KR102531451B1

KR102531451B1 - 엑소좀 유래 miRNA를 이용한 아토피성 피부염 상관 스트레스 진단기술

Info

Publication number: KR102531451B1
Application number: KR1020230027022A
Authority: KR
Inventors: 우정민; 성민경; 서민수; 강경구; 성수은; 최주희; 이시준; 김길수
Original assignee: 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-05-11
Also published as: WO2022102885A1; KR102623368B1; KR20230036088A; KR102507356B1; KR20220065555A; KR20230035551A

Abstract

본 발명은 아토피성 피부염으로 스트레스를 유발한 마우스의 엑소좀에서 유래한 miRNA를 분석한 다음, 스트레스 처리 전후에 발현양상이 달라지는 다수의 miRNA를 확인하여 이를 바이오마커로 활용 가능하다는 점을 도출하였는바, 피부염증과 스트레스의 연관성 및 스트레스 진단 사업 등 관련된 다양한 분야에 이용될 수 있다.

Description

엑소좀 유래 miRNA를 이용한 아토피성 피부염 상관 스트레스 진단기술{Atopic dermatitis-associated stress diagnosis technology using exosome-derived miRNA}

본 발명은 아토피성 피부염에 의해 스트레스 유도된 경우, 엑소좀 유래 miRNA의 발현 양상이 변화한다는 점을 이용한 스트레스 진단용 조성물 등에 관한 것이다.

일반적으로 스트레스(Stress)란, 생체에 가해지는 여러 상해 또는 자극에 대하여 체내에서 일어나는 비특이적인 생물반응을 의미한다. 외부의 일시적인 스트레스에 대한 반응은 자연스런 현상일 수 있지만, 스트레스에 대한 반응이 오랫동안 지속될 경우에는 정신적 또는 신체적으로 손상을 입게 될 수 있다. 특히, 스트레스는 스트레스가 가해지는 대상이 언제나 자각할 수 있는 것은 아니고 동물의 경우 스트레스 상태에 있는 것을 인지하기 어려운 경우도 있으므로 스트레스 상태인지 객관적으로 진단할 수 있는 방법이 필요하다.

한편, 엑소좀은 세포 내부에서 형성되어 다중소낭체를 통해 세포 외부로 분비되는 직경 약 200 nm 이하의 작은 세포외소포체이다. 모세포의 단백질과 유전정보를 포함하고 있는 엑소좀은 최근 다양한 질환의 바이오마커로 활용 가능성이 제시되고 있다.

다만 엑소좀을 이용하여 아토피성 피부염 상관 스트레스를 진단하는 방법에 대한 기술은 아직 연구된 바 없어 이에 대한 심도 깊은 연구가 요구되고 있다.

대한민국 공개특허공보 10-2016-0042703

본 발명의 목적은 엑소좀에서 유래한 특정 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개체의 엑소좀 유래 특정 miRNA의 발현 수준을 대조군의 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-let-7e-5p(서열번호 4), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-miR-5128(서열번호 9), mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 엑소좀은 신경 유래 엑소좀일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 제제는 상기 하나 이상의 엑소좀 유래 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 개체의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계에서 분리된 엑소좀에서 유래한 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-let-7e-5p(서열번호 4), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-miR-5128(서열번호 9), mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군 시료의 해당 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 엑소좀은 신경 유래 엑소좀일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-let-7e-5p(서열번호 4), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8) 및 mmu-miR-5128(서열번호 9)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 고발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 저발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

도 1은 Balb/c 마우스에서 아토피성 피부염을 유발한 방법 및 각 군 설정에 대한 실험 설계 내용을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 DNCB 처리 후 아토피성 피부염 유발 여부를 피부조직을 통해 확인한 것이다.
도 3은 아토피성 피부염 유발 이후 2일, 6일, 14일에 뇌의 해마 (hippocampus) 부위에 특정 단백질 발현 양상 확인한 것이다.
도 4는 아토피성 피부염 유발 동물 혈청 유래 엑소좀의 형태학적 확인(A), 엑소좀의 사이즈 분포 확인(B) 및 엑소좀 표면 특이 발현 단백질 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 혈청 유래 엑소좀 및 신경 유래 엑소좀에서 신경 특이적 마커 발현 여부를 확인한 것이다.
도 6은 정상군 대비 아토피성 피부염 유발군에서 신경 유래 엑소좀의 miRNA 발현 양상을 NGS를 통하여 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아토피성 피부염 유발군에서 발현이 상향되는 miRNA를 나타낸 것이다.
도 8은 아토피성 피부염 유발군에서 발현이 하향되는 miRNA를 나타낸 것이다.

본 발명은 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-let-7e-5p(서열번호 4), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-miR-5128(서열번호 9), mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "miRNA(microRNA)"는, mRNA의 3' 비번역 영역(UTR) 부위와의 염기결합을 통해 전사후 억제자 역할을 하는 대략 22 nt의 비번역 RNA를 의미한다.

엑소좀 miRNAs의 검출은 통상적으로는 시료부터 엑소좀을 추출하여, 추출물 중의 엑소좀 miRNAs을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 엑소좀 miRNAs의 검출은 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 신경 유래 엑소좀 일 수 있다.

본 발명의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 상태에서 생물학적 시료의 검체에서 발현 수준이 감소되는 마커인 엑소좀 miRNA 및 발현 수준이 증가되는 마커인 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명에서 상기 제제는 상기 하나 이상의 엑소좀 유래 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.

즉, 핵산의 검출은 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 엑소좀 miRNAs의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 스트레스 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 스트레스 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.

예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

miRNA의 발현 수준은 당해 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등이 포함되며 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트에는 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 스트레스 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 개체의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및

상기 “대조군 시료의 해당 엑소좀 유래 miRNA 발현 수준과 비교” 한다는 것은 개체와 대조군의 비교 대상이 동일한 종류의 엑소좀에서 유래한 동일한 종류의 miRNA 라는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-let-7e-5p(서열번호 4), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-miR-5128(서열번호 9)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 고발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 저발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현"은 바이오 마커(본 발명에서는 엑소좀 유래 miRNA)가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.

본 명세서에서 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "고발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 높은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 본 발명의 miRNA 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.

본 발명에서 “개체”는 아토피성 피부염으로 스트레스 유도시 본 발명의 아토피 유도군과 miRNA 발현이 유사한 양상을 보이는 대상이면 제한없이 해당할 수 있으며, 바람직하게는 포유동물 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 혈액이며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 신경 유래 엑소좀 일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 재료 및 방법>

실시예 1-1. 실험동물

실험은 8 주령 수컷 balb/c 마우스로 수행되었다. 상기 마우스는 온도, 습도 및 제어된 실내 조명 (24 ± 2 ℃, 50 ± 20 % 상대 습도, 07:00에 조명을 켜고 12/12 시간 명/암주기)조건에 수용되었다. 또한 마우스는 음식과 물에 제한없이 접근 가능하도록 하였다. 상기 마우스 및 본 발명에서 사용되는 시약 등은 상업적으로 구매 가능하다.

실시예 1-2. DNCB에 의해 유발된 아토피 피부염 모델

1-Chloro-2,4-dinitrobenzene(DNCB)(Sigma)을 사용하여 아토피 피부염 모델을 유도하였다. 각 그룹에서 아토피 피부염을 유도하기 위한 프로토콜은 도 1에 나타난 바와 같다. 먼저 마우스를 대조군, DNCB 2일, DNCB 6일 및 DNCB 14일로 나눈 다음 등쪽 털을 제모하였다. DNCB 2일 그룹 마우스는 200 μL의 1% DNCB 희석된 아세톤 및 올리브 오일 (4 : 1)로 1 회 처리되었고 24 시간 후에 희생되었다. DNCB 6일 그룹에서는, 마우스를 0 일 및 3 일에 200μL의 1% DNCB로 2회 처리한 후 6일째 희생시켰다. 마지막으로, DNCB 14 일 그룹의 마우스는 0 일 및 3 일에 200 μL의 1% DNCB로 감작시킨 다음 6 일부터 13 일까지 매일 2% DNCB로 처리하고 14 일째 희생시켰다.

실시예 1-3. 해마의 신경염증 확인을 위한 조직병리검사

뇌를 절개한 다음 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 그 다음 조직을 처리하고 파라핀에 넣었다. 뇌 파라핀 블록 절편은 해마 레벨에서 4μm 두께로 절단되었다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 DAKO CoverStainer (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 신경염증 마커 단백질의 발현을 확인하기 위해 면역 조직 화학(Immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다. 뇌 절편은 anti-BDNF (희석 1 : 500; Abcam, Abcam, Cambridge, UK), COX2 (희석 1 : 250; Abcam, Abcam, Cambridge, UK), GFAP (희석 1 : 500; Abcam, Cambridge, UK) 1차 항체로 염색되었다. 다음으로, 라벨이 붙은 폴리머 DAKO EnVisionTM + System-HRP (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 제조업체의 지침에 따라 면역조직화학적으로 절편하였다. 염색 후, Pannoramic SCAN II (3DHISTECH Kft., Budapest, Hungary)를 사용하여 뇌 절편을 스캔하였다. 현미경 사진은 CaseViewer (3DHISTECH Kft., Budapest, Hungary)로 촬영되었다. 마지막으로, 해마의 신경염증 마커는 Imaged J 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD, USA)로 정량화되었다.

실시예 1-4. 혈청에서 엑소좀 분리

ExoQuick 솔루션 (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 제조업체의 지침을 수정하여 혈청에서 엑소좀을 분리하였다. 먼저, 3 mL 혈청을 3,500 × g에서 15 분간 4 ℃에서 원심 분리를 통해 펠렛화하여 세포 파편을 제거하였다. 다음으로, 3 mL의 데브리가 제거된 혈청(debris-deleted serum)과 885 μL ExoQuick 용액을 혼합하였다. 혼합물을 3,500 × g에서 10 분 동안 원심 분리한 후, 펠렛을 200 μl PBS로 재현탁시켰다.

실시예 1-5. 혈청에서 분리된 총 엑소좀에서 뉴런 엑소좀 분리

종래의 문헌(Plasma extracellular vesicles enriched for neuronal origin: A potential window into brain pathologic processes. Front Neurosci. 2017 May 22;11:278.)을 참조 및 수정하여 신경 엑소좀을 분리하였다. 200 μL PBS를 포함하는 총 엑소좀을 로테이팅 믹서(rotating mixer)에서 4 ℃에서 1 시간 동안 anti-CD171 항체 (Bioss Antibodies, Beijing, China) 4 μL와 함께 배양하였다. 15μL PierceTM streptavidin + UltralinkTM 수지 (Thermo Fisher Scientific)와 25μL PBS를 첨가한 후, 혼합물을 로테이팅 믹서에서 4 ℃로 1 시간 동안 배양한 다음, 4 ℃에서 10 분 동안 500 x g로 원심 분리하였다. 샘플에서 상청액을 제거하고 펠렛을 200 μL 0.1M Glycine-HCl (Biosesang, Seongnam, Korea)에 재현탁시켰다. 10초 동안 혼합하고 30초 동안 볼텍싱(voltexing) 한 후 혼합물을 4,500 x g에서 10분 동안 4 ℃로 원심 분리하여 펠릿화 하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮긴 다음 15 μL Tris-HCl (Biosesang, Seongnam, Korea) 및 25 μL PBS를 첨가하였다.

실시예 1-6. 투과 전자 현미경 (Transmission electron microscopy, TEM)

혈청에서 분리된 엑소좀을 차가운 증류수에 재현탁시켰다. 엑소좀 현탁액을 폼바 카본 코팅 그리드 (formvar carbon coated grid, Ted Pella Inc.)에 로딩한 후, 현탁액을 2% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정하고 용액을 제거한 다음 샘플을 건조시켰다. 그리드는 bioTEM (Hitachi HT7700)을 사용하여 기록되었다.

실시예 1-7. 나노 입자 추적 분석 (Nanoparticle tracking analysis, NTA)

NTA는 제조업체의 지침에 따라 PMX120 (Particle Metrix) nanosight 기기를 사용하여 수행되었다.

실시예 1-8. 유세포 분석

50μl의 총 엑소좀을 10μl의 알데히드/설페이트 라텍스 비드(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 15분 동안 상온에서 배양하였으며, PBS 500 μl 보충된 3% BSA가 첨가되었다. 샘플은 로테이팅 믹서에서 밤새 배양되었다. 비드-결합된 엑소좀을 3,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하고 500 μl PBS로 세척하였다. 세척 후 샘플을 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 샘플에서 상청액을 버리고 펠렛을 상온에서 1시간 동안 anti-CD9, CD81 항체 (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 포함하는 PBS 50μl로 재현탁시켰다. 샘플을 3,000 x g에서 10분 동안 원심 분리하였으며, 펠렛을 200 μl의 PBS로 재현탁시켰다. 엑소좀 마커는 유세포 분석기 Galios (Beckman Coulter)를 사용하여 검출되었으며, Kaluza 소프트웨어로 분석을 수행하였다.

실시예 1-9. 웨스턴 블롯

혈청에서 분리된 총 엑소좀(tEV) 및 뉴런 엑소좀(nEV) 각각은 M-PER, HaltTM Protease 및 Phosphatase Inihhitor Cocktail (Thermo Scientific)을 사용하여 용해되었다. 엑소좀 용해물의 농도는 제조업체의 지침에 따라 PierceTM BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정되었다. 다음으로, 20 μg의 엑소좀 용해물을 BoltTM 4-12 % Bis-Tris Plus 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 (polyvinylidene fluoride, PVDF) 막 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 옮겼다. 그 후, 실온에서 1 시간 동안 TBS-T가 보충된 5 % 탈지유로 막을 블로킹 하였다. 차단 후, TSG101 (NovusBio, USA), CD171(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), TUJ1 (Abcam, Cambridge, UK), NSE (Abcam, Cambridge, UK) 및 NeuN (Abcam, Cambridge, UK) 일차 항체(diluted 1:1000)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 막을 horseradish peroxidase(HRP) 접합된 이차 항체 (1 : 2000 희석)와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하고 TBS-T로 세척하였다. 마지막으로 EzWestLumi plus (ATTO, Japan)로 밴드를 감지하고 Image QuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, UK)을 사용하여 분석하였다.

실시예 1-10. 엑소좀 miRNA의 차등 발현 분석을 위한 차세대 시퀀싱(NGS)

혈청으로부터 분리된 뉴런 엑소좀을 모아 600 μL의 샘플을 제조하였다. 엑소좀의 농도는 제조업체의 지침에 따라 PierceTM BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정되었다. BCA 분석결과 각 샘플의 농도는 1.59 mg/mL (대조군), 2.34 mg/mL (DNCB 14 일)이었다. 엑소좀 smRNA 분리 및 라이브러리 준비는 제조업체의 지침에 따라 SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, USA)를 사용하여 Macrogen (Seoul, Korea)에서 수행하였다. 그 다음 HiSeq 2500 시스템 사용 설명서 문서 # 15035786 v02 HCS 2.2.70에 따라 HiSeq 2500 시스템을 사용하여 miRNA 시퀀싱을 수행하였다.

실시예 1-11. 통계 분석

모든 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 수행되었으며, p<0.05는 유의한 차이로 간주되었다.

<실시예 2: DNCB로 유도된 피부의 아토피성 피부염 확인>

피부의 병리학적 분석을 통해 DNCB에 의한 아토피성 피부염 유발 여부를 확인하였다. 먼저, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 통해 아토피 피부염의 전형적 병변인 각질층과 표피 두께의 증가를 확인하였다(도 2의 A; control=12.05±2.51%; DNCB 2 days=80.6±31.46%, p=0.008; DNCB 6 days=108.54±43.89%, p=0.022; DNCD 14 days=125.74±19.25 %, p=0.00016). 다음으로 톨루이딘(toluidine) 블루 염색을 수행하여 진피의 비만 세포 침윤을 확인하였다. 그 결과, DNCB 처리가 반복됨에 따라 비만 세포가 증가하고 침윤이 증가하는 것이 관찰되었다(도 2의 B; control=6.75±1.5%, DNCB 2 days=12.75±2.87%, p=0.017; DNCB 6 days=13.75±1.89%, p=0.0014; DNCD 14 days=26.5±4.80%, p=0.0022).

<실시예 3: 아토피 피부염 마우스 모델의 해마 병리학적 분석>

H&E 염색과 IHC를 수행하여 아토피성 피부염으로 유도된 스트레스로 인한 신경염증 표지자의 발현 정도를 분석하였다. 조직 병리학적 염색의 결과, 대조군과 비교하여 현미경사진에서 DNCB 2 일, DNCB 6 일 및 DNCB 14 일의 해마에서 유의한 차이가 발견되지 않았다 (도 3의 A). 그리고 IHC 염색을 수행하고 정량화 하였을 때 해마에서 BDNF 발현의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 3의 B; control=0.55±0.11 %, DNCB 2 days=0.80±0.20 %, p=0.150; DNCB 6 days=0.70±0.077 %, p=0.130; DNCD 14 days=0.90±0.20 %, p=0.0706). 또한 COX2는 발현 수준에 큰 변화가 없었다(도 3의 C; control=0.71±0.084 %, DNCB 2 days=0.97±0.21 %, p=0.150; DNCB 6 days=0.90±0.35 %, p=0.448; DNCD 14 days=1.28±0.49 %, p=0.181). 그러나 GFAP 발현 수준은 DNCB 2 일, DNCB 6 일 및 DNCB 14 일에서 유의하게 변화하였다 (도 3의 D; 대조군 = 1.01 ± 0.0526 %, DNCB 2 일 = 1.10 ± 0.11 %, p = 0.327; DNCB 6 일 = 1.74 ± 0.016 %, p = 0.0102; DNCD 14 일 = 3.42 ± 0.077 %, p = 0.00000547).

<실시예 4: 혈청에서 분리된 총 엑소좀 확인>

뉴런 엑소좀을 분리하기 전에 혈청에서 분리된 총 엑소좀의 특성을 확인하였다. 먼저 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 엑소좀의 모양과 크기를 확인하였다. TEM 이미지는 엑소좀이 구형 이중층 막이고 직경이 30-150 nm임을 보여주었다(도 4의 A). 다음으로, 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 이용한 결과 엑소좀 크기가 30-150 nm 범위임을 확인하였다(도 4의 B). 마지막으로, CD9, CD81과 같은 엑소좀 마커의 존재를 확인하기 위해 면역 표지 방법을 사용한 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과 혈청에서 분리된 전체 엑소좀에서 98.08 %의 CD9-양성 및 80.16 %의 CD81-양성 입자를 나타냈다(도 4의 C).

<실시예 5: 분리된 뉴런 엑소좀의 특성화>

혈청으로부터 총 엑소좀을 분리한 후, 면역 침강을 위해 anti-L1 세포 부착 분자(L1CAM; CD171) 비오틴화된 항체를 사용하여 뉴런 엑소좀의 분리를 수행하였다. 뉴런 엑소좀의 식별은 웨스턴 블롯팅을 사용하여 수행되었다. 그 결과 CD171이 총 엑소좀 (tEV)보다 뉴런 엑소좀 (nEV)에 더 많이 포함되어 있고 Tuj1, NSE 및 NeuN과 같은 뉴런 마커가 뉴런 엑소좀에 제시되었지만 총 엑소좀에는 제시되지 않았음을 확인하였다. 마지막으로, 엑소좀마커 TSG101은 총 엑소좀과 뉴런 엑소좀 모두에서 확인되었다 (도 5).

<실시예 6: 아토피성 피부염 유발 스트레스에 의해 변화된 exosomal miRNA 발현 확인>

NGS(Next-generation sequencing)를 사용하여 아토피 피부염에 의해 변화된 miRNA 발현 패턴을 확인하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 14 일 동안 DNCB에서 9 개의 miRNA가 크게 상향 조절되었고 16 개의 miRNA가 크게 하향 조절되었음을 확인하였다(도 6). 대조군과 비교하여 14 일 동안 DNCB에서 상향 조절된 miRNA는 mmu-let-7a-5p, mmu-let-7b-5p, mmu-let-7c-5p, mmu-let-7e-5p, mmu-miR-126a-5p, mmu-miR-3473b, mmu-miR-3473e, mmu-miR-466i-5p 및 mmu-miR-5128 이었다(도 7). 하향 조절된 miRNA는 mmu-let-7i-5p, mmu-miR-130a-3p, mmu-miR-140-3p, mmu-miR-142a-3p, mmu-miR-16-5p, mmu-miR- 17-5p, mmu-miR-185-5p, mmu-miR-19b-3p, mmu-miR-24-3p, mmu-miR-27a-5p, mmu-miR-29a-3p, mmu-miR-301a- 3p, mmu-miR-451a, mmu-miR-669a-3p, mmu-miR-669o-3p 및 mmu-miR-93-5p이었다 (도 8).

상기 miRNA의 서열은 아래 표 1에 나와 있다. 그리고 이러한 miRNA 중 일부는 우울증 관련 연구에서 발현 변화를 보여주는 miRNA로 확인되었다. 아토피 피부염은 심리적 스트레스를 유발하고 스트레스는 우울증을 유발한다는 이전 연구에 따르면 NGS 데이터는 이러한 miRNA가 심리적 스트레스 바이오 마커로 사용될 수 있음을 의미한다.

<110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Atopic dermatitis-associated stress diagnosis technology using exosome-derived miRNA <130> P200837 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-let-7a-5p <400> 1 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-let-7b-5p <400> 2 ugagguagua gguugugugg uu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-let-7c-5p <400> 3 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-let-7e-5p <400> 4 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> mmu-miR-126a-5p <400> 5 cauuauuacu uuugguacgc g 21 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> mmu-miR-3473b <400> 6 gggcuggaga gauggcucag 20 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> mmu-miR-3473e <400> 7 gggcuggaga gauggcucgu a 21 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> mmu-miR-466i-5p <400> 8 ugugugugug ugugugugug 20 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-5128 <400> 9 caauuggggc uggcgagaug gcu 23 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-let-7i-5p <400> 10 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-130a-3p <400> 11 cagugcaaug uuaaaagggc au 22 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> mmu-miR-140-3p <400> 12 uaccacaggg uagaaccacg g 21 <210> 13 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-142a-3p <400> 13 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-16-5p <400> 14 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-17-5p <400> 15 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-185-5p <400> 16 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-19b-3p <400> 17 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-24-3p <400> 18 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-27a-5p <400> 19 agggcuuagc ugcuugugag ca 22 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-29a-3p <400> 20 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-301a-3p <400> 21 cagugcaaua guauugucaa agc 23 <210> 22 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-451a <400> 22 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-669a-3p <400> 23 acauaacaua cacacacacg uau 23 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-669o-3p <400> 24 acauaacaua cacacacacg uau 23 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-93-5p <400> 25 caaagugcug uucgugcagg uag 23

Claims

mmu-miR-5128(서열번호 9)의 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 신경 유래 엑소좀인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제제는 엑소좀 유래 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단용 키트.
(a) 개체의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 분리된 엑소좀에서 유래한 miRNA인 mmu-miR-5128(서열번호 9)의 발현 수준을 대조군 시료의 해당 엑소좀 유래 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염으로 인해 유발된 스트레스 진단을 위한 정보제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것인, 정보제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b)단계의 miRNA는 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7), mmu-miR-466i-5p(서열번호 8), mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 엑소좀 유래 miRNA를 더 포함하는 것인, 정보제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-miR-5128(서열번호 9)의 발현 수준이 대조군에 비해 고발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
제8항에 있어서, 상기 (b)단계에서 개체의 mmu-let-7i-5p(서열번호 10), mmu-miR-130a-3p(서열번호 11), mmu-miR-140-3p(서열번호 12), mmu-miR-142a-3p(서열번호 13), mmu-miR-16-5p(서열번호 14), mmu-miR-17-5p(서열번호 15), mmu-miR-185-5p(서열번호 16), mmu-miR-19b-3p(서열번호 17), mmu-miR-24-3p(서열번호 18), mmu-miR-27a-5p(서열번호 19), mmu-miR-29a-3p(서열번호 20), mmu-miR-301a-3p(서열번호 21), mmu-miR-451a(서열번호 22), mmu-miR-669a-3p(서열번호 23), mmu-miR-669o-3p(서열번호 24) 및 mmu-miR-93-5p(서열번호 25)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 저발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 정보제공 방법.
제8항에 있어서, (b)단계에서 개체의 mmu-let-7a-5p(서열번호 1), mmu-let-7b-5p(서열번호 2), mmu-let-7c-5p(서열번호 3), mmu-miR-126a-5p(서열번호 5), mmu-miR-3473b(서열번호 6), mmu-miR-3473e(서열번호 7) 및 mmu-miR-466i-5p(서열번호 8)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군에 비해 고발현인 경우 상기 개체는 스트레스 상태인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.