迹技术分离得到。
本发明还提供包含纤毛型鼠李糖乳杆菌的用于过敏调节的微生物制剂。微生物制剂是指由纤毛型鼠李糖乳杆菌制成的液态制剂或固态制剂。液态制剂中活菌浓度不低于107 CFU/mL，固态制剂活菌浓度不低于109 CFU/g。
本发明的目的还在于提供一株纤毛型鼠李糖乳杆菌在制备用于过敏调节的微生物制剂中的应用；包含前述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌的用于抑制肥大细胞脱颗粒、组胺释放的微生物制剂。前述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌在制备用于抑制肥大细胞脱颗粒、组胺释放的微生物制剂中的应用。
本发明中的鼠李糖乳杆菌LRYZU021具有以下生物学特征：
（1）形态特征：鼠李糖乳杆菌LRYZU021革兰氏染色结果为阳性，细胞呈短杆形，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。
（2）菌落特征：鼠李糖乳杆菌LRYZU021在MRS 固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。
（3）生理生化特征：过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、七叶苷；不发酵密二糖、绵子糖、木糖；可从纤维二糖、七叶苷、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。
（4）鼠李糖乳杆菌LRYZU021具有纤毛表型，菌体表面能与纳米金标记的纤毛亚基SpaA抗体反应，在透射电镜下可以观察到连珠状纤毛结构。
（5）16S核糖体DNA（16S rDNA）序列特征：鼠李糖乳杆菌LRYZU021的16S rDNA扩增片段长度为1485bp，通过Blastn搜索比对，与GenBank数据库中同源性最高的菌株为Lactobacillus rhamnosus strain 6870（GenBank编号：MH791026.3），序列相似度为99.46%，存在8个碱基差异（20：T/A; 29: G/A; 311: T/G; 694:T/A; 901: G/A; 1009:G/A; 1149: G/A; 1153:T/G）。
（6）具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力。
（7）具有突出的细胞黏附能力。
（8）鼠李糖乳杆菌LRYZU021对致敏肥大细胞脱颗粒及组胺释放具有显著抑制作用。
本发明通过SpaA抗体偶联的磁珠富集传统发酵乳制品中具有纤毛的鼠李糖乳杆菌，通过MRS平板分离、菌落免疫印迹、形态与生理生化鉴定、16S rDNA测序鉴定分离出具有纤毛表型的鼠李糖乳杆菌，并通过电镜观察、耐酸和耐胆汁酸盐能力测定、细胞粘附能力测定、以及对致敏肥大细胞脱颗粒和组胺释放的抑制率测定，筛选对机体过敏具有调节能力的新型菌株，具体包括以下步骤：
（1）菌株富集与培养 称取25g样品加入225 mL生理盐水，匀浆，用生理盐水进行10倍稀释；取5 mL适当稀释倍数的稀释液，加入1 mg SpaA抗体偶联的磁珠，37℃孵育75 min后，置于磁分离架上，磁分离2 min，弃上清；用500 μL PBS洗涤2次，加入200 μL PBS重悬，获得的磁珠悬液直接涂布MRS琼脂平板，37℃，厌氧培养24 h，选取菌落分布均匀的平板，备用。
（2）纤毛表型鼠李糖乳杆菌的菌落分离 用菌落免疫印迹法。选取菌落分布均匀的平板，剪取与培养皿内径大小相同的硝酸纤维素（NC）膜，在去离子水中浸泡10 min，37℃干燥10 min。将NC膜置于培养基表面，室温静置5 min后取下NC膜，37℃干燥30 min；将转印膜放置在5%的脱脂乳中，室温封闭1 h；PBST缓冲液洗涤3次，置于anti-SpaA抗体稀释液孵育1h；PBST洗涤3次，置于HRP标记的羊抗鼠IgG液体中孵育1 h；PBST洗涤3次，将转印膜浸入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色10 min，待膜上出现明显斑点，用去离子水漂洗2次终止反应，将膜置于干净滤纸上自然干燥，挑取阳性斑点对应的菌落进行鉴定。
（3）阳性菌株生理生化鉴定 通过对菌株进行革兰氏染色、镜检观察、过氧化氢酶试验，吲哚、硫化氢和氨，硝酸盐还原，精氨酸水解、以及糖发酵试验鉴定菌株种属。
（4）16S rDNA测序鉴定 阳性菌落生理生化鉴定挑取阳性斑点对应的菌落，接种MRS液体培养基，按文献公开的CTAB方法提取基因组DNA；以基因组DNA为模板进行16S rDNAPCR扩增。获得的PCR产物委托上海生物工程有限公司测序，所得结果在基因库GenBank(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov)中进行Blastn比对，序列同源性大于99%设为相同种。
（5）纤毛型鼠李糖乳杆菌细胞微观形态观察 通过扫描电镜观察鼠李糖乳杆菌细胞微观形态，将108 CFU/mL鼠李糖乳杆菌5%的戊二醛溶液固定过夜，双蒸水洗弃3次，用50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水；乙酸乙酯和无水乙醇等比例混合作用30 min；乙酸乙酯作用30 min后固定于点样盘上镀膜，上镜观察。通过透射电镜观察李糖乳杆菌表面的纤毛结构。参照《纳米金标记试剂盒使用手册》制备纳米金偶联SpaA抗体，并稀释至0.25mg/mL；取100 μL乳酸菌悬液，加入100 μL纳米金偶联抗体，室温孵育1 h，1500 r/min离心10 min，弃上清；PBS洗涤2次，重悬于100 μL PBS，取50μL悬液滴在铜网载膜上，用2%磷钨酸负染2 min，用滤纸吸去染液，干燥后进行透射电镜观察。
（6）耐酸能力测定 将保存的菌株在MRS液体培养基中连续活化2代，按106 CFU/mL接种量接种于pH值为2.0和3.0的MRS培养基中，37℃孵育 4h后用稀释平板法测定乳菌活菌数N （单位：CFU/mL），按N/106×100%计算存活率反映耐酸能力。
（7）耐胆汁酸盐能力测定 将保存的菌株在MRS液体培养基中连续活化2代，按106CFU/mL接种量接种于含有0.3 %的牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃孵育 4h后用稀释平板法测定乳菌活菌数N （单位：CFU/mL），按N/106×100%计算存活率反映耐胆汁酸盐能力。
（8）黏附能力测定 通过大鼠肠上皮细胞系IEC-6为模型测定分离株的粘附能力。将培养好的IEC-6细胞进行胰酶消化，用细胞培养液调整浓度至2×106个细胞/mL，取1 mL细胞加入含有盖玻片的24孔板，培养至细胞贴壁完全，用PBS洗涤2次；再在每孔加入1 mL浓度为5×108 CFU/mL乳酸菌悬液，取出盖玻片，用无菌PBS洗涤3次，除去未粘附的细菌，用4%多聚甲醛固定30 min，烘干后结晶紫染色，镜检观察，随机选择20个视野，计100个细胞表面粘附的乳酸菌个数，取3次平均值表示乳酸菌粘附能力。
（9）致敏肥大细胞的制备 将卵蛋白与弗式佐剂混合，按10 mg/kg腹部皮下多点注射6周龄健康BALB/c小鼠，对照组注射等量PBS与弗式佐剂混合液；第12d加强免疫一次，第20 d眼眶采血，离心收集致敏血清，并应用小鼠卵蛋白IgE Elisa试剂盒测定IgE浓度。将获得的卵蛋白致敏血清按1:100稀释，以0.2 mL/只注射小鼠腹腔，对照组注射等体积PBS缓冲液，24 h后分离小鼠腹腔致敏肥大细胞，备用。
（10）致敏肥大细胞脱颗粒抑制率测定 取100 μL浓度为1×106细胞/ml的致敏肥大细胞悬液，加入无Ca2+的Tyrode液0.8 mL，37℃温育3 min；试验组在致敏肥大细胞悬液中加入100 μL 106 CFU/ml 鼠李糖乳杆菌，阴性对照组加入100 μL无Ca2+的Tyrode液，37℃温育10 min；加入20 μL浓度为1 mg/ml卵蛋白，37℃温育10 min诱导脱颗粒；在倒置显微镜下观察肥大细胞脱颗粒情况，随机选择10个视野，对正常型和脱颗粒型肥大细胞进行计数，细胞数分别记为N正常和N脱颗粒，脱颗粒率（D）按以下公式：N脱颗粒/（N正常+ N脱颗粒）×100%计算，菌株脱颗粒抑制率以阴性对照组脱颗粒率（D对照）和试验组的脱颗粒率（D试验）的差值（D对照- D试验）表示。
（11）致敏肥大细胞组胺释放抑制率测定 通过离心收集上述脱颗粒诱导体系中的培养上清，通过高效液相色谱测定培养上清中的组胺浓度。色谱条件：色谱柱采用C18色谱柱，250×4.6 mm，5 μm；柱温：室温；流动相:V(甲醇)∶V(0.1%的甲酸水溶液)= 70:30；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL。组胺浓度以组胺峰面积标准曲线为基准计算。按下式计算肥大细胞组胺释放抑制率，抑制率（%）=（阴性对照组组胺释放量—试验组组胺释放量）/阴性对照组组胺释放量×100，并比较不同乳酸菌菌株对致敏肥大细胞释放组胺的抑制率。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：自然环境中纤毛表型鼠李糖乳杆菌十分罕见，本发明涉及的一株鼠李糖乳杆菌LRYZU021具有纤毛表型，具有独特的16S核糖体DNA序列特征、同时具有良好的耐酸、耐胆汁酸盐能力，有利于通过胃肠道过程中保持高活性；对肠上皮细胞具有突出的粘附能力，有利于延长在肠道中定植时间；该菌株与致敏肥大细胞接触，对抗原诱导的脱颗粒和组胺释放具有显著抑制作用，有利于缓解变态反应的效应阶段因肥大细胞激活引起的血管扩张和血压下降。利用该菌株构建的微生态制剂在预防食物过敏发生和缓解过敏症状方面具有潜在价值和广阔应用前景。
附图说明
图1免疫磁珠富集后MRS平板分离菌落形态及免疫印迹斑点特征，图中A，免疫磁珠富集后MRS平板分离菌落形态；B，菌落免疫印迹斑点特征；
图2鼠李糖乳杆菌LRYZU021的16S rDNA序列特征，图中，Query：为测定的LRYZU021的16S rDNA序列；Subjct：为GenBank数据库中同源性最高的菌株的16S rDNA序列；
图3鼠李糖乳杆菌LRYZU021细胞微观形态特征；
图4鼠李糖乳杆菌LRYZU021细胞表面的纤毛特征；
图5鼠李糖乳杆菌LRYZU021耐酸能力，图中数据为3次试验的平均值，不同斜体字母标注表示具有显著性差异（P＜0.01）；
图6鼠李糖乳杆菌LRYZU021耐胆汁酸盐能力，图中数据为3次试验的平均值，不同斜体字母标注表示具有显著性差异（P＜0.01）；
图7鼠李糖乳杆菌LRYZU021黏附能力，图中数据为3次试验的平均值，不同斜体字母标注表示具有显著性差异（P＜0.01）；
图8鼠李糖乳杆菌LRYZU021致敏肥大细胞脱颗粒抑制率，图中数据为3次试验的平均值，不同斜体字母标注表示具有显著性差异（P＜0.01）；
图9鼠李糖乳杆菌LRYZU021致敏肥大细胞组胺抑制率，图中数据为3次试验的平均值，不同斜体字母标注表示具有显著性差异（P＜0.01）；
本发明的纤毛型鼠李糖乳杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2017640；保藏日期：2017年10月30日，菌种的分类命名为鼠李糖乳杆菌LRYZU021，Lactobacillus rhamnosus LRYZU021。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1菌株富集与培养
传统发酵乳制品为西藏、新疆和内蒙古牧民家庭自制，称取25g样品加入225 mL生理盐水，匀浆，用生理盐水进行10倍稀释；取5 mL适当稀释倍数的稀释液，加入1 mg SpaA抗体偶联的磁珠，37℃孵育75 min后，置于磁分离架上，磁分离2 min，弃上清；用500 μL PBS洗涤2次，加入200 μL PBS重悬，获得的磁珠悬液直接涂布MRS琼脂平板，37℃，厌氧培养24 h，选取菌落分布均匀的平板备用。
试验结果显示在17份传统发酵乳制品中，只有一份采集自西藏牧区的样品通过免疫磁珠富集后涂布MRS固体培养基，培养24h后呈现出单菌落，菌落分布均匀，菌落形态见附图1（A）。
实施例2 纤毛表型鼠李糖乳杆菌的菌落分离
采用菌落免疫印迹法分离纤毛表型鼠李糖乳杆菌，步骤如下：选取菌落分布均匀的平板，剪取与培养皿内径大小相同的硝酸纤维素膜，在去离子水中浸泡10 min，37℃干燥10min。将NC膜置于培养基表面，室温静置5 min后取下NC膜，37℃干燥30 min；将转印膜放置在5%的脱脂乳中，室温封闭1 h；PBST缓冲液洗涤3次，置于anti-SpaA抗体稀释液孵育1 h；PBST洗涤3次，置于HRP标记的羊抗鼠IgG液体中孵育1 h；PBST洗涤3次，将转印膜浸入新鲜配制的DAB显色液中，避光显色10 min，待膜上出现明显斑点，用去离子水漂洗2次终止反应，将膜置于干净滤纸上自然干燥，挑取阳性斑点对应的菌落进行鉴定。
试验结果显示经菌落免疫印迹检测，在61个单菌落中，有10个菌落在硝酸纤维素膜上呈现出阳性斑点，见附图1（B）。阳性斑点对应的菌落均呈圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明形态。结果表明免疫磁珠联合菌落免疫印迹法是特异性富集和分离食品及环境样品中纤毛型鼠李糖乳杆菌的有效方法。
实施例3 阳性菌株生理生化鉴定
对阳性菌株进行生理生化鉴定，步骤如下：将获得的阳性菌落划线接种MRS培养基，37℃，厌氧培养24 h，挑取平板上的单菌落涂片，固定，滴加结晶紫染液，染色1 min，水洗；滴加碘液，作用1 min，水洗；滴加95 %乙醇脱色15-20 s，水洗；番红复染1 min，水洗；镜检并记录菌株的细胞形态。同时挑取单菌落进行过氧化氢酶试验，吲哚、硫化氢和氨，硝酸盐还原，精氨酸水解、以及糖发酵试验。
结果显示阳性菌落来源的菌株为革兰氏阳性杆菌，过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，鼠李糖、核糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、七叶苷；不发酵密二糖、绵子糖、木糖；可从纤维二糖、七叶苷、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。根据《常用细菌系统鉴定手册》中乳酸菌的相应指标比对鉴定，符合鼠李糖乳杆菌特征。将获得的菌株命名为LRYZU021。
实施例4 16S rDNA测序鉴定
对获得的阳性菌株LRYZU021进行16S rDNA测序鉴定，步骤如下：将LRYZU021单菌落划线接种MRS培养基，37℃，厌氧培养24 h，挑取平板上的单菌落接种MRS液体培养基，按文献公开的CTAB方法提取基因组DNA；以基因组DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增。用于16SrRNA的PCR扩增的引物为: 上游引物F为5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，下游引物R为5’-AGAGTTTGATYMTGGC TCAG-3’； PCR反应体系为：2 µL模板（50 ng/ µL）、4 µL dNTPs（25mmol/ L）、引物8F （10 pmol/µL）和15R（10 pmol/ µL）各1.5 µL、10×Buffer 5 µL、MgCl2（25 mmol/L）5 µL、Tag酶（5 U/ µL）0.3 µL、加ddH2O补足至50 µL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循环；72 ℃延伸10min。PCR产物委托上海生物工程有限公司测序，所得结果在基因库GenBank ( http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中进行Blastn比对，序列同源性大于99%设为相同种。
测定结果显示鼠李糖乳杆菌LRYZU021的16S rDNA扩增片段长度为1485 bp，通过Blastn搜索比对，在GenBank数据库中并未找到完全相同的序列，同源性最高的菌株为Lactobacillus rhamnosus strain 6870（GenBank编号：MH791026.3），序列相似度为99.46%，其中存在8个碱基差异（20：T/A; 29: G/A; 311: T/G; 694:T/A; 901: G/A;1009:G/A; 1149: G/A; 1153:T/G），见附图2，结果表明LRYZU021为一株新的鼠李糖乳杆菌菌株。
实施例5 鼠李糖乳杆菌LRYZU021的细胞微观形态观察
对鼠李糖乳杆菌LRYZU021细胞微观形态特征进行电镜观察，具体步骤如下：将108CFU/mL鼠李糖乳杆菌5%的戊二醛溶液固定过夜，双蒸水洗弃3次，用50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水；乙酸乙酯和无水乙醇等比例混合作用30 min；乙酸乙酯作用30 min后固定于点样盘上镀膜，上镜观察。
通过透射电镜观察李糖乳杆菌表面的纤毛结构，具体步骤如下：参照《纳米金标记试剂盒使用手册》制备纳米金偶联SpaA抗体，并稀释至0.25 mg/mL；取100 μL乳酸菌悬液，加入100 μL纳米金偶联抗体，室温孵育1 h，1500 r/min离心10 min，弃上清；PBS洗涤2次，重悬于100 μL PBS，取50μL悬液滴在铜网载膜上，用2%磷钨酸负染2 min，用滤纸吸去染液，干燥后进行透射电镜观察。
测定结果表明，鼠李糖乳杆菌LRYZU021细胞呈短杆状，直径为（0.588±0.047）µm，长度为（1.378±0.031）µm，见附图3。透射电镜结果显示LRYZU021菌体表面能与纳米金标记的纤毛亚基SpaA抗体反应，在透射电镜下可以观察到连珠状纤毛结构，见附图4，结果证实鼠李糖乳杆菌LRYZU021为纤毛型菌株。
实施例6 鼠李糖乳杆菌LRYZU021的耐酸能力测定
乳酸菌Lactobacillus rhamnosus LRYZU021，Lactobacillus casei FS13，Lactobacillus rhamnosus LD40，Pediococcus pentosaceus H10，Lactobacillusfermentum F7，Lactobacillus brevis YZU.12 和Lactobacillus acidophilus YZU.32耐酸能力对比测定：将保存的菌株在MRS液体培养基中连续活化2代，按106 CFU/mL接种量接种于pH值为2.0和3.0的MRS培养基中，37℃孵育 4h后用稀释平板法测定乳菌活菌数N（单位：CFU/mL），按N/106×100%计算存活率反映耐酸能力。
测定结果显示鼠李糖乳杆菌LRYZU021在pH3.0的MRS培养基中37℃孵育4h后，存活率为（94.1±3.2）%，显著高于LD40，H10，F7以及YZU.12（P﹤0.01）；在pH2.0的MRS培养基孵育4h后，存活率为（85.3±5.5）%，显著高于菌株FS13，LD40，H10，F7以及YZU.12（P﹤0.01），结果见附图5，表明LRYZU021具有良好的耐酸能力，能够在胃酸环境中存活。
实施例7 鼠李糖乳杆菌LRYZU021的耐胆汁酸盐能力测定
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRYZU021与乳酸菌菌株Lactobacilluscasei FS13，Lactobacillus rhamnosus LD40，Pediococcus pentosaceus H10，Lactobacillus fermentum F7，Lactobacillus brevis YZU.12 和Lactobacillusacidophilus YZU.32 耐胆汁酸盐对比测定：将保存的菌株在MRS液体培养基中连续活化2代，按106 CFU/mL接种量接种于含有0.3 %的牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃孵育 4h后用稀释平板法测定乳菌活菌数N （单位：CFU/mL），按N/106×100%计算存活率反映耐胆汁酸盐能力。
测定结果表明鼠李糖乳杆菌LRYZU021在含0.3%的牛胆盐MRS培养基中37℃孵育4h后，存活率为（95.2±4.6）%，显著高于LD40，H10以及YZU.12（P﹤0.01）；结果见附图6，表明LRYZU021具有良好的耐胆汁酸盐能力，能够在小肠环境中存活。
实施例8 鼠李糖乳杆菌LRYZU021的黏附能力测定
对比鼠李糖乳杆菌LRYZU021与乳酸菌菌株Lactobacillus casei FS13，Lactobacillus rhamnosus LD40，Pediococcus pentosaceus H10，Lactobacillusfermentum F7，Lactobacillus brevis YZU.12 和Lactobacillus acidophilus YZU.32对肠上皮细胞的粘附能力，具体步骤如下：
将培养好的大鼠肠上皮细胞系IEC-6细胞进行胰酶消化，用细胞培养液调整浓度至2×106个细胞/mL，取1 mL细胞加入含有盖玻片的24孔板，培养至细胞贴壁完全，用PBS洗涤2次；再在每孔加入1 mL浓度为5×108 CFU/mL乳酸菌悬液，取出盖玻片，用无菌PBS洗涤3次，除去未粘附的细菌，用4%多聚甲醛固定30 min，烘干后结晶紫染色，镜检观察，随机选择20个视野，计100个细胞表面粘附的乳酸菌个数，取3次平均值表示乳酸菌粘附能力。
测定结果如附图7所示，表明鼠李糖乳杆LRYZU021具有最强的IEC-6细胞黏附能力，达到29.6±5.5细菌/细胞，显著高于其它6个菌株（P﹤0.01），结果表明鼠李糖乳杆LRYZU021在肠道中具有良好的定植能力。
实施例9 鼠李糖乳杆菌LRYZU021致敏肥大细胞脱颗粒抑制率测定
对比鼠李糖乳杆菌LRYZU021与乳酸菌菌株Lactobacillus casei FS13，Lactobacillus rhamnosus LD40，Pediococcus pentosaceus H10，Lactobacillusfermentum F7，Lactobacillus brevis YZU.12 和Lactobacillus acidophilus YZU.32对致敏肥大细胞脱颗粒抑制率，具体步骤如下：
将卵蛋白与弗式佐剂混合，按10 mg/kg腹部皮下多点注射6周龄健康BALB/c小鼠，对照组注射等量PBS与弗式佐剂混合液；第12d加强免疫一次，第20 d眼眶采血，离心收集致敏血清，并应用小鼠卵蛋白IgE Elisa试剂盒测定IgE浓度。将获得的卵蛋白致敏血清按1:100稀释，以0.2 mL/只注射小鼠腹腔，对照组注射等体积PBS缓冲液，24 h后分离小鼠腹腔致敏肥大细胞，备用。
取100 μL浓度为1×106细胞/ml的致敏肥大细胞悬液，加入无Ca2+的Tyrode液0.8mL，37℃温育3 min；试验组在致敏肥大细胞悬液中加入100 μL 106 CFU/ml 鼠李糖乳杆菌，阴性对照组加入100 μL无Ca2+的Tyrode液，37℃温育10 min；加入20 μL浓度为1 mg/ml卵蛋白，37℃温育10 min诱导脱颗粒；在倒置显微镜下观察肥大细胞脱颗粒情况，随机选择10个视野，对正常型和脱颗粒型肥大细胞进行计数，细胞数分别记为N正常和N脱颗粒，脱颗粒率（D）按以下公式：N脱颗粒/（N正常+ N脱颗粒）×100%计算，菌株脱颗粒抑制率以阴性对照组脱颗粒率（D对照）和试验组的脱颗粒率（D试验）的差值（D对照- D试验）表示。
测定结果表明鼠李糖乳杆LRYZU021对致敏肥大细胞的脱颗粒抑制率达到（32.1±2.2）%，显著高于其它6个菌株（P﹤0.01），结果见附图8，表明鼠李糖乳杆LRYZU021菌体表面成分能有效地抑制过敏原诱发肥大细胞脱颗粒。
实施例10 鼠李糖乳杆菌LRYZU021致敏肥大细胞组胺释放抑制率测定
对比鼠李糖乳杆菌LRYZU021与乳酸菌菌株Lactobacillus casei FS13，Lactobacillus rhamnosus LD40，Pediococcus pentosaceus H10，Lactobacillusfermentum F7，Lactobacillus brevis YZU.12 和Lactobacillus acidophilus YZU.32对致敏肥大细胞组胺释放抑制率，具体步骤如下：
收集上述脱颗粒诱导体系中的培养上清，应用高效液相色谱测定培养上清中的组胺浓度。色谱条件：色谱柱采用C18色谱柱，250×4.6 mm，5 μm；柱温：室温；流动相:V(甲醇)∶V(0.1%的甲酸水溶液)= 70:30；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL。组胺浓度以组胺峰面积标准曲线为基准计算。按下式计算肥大细胞组胺释放抑制率，抑制率（%）=（阴性对照组组胺释放量—试验组组胺释放量）/阴性对照组组胺释放量×100，并比较不同乳酸菌菌株对致敏肥大细胞释放组胺的抑制率。
测定结果显示鼠李糖乳杆LRYZU021对致敏肥大细胞的脱颗粒抑制率达到（33.7±3.5）%，显著高于其它6个菌株（P﹤0.01），结果见附图9，表明鼠李糖乳杆LRYZU021菌体表面成分能有效地抑制过敏原诱发肥大细胞组胺释放，可能鼠李糖乳杆LRYZU021表面纤毛介导的肥大细胞的粘附具有屏蔽肥大细胞表面的IgE与过敏原结合的能力，或者抑制过敏原诱发肥大细胞非免疫性组胺释放。这些结果均显示本发明中的鼠李糖乳杆LRYZU021在预防和缓解食物过敏方面具有良好的应用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途
<130> xhx2018101801
<141> 2018-10-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acggttacct tgttacgact t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat ymtggctcag 20

Claims (6)

1.一株纤毛型鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述的纤毛型鼠李糖乳杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2017640；保藏日期：2017年10月30日，菌种的分类命名为鼠李糖乳杆菌LRYZU021，Lactobacillus rhamnosus LRYZU021。
2.根据权利要求1所述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌，其特征在于，采用免疫磁珠富集联合菌落免疫印迹技术分离得到。
3.包含权利要求1所述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌的用于过敏调节的微生物制剂。
4.权利要求1所述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌在制备用于过敏调节的微生物制剂中的应用。
5.包含权利要求1所述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌的用于抑制肥大细胞脱颗粒、组胺释放的微生物制剂。
6.权利要求1所述的一株纤毛型鼠李糖乳杆菌在制备用于抑制肥大细胞脱颗粒、组胺释放的微生物制剂中的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944721A (zh) * 2020-08-17 2020-11-17 东北农业大学 一株具有免疫调节作用的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN112725216A (zh) * 2020-11-10 2021-04-30 扬州大学 一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用
CN113604384A (zh) * 2021-07-22 2021-11-05 湖南农业大学 一种鼠李糖乳杆菌及其应用
CN114149937A (zh) * 2021-07-27 2022-03-08 中国海洋大学 一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用
CN114317326A (zh) * 2021-12-06 2022-04-12 浙江工商大学 一种用于缓解过敏反应的清酒乳杆菌及制备方法
CN115386524A (zh) * 2022-10-11 2022-11-25 苏州益优生物科技有限公司 一种乳酸杆菌组合物及其在护肤品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101473028A (zh) * 2006-04-20 2009-07-01 新加坡国立大学 重组乳杆菌及其用途
CN101909643A (zh) * 2007-11-30 2010-12-08 巴斯德研究所 干酪乳杆菌菌株用于制备抑制肥大细胞活化之组合物的用途
CN104560793A (zh) * 2014-12-17 2015-04-29 石家庄君乐宝乳业有限公司 开菲尔乳杆菌kl22、其筛选方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101473028A (zh) * 2006-04-20 2009-07-01 新加坡国立大学 重组乳杆菌及其用途
CN101909643A (zh) * 2007-11-30 2010-12-08 巴斯德研究所 干酪乳杆菌菌株用于制备抑制肥大细胞活化之组合物的用途
CN104560793A (zh) * 2014-12-17 2015-04-29 石家庄君乐宝乳业有限公司 开菲尔乳杆菌kl22、其筛选方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张齐麟: "鼠李糖杆菌LGG在Cottage干酪中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
李海红: "乳酸菌表面蛋白对免疫细胞体外激活及其过敏缓解效应研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944721A (zh) * 2020-08-17 2020-11-17 东北农业大学 一株具有免疫调节作用的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN112725216A (zh) * 2020-11-10 2021-04-30 扬州大学 一株高效降解嘌呤的鼠李糖乳杆菌YZULr026及其应用
CN113604384A (zh) * 2021-07-22 2021-11-05 湖南农业大学 一种鼠李糖乳杆菌及其应用
CN114149937A (zh) * 2021-07-27 2022-03-08 中国海洋大学 一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用
CN114317326A (zh) * 2021-12-06 2022-04-12 浙江工商大学 一种用于缓解过敏反应的清酒乳杆菌及制备方法
CN114317326B (zh) * 2021-12-06 2023-09-12 浙江工商大学 一种用于缓解过敏反应的清酒乳杆菌及制备方法
CN115386524A (zh) * 2022-10-11 2022-11-25 苏州益优生物科技有限公司 一种乳酸杆菌组合物及其在护肤品中的应用
CN115386524B (zh) * 2022-10-11 2024-04-09 苏州益优生物科技有限公司 一种乳酸杆菌组合物及其在护肤品中的应用

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