CN101473028A

CN101473028A - 重组乳杆菌及其用途

Info

Publication number: CN101473028A
Application number: CNA2007800229358A
Authority: CN
Inventors: 蔡考圆; 林丽芳; 陈丽娟
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2006-04-20
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2027-04-04
Also published as: WO2007123488A1; JP2009534029A; US20090169582A1; EP2010645A1; AU2007241557A1; CN101473028B; EP2010645A4

Abstract

本发明涉及重组乳杆菌、其用途和包括该重组乳杆菌的药物组合物。所述重组乳杆菌包括异源核酸序列。所述异源核酸序列编码螨变应原Der p1、Der p2和Blo t5的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。Der p1的各片段包括螨变应原的至少8％的氨基酸序列。也公开了调节哺乳动物中对变应原的免疫应答的方法及药物组合物和药盒。

Description

重组乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及重组乳杆菌(lactobacillus)及其用途。重组乳杆菌包括编码螨变应原(mite allergen)的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的异源核酸序列。本发明也涉及调节哺乳动物对变应原的免疫应答的方法、药物组合物及药盒。

背景技术

认为变应性疾病影响发达国家中25％至40％的人口，多于一半的美国人对一种或更多种变应原过敏。在英国，变态反应速率以每年大约5％的速率飞速增加(尤其是在儿童中)。变态反应如变应性鼻炎(花粉症)、哮喘和荨麻疹是免疫系统应答(即免疫系统对各变应原的病理学应答)的过敏感性。在易感者中，一般无害物质如草的花粉或屋尘(house dust)导致免疫应答的过度反应，使得各物质即变应原被视为威胁并且是攻击性的。对螨类变应原，特别是对房尘螨变应原的敏感性是造成过敏性哮喘、鼻炎和特应性皮炎的最重要因素之一。对螨变应原的变态反应也可引起花粉症症状，如喷嚏、流鼻涕和眼发痒、含泪眼。螨原变态反应构成了复杂的世界性问题，具有卫生和经济意义。虽然至少45％的美国年轻人和15％的德国普通人群对尘螨变应原过敏，但螨原变态反应不限于人体“内”环境中。已经发现更多数的螨类可诱导致敏作用，其症状在职业环境中会遇到。

变应性疾病的特征在于B-淋巴细胞产生称为免疫球蛋白E(IgE)的抗体类型的能力增强。有证据显示IgE例如在哮喘中起主要作用。例如，以改变的方式应答(其中IgG和IgG4免疫球蛋白而非IgE的水平升高)的儿童或成人患哮喘的风险不增加。IgE的合成是T辅助细胞的亚型CD4⁺和B细胞合作的结果。T细胞在例如特异反应性过敏中起中枢作用，并且由2型辅助T细胞(Th2)合成的细胞因子是疾病的主要发病机理。已假设“变态反应-促进”Th-2细胞和“抗感染”Th-1细胞间的平衡转换可能参与变态反应的起始。Th-1细胞产生干扰素(IF)-γ、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNF)-β，而Th-2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。目前用于变态反应的疫苗设计的治疗和预防策略调整为通过促进Th-1或T调节(Tr)细胞(其能下调Th-2效应期)的发育而进行免疫调节恢复。

变态反应倾向个体第一次暴露于变应原时，他的或她的免疫系统产生大量的相应IgE抗体。这些IgE分子结合到肥大细胞(组织中)或嗜碱性细胞(循环中)表面的高亲和力Fc受体(FcεRI)上。随后暴露于变应原引起变应原结合并与这些IgE分子交联，导致例如各肥大细胞的激活。这引起其中组胺和新形成介质如前列腺素和白三烯的快速释放。

作为欧洲和澳大利亚及全世界室内变应原来源的最重要螨类是屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p)。该物种的主要变应原是蛋白质Der p1和Der p2。在热带和亚热带区域，最相关的螨类是热带无爪螨(Blomia tropicalis)(Bt)。在这些亚热带区域，对Der p1、Der p2和Blo t5的螨原多致敏作用是高度盛行的。目前的治疗包括使用缓解症状的类固醇和使用螨粗提物的免疫疗法，两者均具有关于效率和顺应性的问题。照这样，长期需要改善并有效的治疗策略。

目前，处理螨原变态反应的最重要方面是减少对螨的暴露。这包括降低室内温度和湿度水平、使用高度过滤真空吸尘器、经常清洗床上用品并避免倾向于灰尘聚集的东西如墙帷、地毯、书等。目前的治疗方法包括使用组胺H受体拮抗剂、减充血剂或两者的组合。拮抗剂和组胺H受体特别是H₁受体的逆激动剂(因此称作“抗组胺剂”)一旦变应原结合到肥大细胞和嗜碱性细胞的表面IgE上，即从肥大细胞和嗜碱性细胞中释放，干扰组胺的作用。然而，抗组胺剂仅在变应原攻击前施用才有效。

减充血剂通过收缩供应鼻膜内层的血管来减轻鼻膜肿胀。它们因而减轻与变态反应(和冷)相关的症状之一：鼻子不通气，而没有解决变态反应潜在的机理。鼻腔喷雾如局部鼻类固醇和色甘酸钠也可用于治疗变态反应症状。免疫疗法(也称为脱敏作用或变态反应注射(allergy shot))是定期应用少但升高量的变应原。相信其可增加免疫系统对各变应原的耐受性。已发现免疫疗法在不同程度上有效。然而它的有用性受潜在副作用，特别是过敏反应和可得变应原提取物的相对原始性质的限制。在克服这些问题的尝试中，来自植物和树的变应原的天然发生的同种型显示因氨基酸替代或缺失，其结合IgE的能力降低。

此外，已报道了乳酸产生菌对变态反应发展的抑制效应。已发现热灭活的L.paracasi 33和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)减少变应性鼻炎的症状(Peng，G-C等，Pediatric Allergy and Immunology，(2005)，16，433-438；Ishida，Y等，J.Dairy Sci.(2005)，88，527-533)。已经报道了施用L.paracasei GM-080降低吸入纯化的Der p5的小鼠中的IgE水平(美国专利6,994,848)。已经提示组合应用干酪乳杆菌(L.casei casei)和葡聚糖，而不是单独应用干酪乳杆菌可防止花粉特异性IgE、活化调节趋化因子(TARC)和干扰素γ(IFN-γ)水平的增加(Ogawa，T.等，FEMSImmunol.Med.Microbiol.(2006)，doi：10.1111/j.1574-695X.2006.00046.x)。Murooka等利用编码变应原Der f1和Der f7的载体转化了干酪乳杆菌K95-5和植物乳杆菌(L.plantarum)NCL21(JP 2002-281966)。Kruisselbrink等(Clin.Exp.Immunol.[2001]，126-128)还检测了鼻内施用重组植物乳杆菌256的效应，所述重组植物乳杆菌256表达对C57BL/6小鼠呈免疫显性的Der p1的T细胞表位。在处理的小鼠中除了观察到Th-2细胞因子IL-5的降低，还观察到具有一些Th-1性质的肽特异性T细胞的诱导作用。

因此，目前螨原变态反应的治疗不令人满意，并且疾病的预防是不可能的；因此长期需要改善并有效的治疗和预防策略。

因此，本发明的目标是提供适合于调节螨原变态反应中免疫应答的方法。该目标通过所附独立权利要求书的主题来解决。

发明概述

一方面，本发明提供重组乳杆菌。所述重组乳杆菌包括异源核酸序列。该核酸序列编码Der p1、Der p2和Blo t5中任何一种螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。所述核酸序列因此可编码完整的螨变应原，或其对应的免疫原性同源物。本发明也提供重组乳杆菌用于治疗的用途。

另一方面，本发明提供药物组合物。所述药物组合物包括如上所述的重组乳杆菌，和可药用载体或稀释剂。

另一方面，本发明提供药盒。所述药盒包括如上所述的组合物。它还包括变应原或其免疫原性片段。

另一方面，本发明提供调节哺乳动物对变应原的免疫应答的方法。所述方法包括施用如上所述的组合物。

另一方面，本发明涉及如上所述的重组乳杆菌在制备用于调节对变应原的免疫应答的药物组合物和药盒中的用途。

附图简述

结合非限制性实施例以及附图的详细说明，将更好地理解本发明，在所述图中：

图1示意性描述了乳杆菌/大肠杆菌(E.coli)穿梭载体(A)和用于产生尘螨变应原(dust mite allergen)表达构建体的中间载体。

图2示意性描述了其他乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体。

图3显示了本发明的重组乳杆菌中包含的其他表达载体。

图4显示本发明的重组乳杆菌中包含的另一个表达载体。

图5显示蛋白质免疫印迹检测Der p2在两个乳杆菌菌株:干酪乳杆菌Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中的异源表达。

图6显示干酪乳杆菌Shirota-eGFP移位到淋巴集结的T细胞和B细胞区域中。

图7通过透射电子显微术显示完整的干酪乳杆菌Shirota-eGFP移位到淋巴集结的单形和多形细胞的液泡(vacoule)中。

图8显示在体外与干酪乳杆菌Shirota共培养的T细胞中诱导产生TGF-β。

图9描述Der p2特异性T细胞增殖，以及调节性CD4⁺CD25⁺T细胞在重组Lc/Dp2饲喂小鼠中增加。

图10描述用于动物研究的预防方案。

图11显示Der p2特异性免疫球蛋白应答。

图12描述脾T细胞的细胞因子谱。

图13描述肠系膜淋巴结(MLN)细胞的细胞因子谱。

图14显示小鼠中细支气管(broncholalveolar)肺泡灌洗液(BALF)的细胞因子谱。

图15描述小鼠中BALF分析和肺的组织学。

图16描述用于动物研究的治疗方案。

图17显示小鼠中Der p2特异性免疫球蛋白应答。

图18显示脾T细胞中所选细胞因子的谱。

图19显示肠系膜淋巴结细胞中所选细胞因子的谱。

图20描述肺中的病理生理学变化和细支气管液体分析。

图21显示BALF的细胞因子的谱。

图22描述用Der p2变应原预先致敏的小鼠治疗模型。

图23显示全身免疫球蛋白应答和T细胞细胞因子。

图24显示治疗模型假说。

图25显示用于分析皮下引发对小鼠的效应的实验方案原理图(未应用佐剂)。

图26描述小鼠中Der p2特异性体液应答的动力学。

图27描述在脾CD4⁺T细胞的细胞因子谱上的RT-PCR分析。

图28描述培养物中淋巴结的细胞因子谱。

图29显示SP培养物的细胞因子谱。

图30描述抗原特异性TH2细胞与CD4⁺CD25⁺细胞共培养后的增殖和细胞因子应答。

图31描述用于使用表达Blo t5变应原的重组干酪乳杆菌Shirota的动物研究中的方案。

图32描述通过ELISA分析Blo t5特异性血清免疫球蛋白(也参照图31)。

图33描述在图34描述的方案中处死的小鼠的细胞因子分析。

图34描述表达载体pLP400中变应原Blo t5的核酸序列和氨基酸序列。

图35描述表达载体pLP500中变应原Der p2的核酸序列和氨基酸序列。

表I描述通过实时PCR测定的脾CD4⁺T细胞的TH2细胞因子谱。

发明详述

本发明提供重组乳杆菌。乳杆菌是众所周知的形态从长细棒状变化至短球杆菌的革兰阳性菌，其经常形成链。本发明的重组乳杆菌可以是任何乳杆菌。目前已知91种乳杆菌属。各乳杆菌的实例包括但不限于，干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、孢子乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、莱氏乳杆菌(Lactobacillus leishmanis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、高加索乳杆菌(Lactobacillus caucasicus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，以这些为例。虽然许多乳杆菌，如路氏乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌能够在胃肠道中建群，即为“可移植的”，但认为一些乳杆菌如保加利亚德氏乳杆菌(L.delbrueckiibulgaricus)和乳酸乳杆菌(L.lactis)是暂时非移植的菌丛。本发明适用于本发明乳杆菌的任一菌株，无论所述菌株是可移植的还是不可移植的。为方便使用(参照下文)，在一些实施方案中期望选择能够移植的菌株。

可使用各乳杆菌的任何亚种和菌株。作为示例性实例，有几种已知的干酪乳杆菌亚种，如干酪乳杆菌干酪亚种(L.casei subspecies casei)、干酪乳杆菌副酪亚种(L.casei subspecies paracasei)。干酪乳杆菌菌株的实例包括干酪乳杆菌菌株KE99、干酪乳杆菌菌株CRL 431、干酪乳杆菌菌株BL155、干酪乳杆菌菌株Shirota和干酪乳杆菌N19。鼠李糖乳杆菌菌株的实例包括但不限于鼠李糖乳杆菌菌株MTCC 1408、鼠李糖乳杆菌菌株HN001、鼠李糖乳杆菌菌株Lcr35和鼠李糖乳杆菌菌株GG。也称为乳杆菌GG(Gorbachi & Goldini)的鼠李糖乳杆菌GG最初分类于嗜酸乳杆菌。已提示其分类为干酪乳杆菌并也已计划重分类为特殊种L.zeae。在下文中将其称为鼠李糖乳杆菌GG。

重组乳杆菌包括异源核酸序列，其编码螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。因此，各核酸序列对应多肽的氨基酸序列。因而，由异源核酸序列编码的螨变应原的至少免疫原性片段包括多肽或为多肽。关于变应原的“片段”指存在于各变应原的多肽中的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“片段”指缺少翻译后修饰，如糖或糖链，其存在于各天然发生的变应原中。在此类实施方案中，各变应原片段的氨基酸序列可是为任何长度，无论是变应原的任何天然发生形式的全长或部分全长序列(包括变体)。在其他实施方案中，术语“片段”指存在于各变应原的多肽中的任何氨基酸序列，其比变应原的天然发生形式的全长序列短。各变应原的天然发生形式理解为成熟的全长蛋白质，其通常来自前体蛋白质。作为变应原Der p1a前酶原(preproenzyme，称为DERP1_DERPT)的示例性实例，已知其存在于体内，其为UniProtKB/Swiss-Prot登录号P08176(二级登录号Q24616)和NCBI登录号AAB60215的前体。该前体为320个氨基酸，然而NCBI登录号2AS8_A和2AS8_B的成熟并完全活化的变应原Der p1为222个氨基酸。已知其他螨变应原的类似前体，如UniProtKB/Swiss-Prot登录号P49278(称为ALL2_DERPT)的变应原Der p2前体(Der p II)(DPX)。在此类实施方案中，在各天然发生的变应原中发现的翻译后修饰可能以任何程度存在于片段中。

在一些实施方案中，本发明乳杆菌中包括的核酸序列编码螨变应原片段，其包括至少8％的天然发生的(即成熟的全长蛋白质，各螨变应原的形式)氨基酸序列。作为示例性实例，重组乳杆菌可包括编码螨变应原Derp1的至少免疫原性片段(或其各自的免疫原性同源物)的异源核酸序列。所述片段在该情况下可包括至少8％的Der p1的氨基酸序列。在这些实施方案的一些中，该片段因而可包括氨基酸序列的任何一个或多个部分，所述氨基酸序列对应8-100％，如10-100％、例如15-100％，包括25-100％的天然存在螨变应原的完整氨基酸序列。在一些实施方案中，该片段因而可包括部分，其为天然存在螨变应原氨基酸序列各部分的免疫原性同源物(参照下文)。

当提及核酸序列或分子时，术语“异源的”指不是已经引入(或正在引入)所述核酸分子的对应杆菌或细胞中天然发生的核酸序列。异源核酸序列因而来自对应杆菌和细胞之外的来源，并可天然发生和非天然发生。各异源核酸序列例如可整合到乳杆菌染色体中或整合到存在于乳杆菌中的任何其他核酸分子(如载体(参照下文)或RNA分子)中。

螨变应原基于它们的生化组成、序列同源性和分子量分为特定的组。表征的变应原的名称是属的前三个字母，种名称的第一个字母和最后的编号。最后的编号表示分离变应原的顺序或与其同源的其他已经表征过的变应原的编号。本发明乳杆菌中包括的异源核酸序列完整编码的螨变应原片段或各免疫原性同源物形式的螨变应原，通常为Der p1、Der p2和Blo t5。作为示例性实例，重组乳杆菌可以是干酪乳杆菌，并且其中包括的异源核酸序列可编码螨变应原Der p2。

如上早已表明，本发明重组乳杆菌中包括的异源核酸序列编码螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。如此处所用，术语“变应原”指能诱导个体或动物中变态反应的分子。如上所述，变应原能诱导免疫应答，即刺激淋巴细胞产生抗体或直接攻击变应原。因此，变应原是由免疫系统识别的抗原，并可引起变态反应。该变态反应可通过与变应原任何形式的直接接触如摄食(例如进食或饮水)、吸入或例如经皮肤直接接触引起。通常，包括变应原的抗原为多肽，如蛋白质，或多糖。在本发明的上下文中，术语抗原指任何多肽，其可包括任何修饰，如糖或脂类。它也指称为半抗原的短肽，其通常偶联到比半抗原大的载体分子(例如蛋白质)或偶联到细胞上。

如此处所用，术语“免疫原性的”指引起免疫应答的物质的能力，即成为免疫活性的能力。因此，当在一些实施方案中用于变应原的片段时，对应片段其自身能引起免疫应答，例如当向个体或动物施用时。然而应指出变应原的免疫原性片段自身不需要具有引起免疫应答的能力。在一些实施方案中具有免疫活性的能力更依赖于偶联到额外物质上的片段。在一些实施方案中，该偶联到额外分子例如通过结合至蛋白质在体内发生。因此，在一些实施方案中，变应原的免疫原性片段包括，或为半抗原，其需要偶联到载体分子上或偶联到细胞上以显示其免疫原性质。当变应原的免疫原性片段包含在异源核酸序列中时，其因而可以为任何序列长度或大小，只要所获的肽(其在体外、离体或体内转录和翻译)无论其自身或当与额外物质偶联时能引起免疫应答。在典型实施方案中，螨变应原或其片段能结合至少一个IgE抗体。各抗体例如可通过个体或动物的抗体对螨类如粉尘螨为变应性的或敏感性的。通常，变应原的各片段包括至少一个表位。然而在一些实施方案中，可能需要组合变应原的两个或更多片段以获得各表位，例如当偶联到相同的载体分子上时。也称为抗原决定簇的表位是抗原分子的一部分-在该情况下抗原分子可由抗体的抗原结合位点或通过T细胞受体识别并结合。不同的抗体和T细胞受体结合抗原的不同表位。例如Der p2的两个表位是已知的，来自患有变应性鼻炎的日本患者的T细胞能结合到所述表位上，已知其他两个表位被来自相同患者的T辅助细胞结合。

如此处所用，当用于螨抗原或其免疫原性片段时，术语“免疫原性同源物”意思是与各天然存在的螨抗原具有高度同源性的多肽，并且其可被对相应天然存在的螨抗原有活性的至少一种抗体或T细胞受体特异性识别并结合。在典型的实施方案中，该片段与天然存在的螨抗原(包括其免疫原性片段)的对应氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。在一些实施方案中，各片段与天然存在的螨抗原的对应氨基酸序列具有至少80％、如至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。“序列同一性”指测量它们相似性或关系的序列性质。该术语指在已知螨抗原的氨基酸序列或核酸序列与分别正在讨论的氨基酸序列或核酸序列进行同源性比对后获得的配对相同残基的百分比，其中所述百分比数字指两条序列中较长序列中残基的数目。

本发明也包括的是与上文的核酸序列基本互补的核酸序列。如此处所用，“基本互补”指这样的事实，给定的核酸序列与另一条核酸序列至少90％，例如至少95％，并在一些实施方案中100％互补。术语“互补”或“互补序列”指可相互形成多个有益的相互作用的两个核苷酸。该多个有益相互作用包括沃森-克里克碱基配对。核苷酸序列是另一条核苷酸序列的互补序列，如果第一条序列的所有核苷酸与第二条序列的所有核苷酸互补的话。

在一些实施方案中，重组乳杆菌还能表达螨变应原的至少免疫原性片段，或其各免疫原性同源物。在此类实施方案中，编码变应原、片段或其免疫原性同源物的各序列可有效连接到在宿主细胞中有效启动转录的启动子上。重组核酸也可包含在细胞中起作用的转录起始区、与编码激酶多肽的RNA序列互补的序列和在细胞中起作用的转录终止区。在一个实施方案中，重组乳杆菌表达螨变应原、或其片段、或各免疫原性同源物。

可通过向其中引入异源核酸序列从天然发生的乳杆菌中获得重组乳杆菌。作为示例性实例，编码螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的序列可包括在异源序列分子(如异源多核苷酸)中。编码本发明变应原的核酸分子和有效连接的启动子可作为非复制DNA或RNA分子引入到乳杆菌中，所述分子可以是线性分子或闭合共价环状分子。作为示例性实例，DNA分子可稳定整合到乳杆菌的染色体中。可使用载体，其能将期望的基因序列整合到乳杆菌的染色体中。作为示例性实例，在美国专利5,747,310中已公开了使用质粒pAMβ1将L-乳酸脱氢酶基因整合到德氏乳杆菌的染色体中替代D-乳酸脱氢酶。期望时，也可通过引入一个或更多标记物来选择它们染色体中已经稳定整合有引入的DNA的乳杆菌，所述标记物允许选择含有表达载体的宿主细胞。

如此处所用，术语“核酸分子”指任何可能构型(如单链、双链或其组合)的任何核酸。核酸包括例如DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA类似物和PNA(蛋白质核酸)。DNA或RNA可以是基因组或合成来源，并可以是单链或双链的。在本发明中，RNA或DNA通常但不必须包括在重组乳杆菌中。此类核酸分子可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。各核酸分子可进一步含有非天然核苷酸类似物和/或连接到亲和标签或标记物上(参照上文)。

许多核苷酸类似物为已知的并可存在于本发明乳杆菌包括的核酸序列中。核苷酸类似物是例如在碱基、糖或磷酸部分含有修饰的核苷酸。作为示例性实例，已知用2′F、2′O-Me或2′H残基替代siRNA的2′-OH残基来提高各RNA的体内稳定性。碱基部分处的修饰包括A、C、G和T/U、不同嘌呤或嘧啶碱基(如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基)的天然修饰及合成修饰。其他核苷酸类似物为通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能与任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰经常与例如糖修饰(如2′-O-甲氧基乙基)组合例如来实现独特性质(如提高的双链体稳定性)。

在一些实施方案中，异源核酸可包括在异源核酸分子(例如质粒或载体)中，其不整合到乳杆菌的染色体中。因此，在该情况下，重组乳杆菌除它的染色体外还包括异源核酸分子。各载体可含有一种或更多调节序列，如启动子、增强子、沉默子或终止子序列。此类调节序列可控制(例如便于)载体复制或编码序列的转录和/或翻译。各载体的示例性实例是表达载体。在一些实施方案中，变应原可处于诱导型启动子的控制下。作为示例性实例，由抗微生物肽乳链菌肽控制的表达系统已经用于植物乳杆菌中(Pavan，S.等，Applied and Environmental Microbiology(2000)66，4427-4432)。在其他实施方案中，变应原可以以组成型活性方式表达。作为示例性实例，保加利亚德氏乳杆菌PrtB启动子控制下的蛋白酶PrtB和破伤风毒素模拟表位的融合蛋白在约氏乳杆菌中的组成型表达已经由Scheppler等公开(Vaccine[2002]20，2913-2920)。

术语“载体”涉及单链或双链环状核酸分子，其可引入(例如转染)至细胞中并在细胞基因组中复制或独立复制。可切割环状双链核酸分子，并因而在限制性内切酶处理后将其线性化。本领域技术人员可容易地获得多种核酸载体、限制性内切酶和限制性内切酶切割的核苷酸序列的知识。可通过用限制性内切酶切割并连接两段将编码变应原或其片段的核酸分子插入到载体中。例如已基于来自乳酸产生细菌的隐蔽性质粒发展了很多载体(对于综述参照Shareck等，Critical Reviews in Biotechnology(2004)，24，155-208)。隐蔽性质粒为染色体外DNA元件，其除了它们的复制功能外不具有任何明显功能，即不编码可辨别表型。σ复制和θ复制质粒是乳酸产生细菌中最常见质粒。

起源于植物乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pcaT、pA1、pLP1、p8014-1、pC30i1、pLB4、pLP2000、pLP9000、pLKL、pLKS和pMD5057。起源于发酵乳杆菌的载体的实例包括但不限于pLY2、pLY4、pLEM3、pLF1311和pKC5b。起源于嗜酸乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于p1、p3、pPM4、pLA103、pLA105和pLJ106。来自其他乳杆菌种的许多其他隐蔽性质粒为本领域已知(参照例如Shareck等，上文)。任何上述质粒可用于产生载体(包括表达载体)以获得本发明的乳杆菌。来源于植物乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pcaT、pA1、pULP8、pULP9、pLP825、pLP82H、pLPC37、pPSC1、pPSC11、pPSC22、pLPV106、pLPIII、pLEM5、pLEM7和pLFVM2，仅以这些为例。起源于发酵乳杆菌的隐蔽性质粒的实例包括但不限于pLY2、pLY4、pLEM5、pLEM7、pLFVM2和pSP1。

如上述实例之一的隐蔽性质粒，例如可用于构建穿梭载体，所述穿梭载体可用于获得本发明的重组乳杆菌。作为示例性实例，从干酪乳杆菌中分离的隐蔽性质粒pLC494已经用于使用分离的质粒pLC494和分离的产气荚膜杆菌/大肠杆菌质粒pJIR418通过遗传改造技术构建乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体(pJLE4941)(An，H-Y，Miyamoto，T.，Plasmid(2006)55，128-134)。各穿梭载体可在各自的宿主物种，即大肠杆菌和乳杆菌中复制。乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体的另一个示例性实例是从保加利亚德氏乳杆菌质粒pLB10和大肠杆菌质粒pBR328构建的质粒pLE16。起源于隐蔽性质粒的表达载体的两个其他示例性实例是pLP400和pLP500，其为两个其他乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体。作为另一个实例，大肠杆菌表达载体pLF22通过包括来自发酵乳杆菌的隐蔽性质粒pLF1311的复制子已经适用于乳杆菌中。

作为获得本发明重组乳杆菌的示例性实例，螨变应原基因Der p2可经遗传改造并克隆至pL500乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体(参照图1和以下实施例)或对应的载体pL400中。pLP400和pLP500穿梭载体含有来自乳杆菌DNA序列的表达信号和复制元件。携带Der p2基因的这些重组载体pLP400和pLP500可引入乳杆菌中。将核酸引入乳杆菌的多种方法为本领域技术人员已知，如转化、转染、注射或电穿孔。各载体例如经电穿孔进入乳杆菌如干酪乳杆菌Shirota(L.c)或鼠李糖乳杆菌gg(L.gg)中。图5显示检测了通过蛋白质免疫印迹，电穿孔后Der p2在这两个菌株中的细胞内表达(图5)。

作为另一个示例性实例，从质粒pSIP300获得的载体乳杆菌表达载体pSIP308或从质粒pSIP401获得的载体乳杆菌表达载体pSIP412也可经遗传改造并引入乳杆菌中(参照图3和图4)。

等(Microbiology(2005)151，2439-2449)近期已公开了这些及其他相关表达载体的产生及它们在植物乳杆菌和沙克乳杆菌中的用途。本领域的技术人员将注意到这样的事实，可能需要一些修饰以使用这些载体用于其他乳杆菌如干酪乳杆菌或发酵乳杆菌。

通常，螨变应原是Der p1、Der p2或Blo t5(也参照下文)。变应原Der p1例如可以由NCBI登录号U11695的1099个碱基对序列编码。它也可以由NCBI登录号AY947536的650个碱基对序列或NCBI登录号AF276239的591个碱基对序列或包括NCBI登录号AY947536的650个碱基对序列或NCBI登录号AF276239的591个碱基对序列的序列编码。

在螨变应原是Der p2的一些实施方案中，该变应原由SEQ ID NO：1的序列编码(参照图35)。在螨变应原是Blo t5的一些实施方案中，该变应原由NCBI登录号U59102的537个碱基对序列或包括NCBI登录号U59102的537个碱基对序列的序列编码。在螨变应原是Blo t5的一些实施方案中，螨变应原的至少免疫原性片段由SEQ ID NO：2的序列编码(参照图34)。SEQ ID NO：2的序列编码UniProtKB/Swiss-Prot登录号O96870(二级登录号Q17283；对应NCBI登录号O96870和AAD10850)的134个氨基酸序列的117个氨基酸的C末端片段。在一个别的实施方案中，异源核酸分别包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NQ：2的序列。在其他实施方案中，异源核酸包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NQ：2的功能等同物。遗传密码子的简并性允许某些密码子被定义相同氨基酸的其他密码子替代，并因此生成相同的蛋白质。核酸序列大体上可进行变化，因为除甲硫氨酸和色氨酸外，已知氨基酸可由多于一个密码子来编码。因此，从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列获得的部分或完整氨基酸序列可由显著不同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中显示的核酸序列转录。然而，其编码的氨基酸序列是保守的。

此外，核酸序列可包括核苷酸序列，其起因于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的核酸序列5′末端和/或3′末端添加、缺失或替代至少一个核苷酸，或其衍生物。任何核苷酸或多核苷酸可用于该方面，只要其添加、缺失或替代不破坏各转录多肽的免疫原性质。作为示例性实例，编码螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的核酸分子必要时具有添加到其5′末端和/或3′末端的限制性内切酶识别位点。

在一些实施方案中，螨变应原是Der p2，并且异源核酸序列编码Derp2的免疫原性同源物。该异源核酸序列例如可具有与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列(参照上文)。在一些这些实施方案中，所述异源核酸序列可具有与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少90％同一性(如至少95％的同一性)的核酸序列。相应地，在一些实施方案中，所述螨变应原是Blo t5，并且异源核酸序列编码Blo t5的免疫原性同源物。该异源核酸序列例如可具有与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列(参照上文)。在一些这些实施方案中，所述异源核酸序列可具有与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％同一性(如至少95％的同一性)的核酸序列。

本发明也展示了如上所述用于治疗的重组乳杆菌。各治疗的示例性实例是如下详细描述的调节对变应原的免疫应答。在用于治疗的实施方案中，所述重组乳杆菌以适合于向生物体(例如哺乳动物，如人)施用的形式提供。作为示例性实例，所述重组乳杆菌可包括在食物中来提供。包括重组乳杆菌的食物各形式的实例包括但不限于酸乳、酸菜、泡菜、韩国泡菜(Korean kimchi)、乳酪、酵母酪乳面包和青贮饲料。

适合于施用的各形式的其他实例是药物组合物。本发明的药物组合物包括如上所述的重组乳杆菌。所述重组乳杆菌可以是任何活性状态。它例如可以是活的并完全活跃的，进行新陈代谢并复制的(例如参照图25和图26)。作为其他实例，所述重组乳杆菌至少在一定程度上是例如通过热处理而灭活的。例如期望热灭活以破坏不耐热的补体蛋白质。在一些实施方案中，所述重组乳杆菌可以是死的。在一些这些实施方案中，所述重组乳杆菌因此可以是完整的，无论是活的还是死的。在其他实施方案中，其可以是正在分解的或已经分解的。重组乳杆菌的结构例如可以是部分或完全瓦解的，包括存在任何程度的细胞碎片。

在一些实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的重组乳杆菌。如此处所用，短语“治疗有效量”指在必要剂量和时期达到期望的治疗结果的重组乳杆菌的量。施用时，它例如完全或至少一定程度上缓解或减轻正在治疗的变应性疾病的一种或更多症状。重组乳杆菌的精确治疗有效量将依赖于许多因素，包括但不局限于，疾病状态、治疗的受试者年龄、性别和体重、受试者对各变应原的敏感程度、和变态反应的严重程度、制剂的性质、和给药途径，并将最终由主治医师或兽医决定。可调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。通常，重组乳杆菌将以每个受体(动物)每天约10⁹至约10¹¹CFU(菌落形成单位)的范围(如每天约5 x 10¹⁰CFU的范围)给出用于治疗。可接受的每日剂量为每个受体(动物)/天约10⁹CFU至约10¹¹CFU，并例如特别约5 x 10¹⁰CFU至约5 x 10¹¹CFU/天。当然，可施用不同量的药物组合物以实现有效量的施用，或者具有适应相对量的乳杆菌的药物组合物可用于施用。作为示例性实例，当施用时，药物组合物可包括适合于达到约5 x 10¹⁰CFU至约5 x 10¹¹CFU重组乳杆菌的每日剂量范围内的量作为治疗有效量。

在一些实施方案中，药物组合物包括预防有效量的重组乳杆菌。如此处所用，短语“预防有效量”指在必要剂量和时期达到期望的预防结果(如当施用时，其完全或至少一定程度上预防正在治疗的变应性疾病的一种或更多症状)的重组乳杆菌的量。可如上对确定治疗有效量所述来确定预防有效量。对于任何特定受试者，可根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断在一定时期内调整特定的剂量方案。对于预防，重组乳杆菌例如将以每个受体(动物)每天约10⁹CFU至约10¹⁰CFU的范围(如每天约5x109CFU的范围)给出。作为示例性实例，当施用时，药物组合物可包括适合于达到约10⁹CFU至约10¹⁰CFU重组乳杆菌的每日剂量范围内的量作为预防有效量。

药物组合物还包括可药用载体、稀释剂或赋形剂。可使用任何载体或稀释剂，其不消除重组乳杆菌的免疫调节活性。如果需要，可选择载体或稀释剂，其丝毫不影响重组乳杆菌的免疫调节活性。载体可以是例如包含水(例如生理盐水)、羧甲基纤维素钠水溶液或聚乙烯吡咯烷酮溶液、乙醇、多元醇如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇、其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。合适载体的示例性实例是脂质体。合适赋形剂的实例包括但不局限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。药物组合物可额外包括，例如润滑剂(如滑石、硬脂酸镁和矿物油)、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂(如苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和调味剂。稳定剂也可包括在药物组合物中。合适稳定剂的实例包括但不局限于，碱土金属磷酸氢盐、谷氨酸、血清白蛋白、明胶或酪蛋白。佐剂也可包括在药物组合物中，例如表面活性物质如十六烷胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、甲氧基十六烷基甘油、和pluronic多元醇、多胺如吡喃、硫酸葡聚糖、多IC、聚羧乙烯；肽如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽、油乳剂，和矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝。佐剂可以为，例如铝或含有植物油的组合物、单油酸异二缩甘露醇酯和单硬脂酸铝的组合物。佐剂的其他实例包括生物相容基质材料的微粒或珠子。药物组合物可进一步包括防腐剂，如抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞。

药物组合物可以例如为固体形式(如片剂或丸剂)，或为液体形式。作为液体形式的示例性实例，包括用于口服施用或通过注射施用的重组乳杆菌的组合物可以是水溶液、合适的香味糖浆剂、水性混悬剂或油性混悬剂、或具有食用油如芝麻油、椰子油、棉子油、或花生油的香味乳剂、或酏剂。

在一些实施方案中，药物组合物还包括皮质类固醇、抗组胺剂、白三烯调节剂、肥大细胞脱粒抑制剂(肥大细胞稳定剂)、减充血剂和β2肾上腺素受体激动剂的至少一种。

皮质类固醇通常能降低或清除变应性炎症。将皮质类固醇包括进本发明的药物组合物例如可以靶定呼吸道重塑的预防及哮喘中正常肺功能的实现。合适皮质类固醇的实例包括但不限于皮质醇、氢化可的松、醋酸氢化可的松、皮质酮、地塞米松、强的松、甲基强的松龙、氯氟美松酮、甲基强的松龙、泼尼卡酯、二氟美松、氟轻松、莫米松、倍他米松、氟考龙、氟轻松、amcinoid、fluocinoid、halcinoid、氟地松和去炎松。

抗组胺剂如H1-抗组胺剂、H2-抗组胺剂或H4-抗组胺剂是能通过结合组胺受体阻断组胺效应的分子。组胺通常在免疫应答过程中例如从肥大细胞释放。已发现一些分子如H2-抗组胺剂甲腈咪胍和硫替丁为反向激动剂(在H2-受体处)。然而，目前认为大多数抗组胺剂为受体拮抗剂。H1-抗组胺剂的实例包括但不限于乙二胺如美吡拉敏(新安替根)或安他唑啉，乙醇胺如可他敏、卡比沙明、多西拉敏、克立马丁或茶苯海明，烷基胺如phenirarnine、氯苯那敏(氯苯那敏)、dexchlorphenamine、溴苯吡胺或苯丙烯啶，哌嗪如赛克利嗪、羟嗪、或氯苯甲嗪和三环H₁-抗组胺剂如普鲁本近、阿利马嗪(阿利马嗪)、赛庚啶、阿扎他定或氯雷他定。H₁-抗组胺剂的其他实例包括但不限于二甲茚定、新敏乐、阿司咪唑、西替立嗪、左西替利嗪、氯雷他定、咪唑斯汀、特非那定、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、氮卓斯汀、左卡巴司汀和奥洛他定。

H₂-抗组胺剂的实例包括甲腈咪胍、硫替丁、拉呋替丁、法莫替丁和雷尼替丁。认为是H₄-受体拮抗剂的H₄-抗组胺剂的示例性实例是噻普酰胺。

白三烯是由组织中血液炎症细胞响应变态反应和炎性刺激物而释放的分子。白三烯调节剂(也称作抗白三烯)通过干扰它们的生物合成或各自的受体降低白三烯的效果。白三烯调节剂具有细支气管舒张作用和抗炎作用。合适的白三烯受体拮抗剂的实例包括但不限于孟鲁司特和扎鲁司特。干扰白三烯生物合成的白三烯调节剂的示例性实例为脂加氧酶抑制剂弃白通。

肥大细胞脱粒抑制剂阻断了组胺和其他调节剂从肥大细胞的释放。合适的肥大细胞抑制剂的两个示例性实例为色甘酸钠和萘多罗米。

减充血剂(上文)的示例性实例是甲基黄嘌呤衍生物，如咖啡因、茶碱、可可碱、氨茶碱、多索茶碱、己酮可可豆碱。两个其他示例性实例为麻黄碱和假麻黄碱。

β2肾上腺素受体激动剂是强细支气管舒张剂。它们尤其用于治疗哮喘。β2肾上腺素受体激动剂的实例包括但不限于叔丁喘宁、奥西那林、soprenaline、fenoterole、沙丁胺醇和福莫特罗。

在一些实施方案中，药物组合物还包括变应原、变应原的免疫原性片段(包括下文进一步详细描述的各自的免疫原性同源物)。各变应原例如可以是昆虫变应原、螨变应原(如尘螨变应原，包括仓储螨变应原)、植物变应原或引起哺乳动物(包括人)变态反应的任何其他化合物。在一些实施方案中，所述变应原与重组乳杆菌的异源核酸序列编码的螨变应原交叉反应。通常，此类交叉反应性变应原包括与螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物(由重组乳杆菌中包括的各序列编码，例如由乳杆菌表达(也参照下文))的至少一个共同表位。作为示例性实例，已知其他无脊椎动物的许多变应原与螨变应原如蟑螂变应原、衣鱼(Lepisma saccharina)和摇蚊变应原、虾变应原和蜗牛变应原交叉反应。

本发明还展示了包括上述药物组合物的药盒。所述药盒除了包括本发明重组乳杆菌的药物组合物，还包括变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。通常，药盒中包括的各变应原或其免疫原性片段(包括各免疫原性同源物)包括在药物组合物中。变应原或变应原片段(包括其免疫原性片段)和乳杆菌以任何组合包括在药盒中。它们例如可以是相同药盒中包括的相同药物组合物的部分或两种单独药物组合物的部分。

变应原可以是药物组合物的部分或单独包括在药盒中。药盒例如可以是多部分药物包装，其中变应原或变应原片段(包括各免疫原性同源物)保持独立于药物组合物之外(其可能包括本发明的重组乳杆菌)。然后在施用前将其混合或旨在与药物组合物分别施用。变应原可以是具有变应原性质的任何物质，通常为蛋白质、多肽或多糖。通常，所述变应原为参与变应性疾病的变应原。所述变应性疾病可以是任何形式的免疫系统过度敏感。所述变应性疾病可以在如下症状中表现自己：如搔痒、皮疹或荨麻疹、湿疹、皮炎(特应性皮炎或接触性皮炎)、鼻子或眼的排液、窦压迫、咽喉痛、喘鸣、咳嗽、呼吸急促、嘴、唇或咽喉肿胀、或消化问题症状。其可以是皮肤变态反应或呼吸道变态反应(如哮喘)。变应性疾病可以是对任何特定变应原的应答。在一些实施方案中，所述变应性疾病是螨变态反应，如尘螨变态反应，包括房尘螨变态反应。

在一些实施方案中，包括治疗有效量或预防有效量的如上述药盒或药物组合物中包括的变应原。与重组乳杆菌类似，重组乳杆菌精确的治疗或预防有效量将依赖于许多因素，如变应原的类型和上文中同样指出的因素。通常，变应原的量在约1-1000μg范围内。当然，在一些实施方案中，所述变应原每周施用一次，而在一些实施方案中每月施用一次。在其他实施方案中，所述变应原在治疗开始时每周施用一次，然后递减至每月施用一次用于维持。因此，变应原的剂量依赖于递送的类型和方式。作为示例性实例，对于注射，日剂量可以在约0.1至约10μg范围内。对于舌下或经口递送，日剂量例如可以在约10至100μg/递送范围内。药盒例如可以包括药物组合物，其包括适合达到约1μg至约100μg变应原的剂量的范围的量作为有效量。

在一些实施方案中，药盒中包括的变应原为螨变应原。在一些实施方案中，该螨变应原是住家螨的变应原。在一些实施方案中，核酸序列编码尘螨变应原，如房尘螨变应原或仓储螨变应原。如此处所用，术语“尘螨”指灰尘中存在的螨。因此，术语“房尘螨”理解为房尘中存在的螨。房尘螨因而包括但不限于无气门目(Astigmata)和蚍螨科(Pyroglyphidae)。迄今在房尘中已鉴定了13种螨。如上文中部分指出，它们中的三种，粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和宇尘螨(Euroglyphus maynei)(其均发现于温带气候)是世界范围内家庭常见的并且是螨变应原的主要来源。热带气候中房尘螨的示例性实例是仓储螨热带无爪螨(Blomia tropicalis)(Echymyopodidae科)。许多其他仓储螨可见于家庭中并为变应原的潜在来源。其他种的实例包括在，但不局限于甜食螨科(家甜食螨和害鳞嗜螨)、螨科(腐食酸螨和粗脚粉螨)，和嗜渣螨科(Chortoglyphus ancutatus)。例如已经发现害鳞嗜螨是瑞士哥特兰岛农田灰尘(干草灰尘和室尘)中最主要的变应原。室尘中存在的螨的其他实例包括捕食螨(例如Cheyletus)和寄生的太平洋革螨，包括植物的2点革螨(叶螨和似虱螨)。

在其他实施方案中，所述螨例如可以是水螨，如水螨亚股、耳螨(犬耳痒螨)、犬的脂螨(犬脂螨)、桔全爪螨(柑桔全爪螨)、住宅小鼠螨(Liponyssoides sanuineus)、热带大鼠螨(热带鼠螨)、鸟螨(囊形刺脂螨)、鸡螨(鸡皮刺螨)、林禽刺螨(北方刺脂螨)、兽疥螨(疥螨)、羊痂螨(羊痒螨)、谷痒螨(麦蒲螨)、竹螨(Stigmaeopsis longus)、欧洲恙螨(Panonychus ulmi)、小麦卷叶螨(Aceria tosichella)、麦长腿蜘蛛(麦长腿蜘蛛)、草地螨(Oligonychus pratensis)、草莓革螨(Tetranychusturkestani)、三叶草螨(Bryobia praetiosa Koch)或蜜蜂的瓦螨(大蜂螨)，仅以这些为例。许多这些螨例如也可以存在于室尘中。药盒中包括的螨变应原也可以是起源于家畜，例如家畜(如绵羊、猪和猫)的螨的变应原，或其免疫原性片段。实例包括但不限于牛足螨、羊痒螨、猪疥螨和猫耳螨。螨变应原是来自螨，特别是螨身体或螨粪便的蛋白质或蛋白质部分。例如表皮螨的1、3、4、6、8和9组变应原为酶，然而10、11和13组变应原已知分别为原肌球蛋白、副肌球蛋白和脂肪酸结合蛋白。大多数螨变应原(包括尘螨变应原)来自螨的消化道并因此以高水平见于螨粪便中。螨变应原的典型实例是来自螨消化道的酶。作为示例性实例，来自屋尘螨的变应原Der p6在底物亲和力方面已经表征为螨胰凝乳蛋白酶。作为其他示例性实例，来自屋尘螨的变应原Der p1是半胱氨酸蛋白酶。螨变应原的其他示例性实例是与螨从一个生活阶段变化到下一个阶段时发生的蜕皮过程相关的酶。作为示例性实例，已经发现来自屋尘螨的变应原Der p2与esr16连续同源，所述esr16是蛾在蜕皮的同时表达的蛋白质。螨变应原的另一示例性实例是螨食用的食物基质环境中残留的螨唾液成分。

螨变应原的实例包括但不限于Der p1、proDer p1、Der p2、Der p3、Der p4、Der p5、Der p7、Der p8、Der p9、Der p10、Der p11、Der p14、Der p15、Der p18、Der f1、Der f2、Der f3、Der f4、Der f5、Derf6、Der f7、Der f10、Der f11、Der f15、Der f16、Der f18、Der m1、Eur m1、Eur m2、Her f2、Blo t1、Blo t3、Blo t5、Blo t12、Fel d1、Mag 1、Mag 3、Tyr p2、Lep d1、Lep d2、Lep d5、Lep d7、Lep d10和Lep d13。在一些实施方案中，药盒中包括的螨变应原(包括其片段或各同源物)包括至少一种常见表位(参照上文)，所述表位具有重组乳杆菌表达的螨变应原(包括其片段或各同源物)。在该方面，应当指出一些变应原是不同的螨种类共有的，而其他变应原是所选螨种类独有的。作为实例，粉尘螨与屋尘螨和腐食酸螨共有若干变应原。虽然任何螨变应原可用于本发明，但在一些实施方案中因而期望选择例如与仅很少数螨类共有或除目的螨类外无其他螨类共有的抗原。在一个实施方案中，螨变应原因而例如是与重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物交叉反应的螨变应原。在另一个实施方案中，药盒中包括的螨变应原是重组乳杆菌表达的螨变应原、螨变应原片段，或各自的同源物。

可从任何来源获得各变应原或其片段，包括免疫原性同源物。其例如来自天然来源或是已经合成的。例如从已知或怀疑含有变应原的来源中富集、纯化或分离它。在尘螨变应原的情况下，例如可收集灰尘、螨的唾液或螨的粪便来富集、纯化或分离变应原或其变应原片段。也可从天然产生多肽的生物、组织或细胞中富集、纯化或分离变应原或片段。或者，变应原或其片段可以在任何生物中表达为多肽，通常为重组或转基因形式。在一些实施方案中，通过富集、纯化或分离的任何一种从重组生物中(如重组微生物)获得变应原(包括其免疫原性同源物)或变应原的免疫原性片段(包括其免疫原性同源物)。在期望获得具有天然发生变应原中存在的翻译后修饰的变应原或片段时，选择表达翻译后修饰所必需酶的真核生物或原核生物是有益的。富集变应原的示例性实例是各变应原的提取物，例如供应为旨在皮下、皮内或舌下施用的无菌溶液。此类变应原提取物是可通过商业途径获得的，例如来自Hollister-Stier实验室的“PMG Mite Mix/G33G3805”、来自Stallergenes的“Staloral”(用于舌下递送)、来自Greer的变应原提取物标准话螨(Allergenic Extract Standardized Mite)或来自ALK Abello Inc的RX混合房尘霉吸入注射剂(RX mix house dust moldinhalant injection)。

关于分子如变应原或变应原片段的术语“富集的”指特定分子在目的细胞或溶液中比在正常或疾病细胞或从中获取该分子的细胞中占据所有分子的显著更高的部分(如2-5倍)。此处术语“显著的”用于表明水平的增加对造成该增加的个人是有用的，并且通常指相对于其他物质(例如氨基酸序列)约至少2倍，如至少5至10倍或甚至更高的增加。该术语也不排除存在其他来源的变应原。该其他来源的变应原例如包括来自环境或由酵母或细菌基因组或克隆载体编码的变应原。可以理解该术语意为仅涵盖那些情况，其中人类已经介入以增加期望物质(例如期望的变应原)的比例。

富集例如包括从细胞提取物中获取级分，如细胞核级分、质膜级分或微粒体级分。其可通过标准技术(如离心)来获得。其他富集手段的实例为过滤或透析(例如旨在去除低于特定分子量的分子)，或使用有机溶剂或硫酸铵进行沉淀。关于物质如变应原的术语“纯化的”理解为相比于物质的原始环境的相对指征，因而代表例如变应原或变应原片段比在自然环境中的变应原或变应原片段相对更纯。因而其并非指绝对纯度(如均一制剂)意义上的绝对值。相比于天然水平，纯化的变应原或变应原片段的水平应该高至少2-5倍(例如，在μg/ml方面)。清楚地预期至少一个数量级，如两个或三个数量级的纯化。纯化的变应原或变应原片段(或其免疫原性同源物)通常基本上没有显示重叠或类似免疫原活性(如所谓的交叉反应)的污染物质，例如90％、95％或99％纯。

纯化例如包括层析技术，例如凝胶过滤、离子交换层析、亲和纯化、疏水性相互作用层析或疏水性电荷诱导层析。纯化也可包括多种此类技术和其他方法的组合。纯化的另一个示例性实例为电泳技术，如制备性毛细管电泳。分离可包括类似方法的组合。术语“分离的”表明天然发生的物质或天然发生的序列已经从其正常细胞(例如细胞内)环境中去除。因此，物质或序列可以处于无细胞溶液中或悬浮液中等，或处于不同的细胞环境中。该术语并非暗示物质或序列是仅仅存在的物质或序列，也指基本上没有(通常至少约90-95％纯)与其天然相关的其他物质。

可通过本领域熟知的方法从天然来源中分离变应原或变应原片段。天然来源例如可以是哺乳动物(例如人)血液、精液或组织。在一些实施方案中，可从已经改变以表达多肽的生物或组织中获得变应原或变应原片段。通过本领域良好建立的遗传操作技术，可改造细胞或生物以产生其正常不产生或细胞正常以较低水平产生的蛋白质。示例性实例为重组真核或原核宿主细胞或转基因生物。

在另一个实施方案中，例如可通过以氨基酸开始的化学或酶促方法在体外合成多肽。化学方法为本领域所熟知并包括连续步骤：涉及的氨基酸及生长的肽链的活性官能团的保护、活化、偶联和选择性脱保护。酶促策略例如包括通过蛋白酶分别产生的合成片段的blockwise偶联。期望时，可使用市售自动多肽合成仪。

可用如上指出的合适载体和/或稀释剂提供变应原(包括其片段或各自的同源物)。变应原例如可经化学偶联到适当载体蛋白上。作为其他实例，其可掺合到脂质体中，或缀合到用于疫苗配制的多糖和/或其他聚合物。

本发明此外提供调节(包括控制)哺乳动物对变应原免疫应答的方法。通常进行调节哺乳动物中对变应原的免疫应答以完全或至少一定程度减轻或缓和变应性疾病的一种或更多种症状，或完全或至少一定程度预防变应性疾病的一种或更多种症状。哺乳动物例如为小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猫、狨猴、猿或人。在典型实施方案中，本发明的方法是，或包括在治疗变应性疾病的方法中。如此处所用，术语“治疗”包括缓和、基本抑制、降低、减缓、消除或逆转变应性疾病的进程，至少基本上或一定程度上改善变应性疾病的临床或审美症状，至少基本上或一定程度上预防该疾病临床或审美症状的出现，或一定程度上预防或延迟先前受折磨的受试者中状况的重现。

方法包括施用如上所述的组合物。在该方面，本发明也涉及如上所述的重组乳杆菌在制备用于调节(包括控制)对变应原免疫应答的药盒中的用途。在该方面，本发明也涉及各乳杆菌在调节对变应原免疫应答中的用途。所述用途及方法例如在变态反应，例如螨原变态反应(如粉尘螨原变态反应，例如房尘螨原变态反应)的治疗或预防中。所述变应原通常为螨变应原，例如尘螨变应原(例如参照上文)，如房尘螨变应原。在一些实施方案中，螨变应原(各乳杆菌用于调节对所述螨变应原的应答)包括与由重组乳杆菌表达的螨变应原的至少一个共同表位(参照上文)。在一个实施方案中，所述螨变应原是由重组乳杆菌表达的螨变应原。各变态反应的实例包括(对于症状实例，也参照上文)，但不局限于哮喘、鼻炎(花粉症)、特应性皮炎(湿疹)和荨麻疹(荨麻疹)。各变态反应也与症状如咳嗽、喷嚏、鼻充血、咽喉痛、后鼻滴流、面红和恶心相关。

重组乳杆菌可通过任何手段向宿主施用，只要所述乳杆菌可用于调节对变应原的免疫应答。而且，完整的药盒可通过任何手段施用。通常，当向哺乳动物施用时，所述重组乳杆菌包括在药物组合物中。如果乳杆菌包括在药盒中，相同的药物组合物通常应用于抗原。通常也应期望使用对宿主无害的施用形式。技术人员因此将理解本发明允许例如经口或舌下施用重组乳杆菌。在一些实施方案中，可经口或舌下施用完整的药盒。

为了能跟踪经口施用的乳杆菌，在一些实施方案中期望标记乳杆菌或标记伴随施用的相应乳杆菌。示例性实例是与变应原在相同载体中使用增强绿色荧光蛋白(eGFP)，其与变应原一起或在独立载体中。图6显示eGFP在干酪乳杆菌Shirota中pL500载体中的表达和经口施用的活重组乳杆菌在小鼠肠胃道中的监测。实例显示当向小鼠经口施用活的重组干酪乳杆菌Shirota-eGFP时，其能移位到肠内淋巴集结的T细胞区和B细胞区中，如通过共聚焦显微术测定(参照图6)。这进一步通过透射电子显微镜技术证实，所述透射电子显微镜技术显示了淋巴集结中单形细胞和多形细胞的泡(vacoules)中完整的干酪乳杆菌Shirota-eGFP(参照图7)。

使用用于预防或治疗目的的乳杆菌(参照下文)具有若干优点。首先，乳杆菌在奶制品中的常规使用是“公认为是安全的”(GRAS)情况。它们用于专门标准化的食品如酸乳酪、乳酪和酪乳中。乳杆菌的致病潜力非常低。乳杆菌也是益生菌，因为它们例如可以预防肠内感染，降低血清胆固醇水平并显示抗癌活性。术语“益生菌”指当摄取时对健康具有有益影响的活的或灭活的生物。其次，目前不同的乳杆菌菌株用于消费者食物套药包(例如婴儿奶粉)中并且照这样重组乳杆菌可发展成为稳定且便利的食物级套药包。当与肠胃外途径(其为侵袭性且疼痛的)比较时，除在工业欠发达国家中具有经济且重要的多剂量和大规模/群体免疫的可能性外，消耗例如食物级疫苗药盒是便利且高度适应的。第三，虽然乳杆菌具有低的固有免疫原性，乳杆菌的细胞壁组分(例如肽聚糖)不仅能赋予任何表达或偶联到细菌上的外源抗原/变应原佐剂性质，还能赋予免疫应答免疫调节作用。通过安全、非侵袭性手段如乳杆菌将抗原/变应原递送至儿科和免疫受损人群的粘膜相关淋巴样组织中代表了流行疫苗选项的关键改善。

在一些实施方案中，所述方法包括重复施用各乳杆菌，无论所述乳杆菌在用于重复施用相同乳杆菌的药物组合物或药盒中，或在其中分别包括的药物组合物中。对应地，在一些实施方案中，在用于重复施用各乳杆菌的药物组合物或药盒中使用重组乳杆菌。在一些实施方案中，完整的药物组合物或药盒用于重复施用。

可通过本领域已知的任何手段监测对变应原的免疫应答的有效控制或调节。作为示例性实例，可监测参与免疫应答，特别是参与变应性免疫应答的那些因子(例如多肽或蛋白质)的水平。附图和实施例阐明了各监测的方式。图8例如显示与干酪乳杆菌Shirota体外共培养的来自首次用于实验的小鼠脾和肠系膜淋巴结的T细胞介导调节性T细胞细胞因子TGF-β的分泌。Der p2特异性T细胞引发(参照下文)由来自重组干酪乳杆菌Shirota/Der p2(Lc/Dp2)而非NaHCO₃喂饲小鼠淋巴集结的细胞的Der p2特异性增殖来显示(参照图9)。各图还显示用干酪乳杆菌/pLP500(Lc/V)或Lc/Dp2经口施用连续4天的小鼠与用NaHCO₃喂饲的小鼠比较，肠系膜淋巴结(MLN)中的CD3⁺CD4⁺D25⁺T细胞亚群增加(图9B)。这表明益生菌干酪乳杆菌喂饲的小鼠Tr细胞群的诱导作用。

本发明的方法还展示了任何天然发生的乳杆菌与变应原的组合施用(例如参照上文)。在一些实施方案中，所述乳杆菌选自干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、孢子乳杆菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、希氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、Lactobacillus leishmanis、詹氏乳杆菌、路氏乳杆菌、沙克乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、高加索乳杆菌和瑞士乳杆菌。在一些实施方案中，天然发生的乳杆菌还与本发明的重组乳杆菌组合施用。在一些这些实施方案中，所述天然发生的乳杆菌是与重组乳杆菌相同的种类。在其他实施方案中，天然发生的乳杆菌与另一种细菌，例如另一种益生菌如粪链球菌(Streptococcus faecalis)、酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)或肠系膜芽孢杆菌(Bacillusmesentericus)组合施用。在一些实施方案中，各乳杆菌可包括在与各变应原相同的药物组合物中。在其他实施方案中，乳杆菌和变应原可分别提供。它们例如可以包括在分别的药物组合物中。此类药物组合物可包括在常见药盒中。

在一些实施方案中，本发明的方法包括组合施用本发明的重组乳杆菌和变应原或变应原的免疫原性同源物(参照下文)。在一些实施方案中，重组乳杆菌可与变应原的免疫原性片段或其免疫原性同源物组合施用。如上解释，例如可通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得该螨变应原、其免疫原性片段或各免疫原性同源物。在一些实施方案中，其因此例如与变应原或其同源物伴随共同施用。作为示例性实例，乳杆菌可用于制备也包括变应原的药盒。乳杆菌因而与变应原一起成为药盒的部分。乳杆菌和变应原例如可以是药盒中包括的药物组合物的部分。在其他实施方案中，乳杆菌可以是药物组合物的部分，而变应原是独立成份或包括在药盒的独立成份(如其他药物组合物)中。

药盒或包括乳杆菌的药物组合物中包括的各变应原、变应原片段或各自的同源物通常是螨变应原，例如尘螨变应原(例如参照上文)，如房尘螨变应原。在一些实施方案中，螨变应原(使用各乳杆菌用于调节对所述螨变应原的应答)包括与重组乳杆菌表达的螨变应原、螨变应原片段或各同源物的至少一个共同表位(参照上文)。螨变应原(包括其片段或各自的同源物)例如可与乳杆菌表达的变应原(包括其片段或各自的同源物)交叉反应。在一个实施方案中，螨变应原、其片段或各自的同源物是由重组乳杆菌表达的螨变应原、其片段或各自的同源物。可通过任何途径和方法来应用变应原。例如可经舌下、皮下、皮内、经皮、表皮(epicutaneously)或其任何组合来应用变应原(包括其片段或各自的同源物)。作为示例性实例，变应原或变应原片段或其免疫原性同源物(例如药物组合物中包括的)可经皮下施用，并且乳杆菌(例如药物组合物中包括的)可经口施用。与乳杆菌类似，变应原或变应原片段例如在所选时间间隔内应用一次或几次。在一些实施方案中，其因而可重复施用。

技术人员将不仅理解使用乳杆菌的优点(上文)，还理解本发明人的惊人发现：组合应用乳杆菌和各变应原导致治疗和预防变态反应的协同效应，其也在以下实施例中得以阐明。一方面，本发明因此也提供用于变态反应的有效治疗和预防策略的双重模式方法。

乳杆菌和变应原、变应原片段或各自的同源物可彼此独立按独立剂量施用。因此，乳杆菌及变应原(包括同源物)或其片段的许多应用例如可在一段时间内同时或连续进行。乳杆菌因此例如可用作佐剂，当与变应原同时给出时，其可以调节(例如增强)免疫应答。在一些实施方案中，顺序使用乳杆菌和变应原、变应原片段或各同源物。在所选的时间间隔内，在例如剂量方案中仅可施用变应原(包括其片段或各同源物)、仅乳杆菌或仅变应原。作为示例性实例，施用乳杆菌几次时，可在两次应用乳杆菌间或终止应用乳杆菌后提前施用变应原，反之亦然。在一些实施方案中，重复施用乳杆菌，例如每天一次。然后在一段时间一次或更多次应用乳杆菌后施用变应原。随后仅进一步重复施用乳杆菌。可以理解在该情况下乳杆菌和/或变应原的施用形式可变化，例如在图10或图16中描述。在一些实施方案中，可如下文描述首先应用乳杆菌。在其他实施方案中，可如图22显示首先应用变应原。

因此，可按一个或更多独立个体剂量形式(如预防或治疗方式的所谓的“引发加强”方案或方法)来进行变应原(包括其片段或各同源物)及乳杆菌的施用。在该方案(或方法)中，乳杆菌例如可按“引发”步骤递送，并且随后变应原可按“加强”步骤递送，或反之亦然。例如首先施用乳杆菌时，其可称为“引发剂”，随后施用的变应原可称作“加强剂”。例如首先施用变应原时，其可称为“引发剂”，随后施用的乳杆菌然后可称作“加强剂”。可以理解术语“引发”和“加强”指抗原和乳杆菌对宿主生物的影响，而不是指它们的施用顺序。因此，引发剂可在加强剂之前、与其同时或在其之后施用。如果期望加强组合物需要更长时间来起作用，那么例如需要在加强组合物之后施用。

该“引发加强”方案例如可用于预防，即用于提前降低、减少或预防对变应原的免疫应答。在该情况下，也期望降低或预防宿主免疫系统对相应变应原的过度敏感性效应。在此类实施方案中，“引发”也指方法，其中首次施用(例如抗原)为免疫作用，其允许利用相同抗原(例如乳杆菌的抗原)进行第二次施用后产生免疫应答，其中第二次免疫应答比未提供首次免疫达到的应答高。在一些实施方案中，各预防方案可用于保护动物或个体免于变应原致敏。

在一些实施方案中，控制对哺乳动物(例如人类)中变应原的免疫应答的方法包括：

(a)提供本发明的重组乳杆菌或包括如上所述的重组乳杆菌的药物组合物，

(b)施用本发明的重组乳杆菌或包括重组乳杆菌的药物组合物，

(c)提供变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)或包括如上所述的变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)的药物组合物，和

(d)施用变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)或包括变应原的至少免疫原性片段(或其各免疫原性同源物)的药物组合物。

作为示例性实例，所述方法可包括以下步骤：

(a)用治疗有效量的本发明的重组乳杆菌或本发明的药物组合物引发哺乳动物，

(b)在一天至约一周后任选地重复步骤a)一次至三次；

(c)用治疗有效量的变应原加强动物；和

(d)在约一周至约一个月的后续时期后，任选地重复步骤c)一次至五次。

如上指出，变应原在一些实施方案中可以是由本发明的重组乳杆菌表达的变应原或对应于由本发明的重组乳杆菌表达的变应原。

因此，在一些实施方案中，施用乳杆菌在引发中起作用，而施用抗原(包括其片段或各同源物)在加强中起作用。各实例描述于图10中。在该实例中，经口施用的表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota在预防方案中与Der p2的皮下加强组合使用。使用无效的NaHCO₃而非乳杆菌的比较显示单独施用表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota甚至在呼吸道攻击后可抑制IgE的产生(参照图11)。与其相反，Der p2特异血清IgG1的水平未受影响。而且，通过T淋巴细胞产生Th-2细胞因子和促炎性细胞因子被下调(图12)。

在该实例中，施用表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota引发了Th-2和Der p2特异性Tr细胞的混合物(也参照下文)。这些Der p2特异性Tr细胞通过调节性细胞因子如TGF-β1对现有的Th-2细胞产生抑制或耐受原性作用。此外观察到呼吸道攻击后获得的已经施用了表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota的小鼠血清中循环白细胞介素-10(IL-10)细胞因子水平相比于对照组显著降低。IL-10是多效细胞因子，由Th2细胞或T调节型淋巴细胞产生。先前在特异反应性过敏和哮喘中已观察到白细胞介素-10的表达升高。由T调节细胞产生的IL-10是抗炎性的并能调节Th1类型细胞因子和/或Th2的产生。Th-2细胞因子进一步减少。嗜酸细胞活化趋化因子的水平也降低。嗜酸细胞活化趋化因子是调节过敏性炎症的重要趋化因子，并且先前已发现嗜酸细胞活化趋化因子的血清浓度在例如哮喘中升高。也观察到了转化生长因子β1(TGF-β1)水平的显著降低(参照图14)。用于Tr细胞存活和功能的常见已知细胞因子TGF-β1由肺中的嗜酸性粒细胞产生并已知可调节Th-2细胞因子诱导的嗜酸细胞活化趋化因子的释放。其也作为成纤维细胞的生长因子起作用，因而已经报道了肺的粘膜相关淋巴样组织中TGF-β1升高来增进或加剧呼吸道重塑。

同时，这些小鼠也显示细支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数目减少(图15A)，其水平与Ac组(即仅用各变应原和气溶胶攻击处理的小鼠组)的水平相似。嗜中性粒细胞(其为对抗原的炎症应答的部分并且其已知可通过IgE受体而激活)的数目在已经施用了表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota的小鼠中也显著减少(图15B)。嗜酸性粒细胞(其已知在变应性疾病中增加)的数目是低的。呼吸道攻击24小时后所获肺切片的组织学分析显示已经施用了阴性对照(NaHCO₃或具有不编码螨变应原的载体的乳杆菌)的小鼠中呼吸道病理的不同程度(中等至严重)。此外，炎症渗入包围了这些小鼠的细支气管肺泡空间。与之相反，已经施用了表达Der p2的重组干酪乳杆菌Shirota的小鼠的肺切片显示肺部炎症的重大降低并具有与Ac小鼠相似的谱(参照图15C)。如可从该实例推断，重组乳杆菌引发与变应原加强组合在下调过敏反应中有效。

作为其他实例，对变应原的过敏性免疫应答的治疗或预防可以是免疫疗法。免疫疗法中用变应原免疫的组合例如可以与用于治疗目的的乳杆菌施用组合(参照下文所附实施例)。该组合可大体上提高效率并也可缩短免疫疗法所需要的持续时间。例如抗原特异性IgE的血清水平显著降低(参照图17A和图23A)。为了基于传统的免疫疗法单独使用各变应原来达到该效果，如图25和图26中描述，需要高剂量的抗原。仅50μg抗原的皮下剂量(即高剂量)降低IgE水平，而10μg抗原的剂量(即低剂量)引起IgE水平的升高(参照图26A)。因此，乳杆菌和各抗原的组合减少传统免疫疗法的不便，降低了其中治疗的频率和持续时间，并可能降低过敏反应的风险，提高效率。本发明的重组乳杆菌在用于开发基于食物干预策略(用于预防和治疗变应性疾病)的引发加强策略中的潜力和功效也通过所附实施例来阐明。

如从上文显而易见的是，本发明重组乳杆菌的使用相比于目前用于变态反应治疗和变态反应预防的方法是有利的。此外，各乳杆菌和抗原在例如免疫疗法中的组合应用极大提高了基于重组变应原的免疫疗法的效率。各双重模式方法产生了有效治疗变应性疾病的协同效应。在该方面，也可通过本发明重组乳杆菌和变应原的组合应用来通过接种预防变态反应。表达变应原或其片段的重组乳杆菌例如可用作基于食物的抗原特异性预防疫苗以引发免疫系统，随后是施用变应原蛋白质的加强效应。此外，该双重方式方法产生了用于预防后继变应性过敏的协同效应。

为了方便理解本发明并使其生效，特定实施方案现在将通过以下示例性实施方案和非限制性实施例来描述。

本发明的示例性实施方案

本发明重组乳杆菌的示例性实施方案、本发明的药盒及它们的用途示于附图中。

图1A示意性描述了用于表达螨变应原(HDM)基因的常规乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pL500。指出了限制性内切酶的位点。由BamHI和NheI位点定义的区段由编码Der p2抗原的序列替换(参照下文)。“ldh”表示乳酸脱氢酶，“Pldh”表示干酪乳杆菌ldh基因的启动子序列。“Tcbh”表示植物乳杆菌cbh基因的转录终止子序列。

图1B示意性描述了用于产生乳杆菌中Der p2/螨变应原表达构建体的中间pTUAT载体。指出了限制性内切酶的位点。

图1C示意性描述了在组成型乳酸脱氢酶(ldh)启动子控制下的pLP500-HDM表达构建体。“Pldh”表示干酪乳杆菌ldh基因的启动子序列。“锚”(Anchor)表示编码117个氨基酸的肽的区段，其为干酪乳杆菌的锚定序列。

图2示意性描述了同样用于表达螨变应原(HDM)基因的另一个常规乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pL400。指出了限制性内切酶的位点。由BamHI和NheI位点(加下划线的)定义的区段由编码Blo t5抗原的序列替换(参照下文)。

图3示意性描述了乳杆菌表达载体pSIP308，其为本发明的重组乳杆菌中包括的载体的其他实例。报道基因可用于通过各限制性内切酶包括编码螨变应原或其片段的序列。

图4示意性描述了乳杆菌表达载体pSIP412，其为本发明的重组乳杆菌中包括的载体的另一个实例。可再次在报告基因的位点处引入编码螨变应原或其片段的序列。

图5显示了通过蛋白质免疫印迹检测Der p2在乳杆菌的两种菌株干酪乳杆菌Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中的异源表达。在1mL裂解缓冲液中通过超声处理来裂解总计3 x 10⁹个细胞。细胞裂解物(10μL)在10％Tris-tricine SDS-PAGE凝胶上进行分离并进行蛋白质免疫印迹检测。使用针对Der p2的单克隆免疫球蛋白(稀释度1:10,000)、生物素化的抗小鼠免疫球蛋白(稀释度1:10,000)和过氧化物酶缀合的ExtrAvidin(Sigma，稀释度1:5,000)。信号在 West Pico化学发光底物中显影。泳道为：“M”：预染/生物素蛋白质分子量标记(BioRad)；(1)来自L.gg/pL500的总裂解物，(2)来自L.gg/Der p2的总裂解物，(3)来自干酪乳杆菌/pL500的总裂解物，(4)来自干酪乳杆菌/Der p2的总裂解物，和泳道(5)酵母中产生的重组Der p2蛋白质(200ng)。箭头指出Der p2锚定融合蛋白的位置。其存在于重组干酪乳杆菌Shirota和鼠李糖乳杆菌gg中，但不存在于用作对照的野生型中。

图6显示干酪乳杆菌Shirota-eGFP怎样移位到淋巴集结的T和B细胞区域。图像描述了共聚焦显微镜下的视野。所示为(A)活的干酪乳杆菌Shirota-eGFP和(B)来自连续4天用干酪乳杆菌Shirota-eGFP喂饲小鼠的淋巴集结的冷冻切片。左边显示的是(B)各淋巴集结切片中干酪乳杆菌Shirota-eGFP细菌的定位，右边描述了用缀合APC的抗小鼠THY-1.2与相同视野的缀合PE的抗小鼠CD-19(分别染色T细胞和B细胞区域)组合进行免疫组织化学染色并将所有三种颜色叠加，其显示了细菌在T细胞和B细胞区中的定位。共聚焦显微镜分析显示了干酪乳杆菌Shirota-eGFP(参照左边图片)在T细胞和B细胞区域(右)，特别是在区域接合处的分布。

图7显示通过透射电子显微镜观察到完整干酪乳杆菌Shirota-eGFP移位到淋巴集结中的单形细胞(A)和多态细胞(B)的泡(vacoules)中。箭头指向干酪乳杆菌Shirota-eGFP的位置。

图8显示在与干酪乳杆菌Shirota进行体外共培养的T细胞中诱导产生TGF-β。(A)来自与干酪乳杆菌以1:0.5的比例进行共培养的首次用于实验的小鼠的总肠系膜淋巴结(MLN)细胞或脾细胞与只有细胞的对照相比显示TGF-β细胞因子的产生显著增加。(B)来自与干酪乳杆菌以1:0.5或1:1的比例进行共培养的首次用于实验的小鼠的脾的分选CD3⁺T细胞也诱导TGF-β产生的上调。

图9描述了用重组Lc/Dp2喂饲的小鼠中Der p2特异性T细胞增殖与调节性CD4⁺CD25⁺T细胞的增加。(A)用1 x 10⁹cfu/小鼠的重组Lc/Dp2或野生型L.c/V或NaHCO3对照经口向C56BL/6小鼠施用一个月(每周连续三天)。喂饲结束时处死小鼠并从淋巴集结中分离T细胞，用于在缺少或存在5μg/ml或10μg/ml重组酵母Der p2的情况下使用H³-标记的胸苷掺入进行增殖测定。(B)FACS分析来自Lc/Dp2(n＝5)、野生型Lc/V(n＝5)或NaHCO₃(n＝6)喂饲的小鼠的肠系膜淋巴结的细胞。如所示，肠系膜淋巴结中的CD4⁺D25⁺细胞的亚群在Lc/Dp2和Lc/V组中相比于NaHCO3组有显著增加。

图10描述了所用的预防方案。确定了三组C57BL/6小鼠，在整个实验中，其由用NaHCO₃缓冲液、热灭活的Lc/V和Lc/Dp2喂饲的C57BL/6小鼠(每组n＝5)组成。喂饲由时间线下实心三角形“▲”指示。一周连续三天，每天喂饲一剂量。在第11天与第18天，所有小鼠经皮下免疫重组Der p2(50μg/小鼠)来进行加强。随后，所有小鼠通过表皮贴片(在第22、36和50天)致敏三次并通过具有Der p2的气溶胶攻击所述小鼠两次。最后一次攻击后大约24小时，处死小鼠并获得细支气管肺泡灌洗液(BALF)用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于苏木精&曙红(H&E)染色。此外，获得来自肠系膜淋巴结(MLN)和脾的细胞用于原代和继代T细胞培养和细胞因子分析。

图11显示Der p2特异性免疫球蛋白应答。接受Der p2皮下加强的小鼠的Der p2特异性血清IgE的动力学显示三组中没有显著差异，然而未接受皮下加强但用Lc/Dp2喂饲的小鼠比NaHCO₃(p＝0.042)和Lc/V(p＝0.004)喂饲的小鼠其IgE显示出显著的衰减。第85天即最后一次气溶胶攻击后IgE的效价(参照图11的右图)显示对于NaHCO₃应用(参照▲相对于Δ)和Lc/v应用(■相对于□)，接受皮下加强的小鼠相比于未接受皮下加强的小鼠其IgE水平显著较低。仅Lc/Dp2喂饲的小鼠(●相对于O)显示了同等水平。该结果表明用Lc/Dp2喂饲的小鼠在有或没有皮下加强的情况下可减缓IgE的产生。

图12描述了脾T细胞的细胞因子谱。脾细胞在存在Der p2(10μg/ml)的情况下培养3天，随后在存在IL-2的情况下培养另外4天。在培养的第9天，通过Ficoll密度离心纯化T细胞。大约1 x 10⁵细胞/孔在存在3 x 10⁵APC/孔和Der p2(10μg/ml)的情况下培养48小时。对照孔由无Der p2的细胞组成。获得培养基用于通过ELISA形成细胞因子谱。来自Lc/Dp2喂饲小鼠的Der p2特异性脾T细胞相比于NaHCO₃和Lc/V产生更低水平的Th-2(IL-4、IL-5、IL-13)和促炎性细胞因子(TNF-α、IFN-γ)。然而，Lc/Dp2喂饲的小鼠相比于Lc/V组产生更高水平的T调节性细胞因子(TGF-β和IL-10)(也参照图24)。

图13描述了MLN细胞的细胞因子谱。来自小鼠MLN的总细胞在存在抗CD3和CD28的情况下在96孔板中(3 x 10⁵细胞/孔)培养48小时。如所示，L.c/V和Lc/Dp2组相比于NaHCO₃对照组(A、B、C和D)产生显著更低水平的IL-13，并且IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-10未有显著降低(水平与Ac小鼠类似)。此外，来自Lc/Dp2喂饲小鼠的MLN细胞相比于对照组(D)产生增加水平的TGF-β。

图14显示了BALF的细胞因子谱。用Lc/V或Lc/Derp2喂饲的小鼠的BALF细胞因子谱相比于NaHCO₃对照显示效应Th2细胞因子(IL-13、IL-5)、促炎性细胞因子(TNF-α)、TGF-β和趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子减少。

图15描述了BALF分析和肺的组织学。气溶胶攻击后24小时获得BALF和肺，用于分析和组织学H&E染色。Lc/Dp2组相比于NaHCO₃和Lc/V对照组BALF细胞计数减少，其与接受仅气溶胶攻击(Ac)的小鼠类似(A)。此外，仅Lc/Dp2喂饲的小鼠显示嗜中性粒细胞募集减少(B)。所有组的BALF中均显示相似百分比的巨噬细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。显示了每一组中两只代表性小鼠的肺组织。两只气溶胶对照小鼠(G和H)的肺切片的H&E染色显示了肺实质中最低限度的呼吸道炎症背景，并且最低限度的炎症渗入细支气管空间。然而，来自NaHCO₃(A和B)和Lc/V(C和D)组的小鼠的肺组织显示了呼吸道和细支气管空间周围不同程度(中等至严重)的呼吸道渗入炎性细胞。比较起来，Lc/Dp2喂饲的小鼠(E和F)显示炎症渗入有更高降低，其具有与Ac组相似的谱。

图16描述了治疗方案。在治疗方案中，在第0、14和28天用Der p2变应原通过表皮贴片使C57BL/6小鼠预先致敏。在第33天，通过ELISA测定所有小鼠Derp2特异性血清IgE和IgG1的水平，并随后基于IgE的水平将小鼠分为三组(n＝6)。在第35天，用NaHCO₃缓冲液、Lc/V或Lc/Dp2经口喂饲小鼠5周，每天一剂量，一周连续三天。在第55和62天，小鼠接受两次Der p2(50μg/小鼠)皮下免疫，并且一周后用具有Der p2的气溶胶(10ml PBS中1mg)攻击小鼠两次。喂饲由所绘时间线下实心三角形“▲”指示。最后一次攻击后大约24小时，处死小鼠并获得BALF用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于H&E染色。此外，获得肠系膜淋巴结(MLN)和脾的细胞用于原代和继代T细胞培养和细胞因子分析。

图17描述了Der p2特异性免疫球蛋白应答。所有三组小鼠的Der p2特异性血清IgE、IgG1和IgG2a的动力学示于图17(A、C和E)。所有三组中的小鼠在喂饲开始一周后其Der p2特异性IgE减少(A)。Lc/V和Lc/Dp2喂饲小鼠中的IgE水平在连续两次气溶胶攻击前和攻击后(在第69天和第77天)相比于对照小鼠显著下降(B)。这两组中Der p2特异性血清IgG1在第62天和69天相比于对照小鼠显著升高并且甚至在呼吸道受攻击后保持不变(C和D)。

图18显示脾T细胞的所选细胞因子的谱。脾细胞在存在Der p2(10μg/ml)的情况下培养3天，并随后在存在IL-2下培养另外4天。在培养的第9天，通过Ficoll密度离心纯化T细胞，并在存在3 x 10⁵APC/孔和Der p2变应原(10μg/ml)的情况下以大约1 x 10⁵细胞/孔培养48小时。对照孔由没有Der p2的细胞组成。获得培养基用于通过ELISA形成细胞因子谱。Lc/Dp2和Lc/V组相比于NaHCO₃组(A-E)均显示Th-2细胞因子(IL-5、IL-13、IL-10)产生显著降低，并且IL-4和TNF-α无显著降低。TGF-β1的产生也降低了(F)。在所有三组中未检测到IFN-γ的产生。

图19显示肠系膜淋巴结细胞的所选细胞因子的谱。来自肠系膜淋巴结(MLN)的总细胞在存在抗CD3和CD28的情况下在96孔板中(3 x 10⁵细胞/孔)培养48小时。来自Lc/Dp2和Lc/V组的MLN细胞相比于NaHCO₃组显示细胞因子谱，显示Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、IL-4、IL-13、IL-10和TNF-α)没有显著降低(A-E)。此外，TGF-β1的产生相比于对照组，在来自Lc/Dp2和Lc/V组的细胞中是升高的。

图20显示BALF的细胞因子谱。最后的气溶胶攻击后24小时处死小鼠并获得BALF用于细胞因子分析。Lc/V和Lc/Dp2组相比于NaHCO₃组，Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、IL-13、IL-4、IFN-γ、TNF-α、TGF-β)和趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子)均没有显著减少。两组均与Ac对照组具有相似的水平。

图21描述了肺中病理生理学变化和细支气管肺泡流体分析。BALF的分析表明Lc/V和Lc/Dp2均与气溶胶对照组(Ac)具有相似的总渗入细胞数目并且并不显著低于NaHCO₃组中观察到的数目(A)。差异细胞分析表明这两组中的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞减少，淋巴细胞和巨噬细胞计数没有变化(B)。仅Lc/Dp2组相比于其他组其BALF中的单核细胞计数显示有少量减少。显示了每一组中两只代表性小鼠的肺组织。两只气溶胶对照小鼠(G和H)的肺切片的H&E染色显示了肺实质中最低限度的呼吸道炎症背景，并且最低限度的炎症渗入细支气管空间。然而，来自NaHCO₃组的小鼠的肺组织显示了呼吸道和细支气管空间周围不同程度(中等至严重)的呼吸道渗入炎性细胞(A和B)。比较起来，Lc/V(C和D)和Lc/Dp2(E和F)喂饲的小鼠均显示炎症渗入有更大的降低，与Ac小鼠具有相似的谱。

图22描述了使用活的重组乳杆菌的治疗方案。在治疗方案中，在第1、14和28天用重组酵母衍生的Der p2变应原通过表皮贴片使两组C57BL/6小鼠预先致敏。休息14天后，仅将IgE应答者平分成两组(Lb相对于缓冲液，n＝6)用于治疗研究。向Lb组喂饲活的重组Der p2(Lc/Dr p2)。在第42天至第70天间每天喂饲小鼠，共喂饲4周(

)。在第80天，通过含有Der p2的气溶胶(10ml PBS中含1mg)来攻击两组。对细支气管收缩的指示器-增强停顿(enhanced pause)(pEnh)读数大约24小时。在第82天处死小鼠用于原代和继代T细胞培养。

图23显示全身免疫球蛋白应答。7天积极喂饲后，在干酪乳杆菌Shirota/Dp2组中观察到Der p2特异性血清IgE(A)41％的减弱，相比NaHCO₃对照组仅为27％。此外，14天积极喂饲后，干酪乳杆菌/Dp2组中Der p2特异性血清IgG1(B)显著减弱，而NaHCO₃对照组在21天喂饲后仅显示IgG1减弱。在来自(C)中继代培养物的脾细胞因子谱中，白色条形代表5只对照小鼠的数据均值。黑色条形代表从6只喂饲小鼠的混合细胞中获得的数据均值。来自缓冲液喂饲小鼠和重组乳杆菌喂饲小鼠的混合细胞(混合细胞显示弱增殖，为T调节性细胞的标记)的脾脏T细胞的细胞因子谱在TH1(IFNγ)和TH2(IL-5和IL-13)细胞因子形成中未显示有差异。然而，用干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲的小鼠显示T调节性细胞因子(IL-10和TGF-β)的产生增加。缓冲液喂饲小鼠(n＝6)相对于重组乳杆菌喂饲的小鼠的混合细胞。

图24描述了治疗模型假说，其不理解为指在任何方面局限于本发明方法潜在的效应。表皮贴片可能导致来自TH2细胞的IL-5水平降低。然而，重组乳杆菌可引起Tr细胞的细胞因子的水平增加。

图25显示用于分析皮下引发对小鼠的影响的实验方案示意图。在第0、4、8天，用低剂量(LD，10μg)或高剂量(HD，50μg)的Der p2经皮下注射引发小鼠，然后在第28天用Der p2对小鼠进行加强。在第56、58、60和62天用PBS中0.1mg/ml的Der p2对小鼠进行气溶胶吸入30分钟，并在第64天处死小鼠用于T细胞细胞因子分析。单独对对照小鼠进行气溶胶吸入。

图26描述了小鼠中Der p2特异性体液应答的动力学。用低剂量(白色正方形，10μg)或高剂量(黑色正方形，50μg)的Der p2经皮下注射引发小鼠，然后用低剂量的Der p2对小鼠进行加强和气溶胶吸入。通过ELISA测定低剂量或高剂量Der p2引发的小鼠的Der p2特异性IgE(A)、IgG1(B)和IgG2a(C)的效价。数据表示为均值±SEM(n＝8)。＊：p<0.05，用于独立样品的双尾斯氏t检验。

图27描述了脾CD4⁺T细胞的细胞因子谱的RT-PCR分析(也参照表1)。用低剂量(LD，参照图的上部)和高剂量(HD)Der p2引发的小鼠和对照小鼠(C)暴露于气溶胶化的Der p2中并在第64天处死。用Der p2培养脾细胞10天。用抗CD3和抗CD28刺激Der p2培养的脾细胞的纯化CD4⁺T细胞24小时，并分离总RNA用于分析细胞因子表达。包括来自年龄匹配的首次接受试验的小鼠(N)的纯化CD4⁺T细胞用于比较。每一条带显示来自8只小鼠的混合脾的扩增细胞因子药盒。(＊：未进行)。

图28描述了培养物中淋巴结的细胞因子谱。在第0、4、8天用低剂量(LD，10μg)或高剂量(HD，50μg)Der p2蛋白质或PBS引发小鼠，并在第10天处死小鼠。收集淋巴结并在存在rDer p2蛋白质的情况下培养3至5天。收集培养物上清液并通过ELISA分析IFN-γ(A)、IL-4(B)、IL-9(C)、IL-10(D)和TGF-β(E)的形成。显示的结果代表2次独立实验。均值±s.e.m.(n＝4)。＊与PBS的比较，#与HD的比较，p<0.05，独立样品的双尾斯氏t检验。

图29显示SP培养物的细胞因子谱。在第0、4和8天用低剂量(LD，10μg)或高剂量(HD，50μg)Der p2或PBS经皮下注射引发小鼠。在第10天收集SP并用10μg/ml的rDer p2蛋白质进行培养。在第3-5天收集上清液并通过ELISA分析IFN-γ(A)、IL-4(B)、IL-9(C)、IL-10(D)、IL-13(E)和TGF-β(F)的形成。显示的结果代表2次独立实验，均值±s.e.m.(n＝4)。＊与PBS的比较，p<0.05；#与HD的比较，p<0.05，双尾斯氏t检验。

图30描述了与CD4⁺CD25⁺细胞共培养的抗原特异性TH2细胞的增殖和细胞因子应答。抗原特异性TH2细胞来自小鼠的脾细胞培养物，用50μg的rDer p2蛋白质进行贴片。TH2细胞与小鼠(所述小鼠用LD(LD⁺TH2)或HD(HD⁺TH2)的rDer p2蛋白质，或仅rDer p2蛋白质(仅TH2)引发)的脾CD4⁺CD25⁺T细胞在存在rDer p2蛋白质的情况下培养5天并测定增殖应答。增殖比率表示为仅TH2细胞的指数(a)。在t＝72小时收集上清液并测定IL-4、IL-5和IL-13的产生(b、c、d)。结果显示3次独立实验的平均值，均值±s.e.m.。＊与HD的比较；#与仅TH2的比较。斯氏t检验，p<0.05。

图31描述了用于动物研究的方案，所述动物研究使用表达Blo t5变应原的重组干酪乳杆菌Shirota。检查了三组Balbc/J小鼠：NaHCO₃(n＝4)、干酪乳杆菌/pL400(n＝4)和干酪乳杆菌Shirota/Blo t5(干酪乳杆菌/Bt5；n＝4)。每周连续四天，每天用1 x 10⁹cfu/小鼠喂饲小鼠(由箭头指出)。每只小鼠接受的总喂饲为20剂量的1 x 10⁹cfu。每周一次从小鼠中取血长达7周并通过ELISA测定Blo t5特异性血清免疫球蛋白。在第198天处死小鼠并获得淋巴集结和脾的T细胞用于细胞因子分析。

图32描述了通过ELISA获得的Blo t5特异性血清免疫球蛋白的数据。检测到Blo t5特异性IgG1的显著水平，然而未检测到IgE和IgG2a的显著水平。

图33描述了处死的小鼠的细胞因子分析(参照图34)。仅在来自干酪乳杆菌Shirota/Blo t5喂饲小鼠的淋巴集结的T细胞中检测到了调节性细胞因子TGF-β的显著水平，说明活的重组干酪乳杆菌Shirota/Blo t5通过淋巴集结中的T细胞活跃地诱导了T调节性细胞因子的产生。

图34描述了表达载体pLP400中用于实施例中阐明本发明的变应原Blo t5的核酸序列(上面的行)和氨基酸序列(下面的行，单字母密码子)。在5′末端(反向)引入额外的碱基“A”以改变具有载体天然起始密码子的基因读框。

图35描述了表达载体pLP500中用于实施例中阐明本发明的变应原Der p2的核酸序列(上面的行)和氨基酸序列(下面的行，单字母密码子)。在5′末端(反向)引入额外的碱基“A”以改变具有载体天然起始密码子的基因读框。所述序列包括干酪乳杆菌的锚定序列(“锚”)。

表1描述的是通过实时PCR得到的脾CD4⁺T细胞的TH2细胞因子谱。用低剂量和高剂量Der p2引发小鼠，并且对照小鼠暴露于气溶胶化的Der p2中并在第64天处死。用Der p2培养脾细胞10天。用抗CD3和抗CD28刺激Der p2培养的脾细胞的纯化CD4⁺T细胞24小时，并分离总RNA用于分析细胞因子表达。包括来自年龄匹配的首次接受试验的小鼠(N)的纯化CD4⁺T细胞用于比较。显示了一式两份实验的代表性数据。＊：通过除以实验组(样品)和首次用于试验的组(校准)的细胞因子/HPRT的值来确定细胞因子的比率。

实施例

用于下面示例性实施例中的小鼠是3-4周龄的C57BL/6小鼠，购买并饲养于新加坡国立大学(National University of Singapore)的动物保持单元(Animal Holding Unit)。关于动物福利的IACUC批准了用于该项研究的所有动物方案。用于以下实施例的野生型和重组干酪乳杆菌Shirota菌株或鼠李糖乳杆菌GG原种在含有50％甘油的等分试样中保持并保存于-70℃。

使用斯氏t检验通过均值分析进行统计比较。所有值示为均值±标准差(SD)。认为p<0.05的值是显著的。

实施例1：表达增强绿色荧光蛋白(eGFP)的重组干酪乳杆菌的构建使用延伸高保真DNA聚合酶(Boehringer)和合成引物BamHI-eGFP/f[5′-CCC CCG GAT CCA gtg agc aag ggc gag gag ctg-3′，SEQ ID NO：3]和eGFP-xhoSac/r[5′-CCC CCC ctc gag CTT GTA CAG CTC GTC CATGCC GAG-3′，SEQ ID NO：4]通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增eGFP基因。5′末端含有Bam HI位点并且3′末端含有Xho I/Sac I位点的所获PCR产物(kits)随后亚克隆至pTUAT的Bam HI和Sac I处(参照图1)。用pLP500的Bam HI/Nhe I片段表达-分泌载体交换含有eGFP-uidA-Tbch的Bam HI/Nhe I片段(参照图1)。

然后通过用Xho I消化去除uidA基因，生成表达构建体pLP500-eGFP。

实施例2：将Der p2基因和Blo t5基因克隆至乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体

使用延伸高保真DNA聚合酶(Boehringer)和合成引物，Dp2Bam/f[5′-CCCCCGGATCCAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGC-3′，SEQID NO：5]和Dp2xhoSac/r[5′-CCCCCCGAGCTCCTCGAGATCGCGGATTTTAGCATGAGTAGC-3′，SEQ ID NO：6]通过PCR来扩增Der p2cDNA的441bp片段。在5′和3′末端分别含有Bam HI和Xho I/Sac I位点的Der p2基因的所获PCR产物具有序列：5′-GGATCC A GAT CAA

GTC GAT GTC AAA GAT TGT GCC AAT CAT GAA ATC AAA AAA GTT TTG GTA

CCA GGA TGC CAT GGT TCA GAA CCA TGT ATC ATT CAT CGT GGT AAA CCA

TTC CAA TTG GAA GCC GTT TTC GAA GCC AAC CAA AAC ACA AAA ACC GCT

AAA ATT GAA ATC AAA GCC TCA ATC GAT GGT TTA GAA GTT GAT GTT CCC

CGT ATC GAT CCA AAT GCA TGC CAT TAC ATG AAA TGC CCA TTG GTT AAA

GGA CAA CAA TAT GAT ATT AAA TAT ACA TGG AAT GTT CCG AAA ATT GCA

CCA AAA TCT GAA AAT GTT GTC GTC ACT GTT AAA GTT ATG GGT GAT GAT

GGT GTT TTG GCC TGT GCT ATT GCT ACT CAT GCT AAA ATC CGC GAT CTC

GAG(SEQ ID NO：1)。将所述PCR产物亚克隆至中间pTUAT载体的Bam HI和Sac I处(图1B)。随后用乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pLP500的Bam HI/Nhe I片段交换含有Der p2-uidA-锚-Tbch的Bam HI/Nhe I片段(图1A)。然后通过Xho I消化并重新连接去除uidA基因，导致产生pLP500/Dp2-锚表达构建体，其随后通过核苷酸测序进行验证。

对于Blo t5，使用相同的遗传改造技术通过本领域已知的合适材料，使用乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pLP400来实施相应的方法。载体pLP400中的Blo t5基因(编码缺少17个N末端氨基酸的Blo t5蛋白质)的各序列为：

5’-GGATCC A CAA GAG CAC AAG CCA AAG AAG GAT GAT TTC CGA AAC GAA

TTC GAT CAC TTG TTG ATC GAA CAG GCA AAC CAT GCT ATC GAA AAG GGA

GAA CAT CAA TTG CTT TAC TTG CAA CAC CAA CTC GAC GAA TTG AAT GAA

AAC AAG AGC AAG GAA TTG CAA GAG AAA ATC ATT CGA GAA CTT GAT GTT

GTT TGC GCC ATG ATC GAA GGA GCC CAA GGA GCT TTG GAA CGT GAA TTG

AAG CGA ACT GAT CTT AAC ATT TTG GAA CGA TTC AAC TAC GAA GAG GCT

CAA ACT CTC AGC AAG ATC TTG CTT AAG GAT TTG AAG GAA ACC GAA CAA

AAA GTG AAG GAT ATT CAA ACC CAA CTC GAG(SEQ ID NO：2)。

将PCR片段亚克隆至中间pTUAT载体的Bam HI和Sac I处(图1B)。随后用乳杆菌/大肠杆菌穿梭载体pLP400的Bam HI/Nhe I片段交换含有Blo t5-uidA-Tbch的Bam HI/Nhe I片段(图2)。然后通过Xho I消化并重新连接去除uidA基因，导致产生pLP400//Bt5-锚表达构建体，其随后通过核苷酸测序进行验证。

所有质粒DNA和构建体在大肠杆菌宿主细胞中维持并增殖。

实施例3：干酪乳杆菌Shirota-eGFP的共聚焦分析

含有pL500-eGFP构建体(L.casei Shirota-eGFP)和pL500载体的干酪乳杆菌Shirota细胞分别在含有5μg/ml红霉素的MRS培养基(DifcoLaboratories Detroit)中，于37℃ 5.0％CO₂培养箱中进行培养。当培养物达到0.6至1.8的OD_690nm，总共收集0.5ml并在PBS(pH7.4)中洗涤两次。将细胞重悬浮于1ml PBS中并在共聚焦显微镜下进行分析。含有pL500载体的干酪乳杆菌Shirota作为阴性对照。

实施例4：干酪乳杆菌Shirota-eGFP在小鼠淋巴集结中的移位

为了检查干酪乳杆菌Shirota-eGFP体内移位至小鼠的淋巴集结中，每只6周龄的Balbc/J小鼠经口施用1 x 10⁹菌落形成单位(cfu)的干酪乳杆菌Shirota-eGFP或干酪乳杆菌Shirota-pL500连续4天。在第5天，处死小鼠并获得各小鼠的淋巴集结组织的恒冷组织切片用于免疫组织化学和透射电子显微技术。

淋巴集结包埋于OCT并在液氮中快速冷冻。将厚度为2um的恒冷组织切片置于硅化载玻片上并在100％丙酮(+0.02％H₂O₂)中于4℃固定10分钟。将切片风干并随后在PBST(0.05％Tween20)中洗涤三次。固定的切片然后在Ultra V Block(Lab Vision Corp，Fremont CA，美国)中于室温封闭5分钟。去除封闭液并加入在含1％BSA的PBST中1:100稀释的各抗体或其组合[APC缀合的抗小鼠THY-1.2，藻红蛋百(PE)缀合的抗小鼠CD19(BD Biosciences)]并在保湿室中于4℃温育过夜。第二天，切片在PBST中洗涤三次(每次5-10分钟)。载玻片在FluorSave Reagent(Calbiochem)中封片并在共聚焦显微镜下进行观察。

实施例5：透射电子显微镜术(TEM)

对来自经口施用小鼠的淋巴集结组织进行TEM来显示完整干酪乳杆菌Shirota而非eGFP蛋白质的移位。简单而言，来自干酪乳杆菌Shirota-eGFP喂饲小鼠(4天内4次)的淋巴集结的组织切片在2.5％戊二醛中于4℃固定过夜。这些样品用二甲胂酸盐缓冲液中的1％的锇酸于室温进行后固定，在升高浓度的乙醇中逐步脱水，然后在100％环氧丙烷中进行最后的脱水。样品在环氧丙烷:环氧树脂的1:1混合物中温育并最终包埋于环氧树脂中。将超薄切片封片在铜载网上，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色并在透射电子显微镜上进行观察。

实施例6：电穿孔和Der p2在干酪乳杆菌Shirota中的异源表达

最初，在MRS培养基(Difco Laboratories Detroit)中，于37℃5.0％CO₂培养箱中培养干酪乳杆菌Shirota。从对数中期(OD_690nm＝0.6)的细胞制备干酪乳杆菌的感受态细胞，在预冷的洗涤缓冲液(50mMKH₂PO₄-K₂HPO₄(pH7.4)、0.3M蔗糖、1mM MgCl₂)中洗涤，并重悬浮于冰冷的电穿孔缓冲液(952mM蔗糖，3.5mM MgCl₂)中。向100μl细胞悬浮液中加入质粒DNA pLP500或pLP500/Dp2-锚(1μg)并将其转移至0.2cm杯中使用Gene Pulser II，BioRad(条件：2.5kV电压；25μF电容，200ohm电阻)进行电穿孔。脉冲发生后，加入900μl MRS培养基并在接种于含有红霉素(5μg/ml)的MRS琼脂上之前将细胞培育3小时。

如Maassen等(Vaccine.(1999)17，17，2117-2128)先前描述来从转化的干酪乳杆菌Shirota中提取质粒DNA并在干酪乳杆菌Shirota中L-(+)-乳酸脱氢酶基因组成型启动子下进行异源表达。收集总共5ml的转化细胞培养物并在PBS(pH7.4)中将沉淀洗涤一次。细菌沉淀在含有溶菌酶(Sigma)的PBS缓冲液中冰上消化1小时，然后使用Wizard DNAMiniprep试剂盒(Promega)进行DNA质粒的提取。

对于异源表达的研究，Lc/Dp2或Lc/V的过夜培养物用于接种50mlFalcon管中含有5μg/ml红霉素和1％葡萄糖(w/v)的MRS培养液(1:700稀释度)。培养物生长过夜，在OD_690nm>1.0时收集细胞并在PBS中洗涤一次。细胞重悬浮于裂解缓冲液(含1％Tween20和1mM PMSF的PBS)中，超声处理(10微米振幅(amplitude microns)，30秒开/30秒关，2分钟)并在SDS-PAGE上分离可溶性部分，使用Der p2单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹测定用于检测。

实施例7：来自脾和肠系膜淋巴结的小鼠T细胞与野生型干酪乳杆菌Shirota的共培养

与野生型干酪乳杆菌Shirota共培养后测定小鼠T细胞的细胞因子谱。每孔加入大约1 x 10³(肠系膜和脾分选CD3⁺细胞)或3 x 10³(总脾)用于共培养。干酪乳杆菌Shirota的新鲜培养物在MRS培养液(Difco)中于37℃ 0.5％CO₂培养箱中生长直至OD_690nm达到0.6。培养物的等分试样在PBS中洗涤两次，在RPMI1640中洗涤一次并最终重悬浮于T细胞培养基中。培养物等分试样在PBS中洗涤两次，在RPMI1640中洗涤一次并最终重悬浮于T细胞培养基中。在96孔培养板上两组相同孔中(200μl/孔的终体积)，以1:0、1:0.5、1:1、1:2、1:5的T细胞:干酪乳杆菌Shirota的比例来进行共培养。在共培养后16小时和24小时获得培养物的上清液并使用ELISA测定TGF-β细胞因子水平。

实施例8：制备Lc/V和Lc/Dp2用于喂饲

制备完整喂饲实验所需要的热灭活Lc/V和Lc/Dp2的原种。Lc/V或Lc/Dp2的新鲜培养物在MRS培养液(Difco)中于37℃ 0.5％CO₂培养箱中生长并通过分光光度计，基于690nm处的光密度(OD)1.0(等同于5 x10⁸cfu/ml培养物)来定量。所需量的Lc/V或Lc/Dp2培养物在3,500rpm离心10-15分钟并在PBS(pH7.0)中洗涤细胞沉淀两次，随后在0.2MNaHCO₃(pH8.4)中进行最后的洗涤。细胞随后在0.2M NaHCO₃(pH8.4)缓冲液中重悬浮至10⁹cfu/100ul的终浓度并等分400μl至每微量反应管(Eppendorf)中。细菌然后在Thermomixer(Eppendorf)中95℃热灭活30分钟，并随后冷冻储存于-70℃直至进一步使用。通过在MRS平板上培养检测细胞的活力。

实施例9：Der p2特异性免疫球蛋白应答的检测

通过ELISA测定Der p2特异性IgE和IgG1的水平。简单而言，小鼠血清与Der p2(2μg/ml)包被的孔一式两份在4℃温育过夜。生物素缀合的单克隆大鼠抗小鼠IgE(R19-15)和抗小鼠IgG1(G1-1.5)用于检测并随后加入ExtrAvidin碱性磷酸酶。通过加入对硝基苯酚磷酸盐(PNPP)底物显示信号。ELISA指数单位定义为OD_405nm读数，其对应于相同平板中具有抗小鼠Igκ作为捕获抗体的夹层ELISA中1ng/ml纯化的小鼠IgE或IgG1的读数。所用的所有抗体购买于Pharmingen(Pharmingen，San Diego，CA)。

实施例10：T细胞细胞因子谱形成和增殖测定

T细胞培养在补充有10％热灭活小牛血清(StemCellTechnologiesInc.)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Hyclone Laboratories，Logan，UT)和5.5 x 10^-2mM 2-巯基乙醇(Life technology，Grand Island，NY)的RPMI 1640培养基中进行。

简单而言，从脾中制备单细胞悬浮液并进行血红细胞裂解。脾细胞(30x 10⁶细胞/孔)在含10ml补充RPMI1640的6孔板中，存在10μg/ml Derp2的情况下培养3天。在第3天，用含IL-2(10U/ml)的新鲜培养基置换每一孔中的5ml培养基并照这样每2天置换培养基，共培养9天来维持细胞。在第9天，通过Ficoll纯化Der p2特异性T细胞，并在96孔圆底板(Costar，Corning，NY)上一式两份将细胞再活化，每一孔含有1 x 10⁵个纯化的T细胞、3 x 10⁵丝裂霉素处理的APC和10μg/ml Der p2，终体积为200μl/孔。48小时的培养后，收集上清液并储存于-20℃。在用5μg/ml抗CD3(克隆：145 2C11)和抗CD28(克隆：37/E51)(两克隆均来自BD Pharmingen，Oxford，英国)包被的孔中培养肠系膜淋巴结(MLN)细胞。72小时后，收集上清液并储存于-20℃。通过ELISA使用抗体对(Pharmingen)一式两份进行细胞因子谱形成以测定IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、TGF-β和IL-10细胞因子的存在。针对小鼠IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α的纯化抗体和TGF-β抗体以2μg/ml包被在96孔板上。如通过供应商推荐来使用针对各小鼠IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α和TGF-β抗体的生物素化的多克隆抗体。重组小鼠细胞因子在ELISA测定中用作标准品。所有抗体和重组细胞因子来自BD Biosciences PharMingen(San Diago，CA)，除非另作说明。

使用与APC(3 x 10⁵细胞/孔)共培养的淋巴集结细胞(1 x 10⁵细胞/孔)在有或没有5μg/ml或10μg/ml rDer p2的情况下进行T细胞增殖测定72小时。收集前大约18小时，用1μCi的[3H]-胸苷(NEN Life Science，Boston，MA)对细胞进行脉冲。收集细胞至玻璃纤维滤器(Skatroninstruments AS，Lier，挪威)中。加入闪烁液(Amersham Biosciences Corp)后，通过液体闪烁计数器(Beckman Coulter，Inc.FuUerton，CA)测定增殖。增殖指数表示为存在rDer p2时细胞的胸苷掺入与不存在rDer p2时细胞的胸苷掺入的比例。

实施例11：BALF分析和肺的组织学

用致死剂量的含1.25mg/ml咪达唑仑、2.5mg/ml氟丁酰酮和0.079mg/ml枸橼酸芬太尼的混合物腹膜内注射小鼠。通过气管造口术将气管暴露并插入(20G插管)，用0.8ml冰预冷的Hank′s平衡盐溶液(不含钙和镁的HBSS)灌洗肺三次并合并流体体积。进行总细胞计数并使用一式两份细胞离心涂片器用于BALF的分类细胞计数。快速测定BAL样品的体积，将样品离心(700g，5分钟，RT)，将其以1 x 10⁵细胞重悬浮至100μl(PBS/10％FCS)并通过细胞离心(300g，3分钟)将细胞离心涂片器置于多聚(l-赖氨酸)包被的载玻片(Cytospin 5 Thermo Shandon Inc.，Pittsburg，PA)上。将载玻片风干，固定于甲醇中并使用标准程序(Merck，英国)进行染色。在包被载玻片上一式两份对每一样品的500个细胞进行差别细胞计数。通过ELISA测定IL-5、IL-13、TNF-α、TGF-β和嗜酸细胞活化趋化因子的水平。

去除肺，在PBS中洗涤并固定于10％福尔马林中。肺包埋在石蜡中并使用苏木精和曙红(H&E)评估切片(2um厚)的一般形态和细胞渗入。

实施例12：哮喘小鼠模型中的预防方案

本实施例阐明了经口施用表达Der p2(Lc/Dp2)的热灭活重组干酪乳杆菌Shirota与Der p2皮下加强组合在预防方案中的用途(参照图10)。本实施例基于引发加强策略，所述策略使用通过皮肤贴片和Der p2气溶胶攻击而致敏产生的Der p2诱导的实验哮喘小鼠模型。本实施例也阐明怎样使用预防方案在Der p2诱导哮喘模型中提高经口施用的表达Der p2的热灭活重组干酪乳杆菌Shirota与Der p2皮下加强的组合在引发加强策略中的功效(参照图10)。对照组由NaHCO₃缓冲液或热灭活Lc/V喂饲的小鼠组成。在本实施例中，由于可使乳杆菌制备变得容易并满足使用遗传修饰生物(GMO)的安全性需要，使用热灭活的重组乳杆菌代替活的乳杆菌。然而应指出(也参照上文)乳杆菌具有任何期望的活性。

使用高压灭菌的强饲针(Popper & sons，inc.，NY)进行口腔喂饲。将实施例8中描述的冷冻的热灭活Lc/V或Lc/Dp2的等分试样融化至室温并且每只小鼠在研究的整个期间，一周连续三天每天接受含10⁹热灭活Lc/V或Lc/Dp2或100μl NaHCO₃缓冲液的剂量。在第11天和第18天，用Der p2(50μg/小鼠)皮下免疫所有小鼠。然后所有小鼠通过表皮贴片进行致敏三次(在第22、36和50天)。简单而言，每只小鼠的包皮表皮暴露于含50μg Der p2变应原的小块纱布连续三天。第三次致敏后的一个月内，通过含Der p2的气溶胶(1mg/10ml PBS)攻击小鼠两次。攻击后大约24小时，获得细支气管肺泡灌洗液(BALF)用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于组织学分析。获得脾和肠系膜淋巴结(MLN)用于细胞培养。在第0天并且每周均取的血液样品在2000g离心，收集血清并储存于-20℃用于测定抗体水平。

Lc/Dp2喂饲小鼠中Der p2特异性血清IgE水平的动力学比NaHCO₃和Lc/V喂饲小鼠中的低，表明单独用Lc/Dp2喂饲甚至在呼吸道攻击后可抑制IgE产生(图11)。所有三组的Der p2特异性血清IgG1水平没有显著差异。在动物研究的情况下，也可监控Lc/Dp2喂饲动物(例如小鼠)中通过T淋巴细胞产生Th-2细胞因子的一致性下调。为了该目的，获得脾和肠系膜淋巴结(MLN)细胞，在分别存在Der p2或抗CD3/CD28的情况下培养。如在图12中阐明，当与对照组比较时，皮下免疫的Lc/Dp2喂饲小鼠的脾T细胞产生更低水平的Th-2(IL-4、IL-5、IL-13)和促炎性细胞因子(TNF-α)，并且TNF-β一致性增加，Der p2特异性T细胞增殖降低。MLN细胞的分析说明L.c/V和Lc/Dp2喂饲小鼠相比于NaHCO₃组产生显著更低水平的IL-13，IL-4、IL-5和IL-10无显著降低(与Ac对照小鼠水平相似)，并且TGF-β水平升高(参照图13)。

假设用Lc/Dp2喂饲引发Th-2和Der p2特异性Tr细胞的混合物，后者通过Der p2的两次高剂量皮下免疫进一步扩大。这些Der p2特异性Tr细胞可能能够通过调节性细胞因子(如TGF-β1)对现有Th-2细胞发挥抑制性或致耐受性作用。本发明人观察到呼吸道攻击后获得的Lc/Dp2喂饲小鼠的血清中Th-2循环IL-10细胞因子水平相比于对照组有显著降低。Lc/Dp2喂饲小鼠的BALF的细胞因子谱显示IL-13、IL-5、TNF-α、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸性粒细胞的趋化因子)减少并且TGF-β1显著减少(图14)。同时，这些小鼠也显示BALF细胞计数减少(图15A)，与Ac组具有相似的水平。此外，仅Lc/Dp2喂饲小鼠嗜中性粒细胞计数显示有显著减少(参照图15B)。除了Lc/Dp2喂饲小鼠的BALF中淋巴细胞无显著增加外，嗜酸性粒细胞计数低并且所有组均类似。

NaHCO₃或Lc/V组的小鼠的肺组织显示出不同程度(中等至严重)的呼吸道病理学和细支气管肺泡空间周围的炎症渗入(图15C)。与其相反，Lc/Dp2喂饲小鼠的肺切片显示肺炎症基本降低，具有与Ac小鼠相似的谱(参照图15C)。

通过经口施用Lc/Dp2与Der p2蛋白两次皮下加强组合引发的小鼠显示变应性应答整体下调，其因而成为有效的预防方案。该引发加强方案能诱导抗原特异性Tr细胞的亚组(其产生耐性和/或在B和T细胞水平及呼吸道中下调Th-2调节子)因而有效阻断该小鼠模型中变应性哮喘和呼吸道重塑的发病是可能的。已报道鼠类Tr细胞(如CD25⁺CD4⁺、Tr1和Th3)在下调哮喘和变态反应中起决定性作用。将进一步阐明诱导机制和所涉及的Tr细胞和调节性细胞因子的作用。

实施例13：哮喘小鼠模型中的治疗方案

本实施例阐明在Der p2诱导的哮喘小鼠模型的治疗方案中，经口施用热灭活重组Lc/Dp2或野生型Lc/V与皮下免疫Der p2蛋白质的免疫疗法组合的功效(图16)。用于描述数据的对照组由NaHCO₃缓冲液喂饲的小鼠组成。在该方案中，通过表皮贴片使小鼠预先致敏，并随后用热灭活的Lc/V或Lc/Dp2喂饲所述小鼠连续5周。所有小鼠在最后两周喂饲过程中接受两次皮下免疫，因此模拟免疫疗法中使用的皮下免疫。

简单而言，用Der p2(50μg/小鼠)通过表皮贴片(在第0、14和28天)将C57BL/6小鼠预先致敏。简单而言，如实施例12中描述，用Der p2(50μg/小鼠)通过表皮贴片(在第0、14和28天)将C57BL/6小鼠预先致敏。在第33天，通过ELISA测定Der p2特异性血清IgE和IgG1的谱，并随后基于IgE水平将小鼠分成三组，每组六只小鼠。小鼠经口喂饲NaHCO₃缓冲液、热灭活的干酪乳杆菌Shirota/pLP500(Lc/V，野生型对照)或干酪乳杆菌Shirota/Derp2(Lc/Dp2)；使用高压灭菌的灌洗针(Popper& sons，inc.，NY)进行经口喂饲。将先前描述的冰预冷的热灭活Lc/V或Lc/Dp2的等分试样解冻至室温，并且每只小鼠从第35天开始每天接受100μl含10⁹热灭活Lc/V或Lc/Dp2或100μl NaHCO₃缓冲液的一次剂量，一周连续3天，共5周。在第55天和62天，两次皮下注射Der p2(50μg/小鼠)来免疫小鼠，并随后用含Der p2变应原的气溶胶(1mg/10mlPBS)攻击两次，随后用含Der p2变应原的气溶胶(1mg/10ml PBS)攻击小鼠两次。最后一次攻击后大约24小时，获得BALF用于分类细胞计数和细胞因子分析，并获得肺用于组织学研究。

如图17显示，所有三组中的小鼠在喂饲开始后一周显示Der p2特异性IgE有所减少。虽然在62天用高剂量Der p2变应原进行第一次皮下免疫后IgE水平升高，但是连续两次气溶胶攻击(在第69和77天)前后，相比于对照小鼠，Lc/V和Lc/Dp2喂饲小鼠中的IgE水平显著下降(参照图17B)。相反，皮下免疫后在第62和69天，这两组的Der p2特异性血清IgG1相比于对照小鼠显著升高，甚至在呼吸道攻击后依然保持不变(图17C和图17D)。

为了测定Lc/V和Lc/Dp2喂饲小鼠中通过T淋巴细胞产生Th-2细胞因子相比于对照组是否下调，分别获得脾T细胞和肠系膜淋巴结用于在存在Der p2或抗CD3/CD28时进行培养。相比于NaHCO₃组，Lc/Dp2和Lc/V喂饲小鼠的Der p2特异性脾T细胞的Th-2细胞因子(IL-5、IL-13、IL-10)显示有显著减少，而IL-4和TNF-α无显著减少(图18)。有趣的是，两组中TGF-β1的产生均无显著降低。与脾T细胞相似，来自Lc/Dp2和Lc/V组的肠系膜淋巴结(MLN)细胞中Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、IL-4、IL-13、IL-10和TNF-α)的产生没有显著降低(图19)。相反，相比于NaHCO₃组，Lc/Dp2和Lc/V组的MLN细胞中TGF-β1的产生均有所升高(图19F)。

来自Lc/V和Lc/Dp2组的BALF的细胞因子谱相比于NaHCO₃组，显示出Th-2和促炎性细胞因子(IL-5、IL-13、IL-4、IFN-γ、TNF-α、TGF-β)和嗜酸细胞活化趋化因子(用于嗜酸性粒细胞募集的趋化因子)无显著降低。两组具有与Ac对照组相似的水平(参照图20)。Lc/V和Lc/Dp2组与气溶胶对照组(Ac)相比，具有相似数量的总渗入细胞，并且不显著低于在NaHCO₃组中观察到的(参照图21)。分类细胞分析表明两组的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞减少，而淋巴细胞和巨噬细胞计数未受影响。相比于其他组，仅Lc/Dp2组的细支气管灌洗液(BALF)中的单核细胞计数有轻微降低。

显示了每组六只小鼠中两只代表性小鼠的肺组织(参照图21)。两组气溶胶对照小鼠(G和H)的肺切片的苏木精&曙红(H&E)染色显示肺实质中最小限度的呼吸道炎症背景，并在细支气管空间中具有最小限度的炎症渗入。然而，来自NaHCO₃组的小鼠的肺组织显示在呼吸道及细支气管空间周围有不同程度(中等至严重)的呼吸道炎症渗入细胞(A和B)。比较来说，Lc/V(c-d)和Lc/Dp2(E-F)喂饲的小鼠在炎症渗入中显示更高的降低，与Ac小鼠具有相似的谱。

实施例14：经口施用活的干酪乳杆菌Shirota/Dp2对用Der p2预先致敏的小鼠的影响

理解上述实施例同样可使用活的重组乳杆菌而非热灭活乳杆菌来进行的同时，本实施例阐明了表达Der p2的活的重组干酪乳杆菌Shirota的用途。

每周对C57/B6小鼠进行抽血以测定它们的Der p2特异性IgE和IgG1效价。通过ELISA测量所有测定(参照图32)。用100μl PBS中50μg的重组酵母来源的Der p2变应原来表皮贴片小鼠3天。在第1天、第14天和第28天对它们进行贴片3次。休息14天后，仅将IgE应答者平均分成两组(Lb相对于缓冲液)用于治疗研究。

向Lb组中六只小鼠的每只小鼠喂饲50μl碳酸氢盐缓冲液中大约10⁹细胞的活的重组Der p2(Lc/Dr p2)。喂饲前用碳酸氢盐缓冲液洗涤细胞两次。向对照小鼠仅喂饲碳酸氢钠缓冲液。喂饲每天进行一次并共持续4周。

最后一次喂饲后10天攻击(气溶胶)两组。相同组的小鼠置于房间中。向房间内喷洒10ml PBS中1mg的重组酵母来源的Der p2并由小鼠吸入30分钟。

在第0、14和28天用Der p2变应原(50μg/小鼠)通过表皮贴片使C57BL/6致敏。在第42天测定Der p2特异性IgE水平并根据它们各自的IgE效价将应答者分成两组(n＝6)。经口喂饲每天进行一次，共进行1个月，一组用NaHCO₃对照喂饲，另一组用1剂量(1 x 10⁹cfu)/小鼠的重组干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲。在第82天处死前，在第80天气溶胶攻击小鼠一次并获得脾用于T细胞培养(参照图22)。

基于全身IgG1和IgE的产生和脾T细胞的细胞因子谱来分析两组小鼠的免疫应答。预先致敏小鼠在用干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲时可有效降低Der p2特异性血清IgE和IgG1水平。如图23所示，喂饲后大约7天，与NaHCO₃对照组(其显示IgE仅有27％的衰减)相比，干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲的小鼠的Der p2特异性血清IgE显示有41％的衰减(参照图23A)。此外，相比于NaHCO₃对照组，Der p2特异性血清IgG1在干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲小鼠中显著衰减(参照图23B)。

然而，干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲组的脾T细胞谱在TH1和TH2细胞因子产生方面与NaHCO₃对照组相似(参照图24)。此外，用干酪乳杆菌Shirota/Dp2喂饲的小鼠显示T调节性细胞因子(IL-10和TGF-β)产生增加(参照图23C)。在该治疗模型中，未检查这些小鼠中的呼吸道炎症的谱。

实施例15：高剂量Der p2的皮下引发导致用Der p2攻击的小鼠中IgE和Tr相关细胞因子产生的衰减

该实施例阐明在小鼠中不应用佐剂的情况下Der p2变应原在调节抗体产生中的剂量效应的测定。

用低剂量(LD)[10μg/小鼠]和高剂量(HD)[50μg/小鼠]的酵母重组Der p2蛋白质，每隔4天通过皮下注射向8只雌性小鼠组(6至8周龄)施用3次(参照图1)。在第28天，对免疫小鼠进行LD的Der p2加强。在气溶胶攻击中，将小鼠不受限制地保存在干燥箱中并给予由超声雾化器(UltraNEB 99型，DeVilbiss Health Care，Sommerset，PA)产生的恒流气溶胶Der p2。PBS中0.1mg/ml的Der p2的4次剂量以两天的间隔给予30分钟。对照小鼠进行仅气溶胶Der p2吸入。收集血清并分析Der p2特异性抗体(参照图28)。

(a)用于Der p2特异性抗体的ELISA

通过ELISA测定Der p2特异性IgG1、IgE和IgG2a抗体的水平。ELISA平板(Costar，Corning，NY，美国)与包被缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH8.3)中5μg/ml的重组Der p2于4℃温育过夜。所有试剂以50μl/孔的体积使用，除非另有说明。温育后，用PBS/0.05％Tween20洗涤平板3次并用100μl的封闭缓冲液(PBS/0.05％Tween20中的1％BSA)在室温封闭1小时。平板与连续稀释的血清在4℃温育过夜。洗涤平板并将其与250μg/ml的生物素化的单克隆大鼠抗小鼠IgG1(G1-1.5)、IgG2a(R35-92)和IgE(R19-15)(Serotec，Oxford，英国)在室温温育1小时。洗涤平板并将其与碱性磷酸酶缀合的ExtrAvidin(Sigma Chemical Co，St Louis，MO)(1:2000稀释)温育。洗涤平板6次并使用Sigma Fast P-硝基苯基磷酸酶底物进行显色。温育1小时后，使用ELISA平板读出器(TecanG.m.b.H，奥地利)在405nm处测定吸收。除以下改变外，使用相似的方案来生成标准曲线。在一式两份的孔中包被抗小鼠Igκ轻链Ab(187.1)(Pharmingen，San Diego，CA)，并且小鼠重组IgG1(107.3)、IgG2a(G155-178)和IgE(C38.2)(Pharmingen)从50ng/ml开始连续稀释两倍。抗体效价与标准比较。ELISA单位(EU)定义为OD_405mn读数，其对应在相同平板中用抗小鼠Ig κ作为捕获抗体的夹层ELISA中1ng/ml检测抗体的读数。

发现用低剂量(LD)Der p2变应原重复皮下注射可刺激高IgE的产生(4.0±0.7EU)，其加强后一周显著增加(>4倍)(图26A，白色正方形)。IgG1的产生持续保持低水平(3280±550EU)直至第64天，其中很可能由于暴露于气溶胶化的Der p2中而升高(图26B，白色正方形)。IgG2a保持低水平(104±67EU，图26C，白色正方形)。相反，用高剂量(HD)的Der p2变应原引发的小鼠具有低的基础IgE水平(1.30±0.33EU，图26A，黑色正方形)。该组的小鼠显示持续较高的IgG1产生(8130±1000EU，图26B，黑色正方形)，其加强后升高很快(44800±4250EU)。它们的IgG2a水平也比用LD引发的小鼠，特别是加强或吸入攻击后的小鼠中的水平高(340±260EU，图26C，黑色正方形)。

(b)脾T细胞培养

在第64天通过颈脱位法处死处理的小鼠。从小鼠中切除脾并通过使用RBC裂解缓冲液(0.53％氯化铵)使红细胞耗尽。用10μg/ml的Der p2变应原以2 x 10⁶个细胞/ml在添加10％热灭活胎牛血清(FBS)[HycloneLaboratories，Logan，UT]、2mM L-谷氨酰胺(Hyclone Laboratories)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)、5.5 x 10^-2mM的β-巯基乙醇(Life Technology，Grand Island，NY)、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)(Hyclone Laboratories)于5％CO₂培养箱中37℃培养细胞。在第3、5、7天加入10U/ml的小鼠重组IL-2(R&D systems，Minneapolis，MN，美国)。在第10天，通过使用ficoll梯度离心(Ficoll pague plus，Pharmacia)回收有活力的细胞。

(c)CD4⁺T细胞的富集和刺激

使用抗小鼠CD4生物素缀合的抗体(GK1.5)和链霉抗生物素蛋白缀合的微珠(Miltenyi Biotec)根据生产商的说明书通过AutoMacs(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，德国)富集CD4⁺T细胞。在进行富集方案之前，用5％FCS/PBS和抗小鼠FcγIII/II受体(CD16/CD32)[2.4G2]封闭首次用于实验的小鼠的脾细胞，通过使用抗Pan NK生物素缀合的Ab(DX5)、抗CD11c微珠和链霉抗生物素蛋白缀合的微珠使天然杀伤细胞和树突细胞耗竭。使用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件(BectonDickinson)通过流式细胞术分析测定细胞纯度。对于所有组，至少95％的细胞为CD4⁺T细胞。纯化的CD4⁺T细胞在96孔板以3 x 10⁵细胞/200μl进行培养并用抗小鼠CD3εAb(5μg/ml，145-2C11)和抗小鼠CD28Ab(2μg/ml，37.51)刺激小鼠24小时。

(d)cDNA产生、扩增和实时PCR

裂解细胞并使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen Inc，CA)根据生产商说明书分离总RNA。如推荐，使用1μg的15mer多聚d(T)寡核苷酸和20单位的Moloney-鼠白血病病毒(Moloney-Murine Leukaemia Virus)(M-MVL)反转录酶(Promega，Madison，美国)从2μg总RNA中产生cDNA。

在每一样品中将HPRT归一化以使用于每一PCR的cDNA样品的量标准化。向含有10x PCR缓冲液、10pmol细胞因子引物、0.5mM dNTP和2.5单位的Taq DNA聚合酶的反应混合物中加入cDNA。25μl终体积的每一样品在DNA热循环仪(Perkin Elmer Gene Amp PCR system 9700，PE applied biosystems，美国)中温育共30个循环。每一循环由94℃30秒、58℃ 30秒和72℃ 1分钟组成。每一个反应中包括94℃开始温育5分钟和72℃最后延伸10分钟。

在LightCycler中使用SYBR Green技术进行实时PCR来扩增cDNA样品、阴性对照(水)和一系列稀释标准品。首次用于实验的小鼠样品用作标准以产生每一细胞因子的拟合系数文件。使用Fast start DNA MasterSYBR Green I(Roche Diagnostics，瑞士)根据生产商的说明书进行反应。扩增程序为：95℃变性10分钟、95℃ 5秒、58℃ 5秒和72℃ 12秒、58℃退火15秒、40℃冷却30秒的定量40个循环。基于通过相对定量软件(RelativeQuantification Software)(Roche Molecular Biochemicals，德国)自动进行的非线性回归拟合以效率矫正计算细胞因子相对比率。

以下寡核苷酸用于PCR分析：

HPRT：正义5′GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG 3′(SEQ IDNO：7)

反义5′GAGGGTAGGCTGGCCTATGGG 3′(SEQ ID NO：8)；

IFN-γ：正义5′CATTG AAAGCCT AG AAAAGTCTG 3′(SEQ IDNO：9)

反义5′CTCATGAATGCATCCTTTTTCG 3′(SEQ ID NO：10)；

IL-4正义5′CATCGGCATTTTGAACGAGGTCA 3′(SEQ ID NO：11)；

反义5′CTTATCGATGAATCCAGGCATCG 3′(SEQ ID NO：12)；

IL-5正义5′GAAAGAGACCTTGACACAGCTG 3′(SEQ ID NO：13)；

反义5′GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG 3′(SEQ ID NO：14)；

IL-9正义5′ATGTTGGTGACATACATCCTTGC 3′(SEQ ID NO：15)；

反义5′CGGCTTTTCTGCCTTTGCATCTC(SEQ ID NO：16)；

IL-10：正义5′CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG 3′(SEQ IDNO：17)；

反义5′TGTCTAGGGTCCTGGAGTCC AGCAGACT 3′(SEQ IDNO：18)；

IL-12正义5′ATGGCCATGTGGGAGCTGGAG 3′(SEQ ID NO：19)；

反义5′TTTGGTGCTTCACACTTCAGG 3′(S EQ ID NO：20)；

IL-13正义5′ATGGCCATGTGGGAGCTGGAG 3′(SEQ ID NO：21)；

反义5′TTTGGTGCTTCACACTTCAGG 3′(SEQ ID NO：22)；

(e)用于CD4⁺CD25⁺调节性T细胞研究的免疫方案

在第0、4和8天，用低剂量(LD)[10μg/小鼠]或高剂量(HD)[50μg/小鼠]的酵母重组Der p2蛋白质(rDer p2)通过皮下注射(皮下)来引发小鼠。在第28天给予LD的Der p2加强并通过ELISA测定Der p2特异的免疫应答。在另一项研究中，在第21天处死rDer p2引发的小鼠。获得淋巴结和脾用于T细胞培养物的细胞因子谱分析。用100μl的PBS皮下注射对照小鼠。如先前描述来产生rDer p2表皮贴片的小鼠(Wang LF等1996)。简单而言，先将含50μg r Der p2的100μl PBS应用于贴片上的1cm²纱布，该贴片随后应用于剃毛的皮肤并用弹性绷带固定。在第0天和14天进行贴片。每一贴片应用4天后去除。在第21天处死小鼠并确立抗原特异性TH2细胞。

仅接受Der p2气溶胶攻击的对照小鼠产生高表达水平的Ag特异性TH2细胞因子，尤其是IL-5、IL-10和IL-13。然而当与用LD引发的小鼠或对照组比较时，HD引发的小鼠显示其IL-5、IL-10和IL-13的表达受到显著抑制。此外，LD引发的小鼠与HD引发小鼠及对照相比仅具有高表达的IL-9。因此，初期HD引发通过抑制TH2相关细胞因子的表达减轻吸入Der p2的效应。

(f)CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的富集

通过使用CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)富集脾的调节性T细胞并根据生产商的说明书使用AutoMacs(Becton Dickinson)进行分选。部分分离细胞与FITC缀合的抗小鼠CD4抗体、Per-CP缀合的抗小鼠CD3ε抗体，和PE缀合的抗小鼠CD25温育用于纯度检查。使用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)通过流式细胞术分析来测定细胞纯度，并且至少95％的分离细胞为CD4⁺CD25⁺T细胞。

(g)脾细胞培养物和抗原呈递细胞(APC)制备

在补加10％热灭活小牛血清(StemCell Technologies)、1mM丙酮酸钠(Hyclone Laboratories)、2mM L-谷氨酰胺、抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和5.5 x 10^-2mM 2-β巯基乙醇(Lifetechnology)的完全RPMI-1640培养基中培养脾细胞并维持在37℃ 5％CO₂培养箱中。在含10μg/ml的Der p2蛋白质的96孔(4 x 10⁵细胞/孔)中培养脾细胞3-5天并将收集的上清液冰冻于-20℃。通过在含rDer p2的6孔板(2 x 10⁷细胞/孔)中培养脾细胞从表皮贴片小鼠中建立抗原特异性TH2细胞。在第3、5和7天，用含有10U/ml重组小鼠IL-2(rIL-2)(R&D systems)的新鲜培养基补充细胞。在第10天，收集并通过菲可帕克加(AmershamBiosciences)离心纯化TH2细胞。APC来自首次接受试验的小鼠经丝裂霉素C处理的脾细胞。简单而言，丝裂霉素C(Roche Diagnostic GmbH，Mannheim，德国)以50μg/ml的终浓度加入到细胞中并在黑暗中37℃温育20分钟。用30ml的1X HBSS洗涤细胞3次并将其悬浮于RPMI-1640培养基中。

(h)细胞因子谱形成和细胞增殖测定

抗原特异性TH2细胞和CD4⁺CD25⁺T细胞在含或不含10μg/ml rDerp2的情况下以1 x 10⁵细胞/孔进行培养。APC以3 x 10⁵细胞/孔使用。在第3天收集上清液并测定IL-4、IL-5和IL-13的产生。在增殖研究中，温育细胞5天并在最后18小时用1μCi的[3H]-胸苷(NEN Life Science，Boston，MA)进行脉冲。收集细胞至玻璃纤维滤器(Skatron instruments AS，Lier，挪威)中。加入闪烁液(Amersham Biosciences Corp)后，通过液体闪烁计数器(Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA)测定增殖。增殖指数表示为仅TH2细胞的比例。

(i)细胞因子ELISA

针对小鼠IFN-γ(RA-6A2)、IL-4(BVD4-1D11)、IL-5(TRFK5)、IL-9(D8402E8)、IL-10(JES052A5)(R&D systems，Minneapolis，MN，美国)、IL-13(38213)(R&D systems)的纯化抗体和TGF-β(A75-2.1)抗体以2μg/ml包被于96孔板上。按照建议使用针对小鼠IFN-γ(XMGl.2)、IL-4(BVD6-24G2)、IL-5(TRFK4)、IL-9(D9302C12)、IL-10(R&D systems)、IL-13(R&D systems)和TGF-β(A75-3.1)抗体的生物素化的多克隆抗体。重组小鼠细胞因子用作ELISA测定中的标准。除非另作说明，所有抗体和重组细胞因子来自BD BiosciencesPharMingen(San Diago，CA)。

图27描述了在用气溶胶化的Der p2攻击的Der p2引发的小鼠中细胞因子mRNA表达的定量。未检测到IL-12并且小鼠组间IL-4和IFN-γ的表达水平没有差异。然而，其他TH2细胞因子，尤其是效应细胞因子的表达中有差异。

使用实时PCR进一步评估这些细胞因子的表达水平(参照表I)。每一扩增药盒的解链曲线分析显示出在水对照中未观察到的特征尖峰(数据未显示)。表I表明了校准器(未处理的)-归一化的扩增细胞因子产物/HPRT比例。在所有组的小鼠中IL-4的表达没有明显差异。进行气溶胶Der p2吸入的对照小鼠产生高表达水平的Ag特异性TH2细胞因子，尤其是IL-5、IL-10和IL-13。当与用LD引发的小鼠或对照组比较时，HD引发的小鼠显示IL-13的表达(至少低100倍)、IL-5和IL-10的表达(～低7倍)受到显著抑制。这暗示初期HD引发通过抑制TH2相关细胞因子的表达改善吸入Der p2的效应。LD引发的小鼠相比于HD引发小鼠和对照仅具有高表达的IL-9(>100倍)。因此，TH2细胞因子与变应原剂量免疫相关。

图27和28显示了来自用高剂量或低剂量rDer p2蛋白质引发的小鼠的淋巴结和脾的细胞因子谱。在第0、4和8天，用低剂量(LD，10μg)或高剂量(HD，10μg)的rDer p2蛋白质或PBS引发小鼠并在第10天处死(上文)。收集淋巴结和脾并在rDer p2蛋白质存在的情况下将其培养3至5天。相比于高剂量引发的小鼠，来自低剂量引发小鼠的淋巴结和脾均显示TH2细胞因子(IL-4、IL-13和IL-9)增加和TH1细胞因子(IFN-γ)产生的降低。另一方面，高剂量引发的小鼠在淋巴结和脾中都显示更高的TGF-β产生。

图30描述了用高剂量rDer p2蛋白质引发的小鼠的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的抑制作用。用LD或HD的rDer p2蛋白质引发的小鼠的脾CD4⁺CD25⁺T细胞在rDer p2蛋白质存在的情况下与抗原特异性TH2细胞共培养5天并测定增殖和细胞因子应答。如图30(A-D)所示，用HD的rDer p2蛋白质引发的小鼠的脾CD4⁺CD25⁺T细胞能在TH2细胞增殖和TH2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的产生上施以抑制作用。用LD的rDer p2蛋白质引发的小鼠的脾CD4⁺CD25⁺T细胞不能产生相似的抑制作用。

实施例16：小鼠中重组干酪乳杆菌Shirota/Blo t5引发的免疫应答的研究

每周连续4天每天以1 x 10cfu/小鼠喂饲小鼠(图31)。每只小鼠接受的总喂饲为20剂量的1 x 10⁹cfu。每周对小鼠抽血直至7周并通过ELISA测定Blo t5特异性血清免疫球蛋白。检测到Blo t5特异性IgG1的显著水平，但未检测到IgE和IgG2a的显著水平(图32)。在第198天处死小鼠并获得来自淋巴集结和脾的T细胞用于细胞因子分析。仅在来自干酪乳杆菌Shirota/Blo t5喂饲小鼠的淋巴集结的T细胞中检测调节性细胞因子TGF-β的显著水平，表明活的重组干酪乳杆菌Shirota/Blo t5通过淋巴集结中的T细胞活跃诱导T调节性细胞因子的产生(参照图33)。

本说明书中先前公布的文件中的列表或讨论不应必须认为是承认所述文件是现有技术的部分或是普通一般知识。因此所有列出的文件此处引入作为参考。

此处示例性描述的发明可在缺少本文中没有特别公开的任何元素或多种元素、限制或多种限制的情况下适当地实施，而非此处明确公开的。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等，应作广义理解并不受限制。此外，此处使用的术语和表达已用作说明书的术语并非限制，并且不旨在使用此类术语和表达排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而认为在本发明要求的范围内多种修改是可能的。因此，应理解虽然本发明已经通过优选实施方案明确公开，本领域技术人员可做出此处公开的本发明的修改和变型，并且认为此类修改和变型在本发明范围内。

在此已广泛和一般性描述了本发明。一般性公开范围内的每一较窄的种类和次一般的分组也形成了发明的部分。这包括本发明的一般性描述，其限制性条款或负面限制为从类中去除任何主题，不管去除的主题是否在此处明确引用。

其他实施方案在以下权利要求书中。此外，按照马库什组描述了本发明的特征或方面，技术人员将承认本发明因此在马库什组的任何个体成员或亚组成员方面也有描述。

序列表

<110>新加坡国立大学

<120>重组乳杆菌及其用途

<160>21

<170>MS Word

<210>1

<211>400

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>载体PLP500中的Der p2

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<220>

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<223>载体PLP400中的Blo t5

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<223>引物BamHI-eGFP/f

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<223>引物eGFP-xhoSac/r

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<223>引物Dp2xhoSac/r

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<223>有义引物IF-γ

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<223>有义引物IL-4

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<223>反义引物IL-4

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<223>有义引物IL-12

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<223>有义引物IL-13

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<223>反义引物IL-13

<400>22

Claims

1.重组乳杆菌，其包含异源核酸序列，所述核酸序列编码螨变应原Der p 2或Blo t 5的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

2.重组乳杆菌，其包含异源核酸序列，所述核酸序列编码螨变应原Der p 1的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物，其中所述片段包含Der p 1的成熟全长蛋白质的至少8％的氨基酸序列。

3.权利要求1或权利要求2的重组乳杆菌，其中所述乳杆菌选自干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、孢子乳杆菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、希氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、莱氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、路氏乳杆菌、沙克乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、高加索乳杆菌和瑞士乳杆菌。

4.权利要求3的重组乳杆菌，其中所述乳杆菌是鼠李糖乳杆菌GG或干酪乳杆菌Shirota。

5.权利要求1-4任一项的重组乳杆菌，其中由所述异源核酸序列编码的所述免疫原性同源物与所述螨变应原各自的至少免疫原性片段的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

6.权利要求1-5任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2或Blo t 5，并且所述乳杆菌是干酪乳杆菌Shirota。

7.权利要求1-6任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2并且其中所述螨变应原由SEQ ID NO：1的序列编码。

8.权利要求1-7任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Der p 2并且其中所述异源核酸序列编码Der p 2的免疫原性同源物，或其免疫原性片段，所述免疫原性同源物具有与SEQ ID NO：1的核酸序列至少70％同一性的核酸序列。

9.权利要求1-6任一项的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Blo t5并且其中所述螨变应原的所述至少免疫原性片段由SEQ ID NO：2的序列编码。

10.权利要求1-6任一项或权利要求9的重组乳杆菌，其中所述螨变应原是Blo t 5并且其中所述异源核酸序列编码Blo t 5的免疫原性同源物，或其免疫原性片段，所述免疫原性同源物具有与SEQ ID NO：2的核酸序列至少70％同一性的核酸序列。

11.权利要求1-10任一项的重组乳杆菌，其中编码所述螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的所述序列包含在异源核酸分子中。

12.权利要求11的重组乳杆菌，其中所述异源核酸分子是表达载体。

13.权利要求12的重组乳杆菌，其中所述表达载体选自pLP400、pLP500、pSIP308和pSIP412。

14.药物组合物，其包含权利要求1-13任一项的重组乳杆菌。

15.权利要求14的药物组合物，还包含可药用载体或稀释剂。

16.权利要求14或15的药物组合物，还包含皮质类固醇、抗组胺剂、白三烯调节剂、肥大细胞稳定剂、减充血剂和β2肾上腺素受体激动剂的至少一种。

17.权利要求14-16任一项的药物组合物，还包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

18.权利要求17的药物组合物，其中所述变应原为螨变应原。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述螨变应原为尘螨变应原。

20.权利要求18或19的药物组合物，其中所述螨变应原选自Der p 1、proDer p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 7、Der p 8、Derp 9、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 7、Der f 10、Der f 11、Der f 15、Der f 16、Der f 18、Der m 1、Eur m 1、Eur m 2、Her f 2、Blo t 1、Blo t 3、Blo t 5、Blo t 12、Fel d 1、Mag1、Mag 3、Tyr p 2、Lep d 1、Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10和Lep d 13。

21.权利要求18-20任一项的药物组合物，其中所述螨变应原包含与所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。

22.权利要求21的药物组合物，其中螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物是所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

23.药盒，其包含

(a)如权利要求14-16任一项中定义的药物组合物，和

(b)包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物。

24.权利要求23的所述药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述变应原为螨变应原。

25.权利要求24的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述螨变应原为尘螨变应原。

26.权利要求24或25的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的所述螨变应原选自Der p 1、proDer p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 7、Der p 8、Der p 9、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Derp 18、Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 7、Der f10、Der f 11、Der f 15、Der f 16、Der f 18、Der m 1、Eur m 1、Eur m 2、Her f 2、Blo t 1、Blo t 3、Blo t 5、Blo t 12、Fel d 1、Mag 1、Mag 3、Tyrp 2、Lep d 1、Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10和Lep d 13。

27.权利要求24-26的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含与(a)的药物组合物中包含的所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。

28.权利要求27的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物为(a)的药物组合物中包含的所述重组乳杆菌表达的螨变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

29.权利要求23-28任一项的药盒，其中(b)的药物组合物中包含的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得。

30.权利要求1-13任一项的所述重组乳杆菌，其用于治疗。

31.权利要求30的重组乳杆菌，其中所述治疗是调节对变应原的免疫应答。

32.权利要求30或31的重组乳杆菌，其用于经口施用。

33.权利要求30-32任一项的重组乳杆菌，用于与变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物组合施用。

34.权利要求33的重组乳杆菌，用于舌下、皮下、皮内、经皮或表皮施用变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

35.权利要求33或34的重组乳杆菌，其中所述变应原为螨变应原。

36.权利要求30-35任一项的重组乳杆菌，其中所述重组乳杆菌包含在药盒中，所述药盒还包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

37.权利要求33-36任一项的重组乳杆菌，用于顺序施用重组乳杆菌和变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

38.权利要求37的重组乳杆菌，其中所述顺序施用包括第一步施用变应原的所述至少免疫原性片段和第二步施用所述重组乳杆菌。

39.调节哺乳动物中对变应原的免疫应答的方法，所述方法包括施用权利要求14的药物组合物。

40.权利要求39的方法，其中所述哺乳动物为人。

41.权利要求39的方法，其中所述变应原为螨变应原。

42.权利要求41的方法，其中所述螨变应原为尘螨变应原。

43.权利要求39的方法，用于治疗变应性疾病。

44.权利要求43的方法，其中所述变应性疾病为螨变态反应。

45.权利要求43的方法，其中所述变应性疾病选自哮喘、鼻炎、特应性皮炎和荨麻疹。

46.权利要求39的方法，用于预防变应性疾病。

47.权利要求46的方法，其中所述变应性疾病为螨变态反应。

48.权利要求46的方法，其中所述变应性疾病选自哮喘、鼻炎、特应性皮炎和荨麻疹。

49.权利要求39的方法，其中权利要求14的药物组合物经口或舌下施用。

50.权利要求39的方法，其包括重复施用包含重组乳杆菌的药物组合物。

51.权利要求39的方法，其中所述药物组合物还包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

52.权利要求39的方法，还包括施用药物组合物，所述药物组合物包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

53.权利要求52的方法，其中包含重组乳杆菌的药物组合物和包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物包含在药盒中。

54.权利要求52的方法，其中所述变应原为螨变应原，所述变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含在所述药物组合物中。

55.权利要求52的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含与所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。

56.权利要求55的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物是所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

57.权利要求52的方法，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得。

58.权利要求52的方法，其中包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的所述药物组合物以选自舌下、皮下、皮内、经皮、表皮和其任何组合的方式施用。

59.权利要求52的方法，其中包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的所述药物组合物经皮下施用，并且其中权利要求14的药物组合物经口施用。

60.权利要求52的方法，其中顺序施用包含所述重组乳杆菌的药物组合物和包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物。

61.权利要求60的方法，其包括：

(a)提供权利要求14的药物组合物，

(b)施用权利要求14的药物组合物，

(c)提供包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物，和

(d)施用包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物。

62.权利要求52的方法，其中首先施用包含变应原的至少免疫原性片段的药物组合物，其后施用权利要求14的药物组合物。

63.权利要求52的方法，其中所述方法为免疫疗法。

64.权利要求52的方法，其中重复施用包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的药物组合物。

65.权利要求1-13任一项的重组乳杆菌在制备用于调节对变应原的免疫应答的药物组合物中的用途。

66.权利要求65的用途，其中所述变应原为螨变应原。

67.权利要求66的用途，其中所述螨变应原为尘螨变应原。

68.权利要求65至67任一项的用途，用于治疗或预防变态反应。

69.权利要求68的用途，其中所述变态反应为螨变态反应。

70.权利要求65-69任一项的用途，用于经口或舌下施用所述重组乳杆菌。

71.权利要求65-70任一项的用途，用于重复施用所述重组乳杆菌。

72.权利要求65-71任一项的用途，其中所述药物组合物还包含皮质类固醇、抗组胺剂、白三烯调节剂、肥大细胞稳定剂、减充血剂和β2肾上腺素受体激动剂的至少一种。

73.权利要求65-72任一项的用途，用于与变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物组合施用。

74.权利要求73的用途，其中所述药物组合物包含变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

75.权利要求65-73任一项的用途，用于制备药盒，其中所述药盒还包含药物组合物，所述药物组合物包含变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

76.权利要求73-75任一项的用途，其中所述变应原为螨变应原。

77.权利要求73-76任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物包含与所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物的至少一个共同表位。

78.权利要求77的用途，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物为所述重组乳杆菌表达的变应原的至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

79.权利要求73-78任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物通过富集、纯化和分离的任何一种从重组生物中获得。

80.权利要求73-79任一项的用途，用于顺序施用所述重组乳杆菌和变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物。

81.权利要求80的用途，用于免疫疗法。

82.权利要求80或81的用途，其中首先施用变应原的所述至少免疫原性片段，其后施用变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物。

83.权利要求73-82任一项的用途，其中变应原的所述至少免疫原性片段，或其免疫原性同源物以选自舌下、皮下、皮内、经皮、表皮和其任何组合的方式施用。

84.权利要求83的用途，其中所述重组乳杆菌经口施用，并且包含变应原的至少免疫原性片段或其免疫原性同源物的所述药物组合物皮下施用。

85.权利要求73-84任一项的用途，其中重复施用变应原的所述至少免疫原性片段或其免疫原性同源物。