CN117363701A - 全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字pcr油相表面活性剂中的应用 - Google Patents

全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字pcr油相表面活性剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用，涉及生物技术领域。经发明人研究发现，二氧化硅纳米颗粒经过全氟烃基硅烷化试剂硅烷化后，在纳米颗粒表面形成一定程度的硅烷化修饰，使得纳米颗粒表面带有部分的全氟烃基因而具有油水两亲的特性。在使用含全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的氢氟醚生成油包水微液滴的过程中，二氧化硅纳米颗粒能迅速自主装到液滴的油水界面，形成保护层。该颗粒保护层相比高分子两亲性表面活性剂来说更难以从界面发生逃逸，并且此类表面活性剂不会在连续相中形成胶束，因此液滴的稳定性更好；得益于液滴良好的稳定性，该表面活性剂通用性更高，可适用于更多种类的核酸扩增Mix。

Description

全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性 剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用。
背景技术
数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始DNA模板的绝对定量。
微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)将样品进行微滴化处理，形成几万个纳升级液滴，每个液滴或不含待检核酸靶分子，或含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对微滴进行检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。目前比较常用的油相为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。然而上述油相和表面活性剂与PCR试剂适配的通用性不够高，还有待提升。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种微滴数字PCR油相组合物。
本发明的第三目的在于提供上述微滴数字PCR油相组合物在微滴数字PCR中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种微滴数字PCR方法。
本发明的第五目的在于提供一种微滴数字PCR试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用；
所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒为表面硅烷化修饰有全氟烃基硅烷的二氧化硅纳米颗粒。
作为进一步技术方案，所述全氟烃基硅烷包括：1H，1H，2H，2H-全氟烃基三取代基硅烷，其中烃基的碳链长度为C8-C12，取代基包括乙氧基、甲氧基或氯原子中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述二氧化硅纳米颗粒的粒径为20-200nm。
作为进一步技术方案，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将全氟烃基硅烷与二氧化硅纳米颗粒进行硅烷化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒。
作为进一步技术方案，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将二氧化硅纳米颗粒和全氟烃基硅烷于有机溶剂中溶解混合，经催化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒；
优选地，混合后，有机溶剂中二氧化硅纳米颗粒的浓度为20mg/mL-30mg/mL；
优选地，混合后，有机溶剂中全氟烃基硅烷的浓度为5μL/mL-160μL/mL。
作为进一步技术方案，所述溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇中的至少一种；
所述催化反应的催化剂包括氨分子和水分子；
所述催化反应的时间为6-12h。
第二方面，本发明提供了一种微滴数字PCR油相组合物，主要由所述的全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒和氢氟醚组成；
所述微滴数字PCR油相组合物中全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的含量为15-50mg/mL。
第三方面，本发明提供了一种微滴数字PCR油相组合物在微滴数字PCR中的应用。
第四方面，本发明提供了一种微滴数字PCR方法，以所述的微滴数字PCR油相组合物作为油相。
第五方面，本发明提供了一种微滴数字PCR试剂盒，包括所述的微滴数字PCR油相组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
经发明人研究发现，二氧化硅纳米颗粒经过全氟烃基硅烷化试剂硅烷化后，在纳米颗粒表面形成一定程度的硅烷化修饰，使得纳米颗粒表面带有部分的全氟烃基因而具有油水两亲的特性。在使用含全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的氢氟醚(HFE)生成油包水微液滴的过程中，二氧化硅纳米颗粒能迅速自主装到液滴的油水界面，形成保护层。该颗粒保护层相比高分子两亲性表面活性剂来说更难以从界面发生逃逸，并且此类表面活性剂不会在连续相中形成胶束，因此液滴的稳定性更好，而得益于液滴良好的稳定性，该表面活性剂通用性更高，可适用于更多种类的核酸扩增Mix。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1提供的油相组合物的液滴生成情况；
图2为实施例1提供的油相组合物的微液滴数字PCR扩增情况；
图3为液滴乳化及破乳测试对比；
图4为实施例2提供的油相组合物的液滴生成情况；
图5为实施例2提供的油相组合物的微液滴数字PCR扩增情况；
图6为实施例3提供的油相组合物的液滴生成情况；
图7为实施例3提供的油相组合物的微液滴数字PCR扩增情况。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用；
所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒为表面硅烷化修饰有全氟烃基硅烷的二氧化硅纳米颗粒。
经发明人研究发现，采用含全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的HFE形成的液滴稳定性更好，并且改性二氧化硅纳米颗粒通用性更高，可适用于更多种类的核酸扩增Mix。
在一些优选的实施方式中，所述全氟烃基硅烷包括：1H，1H，2H，2H-全氟烃基三取代基硅烷，其中烃基的碳链长度为C8-C12，取代基包括乙氧基、甲氧基或氯原子中的至少一种，全氟烃基硅烷例如可以为1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟壬基三甲氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三氯硅烷等。
在一些优选的实施方式中，所述二氧化硅纳米颗粒的粒径例如可以为，但不限于20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm或200nm。
以上述粒径范围的二氧化硅纳米颗粒制备得到的全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的效果更好。
在一些优选的实施方式中，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将全氟烃基硅烷与二氧化硅纳米颗粒进行硅烷化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒。
需要说明的是，本发明中对于硅烷化反应的方法不作具体限制，能够将全氟烃基硅烷烷基化修饰到二氧化硅纳米颗粒的表面即可。
在一些优选的实施方式中，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将二氧化硅纳米颗粒和全氟烃基硅烷于有机溶剂中溶解混合，经催化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒；
优选地，混合后，有机溶剂中二氧化硅纳米颗粒的浓度例如可以为，但不限于20mg/mL、22mg/mL、24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL或30mg/mL；
优选地，混合后，有机溶剂中全氟烃基硅烷的浓度例如可以为，但不限于5μL/mL、10μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、80μL/mL、120μL/mL或160μL/mL。
在一些优选的实施方式中，所述溶剂包括但不限于甲醇、乙醇或丙醇中的至少一种，甲醇、乙醇和丙醇是良好的溶剂，能够与水互溶，能够溶解全氟烃基硅烷，有利于反应的进行。
所述催化反应的催化剂包括氨分子和水分子，在氨分子和水分子的催化下实现二氧化硅纳米颗粒和全氟烃基硅烷的烷基化反应。
所述催化反应的时间例如可以为，但不限于6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h。
通过对溶剂、催化剂和反应时间的进一步优化和调整，更好的实现全氟烃基硅烷对二氧化硅纳米颗粒的烷基化修饰。
第二方面，本发明提供了一种微滴数字PCR油相组合物，主要由所述的全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒和氢氟醚组成；
所述微滴数字PCR油相组合物中全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的含量例如可以为，但不限于15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL或50mg/mL。
经发明人研究发现，本发明提供的含特定配比的全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒和氢氟醚的油相组合物用于微滴数字PCR形成的液滴稳定性好，有助于提高扩增效果。
第三方面，本发明提供了一种微滴数字PCR油相组合物在微滴数字PCR中的应用。
本发明提供的油相组合物形成的液滴稳定性好，能够用于微滴数字PCR。
第四方面，本发明提供了一种微滴数字PCR方法，以所述的微滴数字PCR油相组合物作为油相。
本发明提供的油相组合物形成的液滴更稳定，因此，本发明提供的微滴数字PCR方法的扩增效果更好。
第五方面，本发明提供了一种微滴数字PCR试剂盒，包括所述的微滴数字PCR油相组合物。
本发明提供的油相组合物形成的液滴更稳定，因此，包括该油相组合物的微滴数字PCR试剂盒具有更好的扩增效果。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
二氧化硅纳米颗粒的硅烷化修饰及油相组合物的制备：
取粒径为100nm的25mg/mL的二氧化硅纳米颗粒水溶液1mL，经离心沉降后弃上清。按乙醇：25％氨水：水＝50：2：1的比例配置含氨水的乙醇溶液，加入1mL至二氧化硅纳米颗粒后超声重悬。其中，氨分子和水分子为反应的催化剂。加入10μL的1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷，室温下剧烈震荡过夜。离心弃上清，加入3M公司HFE7500氢氟醚，超声重悬后离心弃上清，进行清洗并再重复2次。最后加入HFE7500重悬并配置成特定浓度(25mg/mL)的悬液备用，制备得到油相：含全氟二氧化硅纳米颗粒的HFE7500。
实施例2
二氧化硅纳米颗粒的硅烷化修饰及油相组合物的制备：
取粒径为20nm的20mg/mL的二氧化硅纳米颗粒水溶液1mL，经离心沉降后弃上清。按乙醇：25％氨水：水＝50：2：1的比例配置含氨水的乙醇溶液，加入1mL至二氧化硅纳米颗粒后超声重悬。其中，氨分子和水分子为反应的催化剂。加入5μL的1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷，室温下剧烈震荡过夜。离心弃上清，加入3M公司HFE7500氢氟醚，超声重悬后离心弃上清，进行清洗并再重复2次。最后加入HFE7500重悬并配置成特定浓度(15mg/mL)的悬液备用，制备得到油相：含全氟二氧化硅纳米颗粒的HFE7500。
实施例3
二氧化硅纳米颗粒的硅烷化修饰及油相组合物的制备：
取粒径为200nm的30mg/mL的二氧化硅纳米颗粒水溶液1mL，经离心沉降后弃上清。按乙醇：25％氨水：水＝50：2：1的比例配置含氨水的乙醇溶液，加入1mL至二氧化硅纳米颗粒后超声重悬。其中，氨分子和水分子为反应的催化剂。加入160μL的1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三甲氧基硅烷，室温下剧烈震荡过夜。离心弃上清，加入3M公司HFE7500氢氟醚，超声重悬后离心弃上清，进行清洗并再重复2次。最后加入HFE7500重悬并配置成特定浓度(50mg/mL)的悬液备用，制备得到油相：含全氟二氧化硅纳米颗粒的HFE7500。
对比例1
油相组合物：4％dSURF(Fluigent)的HFE7500。
试验例1液滴乳化及破乳测试对比
将实施例1和对比例1的油相组合物各取20μL，再分别加入20μL以下两种PCR缓冲体系进行测试：(1)NEB热启动2X预混液配置的PCR体系；(2)自研数字PCR mix(主要成分包括盐离子缓冲盐体系、dNTP、聚乙二醇、甜菜碱等)。然后在涡旋振荡器上混匀1min，形成油包水液滴。将上述各管置于PCR仪上进行PCR循环：95℃2min，循环段95℃5s，60℃20s，循环45次，升降温速率为1.5℃/s。观察液滴破乳情况，结果如图3所示。图3中的编号1-4分别为全氟二氧化硅HFE7500+NEB mix、全氟二氧化硅HFE7500+自研数字PCR mix、4％dSURF HFE7500+NEB mix、4％dSURF HFE7500+自研数字PCR mix，图3中的编号5-8依次为编号1-4的反应体系经过PCR温度循环后的结果。其中，编号7、8为经过PCR循环后的常规油相结果，破乳明显，而采用以全氟二氧化硅纳米颗粒作为表面活性剂的HFE7500液滴稳定性较好，通用性更强。
试验例2微液滴的生成与数字PCR
微液滴数字PCR的扩增体系包括目标质粒DNA 1.1×105copies/mL、靶序列上下游引物一对及一条Taqman荧光探针，配制自研数字PCR mix(主要成分包括缓冲盐体系、dNTP、聚乙二醇、甜菜碱等)，分别以实施例1、实施例2和实施例3提供的油相组合物作为PCR反应的油相，通过微流控芯片生成微液滴，其中实施例1和实施例2的微液滴的生成情况如图1和图4所示，从图中可以看出，形成的微液滴均一稳定，液滴直径在100μm左右，实施例3形成的微滴与实施例1-2的结果相似没有显著差异(如图6所示)。将微液滴生成芯片置于平板PCR仪进行PCR过程。PCR流程为：95℃2min，循环段95℃5s，60℃20s，循环45次，升降温速率为1.5℃/s。经过PCR流程后，微液滴仍能保持液滴稳定且PCR扩增效率不受抑制，如图2和图5所示(图2和图5中，白色亮液滴为阳性液滴，其余为阴性液滴)，实施例3的PCR结果与实施例1-2的结果相似没有显著差异(如图7所示)。
扩增序列：
5’-CGAAGGACATCCCTGACAACATTATTGCCGATGTTGATGCTGTTCCTCGTTCTCTGGCCATGCTGATTGATGGCTTATCCAATAGAGAGAGCAGCCTT-3’(SEQ ID NO.1)。
引物序列：
5’-CGAAGGACATCCCTGACAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
5’-AAGGCTGCTCTCTCTATTGGAT-3’(SEQ ID NO.3)。
探针序列：
5’-FAM-TGCCGATGTTGATGCTGTTCCTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.4)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州博日科技股份有限公司
<120> 全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgaaggacat ccctgacaac attattgccg atgttgatgc tgttcctcgt tctctggcca 60
tgctgattga tggcttatcc aatagagaga gcagcctt 98
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgaaggacat ccctgacaac 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaggctgctc tctctattgg at 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgccgatgtt gatgctgttc ctc 23

Claims (10)

1.全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒在微滴数字PCR油相表面活性剂中的应用；
所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒为表面硅烷化修饰有全氟烃基硅烷的二氧化硅纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述全氟烃基硅烷包括：1H，1H，2H，2H-全氟烃基三取代基硅烷，其中烃基的碳链长度为C8-C12，取代基包括乙氧基、甲氧基或氯原子中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二氧化硅纳米颗粒的粒径为20-200nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将全氟烃基硅烷与二氧化硅纳米颗粒进行硅烷化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的制备方法包括：将二氧化硅纳米颗粒和全氟烃基硅烷于有机溶剂中溶解混合，经催化反应，制备得到全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒；
优选地，混合后，有机溶剂中二氧化硅纳米颗粒的浓度为20mg/mL-30mg/mL；
优选地，混合后，有机溶剂中全氟烃基硅烷的浓度为5μL/mL-160μL/mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶剂包括甲醇、乙醇或丙醇中的至少一种；
所述催化反应的催化剂包括氨分子和水分子；
所述催化反应的时间为6-12h。
7.一种微滴数字PCR油相组合物，其特征在于，主要由权利要求1-6任一项中所述的全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒和氢氟醚组成；
所述微滴数字PCR油相组合物中全氟硅烷化二氧化硅纳米颗粒的含量为15-50mg/mL。
8.权利要求7所述的微滴数字PCR油相组合物在微滴数字PCR中的应用。
9.一种微滴数字PCR方法，其特征在于，以权利要求7所述的微滴数字PCR油相组合物作为油相。
10.一种微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的微滴数字PCR油相组合物。
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