CN112574853A - 用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法，所述高通量微流控芯片包括载片层和捕获层，捕获层设有流道，流道含有入口和出口，流道具有自入口朝向出口的第一方向和垂直第一方向的第二方向，流道内设有多个捕获单元，每个捕获单元内沿第一方向依次设有一第一捕获结构和一第二捕获结构；在细胞样品流经捕获单元后，其中一细胞样品穿过第一捕获结构被第二捕获结构捕获；在磁珠样品流经捕获单元后，其中一磁珠样品被第一捕获结构捕获。本发明旨在提供一种结构简单、高通量且可快速实现单细胞配对的微流控芯片及方法。

Description

用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴 阵列形成方法

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，具体涉及用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法。

背景技术

细胞是生命体的组成以及生命活动的最基本单位。传统方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊了人们对大脑、血液系统、免疫系统，及其组成这些系统的细胞之间异质性(heterogeneity)的认识。随着高通量测序技术的发展，单细胞测序技术已经成为单细胞分析最重要的手段之一，它极大的提高了单细胞分析的效率和准确性。对单细胞基因水平的分析可以揭示细胞(特别是癌细胞)基因组中发生的突变以及结构变异，了解细胞之间对于药物的响应的差异性，找到与这些病变细胞相关的特异性分子，给现代的个性化治疗提供一个重要的手段，可以更好的指导医学工作者对疾病的诊断和治疗，实现真正的疾病个性化治疗。

对单细胞分析来说，其面临的挑战主要有两点，首先是对单细胞分离技术的要求，如何快速高效地分离单细胞；其次是由于单细胞中所含有的分析靶标量太少，因此我们在分析之前需要对其进行信号放大，在这一个过程中，常常会遇到样品丢失或放大偏差性的问题，导致出现大量实验不平行的现象，而且在细胞数目较多时，需要大量的重复操作，极其耗时，导致实验通量无法提升。

微流控芯片把生物和化学等相关领域中的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上,由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用来代替常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。在微流控芯片中，试剂消耗量从mL和μL级可减少到nL和fL级，可以大大减少昂贵的生化试剂而降低分析成本，且反应时间也从几小时缩短到几秒甚至更短。因此，微流控芯片特别适合于单细胞分析研究。

但目前用于单细胞配对的微流控芯片操作比较繁琐，需要的控制单元比较复杂，如发明专利(授权号：CN107012067B)所述的方法，采用的是微流控芯片技术，包括单细胞捕获流体层、阀门控制层，以及载玻片层。芯片的制作是比较复杂的，需要将流体层和控制层对齐封接；单细胞配对的过程以及形成的液滴过程需要多步处理才能实现，实现单细胞磁珠的配对过程比较复杂；且由于控制层需要有阀的设计，导致单位面积芯片可容纳的捕获单元有限，因此细胞捕获通量还是受限。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法，旨在提供一种结构简单、高通量且可快速实现单细胞配对的微流控芯片及方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

在一个总体方面，本发明提供用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，包括载片层和捕获层，所述捕获层设有流道，所述流道含有入口和出口，所述流道具有自入口朝向出口的第一方向和垂直第一方向的第二方向，所述流道内设有多个捕获单元，每个所述捕获单元内沿第一方向依次设有一第一捕获结构和一第二捕获结构；在细胞样品流经所述捕获单元后，其中一细胞样品穿过所述第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获；在磁珠样品流经所述捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获。

优选地，所述第一捕获结构包括两第一夹持部，两所述第一夹持部沿第二方向相对间隔设置；

所述第二捕获结构包括两第二夹持部，两所述第二夹持部沿沿第二方向相对间隔设置；

其中，相对的两所述第一夹持部之间的间距大于单细胞的直径而小于单磁珠的直径；相对的两所述第二夹持部之间的间距小于单细胞的直径。

优选地，相对的两所述第一夹持部之间的间距为20～30um，和/或，相对的两所述第二夹持部之间的间距为5～10um。

优选地，所述捕获层采用PDMS材料制作而成，所述捕获层与载片层使用等离子处理后键合。

优选地，每一所述捕获单元均含有一供样品进出的子入口和子出口，所述子入口和子出口沿所述第一方向相对设置。

在又一个总体方面，本发明还提供一种单细胞磁珠配对的方法，采用上述所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，所述方法包括步骤：

S1、自流道入口向所述流道内通入细胞样品，细胞样品流经所述捕获单元后，其中一细胞样品穿过所述第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获；

S2、自流道入口向所述流道内通入磁珠样品，磁珠样品流经所述捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获。

优选地，步骤S1具体包括：

S11、将目标细胞稀释到10⁴～10⁶cell/ml，获得细胞样品；

S12、将所述细胞样品自流道入口以10～1000mbar的恒定气压通入流道；

S13、进入流道内的细胞样品沿第一方向流动，细胞样品流经捕获单元后，其中一细胞样品穿过该捕获单元内的第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获，待流道内的捕获单元的细胞捕获率达到90％时，则停止通入细胞样品；和/或，

步骤S2具体包括：

S21、提供10⁴～10⁶beads/ml密度的磁珠样品；

S22、将所述磁珠样品自流道入口以10～1000mbar的恒定气压通入到流道；

S23、进入流道内的磁珠样品沿第一方向流动，磁珠样品流经捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获，待流道内的捕获单元的磁珠捕获率达到90％时，则停止通入磁珠样品。

优选地，所述方法还包括步骤：

S3、自流道入口向所述流道内通入PBS。

在另一个总体方面，本发明还提供一种液滴阵列的形成方法，基于上述所述的单细胞磁珠配对的方法完成单细胞磁珠配对后，所述液滴阵列的形成方法还包括：

自流道入口向所述流道内通入碳氟油，碳氟油流经所述捕获单元后，捕获单元内的液体被截留，流道捕获单元外的区域的液体被碳氟油替代，从而形成含有单细胞磁珠的液滴阵列。

在另一个总体方面，本发明还提供一种磁珠回收方法，基于上述所述的单细胞磁珠配对的方法完成单细胞磁珠配对后，所述磁珠回收方法还包括：

自流道出口向所述流道内通入PBS缓冲液，PBS缓冲液自流道的出口流向入口，PBS缓冲液流经捕获单元后，被捕获于第一捕获结构内的磁珠被推出所述第一捕获结构，被推出的磁珠随PBS缓冲液的流动而自流道的入口流出；

使用磁棒对流出的磁珠进行清洗并回收。

本发明的有益效果：本发明的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法，其可实现高通量、快速的单细胞磁珠配对，该高通量微流控芯片只有置于载片层上的一捕获层结构，操作过程中没有任何阀门的控制，只需简单的进样过程就可以实现单细胞磁珠的配对并形成单独的液滴阵列，其具有可产业化生产的可能，以及在使用的过程中能让使用者更容易操作，可达到将单细胞磁珠配对的通量提高到现有的商业化产品的级别的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明示例性的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片的俯视示意；

图2为本发明示例性的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片的侧视示意图；

图3为图1中的A部放大示意图；

图4为图3中的B部放大示意图；

图5为采用本发明示例性的单细胞磁珠配对的方法配对后的示意图；

图6为采用本发明示例性的液滴阵列的形成方法形成的液滴阵列示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。

实施例一

图1为本发明示例性的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片的俯视示意，图2为本发明示例性的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片的侧视示意图。结合图1和图2所示，本发明示例性的提供一种用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片包括载片层10和设于载片层10上的捕获层20。示例性的，载片层10为一光片。

具体的，捕获层20设有流道21，流道21含有入口21a和出口21b，流道21具有自入口21a朝向出口21b的第一方向X和垂直第一方向X的第二方向Y。参照图1、图3和图5所示，流道21内设有多个捕获单元22，每个捕获单元22内沿第一方向X依次设有一第一捕获结构23和一第二捕获结构24；在细胞样品b流经捕获单元22后，其中一细胞样品b穿过第一捕获结构23被第二捕获结构24捕获；在磁珠样品a流经捕获单元22后，其中一磁珠样品a被第一捕获结构23捕获。

优选的，本实施例的芯片宽度为2.1cm，长度为6cm，捕获层20内的流道21的高度为40～60um。其中，如图1所示，捕获单元22在流道21内设有多行多列，相邻的两行之间的捕获单元22交错设置，以便样品能够在流道21内顺利流动，并进入捕获单元22内。较佳的，捕获单元22的上下间距为350um，左右间距为350um。

结合图3和图4所示，为了样品液体的流动及在样品被捕获后排出多余液体，每一捕获单元22均含有一供样品进出的子入口22a和子出口22b，子入口22a和子出口22b沿第一方向X相对设置，以便液体及时排出。

示例性的，参阅图2和图4所示，第一捕获结构23包括两第一夹持部23a，两第一夹持部23a沿第二方向Y相对间隔设置；第二捕获结构24包括两第二夹持部24a，两第二夹持部24a沿沿第二方向Y相对间隔设置；其中，相对的两第一夹持部23a之间的间距大于单细胞的直径而小于单磁珠的直径。相对的两第二夹持部24a之间的间距小于单细胞的直径。通常的，磁珠的大小为30um粒径，细胞大小为8～20um。优选的，相对的两第一夹持部23a之间的间距为20～30um。相对的两第二夹持部24a之间的间距为5～10um。

参阅图4，为了保证捕获的样品的稳定性，第一夹持部23a包括沿第一方向X相连的第一夹持座和第二夹持座，沿第二方向，第二夹持座的上顶面超出所述第一夹持座的上顶面，使第一夹持座与第二夹持座之间形成一台阶面，便于磁珠样品卡入并被稳定捕获。优选的，形成的台阶面为斜面，形成一过渡面，便于样品进入的同时便于对磁珠进行反向冲洗回收。进一步，为了便于液体顺利进入捕获单元22并流出，第一夹持座的远离台阶面的一侧为斜面，该斜面提供了顺滑的流动面，便于进入捕获单元22内的液体在捕获单元22内流动。

继续参阅图4，同样的，第二夹持部24a包括沿第一方向X相连的第三夹持座和第四夹持座，沿第二方向，第四夹持座的上顶面超出所述第三夹持座的上顶面，使第三夹持座与第四夹持座之间形成一台阶面，便于细胞样品卡入并被稳定捕获。优选的，形成的台阶面为斜面，形成一过渡面，便于细胞样品进入。进一步，为了便于液体在捕获单元22内流动，第三夹持座的远离台阶面的一侧为斜面，该斜面提供了顺滑的流动面，便于进入捕获单元22内的液体在捕获单元22内流动。

优选的，捕获层20采用PDMS材料一体制作而成，采用PDMS材料制作而成的结构易成形，复制形状真实，使用简单。进一步，捕获层20与载片层使用等离子处理后键合，该方式使得封接速度快、高效、牢固、不可逆封接。

实施例二

参阅图1和图5所示，本发明示例性的提供一种单细胞磁珠配对的方法，采用实施例一所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，本实施例的单细胞磁珠配对的方法包括步骤：

S1、自流道21入口21a向流道21内通入细胞样品b，细胞样品b流经捕获单元22后，其中一细胞样品b穿过第一捕获结构23被第二捕获结构24捕获。

S2、自流道21入口21a向流道21内通入磁珠样品a，磁珠样品a流经捕获单元22后，其中一磁珠样品a被第一捕获结构23捕获。

S3、自流道21入口21a向流道21内通入PBS。通入PBS冲洗剩余的磁珠，使捕获结构以外的流道无细胞和磁珠滞留。

先通入细胞的目的是为了让细胞捕获结构都被单细胞占据，由于磁珠的捕获结构的间距超过了细胞的直径，因而，细胞不会被磁珠的捕获结构捕获。如果先通入磁珠的话，磁珠就很有可能会被细胞的捕获结构所捕获。所以，捕获的顺序应先捕获单细胞，后捕获磁珠。

其中，步骤S1具体包括：

S11、将目标细胞稀释到10⁴～10⁶cell/ml，获得细胞样品；优选的，将目标细胞稀释到10⁵cell/ml，合适的浓度有利于捕获细胞的效果，如果细胞太稀，需要的捕获时间需要增加，如果细胞太密，捕获的双细胞率会增加。

S12、将细胞样品自流道21入口21a以10～1000mbar的恒定气压通入流道21；优选的，恒定气压选择100mbar，恒定的气压保证捕获细胞过程的稳定性。压力过大会导致捕获的细胞被挤出捕获结构。

S13、进入流道21内的细胞样品b沿第一方向X流动，细胞样品b流经捕获单元22后，其中一细胞样品b穿过该捕获单元22内的第一捕获结构23被第二捕获结构24捕获，待流道21内的捕获单元22的细胞捕获率达到60～100％时，则停止通入细胞样品b。优选的，在细胞捕获率达到90％时则停止通入细胞样品b，这是因为捕获的位置在90％可以很快就实现，但如果要确保所有位置都捕获细胞，需要更长的时间，而且会增加双细胞或磁珠的概率。

其中，步骤S2具体包括：

S21、提供10⁴～10⁶beads/ml密度的磁珠样品；优选的，提供10⁵beads/ml密度的磁珠样品，合适的浓度有利于捕获磁珠的效果，如果磁珠太稀，需要的捕获时间需要增加，如果磁珠太密，捕获的双磁珠率会增加。

S22、将磁珠样品自流道21入口21a以10～1000mbar的恒定气压通入到流道21。优选的，恒定气压选择100mbar，恒定的气压保证捕获磁珠过程的稳定性。

S23、进入流道21内的磁珠样品a沿第一方向X流动，磁珠样品a流经捕获单元22后，其中一磁珠样品a被第一捕获结构23捕获，待流道21内的捕获单元22的磁珠捕获率达到60～100％时，则停止通入磁珠样品a。优选的，在磁珠捕获率达到90％时则停止通入磁珠样品a，这是因为捕获的位置在90％可以很快就实现，但如果要确保所有位置都捕获磁珠，需要更长的时间，而且会增加双磁珠的概率。

实施例三

参阅图6所示，本发明示例性的提供一种液滴阵列的形成方法，该形成方法基于实施例二的单细胞磁珠配对的方法，是在实施例二的配对方法完成单细胞磁珠配对后，进一步形成液滴阵列c，本实施例的液滴阵列的形成方法在上述步骤S1～S3的基础上还包括：

S4、自流道21入口21a向流道21内通入碳氟油，碳氟油流经捕获单元22后，捕获单元22内的液体被截留，流道21捕获单元22外的区域的液体被碳氟油替代，从而形成含有单细胞磁珠的液滴阵列c。

示例性的，完成单细胞磁珠的配对后，以300mbar的恒定气压通入NOVCE7500(碳氟油)，当碳氟油流经液滴捕获阵列区域的时候，在捕获结构内的液体会被截留，在流道区域的液体会被碳氟油替代，因此可以很快形成含有单细胞磁珠的液滴阵列，如图4所示。如果是需要做细胞裂解的步骤，只需在通入碳氟油之前，将裂解试剂通入替换原来的液体即可。

实施例四

本发明示例性的提供一种磁珠回收方法，该回收方法基于实施例三的单细胞磁珠配对的方法，是在实施例三的液滴阵列的形成方法完成后，对完成了细胞的内含物结合后的磁珠进行回收处理，本实施例的磁珠回收方法还包括：

S5、自流道21出口21b向流道21内通入PBS缓冲液，PBS缓冲液自流道21的出口21b流向入口21a，PBS缓冲液流经捕获单元22后，被捕获于第一捕获结构23内的磁珠被推出第一捕获结构23，被推出的磁珠随PBS缓冲液的流动而自流道21的入口21a流出。

S6、使用磁棒对流出的磁珠进行清洗并回收。

即使用PBS缓冲液从液体出口进样，与捕获细胞及磁珠时的流向相反，即可把被捕获的磁珠推出芯片，收集回收液，再使用磁棒清洗回收的磁珠即可进行后续的操作。

本发明的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片、配对方法及液滴阵列形成方法，其可实现高通量、快速的单细胞磁珠配对，该高通量微流控芯片只有置于载片层上的一捕获层结构，操作过程中没有任何阀门的控制，只需简单的进样过程就可以实现单细胞磁珠的配对并形成单独的液滴阵列，其具有可产业化生产的可能，以及在使用的过程中能让使用者更容易操作，可达到将单细胞磁珠配对的通量提高到现有的商业化产品的级别的目的。

本发明所揭示的乃较佳实施例的一种或多种，凡是局部的变更或修饰而源于本发明的技术思想而为熟习该项技术的人所易于推知的，俱不脱离本发明的专利权范围。

Claims (10)

1.一种用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，其特征在于，包括载片层和捕获层，所述捕获层设有流道，所述流道含有入口和出口，所述流道具有自入口朝向出口的第一方向和垂直第一方向的第二方向，所述流道内设有多个捕获单元，每个所述捕获单元内沿第一方向依次设有一第一捕获结构和一第二捕获结构；在细胞样品流经所述捕获单元后，其中一细胞样品穿过所述第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获；在磁珠样品流经所述捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获。

2.如权利要求1所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，其特征在于，所述第一捕获结构包括两第一夹持部，两所述第一夹持部沿第二方向相对间隔设置；

所述第二捕获结构包括两第二夹持部，两所述第二夹持部沿沿第二方向相对间隔设置；

其中，相对的两所述第一夹持部之间的间距大于单细胞的直径而小于单磁珠的直径；相对的两所述第二夹持部之间的间距小于单细胞的直径。

3.如权利要求2所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，其特征在于，相对的两所述第一夹持部之间的间距为20～30um，和/或，相对的两所述第二夹持部之间的间距为5～10um。

4.如权利要求1所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，其特征在于，所述捕获层采用PDMS材料制作而成，所述捕获层与载片层使用等离子处理后键合。

5.如权利要求1～4任一所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，其特征在于，每一所述捕获单元均含有一供样品进出的子入口和子出口，所述子入口和子出口沿所述第一方向相对设置。

6.一种单细胞磁珠配对的方法，其特征在于，采用如权利要求1～5任一所述的用于单细胞磁珠配对的高通量微流控芯片，所述方法包括步骤：

S1、自流道入口向所述流道内通入细胞样品，细胞样品流经所述捕获单元后，其中一细胞样品穿过所述第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获；

S2、自流道入口向所述流道内通入磁珠样品，磁珠样品流经所述捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获。

7.如权利要求6所述的单细胞磁珠配对的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：

S11、将目标细胞稀释到10⁴～10⁶cell/ml，获得细胞样品；

S12、将所述细胞样品自流道入口以10～1000mbar的恒定气压通入流道；

S13、进入流道内的细胞样品沿第一方向流动，细胞样品流经捕获单元后，其中一细胞样品穿过该捕获单元内的第一捕获结构被所述第二捕获结构捕获，待流道内的捕获单元的细胞捕获率达到90％时，则停止通入细胞样品；和/或，

步骤S2具体包括：

S21、提供10⁴～10⁶beads/ml密度的磁珠样品；

S22、将所述磁珠样品自流道入口以10～1000mbar的恒定气压通入到流道；

S23、进入流道内的磁珠样品沿第一方向流动，磁珠样品流经捕获单元后，其中一磁珠样品被所述第一捕获结构捕获，待流道内的捕获单元的磁珠捕获率达到90％时，则停止通入磁珠样品。

8.如权利要求6或7所述的单细胞磁珠配对的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

S3、自流道入口向所述流道内通入PBS。

9.一种液滴阵列的形成方法，其特征在于，基于如权利要求6～8任一所述的单细胞磁珠配对的方法完成单细胞磁珠配对后，所述液滴阵列的形成方法还包括：

自流道入口向所述流道内通入碳氟油，碳氟油流经所述捕获单元后，捕获单元内的液体被截留，流道捕获单元外的区域的液体被碳氟油替代，从而形成含有单细胞磁珠的液滴阵列。

10.一种磁珠回收方法，其特征在于，基于如权利要求6～8任一所述的单细胞磁珠配对的方法完成单细胞磁珠配对后，所述磁珠回收方法还包括：

自流道出口向所述流道内通入PBS缓冲液，PBS缓冲液自流道的出口流向入口，PBS缓冲液流经捕获单元后，被捕获于第一捕获结构内的磁珠被推出所述第一捕获结构，被推出的磁珠随PBS缓冲液的流动而自流道的入口流出；

使用磁棒对流出的磁珠进行清洗并回收。

Images