JP2021534956A - 安定なジェットからの単分散粒子に誘発される液滴の形成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年8月17日に出願された米国仮特許出願第62/719,569号の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号R21AI116218の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
ビーズなどの粒子は、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体の化学的および酵素的カップリングを可能にする有用な機械的および化学的特性を生成または購入できるため、商業的および学術的な液滴ワークフローで広く使用されている。液滴マイクロ流体は、この概念を利用して、例えば、油中液滴内の粒子および標的を対合(ペアリング)することによって、単一分子または単一細胞の分析を行うことができる。しかし、対合は通常、スループットを制限した滴下方式で動作するデバイスで実現されている。かかるワークフローは、キャピラリ数(Ca)に依存する滴下から噴射への遷移によって制御されるスループットの上限となる。本開示は、上記の問題に対処し、関連する利点を提供するものである。
上記に要約したように、本開示は、例えば、様々な液滴ベースのワークフローを容易にするために、単分散液滴を生成するための改善された方法を提供する。開示される方法は、マイクロ流体デバイスを使用して、様々な対象の標的、例えば、細胞、核酸等への粒子の対合を容易にし、かつ任意選択でその後の分析を容易にする。特に、開示される方法は、マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、第2の流体中に第1の流体のジェットを提供することであって、第1の流体が、第2の流体と非混和性である、流動させることと、複数の粒子を第1の流体のジェット中へ導入することで、第1の流体のジェットの分解、および第2の流体中の第1の流体の複数の単分散液滴の複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む。例示的な実施形態を図1D、1E、2D、2E、4Aおよび4Bに示す。
本明細書で使用される場合、「(複数の)粒子」および「(単一の)粒子」という用語は、開示される方法の文脈において、安定ジェットの分解を誘発して、構造を含有する液滴を形成できる構造を指すために互換的に使用される。本明細書の任意の好適な実施形態では、粒子はビーズであってもよい。粒子は、多孔質または非多孔質であってもよい。本明細書の任意の好適な実施形態では、粒子は、追加の成分および/または試薬、例えば、本明細書に記載されるように単分散液滴に放出可能であり得る追加の成分および/または試薬を含有し得るマイクロ区画を含み得る。本明細書の任意の好適な実施形態では、粒子は、ポリマー、例えば、ヒドロゲルを含み得る。本明細書の他の好適な実施形態では、粒子は、剛性粒子を含んでもよい。一部の実施形態では、例えば、第1の流体が水性流体である本明細書に記載の実施形態では、ポリマーは親水性ポリマーである。一部の実施形態では、例えば、第1の流体が非水性流体、例えば、油である本明細書に記載の実施形態では、ポリマーは、親油性ポリマーである。第1の流体が水相流体である他の実施形態では、ポリマーは、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)ポリマーである。本明細書の任意の好適な実施形態では、粒子は、細胞、例えば、哺乳類細胞、酵母細胞、または細菌細胞であってもよい。粒子は概して、直径または最大寸法で約0.1〜約1000μmの範囲である。一部の実施形態では、粒子の直径または最大寸法は、(包括的に)約1.0μm〜1000μm、例えば(包括的に)1.0μm〜750μm、1.0μm〜500μm、1.0μm〜250μm、1.0μm〜200μm、1.0μm〜150μm、1.0μm〜100μm、1.0μm〜10μm、または1.0μm〜5μmである。一部の実施形態では、粒子は、約10μm〜約200μm、例えば、約10μm〜約150μm、約10μm〜約125μm、または約10μm〜約100μmの直径または最大寸法を有する。例示的な実施形態では、複数の単分散液滴の各液滴は、1つの粒子を含み、かつ1つ以下の粒子を含む。
本明細書で使用される場合、液滴に適用される「単分散」という用語は、本明細書に記載の安定ジェットの粒子誘発分解によって生成される粒子含有液滴の直径または最大寸法の変動を指す。一般に、単分散液滴は、それらが生成される粒子と比較してより大きな直径または最大寸法の変動を有することができるが、一方で、本明細書に記載される様々な方法においても機能する。単分散液滴は、概して、直径または最大寸法で約0.1〜約1000μmの範囲であり、直径または最大寸法の変動は、10未満の係数を有し得、例えば、直径または最大寸法で、5未満の係数、4未満の係数、3未満の係数、2未満の係数、1.5未満の係数、1.4未満の係数、1.3未満の係数、1.2未満の係数、1.1未満の係数、1.05未満の係数、または1.01未満の係数を有し得る。一部の実施形態では、単分散液滴は、少なくとも50%以上、例えば60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、または99%以上の単分散液滴が、直径または最大寸法で10倍未満、例えば5倍未満、4倍未満、3倍未満、2倍未満、1.5倍未満、1.4倍未満、1.3倍未満、1.2倍未満、1.1倍未満、1.05倍未満、または1.01倍未満の係数で変化するように、直径または最大寸法の変動を有する。一部の実施形態では、単分散液滴の直径は、(包括的に)約1.0μm〜1000μm、例えば、(包括的に)約1.0μm〜約750μm、約1.0μm〜約500μm、約1.0μm〜約250μm、約1.0μm〜約200μm、約1.0μm〜約150μm、約1.0μm〜約100μm、約1.0μm〜約10μm、または約1.0μm〜約5μmである。一部の実施形態では、単分散液滴の内部体積は、約0.01pL以下、約0.1pL以下、1pL以下、約5pL以下、10pL以下、100pL以下、または1000pL以下であり得る。一部の実施形態では、単分散液滴の内部体積は、約1fL以下、約10fL以下、または100fL以下であり得る。一部の実施形態では、単分散液滴の内部体積は、ピコリットルとフェムトリットルとの間の範囲(例えば、約0.001pL〜約1000pL)の液体体積を包含し得る。一部の実施形態では、単分散液滴の内部体積は、ナノリットルレベル(例えば、厳密にはピコリットル、厳密にはフェムトリットル、またはこれらの組み合わせ)を厳密に下回って伸長する。
二重エマルションは、概して、エマルション内のエマルション、すなわち、第2の非混和相の液体液滴内に含有される液体液滴を指す。これらは、界面活性剤によって安定化することができるが、重要なことに、中間相「シェル」には、任意の界面活性剤に加えて、液体相が含まれる。シェルの体積が減少すると、二重エマルションは、液滴内の液滴というより、コア流体が界面活性剤分子の薄い膜にカプセル化された小胞様構造に似ている。二重エマルションを使用して、それらが脱湿性遷移を受けることを可能にすることによって、かかる「小胞」を形成することができる。当該脱湿性遷移では、中間液相流体はシェルから除去されるが、界面活性剤層は維持され、それを取り囲む界面活性剤分子の薄い層を有する水性コア、ならびに元来それに接着するシェルであった小さな油滴を含む小胞が生成される。
非混和性流体がマイクロ流体チャネル内で一緒に流動すると、液滴が形成され得る。
本明細書で考察されるように、開示される方法は、概して、マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、第2の流体中に第1の流体のジェットを提供することであって、第1の流体が、第2の流体と非混和性である、流動させることと、複数の粒子を第1の流体のジェット中へ導入することで、第1の流体のジェットの分解、および第2の流体中の第1の流体の複数の単分散液滴の複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む。一部の実施形態では、本方法は、第1の流体を第2の流体中へ流動させる前に、第3の流体を第1の流体中へ流動させるさらなるステップを含み、第3の流体は、第1の流体と混和性である。第1の流体は、概して、第2の流体と非混和性であるように選択され、粒子を構成する材料と共通の親水性/疎水性を共有する。第3の流体は、概して、第2の流体と非混和性であるように選択され、第1の流体と混和性または非混和性であってもよい。したがって、一部の実施形態では、第1の流体は、水相流体であり、第2の流体は、非水相、例えば、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせなどの第1の流体と非混和性である流体であり、第3の流体は、水相流体である。代替的に、一部の実施形態では、第1の流体は、非水相、例えば、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせであり、第2の流体は、第1の流体、例えば、水相流体と非混和性である流体であり、第3の流体は、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせである。
ある特定の態様において、界面活性剤は、第1の流体、第2の流体、および/または第3の流体に含まれてもよい。したがって、液滴、例えば、粒子含有液滴は、界面活性剤安定化エマルション、例えば、界面活性剤安定化単一エマルションまたは界面活性剤安定化二重エマルションを含んでもよく、界面活性剤は、第1の流体、第2の流体、および/または第3の流体に可溶性である。オクチルフェノールエトキシレート(Triton X−100)、ポリエチレングリコール(PEG)、(Tween20)、および/またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノール(IGEPAL)を含むがこれらに限定されない、液滴内で所望の反応が行われることを可能にする任意の簡便な界面活性剤を使用してもよい。他の態様では、液滴は、界面活性剤によって安定化されない。
液滴は、いくつかの化学的および生物学的用途、例えば、化学合成、動態学研究、生物学的内容物のスクリーニング、および生物医学的診断のための独立したマイクロリアクタとして使用することができる。主題の方法を実践する際に、1つ以上のステップ(例えば、約2、約3、約4、または約5以上のステップ)で、いくつかの試薬を液滴に添加する必要があり得る。液滴に試薬を添加する手段は、例えば、液滴のエマルション化段階に応じて、いくつかの方法で変化してもよく、例えば、異なるアプローチが二重エマルション液滴などの多重エマルション液滴に対して単分散単一エマルション液滴への試薬添加に適用可能であってもよい。対象のアプローチとしては、Ahn,et al.,Appl.Phys.Lett.88,264105(2006)、Priest,et al.,Appl.Phys.Lett.89,134101(2006)、Abate,et al.,PNAS,November 9,2010 vol.107 no.45 19163−19166、およびSong,et al.,Anal.Chem.,2006,78(14),pp4839−4849により記載されたものが含まれるが、これらに限定されず、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、試薬は、例えば、マイクロ流体デバイスまたはシステムを使用せずに、例えば、第1の流体の成分として、本明細書に記載されるエマルション化プロセス中に液滴に添加されてもよい。他の実施形態では、マイクロ流体技術、デバイス、および/またはシステムは、本明細書に別途記載されるように一度調製された単分散液滴を添加および/または修正するために利用されてもよい。
一部の実施形態では、標的、例えば、核酸標的分子、核酸合成試薬、および/または核酸検出試薬は、粒子上または粒子内に配置された1つ以上の係留部分を介して粒子に結合される。係留部分は、係留される標的と相互作用し得る。例えば、係留部分は、粒子上または粒子内に結合される特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。特定のオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対および架橋を介して、流体中の標的にハイブリダイゼーションすることができる。
本明細書に開示される方法は、概して、分光法、化学技術、生物学的技術、配列決定等の様々な検出方法を使用して、多数の区画化反応の実行、ならびにそれらの反応のその後の読み取りおよび選別を容易にする。反応には、生体分子なしで行われる有機反応もしくは無機反応、または酵素反応、例えばPCRなどの生体分子および/または細胞を伴う反応が含まれ得る。また、細胞材料または細胞ベースの抽出物を伴う反応であってもよく、これには、生体細胞を使用することなく、DNA、RNA、およびタンパク質を発現することができる転写および翻訳抽出物が含まれる。これは、例えば、活性について経路をスクリーニングすることを含む、合成生物学的用途に使用され得る。
主題の方法を実施する際、核酸合成および/または増幅産物(例えば、等温核酸増幅産物またはPCR産物)を検出する方法は、様々であり得る。例えば、単に集団に存在する特定の細胞型、例えば腫瘍細胞の数をカウントすることを目的とする場合、これは、SybrGreen、または任意の他の染色剤および/またはインターカレート染色剤が各単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴に添加される単純なバイナリーアッセイを使用することによって達成することができ、その結果、特徴的な遺伝子、例えば癌遺伝子が存在し、PCR産物が産生される場合、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴が蛍光を発する。蛍光の変化は、蛍光偏光に起因し得る。成分の検出には、インターカレート染色剤(例えば、SybrGreen)を使用することを含み得る。
主題の方法の態様は、生体試料中の1つ以上の細胞または細胞のサブセット(例えば、腫瘍細胞)の存在を検出することを含む。かかる方法は、例えば、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中に細胞をカプセル化および/または結合するステップと、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴を、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中の細胞の溶解をもたらすのに十分な条件に供するステップと、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴を、核酸増幅に対する阻害効果を有する1つ以上の材料を非活性化または除去するのに十分な条件に供するステップと、核酸合成試薬、例えば、核酸増幅試薬を、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中中へ導入するステップと、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴を、存在する場合に標的核酸の合成、例えば、増幅をもたらすのに十分な核酸合成条件、例えば、核酸増幅条件に供するステップと、存在する場合に、標的核酸の合成、例えば、増幅から生じる増幅または合成産物を検出するステップと、を含み得る。
本明細書で考察されるように、開示される方法により、様々な生体試料からの対象となる核酸、例えば、DNAまたはRNAの検出における使用が見出される。かかる方法は、例えば、核酸および合成試薬を単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内にカプセル化するステップと、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴を核酸の増幅をもたらすのに十分な増幅条件に供するステップと、核酸の増幅から生じる増幅産物を検出するステップと、を含んでもよい。増幅条件は、MDA条件および/もしくはPCR条件、例えば、RT−PCR条件、ならびに/または追加の等温核酸増幅条件、例えば、ループ媒介等温核酸増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、およびニッキング酵素増幅反応(NEAR)であってもよい。
上記に要約したように、本発明の方法を実践する際に、MDAを使用して、核酸、例えば、ゲノムDNAを、例えば、次世代配列決定を介して、下流分析のための概して偏りのない非特異的な方法で増幅することができる。
上記に要約したように、本発明の方法を実践する際に、PCRベースのアッセイを使用して、細胞または核酸の異種試料中に存在する特定の対象となる核酸、例えば、対象の遺伝子および/または遺伝子マーカー、例えば、癌遺伝子(複数可)の存在を検出してもよい。かかるPCRに基づくアッセイは、前または後のMDA増幅ステップとして、同じ単分散液滴、例えば単分散単一エマルション液滴または多重エマルション単分散液滴において実行されてもよい。他の実施形態では、PCR反応は、単分散液滴中で独立して行われてもよい。かかるPCRベースのアッセイの条件は、1つ以上の方法で変化し得る。
稀少な転写産物を増幅するために、本明細書に記載されるように、単分散単一エマルション液滴、第1のステップRT−PCRまたはPCR反応を受けた多重エマルション液滴を、第2のステップPCR反応にさらに供することができる。一部の実施形態では、第1のステップRT−PCRまたはPCR反応を受けた第1の単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、酵素(例えば、DNAポリメラーゼ)、DNAプローブ(例えば、蛍光DNAプローブ)およびプライマーを含むがこれらに限定されない、追加のPCR試薬を含有する第2の単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内にカプセル化され、続いて、第1の単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴が破裂する。ある特定の実施形態では、追加のPCR試薬を含有する第2の単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、第1のステップRT−PCRまたはPCR反応を受けた単分散液滴よりも大きい。例えば、第2のステップPCRを阻害し得る細胞成分の希釈を可能にするので、これは有益であり得る。第2のステップPCR反応は、第1のステップ反応を行うために使用される同じマイクロ流体デバイス上で行われてもよく、異なるマイクロ流体デバイス上で行われてもよく、あるいはマイクロ流体デバイスを使用せずに行われてもよい。
本明細書に記載される方法は、例えば、デジタルPCRを使用して核酸を定量化するために使用することができる。デジタルPCRでは、試料が液滴中で単離されると、多くの液滴は、ゼロまたは1つの標的分子のいずれかをカプセル化するように、溶液由来の標的核酸を希釈するが、それらのモデル化が可能であれば、より高い充填率を使用することができることが多い。標的核酸の増幅に十分な試薬も液滴に含まれ、液滴は増幅に好適な条件に供される。一部の実施形態では、試料は、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション単分散液滴(例えば、二重エマルション)中で区画化され、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション単分散液滴(例えば、二重エマルション)は、増幅条件に供される。標的を含有する液滴は増幅を受け、そうでない液滴は増幅を受けないため、核酸増幅産物をもたらさない。検出成分が含まれる場合、標的を含む単一エマルションまたは多重エマルションは、検出可能なシグナルで満たされ得、例えば、イメージングまたはフロードロポメトリによってそれらを特定することを可能にする。かかるデジタルPCRを実行するために二重エマルションを使用する強力な利点は、二重エマルションが、分画した試料と混和性である水性担体相に懸濁され得、これにより、市販のフローサイトメータおよび蛍光活性化細胞選別機(FACS)を使用して容易に検出および/または選別され得ることである。これにより、選別が容易ではない他の方法では不可能な試料から標的エンティティを濃縮させることができる。
本明細書に開示される方法は、単一細胞カプセル化およびRNAseqに使用され得る。RNAseqは、次世代配列決定(NGS)技術によって可能になる大規模な並列配列決定を利用して、組織試料中のRNA転写産物の列挙にアプローチする別の方法である。具体的には、RNAseqは、遺伝子融合事象、新規転写産物、およびRNA編集を含む、遺伝子発現変化、代替スプライシング事象、対立遺伝子特異的遺伝子発現、およびキメラ転写産物等の現象を研究するために使用され得る。相補的DNA(cDNA)は、単分散エマルション、ならびに単一細胞遺伝子発現プロファイル分析のデータを収集するために実施されるNGSの標準的なインビトロ転写およびライブラリ調製により回収され得る。
本明細書に記載される方法は、溶液中の核酸の長さ分布を測定するために使用することができる。これは、標的核酸にそれらの長さに沿って既知の距離の異なる領域でアニールするプローブ配列を設計することによって達成され得る。次いで、プローブを標的核酸と混合し、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中で区画化することができる。各単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、例えば、既知の距離だけ離れた標的上の2つの異なる領域の存在をシグナル伝達する2つのプライマーおよびプローブセットを含有してもよい。これは、異なる対合が標的の異なる距離および異なる領域をプローブするように、プローブの異なる組み合わせについて繰り返すことができる。必要に応じて、試料を増幅、分析、および選別に供することができる。分析により、いくつかの単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、1つのプローブのみで増幅を受けるが、他のものには、例えば、他方のプローブのみで増幅を受けるものがあることがわかる。これは、これらの単一エマルション液滴または多重エマルション液滴において、一方の種類は、一方のプローブのみの領域を含有し、他方の種類は、他方のプローブの領域を含有することを示唆している。この集団において、両方のプローブで増幅を受ける単一エマルション液滴または多重エマルション液滴も存在し得、その中の標的核酸が両方の領域を含有することを示している。この同じ懸濁液には、(勿論、増幅を受けないために、おそらく標的領域を含有しないものに加えて)3つの種類の液滴の各々の測定可能な分画を含む多数の単一エマルション液滴または多重エマルション液滴が含まれる。このデータは、溶液中の核酸の長さを推測するために使用され得る。
本明細書に記載される方法は、標的核酸の配列分析のためのマイクロ流体濃縮(MESA)を実行するために使用され得る。これは、本方法を使用して、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴に標的核酸をカプセル化し、それらの液滴において増幅を行い、液滴が標的配列を含有するときに蛍光シグナルをもたらすことによって達成される。次いで、これらの液滴を選別し、それによって、選別されたプール内の核酸を濃縮することができる。必要に応じて、反応は、複数の異なる部分配列を含有する分子間を区別するために多重化されてもよい。増幅を使用して、選別前、同時、または選別後のいずれかの選別された核酸を増幅し、配列決定を可能にすることもできる。
MESA技術は、溶液からの裸の核酸の濃縮を可能にするが、同様のアプローチは、細胞、ウイルス、胞子、粒子などのエンティティ内に含有される核酸に適用することができ、そのプロセスは略同じである。例えば、標的核酸を含むエンティティは、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内にカプセル化され、上述のように、標的核酸を増幅するのに十分な条件に供され得る。次いで、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴を増幅に基づいて選別して、標的を有するエンティティを回収することができる。
本明細書に記載されるように、細胞へのエマルションPCRの適用および選別には、生物の溶解、ならびに多くの場合、死滅が含まれている。しかしながら、アプローチを修正し、本明細書に記載の方法を使用することによって、生きた無傷の細胞を回収することも可能である。これは、例えば、細胞内容物が、細胞の生存率を維持しながら、カプセル化された単分散単一エマルション液滴または多重エマルション単分散液滴に漏出するような条件下で、生細胞を単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内にカプセル化することによって達成され得る。これは、例えば、電流も流れるチャネルを通って細胞を流動させることによって可能であり、これにより、細胞膜内の細孔形成を誘導し、細胞溶解物が漏出することを可能にし得る。細胞がこのチャネルから通過すると、その膜は再び密閉され得るが、一方で、漏出した溶解物は細胞の周囲に依然として存在する。層流条件の場合、これは、細胞の周囲の溶解物が細胞と共に流動し、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴などの同じ区画にカプセル化されるように実施することができる。細胞核酸の増幅または他の細胞成分の検出に好適な試薬も、細胞の周りの溶解物が液滴中にあるときに試薬と相互作用することができるように含めることができる。蛍光シグナルが産生され、標的細胞を含有する液滴を選別によって回収することを可能にし、細胞の生回収を可能にするように、反応を設計することができる。これは、他の反応および分析を実行できるように細胞寿命を維持しながら、分子およびRNAなどの配列バイオマーカーに基づいて細胞間を区別する能力であるPACSの利点を提供するため、技術を極めて有効に活用したものである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴(例えば、二重エマルション)中の反応を区画化し、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内の反応産物を検出し、それらの産物に基づいて特定のエンティティを回収するように液滴を選別し、適切な分析を実行する能力に依存している。細胞およびウイルスなどの異なるエンティティを区別するために、酵素アッセイ、例えばPCRなどの多くの種類のアッセイを実行することができる。しかしながら、場合によっては、酵素技術は、対象の分析物を検出することができない可能性がある。これらの例では、分光法などの他の方法を実装することができる。質量分析は、感度が高く、一般的であるため、非常に強力な検出方法である。しかしながら、質量分析の限界として、それが破壊的な技術であり、分析する試料を破壊する可能性がある。目標が情報の回収のみである場合、これは許容可能であり得るが、場合によっては、通常、質量分析器によって破壊されるシステムから材料を追加で回収することが望ましい。
単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴(例えば二重エマルション)に細胞をカプセル化する能力は、細胞およびウイルスなどの生物を培養する点で貴重である。例えば、細胞が単一の共有体積で成長した場合、細胞間の競合により、ある特定の細胞が集団を支配し、その結果、それらがいくつかの培養時間後に細胞の大部分を含む場合がある。単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中の細胞を区画化し、それらを培養することによって、当該競合を制御および/または軽減することができる。さらに、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴の透過性により、特定の分子が通過することができる一方で、他の分子が通過しないように設定することができる。これにより、例えば、増殖に重要なシグナル伝達分子または他の分子が、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴シェルを自由に通過することにより、培養条件をより良好に制御することが可能になる。
主題の方法のある特定の実施形態では、複数のバイオマーカーを検出して、特定の細胞について分析することができる。検出されるバイオマーカーは、細胞のゲノムまたはこれらの組み合わせにおける1つ以上のタンパク質、転写産物、および/または遺伝子シグネチャを含んでもよいが、これらに限定されない。標準的な蛍光ベースの検出では、同時に調べることができるバイオマーカーの数は、各単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内で独立して可視化することができる蛍光色素の数に制限され得る。ある特定の実施形態では、特定の単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内で個別に検出され得るバイオマーカーの数を増加させることができる。例えば、これは、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴の異なる部分への色素の分離によって達成されてもよい。特定の実施形態では、色素およびプローブ(例えば、核酸または抗体プローブ)とコンジュゲートされた粒子(例えば、LUMINEX(登録商標)粒子)は、分析されるバイオマーカーの数を増加させるために、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内にカプセル化されてもよい。別の実施形態では、蛍光偏光を使用して、単一の細胞についての異なるバイオマーカーについてより多くの検出可能なシグナルを達成してもよい。例えば、蛍光色素は、様々なプローブに取り付けられてもよく、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、異なる偏光条件下で可視化されてもよい。このようにして、同じ着色色素を利用して、単一の細胞の異なるプローブ標的のシグナルを提供することができる。固定細胞および/または透過細胞の使用はまた、(以下でより詳細に考察されるように)多重化のレベルの増加を可能にする。例えば、標識抗体を使用して、細胞成分に局在化されたタンパク質標的を標的化してもよく、一方、標識PCRおよび/またはRT−PCR産物は、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴内に遊離する。これにより、同じ色の色素を抗体およびRT−PCRによって産生されるアンプリコンに使用することが可能になる。
一部の実施形態では、開示される方法およびデバイスを使用して、デジタルELISA手順を使用して、試料中のエピトープを定量化することができる。一部の実施形態では、例えば、平面基質表面または粒子表面などの固体基質に結合したエピトープは、酵素触媒で標識された親和性試薬でさらに結合することができる。試料を洗浄して、非結合親和性試薬および酵素を除去することができる。次いで、標識されたエピトープまたはその一部は、様々な様式で溶液中に放出され得る。容易にするために、酵素触媒は、化学的に、または例えば熱もしくは光の印加で分解され得る結合を通じて、親和性試薬に結合することができる。代替的に、親和性試薬とエピトープとの間の相互作用を破壊することができ、またはエピトープと基質との間の相互作用を破壊することができる。粒子に結合が生じた場合、粒子は洗浄ステップ後に溶液中に懸濁され、それによって酵素触媒を懸濁させることができる。次いで、懸濁した酵素触媒は、酵素触媒が蛍光産物に変換することができる基質などの酵素触媒を検出するのに十分な試薬を用いて、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴(例えば二重エマルション)にカプセル化することができる。次いで、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴は、触媒に適した条件下でインキュベートすることができ、触媒が存在するときに多量の反応産物を含有し、存在しない場合に少量の単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴をもたらす。次いで、蛍光単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴の数を、薄暗い単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴と比較して定量化し、試料中に存在する触媒分子の数を測定することができる。この情報は、次いで、元の試料中のエピトープの濃度を推測するために使用され得る。
本明細書に記載される方法は、RNA分子の高感度検出および絶対定量化のために使用することができる。対象のアッセイアプローチとしては、Chang,et al.,J.Immuno.Methods.378(1−2),102−15(2012)によって記載されたものも含まれるが、これらに限定されず、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、極めて低い濃度の分析物に適用されるものであり、結合特性は、典型的なイムノアッセイまたはELISAプラットフォームから逸脱する場合がある。理論分析により、一連の実験パラメータから期待できるパフォーマン指標(検出感度、アッセイ速度など)が明確になる。
本明細書に記載の方法を実践する際に、単分散液滴の選別を含む、1つ以上の選別ステップを用いることができる。例えば、複数の粒子が無秩序構成において第1の流体のジェット中へ導入され、単分散粒子含有液滴の集団を含む多分散エマルションをもたらす開示される方法の文脈において、本方法は、例えば、非粒子含有液滴に対する単分散粒子含有液滴のサイズ差に基づいて、単分散粒子含有液滴を選別して、多分散エマルション中の他の液滴から分離するステップを含み得る。
主題の方法は、様々な異なる対象から採取された生体試料に適用することができる。多くの実施形態では、対象は、「哺乳類」または「哺乳動物」であり、これらの用語は、肉食動物(例えば、イヌおよびネコ)、げっ歯類(例えば、マウス、モルモット、およびラット)、ならびに霊長類(例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル)を含む、哺乳類に属する生物を説明するために広く使用される。多くの実施形態では、対象はヒトである。主題の方法は、性別を問わず、任意の発達段階(すなわち、新生児、乳幼児、少年、思春期、成人)のヒト対象に適用され得、ある特定の実施形態において、ヒト対象は、少年、思春期、または成人である。本発明はヒト対象に適用され得るが、主題の方法が、鳥、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜、およびウマ等の他の動物対象(すなわち、「非ヒト対象」において)にも実施され得、これらに限定されないことを理解されたい。したがって、本明細書に記載されるような評価を必要とする任意の対象が好適であることを理解されたい。
本明細書に記載される方法およびデバイスは、異種溶液中のエンティティを検出および選別するための様々な方法で使用することができる。これまでに記載された一部の実施形態は、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴(例えば、二重エマルション)中で実施される核酸増幅を使用してこれを達成するが、他の方法もまた、本明細書に記載されるように有効である。開示される方法およびデバイスが核酸を検出するために使用される場合、これは、例えば、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴に個々の核酸エンティティをカプセル化し、次いで、それらを標的核酸に特異的なプライマーで増幅に供し、標的アンプリコンを検出し、次いで増幅に基づいて選別することによって、達成することができる。ただし、標的への親和性試薬の結合などの他の手段を使用して、他の検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、標的が核酸である場合、標的に特異的なプローブを合成することができ、これは、存在する場合に、標的にハイブリダイゼーションすることができる。これらのプローブは、色素、または場合によっては、触媒(酵素ベースまたは非酵素ベースの触媒など)で標識されてもよい。標的は、それらのプローブによって結合し、未結合のプローブを除去するために精製に供され得、残りの材料は、本明細書に記載される方法を使用して液滴内にカプセル化することができる。
本明細書に記載される方法は、癌を検出するための方法も含む。かかる方法は、対象に由来する生体試料から得られた単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴オリゴヌクレオチドにカプセル化することであって、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが、単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴に存在する、カプセル化することと、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬、検出成分、および複数のPCRプライマーを単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴中へ導入することと、PCR増幅がPCR増幅産物を産生することを可能にする条件下で単分散単一エマルション液滴または多重エマルション液滴をインキュベートすることであって、複数のPCRプライマーが、それぞれ1つ以上の癌遺伝子にハイブリダイゼーションする1つ以上のプライマーを含む、インキュベートすることと、検出成分の検出によってPCR増幅産物の有無を検出することと、を含んでよく、検出成分の検出は、PCR増幅産物の存在を示す。
上記に概説したように、本開示は、単分散液滴を生成するためのシステムを提供し、当該システムは、第1のチャネル、第2のチャネル、第3のチャネル、および第4のチャネルを含む、マイクロ流体デバイスを含み、第1の流体は、第1、第2、第3、および第4のチャネルの接合部を通って、第1のチャネルから第2のチャネル中へ流動し、安定噴射条件下で第2の流体中へ流動し、第2の流体中へ第1の流体のジェットを提供し、第1の流体は、第2の流体と非混和性であり、第2の流体は、第3および第4のチャネルを介して接合部中へ導入され、複数の粒子は、第1の流体のジェット中へ導入され、それによって第1の流体のジェットの分解、および第2の流体中の第1の流体の複数の単分散液滴の複数の粒子のカプセル化を誘発する。いくつかの実施形態では、第1のチャネルは、複数の粒子の粒子の10%以内の断面積を有する。一部の実施形態では、第2のチャネルの断面積は、第1のチャネルの断面積よりも大きい。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスは、第1、第2、第3、および第4のチャネルの接合部の上流にある第1のチャネルとの接合部を形成する第5のチャネルおよび第6のチャネルをさらに含む。かかる実施形態では、第3の流体は、第1の流体を第2の流体中へ流動させる前に、第5および第6のチャネルから第1の流体中へ流動され得、第3の流体は、第1の流体と混和性である。例示的な実施形態を図1D、1E、2D、2E、4Aおよび4Bに示す。
本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの調製に使用され得る方法および材料が提供される。
1)光学的に透明なので、フローの可視化を可能にする。
2)適切な量の網状化剤と混合した場合のPDMSは、マイクロ流体接続を「水密性」に保つことを容易にするエラストマー特性を有する。
3)膜を使用したバルブとポンプは、その弾性のためにPDMSで作製することができる。
4)未処理のPDMSは疎水性であり、酸素プラズマによる表面の酸化後、または強塩基中に浸漬した後に一時的に親水性になり、酸化されたPDMSは、それらの表面自体が酸素プラズマに曝露される限り、それ自体がガラス、シリコン、またはポリエチレンに付着する。
5)PDMSはガスに透過性がある。気泡が材料から強制的に除去されるため、カナル内に気泡がある場合でも、チャネルに液体を充填することが容易である。ただし、非極性有機溶剤にも透過性がある。
上述の本主題の態様(実施形態を含む)は、単独で、または1つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。先の説明を限定することなく、番号1〜100の本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかであろうように、個々に番号付けされた態様の各々は、前述の態様のいずれかまたは個々に番号付けされた態様に続く態様のいずれかと使用または組み合わせられ得る。これは、態様の全てのかかる組み合わせのサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
1.単分散液滴を生成するための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供することであって、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和性である、流動させることと、
複数の粒子を前記第1の流体の前記ジェット中へ導入することで、前記第1の流体の前記ジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の単分散液滴の前記複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む、方法。
2.前記複数の粒子が、無秩序構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様1に記載の方法。
3.前記複数の粒子が、剛性粒子を含む、態様1または2に記載の方法。
4.前記複数の粒子が、秩序化構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様1または3に記載の方法。
5.前記複数の粒子が、充填構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様4に記載の方法。
6.複数の粒子が、弾性粒子を含む、態様1、2、4、および5のいずれか一項に記載の方法。
7.前記複数の粒子が、慣性秩序化を介して秩序化される、態様4〜6のいずれか一項に記載の方法。
8.複数の粒子が、ヒドロゲルを含む、態様1〜7のいずれか一項に記載の方法。
9.前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、態様8に記載の方法。
10.複数の単分散液滴の各液滴が、1つの粒子を含み、かつ1つ以下の粒子を含む、態様1〜9のいずれか一項に記載の方法。
11.前記第1の流体が、水相流体を含む、態様1〜10のいずれか一項に記載の方法。
12.前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、互いに100倍以内である、態様1〜11のいずれか一項に記載の方法。
13.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに50倍以内である、態様12に記載の方法。
14.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに10倍以内である、態様13に記載の方法。
15.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに5倍以内である、態様14に記載の方法。
16.前記第2の流体が、油を含む、態様1〜15のいずれか一項に記載の方法。
17.前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、態様16に記載の方法。
18.前記油が、フルオロカーボン油を含む、態様17に記載の方法。
19.前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、第3の流体を前記第1の流体中へ流動させることを含み、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、態様1〜18のいずれか一項に記載の方法。
20.前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、態様1〜19のいずれか一項に記載の方法。
21.前記単分散液滴を、前記重合可能な成分を重合するのに十分な条件に曝露することを含む、態様20に記載の方法。
22.前記第3の流体が、複数の細胞を含む、態様19〜21のいずれか一項に記載の方法。
23.前記第3の流体が、1つ以上の試薬を含む、態様19〜22のいずれか一項に記載の方法。
24.前記ジェットの分解の前に、1つ以上の液滴を前記ジェットと合流させることを含む、態様1〜23のいずれか一項に記載の方法。
25.前記1つ以上の液滴が、1つ以上の細胞を含む、態様24に記載の方法。
26.前記複数の粒子が、1Hz〜100kHzの速度でカプセル化される、態様1〜23のいずれか一項に記載の方法。
27.前記複数の粒子が、>15,000/秒の速度でカプセル化される、態様26に記載の方法。
28.前記複数の粒子が、>20,000/秒の速度でカプセル化される、態様27に記載の方法。
29.前記単分散液滴を選別することを含む、態様1〜28のいずれか一項に記載の方法。
30.前記選別することが、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実行される、態様29に記載の方法。
31.前記粒子が、細胞である、態様1〜30のいずれか一項に記載の方法。
32.前記粒子が、ビーズである、態様1〜30のいずれか一項に記載の方法。
33.前記複数の粒子が、無秩序構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入され、単分散粒子含有液滴の集団を含む多分散エマルションをもたらし、前記方法が、前記単分散粒子含有液滴を選別して、それらを前記多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、態様1〜3および6〜32のいずれか一項に記載の方法。
34.前記単分散粒子含有液滴が、サイズに基づいて分離される、態様33に記載の方法。
35.前記第1の流体が、ポリマーを含み、前記選別することが、前記単分散粒子含有液滴を濾過して、それらを前記多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、態様34に記載の方法。
36.前記第2の流体が、濾過の前に除去される、態様35に記載の方法。
37.単分散液滴を生成するためのシステムであって、
第1のチャネル、第2のチャネル、第3のチャネル、および第4のチャネルを含む、マイクロ流体デバイスを含み、
第1の流体が、前記第1、第2、第3、および第4のチャネルの接合部を通って、前記第1のチャネルから前記第2のチャネル中へ流動し、安定噴射条件下で第2の流体中へ流動し、前記第2の流体中へ前記第1の流体のジェットを提供し、
前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和性であり、
前記第2の流体が、前記第3および第4のチャネルを介して前記接合部中へ導入され、
複数の粒子が、前記第1の流体の前記ジェット中へ導入され、それによって、前記第1の流体の前記ジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の単分散液滴の前記複数の粒子のカプセル化を誘発する、システム。
38.前記複数の粒子が、無秩序構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様37に記載のシステム。
39.前記複数の粒子が、剛性粒子を含む、態様37または38に記載のシステム。
40.前記複数の粒子が、秩序化構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様37または39に記載のシステム。
41.前記複数の粒子が、充填構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、態様40に記載のシステム。
42.前記複数の粒子が、弾性粒子を含む、態様37、38、40、および41のいずれか一項に記載のシステム。
43.前記複数の粒子が、慣性秩序化を介して秩序化される、態様40〜42のいずれか一項に記載のシステム。
44.前記複数の粒子が、ヒドロゲルを含む、態様37のいずれか一項に記載のシステム。
45.前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、態様44に記載のシステム。
46.前記複数の単分散液滴の各液滴が、1つの粒子を含み、かつ1つ以下の粒子を含む、態様37〜45のいずれか一項に記載のシステム。
47.前記第1のチャネルが、前記複数の粒子の粒子の10%以内の断面積を有する、態様37〜46のいずれか一項に記載のシステム。
48.前記第2のチャネルの前記断面積が、前記第1のチャネルの断面積よりも大きい、態様37〜46のいずれか一項に記載のシステム。
49.前記第1の流体が、水相流体を含む、態様37〜48のいずれか一項に記載のシステム。
50.前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、互いに100倍以内である、態様34〜49のいずれか一項に記載のシステム。
51.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに50倍以内である、態様50に記載のシステム。
52.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が互いに10倍以内である、態様51に記載のシステム。
53.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が互いに5倍以内である、態様52に記載のシステム。
54.前記第2の流体が、油を含む、態様37〜49のいずれか一項に記載のシステム。
55.前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、態様54に記載のシステム。
56.前記油が、フルオロカーボン油を含む、態様55に記載のシステム。
57.前記マイクロ流体デバイスが、前記第1、第2、第3、および第4のチャネルの前記接合部の上流にある前記第1のチャネルとの接合部を形成する第5のチャネルおよび第6のチャネルを含む、態様37〜56のいずれか一項に記載のシステム。
58.第3の流体が、前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、前記第5および第6のチャネルから前記第1の流体中へ流動され、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、態様57に記載のシステム。
59.前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、態様34〜58のいずれか一項に記載のシステム。
60.前記重合性成分が、重合されている、態様59に記載のシステム。
61.前記第3の流体が、複数の細胞を含む、態様57に記載のシステム。
62.前記第3の流体が、1つ以上の試薬を含む、態様56または57に記載のシステム。
63.1つ以上の液滴が、前記ジェットの分解の前に前記ジェットと合流される、態様37〜62のいずれか一項に記載のシステム。
64.前記1つ以上の液滴が、1つ以上の細胞を含む、態様63に記載のシステム。
65.前記複数の粒子が、1Hz〜100kHzの速度でカプセル化される、態様37〜64のいずれか一項に記載のシステム。
66.前記複数の粒子が、>15,000/秒の速度でカプセル化される、態様65に記載のシステム。
67.前記複数の粒子が、>20,000/秒の速度でカプセル化される、態様66に記載のシステム。
68.前記単分散液滴が選別されている、態様37〜67のいずれか一項に記載のシステム。
69.前記選別することが、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実行される、態様68に記載のシステム。
70.前記粒子が、細胞である、態様34〜69のいずれか一項に記載のシステム。
71.前記粒子が、ビーズである、態様34〜69のいずれか一項に記載のシステム。
72.前記複数の粒子が、無秩序構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入され、単分散粒子含有液滴の集団を含む多分散エマルションをもたらし、前記方法が、前記単分散粒子含有液滴を選別して、それらを前記多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、態様34〜39および44〜71のいずれか一項に記載のシステム。
73.前記単分散粒子含有液滴が、サイズに基づいて分離される、態様72に記載のシステム。
74.試薬を粒子含有液滴と合流させるための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供することであって、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和性であり、1つ以上の試薬を含む、流動させることと、
複数の粒子含有液滴を前記第1の流体の前記ジェット中へ合流させることで、前記第1の流体の前記ジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の合流した単分散粒子含有液滴内の前記複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む、方法。
75.試薬を液滴と合流させるための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供することであって、前記第1の流体が、複数の粒子を含み、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和性であり、1つ以上の試薬を含む、流動させることと、
複数の液滴をジェット形成の上流または下流のいずれかで前記第1の流体中へ合流させることであって、前記複数の粒子が、前記第1の流体の前記ジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の単分散粒子含有液滴内の前記複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む、方法。
76.前記複数の粒子含有液滴が、剛性粒子を含む、態様74に記載の方法。
77.前記複数の粒子含有液滴が、弾性粒子を含む、態様74に記載の方法。
78.前記複数の粒子含有液滴が、ヒドロゲルを含む、態様74〜76のいずれか一項に記載の方法。
79.前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、態様77に記載の方法。
80.前記複数の合流した単分散粒子含有液滴の各液滴が、1つの粒子を含み、かつ1つ以下の粒子を含む、態様74〜78のいずれか一項に記載の方法。
81.前記第1の流体が、水相流体を含む、態様74および75〜80のいずれか一項に記載の方法。
82.前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、互いに100倍以内である、態様74および75〜81のいずれか一項に記載の方法。
83.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに50倍以内である、態様82に記載の方法。
84.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに10倍以内である、態様83に記載の方法。
85.前記第1の流体の前記粘度および前記第2の流体の前記粘度が、互いに5倍以内である、態様84に記載の方法。
86.前記第2の流体が、油を含む、態様74〜85のいずれか一項に記載の方法。
87.前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、態様86に記載の方法。
88.前記油が、フルオロカーボン油を含む、態様87に記載の方法。
89.前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、第3の流体を前記第1の流体中へ流動させることを含み、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、態様74〜87のいずれか一項に記載の方法。
90.前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、態様74〜89のいずれか一項に記載の方法。
91.前記合流した単分散粒子含有液滴を、前記重合可能な成分を重合するのに十分な条件に曝露することを含む、態様90に記載の方法。
92.前記第3の流体が、複数の細胞を含む、態様89〜91のいずれか一項に記載の方法。
93.前記第3の流体が、1つ以上の試薬を含む、態様89〜92のいずれか一項に記載の方法。
94.前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、1Hz〜100kHzの速度で形成される、態様74〜93のいずれか一項に記載の方法。
95.前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、>15,000/秒の速度で形成される、態様94に記載の方法。
96.前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、>20,000/秒の速度で形成される、態様94に記載の方法。
97.前記単分散液滴を選別することを含む、態様74〜96のいずれか一項に記載の方法。
98.前記選別することが、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実行される、態様97に記載の方法。
99.前記粒子が、細胞である、態様74〜98のいずれか一項に記載の方法。
100.前記粒子が、ビーズである、態様74〜98のいずれか一項に記載の方法。
以下の材料および方法は、別段明記しない限り、概して、本明細書に記載の実施例に提示される結果に適用される。
SU−8 2025フォトレジスト(MicroChem,Westborough,MA,USA)を用いて、標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、3インチシリコンウェハ上でマスター構造を作製した。硬化剤およびPDMSプレポリマー(Momentive,Waterford,NY,USA;RTV 615)を1:10で混合し、真空チャンバ中で脱気し、ペトリ皿中でマスター金型上に注ぎ、気泡が存在しないまでさらに脱気し、65℃で4時間脱気した。PDMSレプリカをマスターから除去し、0.75mmの生検パンチ(Ted Pella,Inc.,Redding,CA,USA;Harris Uni−Core 0.75)でパンチし、プラズマボンダー(Technics Plasma etcher)を使用してガラススライド(75×50×1.0mm、12−550C、Fisher Scientific)に結合させ、150℃で10分間配置して結合を強化した。デバイスを5分間の接触時間でアクアペルで処理し、空気でパージし、それらを疎水性にした。デバイスを少なくとも30分間ベークして、残りのアクアペルを蒸発させた。
ヒドロキシル化メタクリルポリマー(Toyopearl HW−65S,Tosoh Bioscience)から作製された剛性20〜40μmのビーズを使用して、制限希釈での単分散ビーズ含有液滴の形成を実証した。ビーズを68% OptiPrep密度勾配培地(Sigma−Aldrich)に懸濁し、2%アガロース(超低ゲル化温度アガロース、IX−A型、Sigma−Aldrich)と1×PBS中で共流動させた。Macosko et al.に以前に記載されているものと同一のデバイスを、100μmの高さで製造した。流速は、ビーズ含有溶液で2000μl/時間、アガロースで2000μl/時間、および2%イオン性クリトックスで40,000μl/時間であり、DeJournette et al.に以前に記載されたように調製された。
カスタムマイクロ流体サイトメータは、Mazutis et al.に依然に記載されるように設計された。このシステムは、3つのレーザ(473nm、532nm、638nm)を備えた。EVA green(1個)で染色されたToyopearl HW−65Sビーズを473nmレーザで検出した(図3A〜3D)。Cy5とコンジュゲートされたBSAを使用して、638nmレーザで液滴サイズを測定した(図3A〜3D)。カルセインレッドオレンジを使用して、532nmレーザで細胞を検出した(図6A〜6D)。FAMを含有するアクリル化プライマーを液滴ポリアクリルアミド形成中に重合させ、473nmレーザで検出した(図6A〜6D)。液滴蛍光を、ピーク強度を液滴サイズで割った積分として計算した。液滴長を、液滴がレーザ励起ウィンドウに費やす時間(ミリ秒)として測定した。結果をエクスポートし、FlowJoで分析した。
ビーズ充填実験のための弾性ヒドロゲルを、Yan et al.のように気泡誘発デバイスを使用してマイクロ流体的に作製した。8%のアクリルアミドと架橋剤(40%のアクリルアミド/ビス溶液、19:1、Biorad)、200mMのトリス(pH8.3)、および0.3%の過硫酸アンモニウムを水に含有する溶液を分散相として使用した。連続相は、1%N,N,N’,N’−テトラメチレンジアミン(ThermoFisher)を有する2%イオン性クリトックスから構成された。固化を室温で1時間行った。
使用の前に、固化したポリアクリルアミドビーズを、70μmの細胞ストレーナー(Corning Falcon細胞ストレーナー)を使用して濾過して、大きなビーズを除去し、デバイスの目詰まりを防止した。カスタム3D印刷シリンジアダプタを使用して、ビーズを4700rpmで10分間遠心分離(Sorvall ST40R)することによってシリンジ内に充填した。上清を除去し、ビーズをマイクロ流体デバイス上に注入した。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、高速圧縮ビーズが、滴下条件下よりも高いレベルのビーズ擾乱および破裂をもたらすとの提案がなされている。これは、PE/2チューブ(Scientific Commodities)の代わりにPE/5チューブを使用して改善された。滴下方式において、流量は、0.1%Tweenを有する1xPBSでは200μl/時間、充填されたポリアクリルアミドビーズでは200μl/時間、および油では600μl/時間であった。噴射方式において、流量は、0.1%Tweenを有する1xPBSでは4000μl/時間、充填されたポリアクリルアミドビーズでは4000μl/時間、および油では6000μl/時間であった。共流動せずに充填ビーズカプセル化するために、様々なビーズおよび油の流量を使用した。キャピラリ数は、55μm×55μmの正方形チャネル断面を想定して、連続相流量、連続相の粘度(HFE−7500、1.24×10−3kg m−1s−1)および界面張力(4mN m−1)を用いて計算した。
1×PBS中のカルセイン(25μMのカルセインレッドオレンジ、AM、C34851、ThermoFisher)を用いて細胞を染色し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し(HBS、カルシウムなし、マグネシウムなし、14170112、ThermoFisher)、HBS中の18%OptiPrep密度勾配培地(Sigma−Aldrich)に再懸濁した。ポリアクリルアミドビーズを、FAM標識3’末端を含有する10μMの酸化オリゴヌクレオチド(IDT)と重合させた。流量は、45μmのビーズでは4000μl/時間、溶解バッファーでは4000μl/時間(0.1%LiDS、1mM EDTA、20mM TRIS 8.3、500mM LiCl)、および油では8000μl/時間(EvaGreen#1864005のBiorad Droplet Generation Oil)であった。単分散ビーズ誘発液滴を生成する条件を素早く見つけるために、ビーズの不在下でジェットを形成した。後で再注入および検出するために、液滴を10mLシリンジに回収した。液滴生成速度を計算するために、流動液滴について蛍光強度のタイムトレースデータを収集し、高速フーリエ変換(fft)関数を使用してMatlabで分析した。パワースペクトルは、fftの絶対値を試料数で割った2乗として計算した。
結果
疎水性マイクロ流体チャネル内で水および油を共流動し、キャピラリ数(Ca)に依存する様式で油中液滴を生成した。かかる装置により、異なる方式で液滴を形成した。擾乱がない場合、ジェットは安定したままであり、メインチャネルに液滴は形成されなかった(図2B)。ビーズの導入により、内部擾乱が生じ、これは、ジェット分解および液滴形成を誘発した(図2C〜2E)。低いCaでは、準静的閉塞および圧搾機構を通じて液滴が形成され、中程度のCaでは、液滴相に対する連続相の剪断が重要となった(図2A)。特に、図2Aは、ビーズを含まない滴下方式における液滴形成を示す。より高いCaでは、分散相は、分解することなく安定ジェットとして流動した。具体的には、図2Bは、ビーズを含まない高いキャピラリ数での安定ジェット形成を示す。細胞、粒子、またはビーズをジェット中へ導入した場合、それらはレイリープラトー不安定性を播種し、それを液滴に分解することができる(図2C)。しかしながら、これらの別個のエンティティは液滴相中にランダムに分散したため、分解は不規則であり、多分散エマルションが得られた。特に、図2Cは、分散相の分解を誘発するために限界希釈時に非充填剛性ビーズを使用した液滴形成を示す。単分散エマルションを生成するために、均一に周期的な擾乱をジェットに適用しており、これは、気泡を導入することによって達成され得る。この概念は、気泡のように規則的な周期で流動する充填弾性ビーズに拡張され、これにより、ジェットを単一のビーズを含有する単分散液滴に分解した(図2D)。具体的には、図2Dは、追加の共流動なしで分解を誘発するために充填ビーズを使用する液滴形成を示す。追加の水溶液は、誘発方式における液滴体積を独立して調整するために側方チャネルを介して導入され得る(図2E)。特に、図2Eは、共流動分散相の分解を誘発するために充填ビーズを使用した液滴形成を示す。
結果
目詰まりにより充填できなかった硬質ビーズについては、試料を希釈し、10滴中1滴未満のビーズの含有が得られた。希釈細胞と対合すると、100滴中1滴未満がビーズ細胞対合を含有した。全ての空の液滴を生成する必要があるため、これは、プロセスを無駄にし、全体的なスループットを制限する。ビーズ誘発装置は、噴射条件下で駆動し、スループットを10倍増加させた。これを実証するために、2%アガロースおよび硬質ビーズを含有する1xPBS(Toyopearl HW−65S)を共流動すことによって安定ジェットを形成した。このジェットは、擾乱されていないが、チャネル内で分解しなかった(図3A)。剛性ビーズは、ジェット内の流れを分解し、油−水界面を擾乱させ、ジェットを分解するレイリープラトー不安定性を播種する(図3A)。特に、図3Aは、安定ジェット形成およびビーズ誘導ジェット分解を示すデバイス動作の映像からのフレームを示す。同様の状態のジェットについては、分解プロセスは再現可能であり、粒子よりも実質的に大きい液滴を生じ、これは、均一であった。得られたエマルションは、大規模な多分散空滴、および第2の集団の小単分散ビーズ含有液滴から構成された。
結果
ビーズ含有液滴の単分散エマルションを生成するために、Abate et al.に記載されるように弾性ビーズを充填した。これにより、ビーズを一定間隔で注入することができ、ビーズ間の不均一な間隔を防止し、これにより空の滴がもたらされる。滴下方式における充填ビーズ充填中に、ビーズの存在とは無関係に液滴生成が生じた(図4B)。単一のビーズ1滴当たりの充填は、ビーズ注入を液滴形成と同期させるために流量を調整することによって達成された(図4B)。結果として、弾性微粒子の充填は、ビーズベースのワークフローのスループットを制約する滴下方式で動作する能力によって制限された。ビーズ充填とジェット誘発を組み合わせることで、定期的なビーズ注入を利用して、定期的なジェット分解と単分散液滴形成を誘発した。
結果
滴下方式で動作する場合、数百万個のビーズ含有液滴の産生は遅いものとなる。ビーズ誘発液滴形成の有用性は、エマルション品質の低減を最小限に抑えながらスループットの増加を可能にすることである。かかる理論は、45μmのポリアクリルアミドビーズを単分散液滴に高速でカプセル化することによって実証された。液滴作製装置を、それぞれ4000μl/時間の2つの水性ストリーム、および約23kHzの予測カプセル化周波数に対応する8000μl/時間の油で起動した(図6A)。特に、図6Aは、デバイス動作と、出口内の結果として生じる液滴とを示す。液滴作製周波数を測定するために、流動液滴の蛍光時間トレースデータを記録し(図6B、挿入図)、パワースペクトルの強度を計算した(図6B)。このスペクトルのピークは、流量に基づく液滴作製周波数の推定値と一致し、滴下方式での実行と比較してスループットが1桁増加することを示している。ビーズ誘発により、20kHzを超える単分散液滴が生成され、ビーズ含有液滴の迅速な生成が可能となる。
結果
多くの場合、ビーズをヒドロゲルでコーティングすることが重要であり、これにより、後続のビーズ充填、ゲノムの捕捉などが可能となる。アガロースでコーティングされた粒子を、大きなアガロース液滴の集団内で生成した(図7)。ビーズ誘発を使用して、ビーズを均一なシェルで容易にコーティングした。剛性ビーズをヒドロゲルでコーティングし、サイズ別に分離した。非ビーズ含有液滴は大きく(または小さくすることができる)、これをサイズに基づいて濾過した(図7)。
1.E.Z.Macosko,A.Basu,R.Satija,J.Nemesh,K.Shekhar,M.Goldman,I.Tirosh,A.R.Bialas,N.Kamitaki,E.M.Marter−steck,J.J.Trombetta,D.A.Weitz,J.R.Sanes,A.K.Shalek,A.Regev and S.A.McCarroll,Cell,2015,161,1202−1214.
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Claims (100)
- 単分散液滴を生成するための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供すること(ただし、前記第1の流体は前記第2の流体と非混和性である)、及び、
複数の粒子を前記第1の流体のジェット中へ導入して、前記第1の流体のジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の単分散液滴における前記複数の粒子のカプセル化を誘発すること、を含む方法。 - 前記複数の粒子が、無秩序構成で前記第1の流体のジェットの中に導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、剛性粒子を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、秩序化構成で前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、請求項1または3に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、充填構成で前記第1の流体の前記ジェット中へ導入される、請求項4に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、弾性粒子を含む、請求項1、2、4、および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、慣性秩序化を介して秩序化される、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、ヒドロゲルを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記複数の単分散液滴の各液滴が、1以下の粒子を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体が、水相流体を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に100倍以内である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に50倍以内である、請求項12に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に10倍以内である、請求項13に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に5倍以内である、請求項14に記載の方法。
- 前記第2の流体が油を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記油が、フルオロカーボン油を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、第3の流体を前記第1の流体中へ流動させることを含み、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単分散液滴を、前記重合可能な成分を重合するのに十分な条件に曝露することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記第3の流体が、複数の細胞を含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3の流体が、1以上の試薬を含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジェットの分解の前に、1以上の液滴をジェットと合流させることを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1以上の液滴が、1以上の細胞を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、1Hz〜100kHzの速度でカプセル化される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、>15,000/秒の速度でカプセル化される、請求項26に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、>20,000/秒の速度でカプセル化される、請求項27に記載の方法。
- 前記単分散液滴を選別することを含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選別することが、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実施される、請求項29に記載の方法。
- 前記粒子が、細胞である、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、ビーズである、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の粒子が、無秩序構成で前記第1の流体のジェット中へ導入され、単分散粒子含有液滴の集団を含む多分散エマルションをもたらし、前記方法が、前記単分散粒子含有液滴を選別して、それらを多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、請求項1から3および6から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単分散粒子含有液滴が、サイズに基づいて分離される、請求項33に記載の方法。
- 第1の流体がポリマーを含み、選別することが、前記単分散粒子含有液滴を濾過して、それらを前記多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、請求項34に記載の方法。
- 第2の流体が、濾過の前に除去される、請求項35に記載の方法。
- 単分散液滴を生成するためのシステムであって、
第1のチャネル、第2のチャネル、第3のチャネル、および第4のチャネルを含むマイクロ流体デバイスを備え、
第1の流体が、前記第1、第2、第3、および第4のチャネルの接合部を通って、第1のチャネルから第2のチャネル中へ流動し、安定噴射条件下で第2の流体中へ流動し、第2の流体中へ第1の流体のジェットを提供し、
第1の流体が第2の流体と非混和性であり、
第2の流体が、第3および第4のチャネルを介して前記接合部中へ導入され、
複数の粒子が、第1の流体のジェット中へ導入され、それによって、第1の流体のジェットの分解、および第2の流体中の第1の流体の複数の単分散液滴の前記複数の粒子のカプセル化を誘発する、システム。 - 前記複数の粒子が、無秩序構成で第1の流体のジェット中へ導入される、請求項37に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、剛性粒子を含む、請求項37または38に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、秩序化構成で第1の流体のジェット中へ導入される、請求項37または39に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、充填構成で第1の流体のジェット中へ導入される、請求項40に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、弾性粒子を含む、請求項37、38、40、および41のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、慣性秩序化を介して秩序化される、請求項40から42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、ヒドロゲルを含む、請求項37に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項44に記載のシステム。
- 前記複数の単分散液滴の各液滴が、1以下の粒子を含む、請求項37から45のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1のチャネルが、前記複数の粒子の粒子の10%以内の断面積を有する、請求項37から46のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のチャネルの前記断面積が、前記第1のチャネルの断面積よりも大きい、請求項37から46のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の流体が、水相流体を含む、請求項37から48のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に100倍以内である、請求項34から49のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に50倍以内である、請求項50に記載のシステム。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に10倍以内である、請求項51に記載のシステム。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が相互に5倍以内である、請求項52に記載のシステム。
- 前記第2の流体が、油を含む、請求項37から49のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、請求項54に記載のシステム。
- 前記油が、フルオロカーボン油を含む、請求項55に記載のシステム。
- 前記マイクロ流体デバイスが、前記第1、第2、第3、および第4のチャネルの前記接合部の上流にある前記第1のチャネルとの接合部を形成する第5のチャネルおよび第6のチャネルを含む、請求項37から56のいずれか一項に記載のシステム。
- 第3の流体が、前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、前記第5および第6のチャネルから前記第1の流体中へ流動され、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、請求項57に記載のシステム。
- 前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、請求項34から58のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記重合可能な成分が重合される、請求項59に記載のシステム。
- 前記第3の流体が、複数の細胞を含む、請求項57に記載のシステム。
- 前記第3の流体が、1以上の試薬を含む、請求項56または57に記載のシステム。
- 1以上の液滴が、前記ジェットの分解の前にジェットと合流される、請求項37から62のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1以上の液滴が、1以上の細胞を含む、請求項63に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、1Hz〜100kHzの速度でカプセル化される、請求項37から64のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、>15,000/秒の速度でカプセル化される、請求項65に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、>20,000/秒の速度でカプセル化される、請求項66に記載のシステム。
- 前記単分散液滴が選別される、請求項37から67のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記選別が、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実施される、請求項68に記載のシステム。
- 前記粒子が、細胞である、請求項34から69のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記粒子が、ビーズである、請求項34から69のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記複数の粒子が、無秩序構成において前記第1の流体の前記ジェット中へ導入され、単分散粒子含有液滴の集団を含む多分散エマルションをもたらし、前記方法が、前記単分散粒子含有液滴を選別して、それらを前記多分散エマルション中の他の液滴から分離することを含む、請求項34から39および44から71のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記単分散粒子含有液滴が、サイズに基づいて分離される、請求項72に記載のシステム。
- 試薬を粒子含有液滴と合流させるための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供することであって、前記第1の流体が、前記第2の流体と非混和性であり、1以上の試薬を含む、流動させること、
複数の粒子含有液滴を前記第1の流体の前記ジェット中へ合流させることで、前記第1の流体の前記ジェットの分解、および前記第2の流体中の前記第1の流体の複数の合流した単分散粒子含有液滴内の前記複数の粒子のカプセル化を誘発することと、を含む、方法。 - 試薬を液滴に合流させるための方法であって、
マイクロ流体デバイスのチャネル内で、第1の流体を安定噴射条件下で第2の流体中へ流動させて、前記第2の流体中に前記第1の流体のジェットを提供すること、ただし、前記第1の流体が複数の粒子を含み、前記第1の流体が前記第2の流体と非混和性であり、1以上の試薬を含む、及び
複数の液滴をジェット形成の上流または下流のいずれかで前記第1の流体中へ合流させること、ただし、前記複数の粒子が前記第1の流体のジェットの分解、および前記第2の流体中の第1の流体の複数の単分散粒子含有液滴内の複数の粒子のカプセル化を誘発する、を含む方法。 - 前記複数の粒子含有液滴が、剛性粒子を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記複数の粒子含有液滴が、弾性粒子を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記複数の粒子含有液滴が、ヒドロゲルを含む、請求項74から76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項77に記載の方法。
- 前記複数の合流した単分散粒子含有液滴の各液滴が、1以下の粒子を含む、請求項74から78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体が、水相流体を含む、請求項74および75から80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に100倍以内である、請求項74および75から81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に50倍以内である、請求項82に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に10倍以内である、請求項83に記載の方法。
- 前記第1の流体の粘度および前記第2の流体の粘度が、相互に5倍以内である、請求項84に記載の方法。
- 前記第2の流体が、油を含む、請求項74から85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記油が、フルオロカーボン油、炭化水素油、またはこれらの組み合わせを含む、請求項86に記載の方法。
- 前記油が、フルオロカーボン油を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記第1の流体を前記第2の流体中へ流動させる前に、第3の流体を第1の流体中へ流動させることを含み、前記第3の流体が、前記第1の流体と混和性である、請求項74から87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の流体または前記第3の流体が、重合可能な成分を含む、請求項74から89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合流した単分散粒子含有液滴を、前記重合可能な成分を重合するのに十分な条件に曝露することを含む、請求項90に記載の方法。
- 前記第3の流体が、複数の細胞を含む、請求項89から91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3の流体が、1つ以上の試薬を含む、請求項89から92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、1Hz〜100kHzの速度で形成される、請求項74から93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、>15,000/秒の速度で形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記複数の合流した単分散粒子含有液滴が、>20,000/秒の速度で形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記単分散液滴を選別することを含む、請求項74から96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選別することが、サイズベースの選別、誘電偏移、選択的凝集、蛍光活性化細胞選別(FACS)、電気泳動、音響分離、磁気活性化細胞選別(MACS)、流量制御、または単分散液滴を選択的に偏移するために使用される他の刺激によって実行される、請求項97に記載の方法。
- 前記粒子が、細胞である、請求項74から98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、ビーズである、請求項74から98のいずれか一項に記載の方法。
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