CN113444677B - 一种基于磁性mof纯化分离外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，涉及生物技术领域，所述方法是一种能够纯化所述外泌体的磁性分离方法，一种表面吸附有CD63核酸适配体的磁性Al‑MOF纳米颗粒特异性地捕获微量生物样本中的所述外泌体，经磁性分离和多次洗涤后，再加入氨水或低浓度的氢氧化钠等碱性溶液将所述外泌体从所述磁性Al‑MOF纳米颗粒释放下来，并经超滤洗涤最终得到高纯度的所述外泌体。本发明种既可以简便快速，又可以保证从微量样品中分离得到高纯度外泌体。

Description

一种基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是一类特殊的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，大多数细胞分泌的外泌体直径为30-150nm(J Biol Chem,1987,262(19):9412-20.)。外泌体广泛存在于各种体液(如血液、尿液、唾液、脑脊髓液、眼房水和黏膜渗出液等)中。由于外泌体的生物发生，它们具有和细胞类似的拓扑结构，包含来源于母细胞的DNA、RNA、蛋白质、脂质和小分子代谢物等物质(Cell,2019,177(2):428-445.)，可作为细胞间物质交流和信号传递的途径，参与免疫调节、生殖发育、肿瘤转移以及代谢性疾病的发生发展等多种生理病理过程(Science,2016,352(6291):1349-1351.)。外泌体作为疾病诊断的指标和疾病治疗的载体已经成为当今全球生命科学/基础医学研究的一大热点。

外泌体提取的金标准方法是梯度超速离心法，但该方法耗时长、费人力、实验设备昂贵，而且样品消耗量大，非常不利于微量生物样本(如脑脊液、眼房水、黏膜渗出液等)中的外泌体分离。磁性分离法可以特异性地从微量样本中获得高纯度的外泌体。

因此，国内亟需一种既可以简便快速，又可以保证从微量样品中分离得到高纯度外泌体的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何简便地从微量样品中分离得到高纯度外泌体。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述方法是一种能够纯化所述外泌体的磁性分离方法，一种表面吸附有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒特异性地捕获微量生物样本中的所述外泌体，经磁性分离和多次洗涤后，再加入氨水或低浓度的氢氧化钠等碱性溶液将所述外泌体从所述磁性Al-MOF纳米颗粒释放下来，并经超滤洗涤最终得到高纯度的所述外泌体。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

步骤1、通过共沉淀法制备一种磁性纳米颗粒；

步骤2、在所述磁性纳米颗粒的表面合成一层Al-MOF，制备成磁性Al-MOF纳米颗粒，并配制成水分散液；

步骤3、在所述磁性Al-MOF纳米颗粒水分散液中加入针对CD63蛋白的核酸适配体，通过磁性Al-MOF纳米颗粒表面的Al3+与CD63核酸适配体骨架中的磷酸根之间的静电吸附作用，将CD63核酸适配体固定在磁性Al-MOF纳米颗粒，形成修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒；

步骤4、将所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒与微量生物样本混合，外泌体被捕获在修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒表面；

步骤5、进一步地，将所述捕获有外泌体的磁性Al-MOF纳米颗粒微量溶液加入到一根毛细玻璃管中；

步骤6、进一步地，将所述装有捕获住外泌体的磁性Al-MOF纳米颗粒微量溶液的毛细玻璃管紧靠或固定在永磁铁表面，毛细玻璃管的长度方向与永磁铁表面相平行，静置30min进行磁性分离；

步骤7、用一滤纸或吸管或注射工具将所述永磁铁表面的毛细玻璃管中的溶液排除，并使用纯水或PBS溶液冲洗数遍，洗涤过程中毛细玻璃管仍就紧贴这永磁铁表面。

步骤8、使用氨水或低浓度的氢氧化钠等碱性溶液通入上一步骤中所述的毛细玻璃管中冲洗，并收集冲洗液，冲洗过程中毛细玻璃管仍就紧贴这永磁铁表面；

步骤9、将上一步骤诉述收集到的冲洗液加入到100K超滤管中进行超滤。

进一步地，所述步骤1采用的是共沉淀法。

进一步地，所述步骤1中所述磁性纳米颗粒制备方法是：室温(30)℃下，将5mL超纯水和5mL 0.3mmol/mL FeCl3水溶液装入三颈瓶中，抽真空30min以去除瓶中的空气，连续充入氮气5min后，在保持氮气流继续和持续搅拌(1000rpm)的情况下，从所述三颈瓶的右侧口的橡胶密封盖插入pH计，加入2.5mmol的对苯二甲酸二钠盐，充分搅拌溶解(1000rpm*10min)，加入1mmol的FeCl2·4H2O颗粒，充分搅拌溶解(1000rpm*15min)，加入氢氧化钠溶液，1000rpm持续搅拌20min后结束反应，使用永磁铁在所述三颈瓶外吸引所述磁性纳米颗粒，去除澄清的液体后，使用超纯水反复洗涤5次。

进一步地，所述氢氧化钠加入的量需要使溶液PH值达到11。

进一步地，所述步骤2中所述磁性Al-MOF纳米颗粒制备方法是：将1g所述磁性纳米颗粒加入15mL超纯水中，在持续搅拌(1000rpm)的情况下加入5.0gAlCl3·6H2O，搅拌(1000rpm)20分钟后，加入2g NaOH、0.1g 2-氨基对苯二甲酸和3mL甲酸，在70℃的水浴和连续搅拌(1000rpm)条件下反应72h，冷却至室温后，10000rpm离心15min，吸弃上清，加入15mL超纯水超声重悬分散，再次10000rpm离心15min，如此反复洗涤5次后，加入超纯水得到0.2mg/mL的所述磁性Al-MOF纳米颗粒悬液。

进一步地，所述步骤3中所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒制备方法是：取100μL 0.2mg/mL的所述磁性Al-MOF纳米颗粒悬液，加入10μL 20μMCD63核酸适配体溶液，吹打混匀后放置室温静置30min，5000rpm离心5min后，吸弃上清，加入100μL灭菌水重悬，再次5000rpm离心5min后，此反复洗涤3次后，加入100μL灭菌水重悬得到表面所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒。

进一步地，所述步骤4中样本混合后需要4℃过夜孵育或37℃孵育30min-60min。

进一步地，所述步骤5中磁性分离的过程是：取50μL黏膜渗出液与50μL 0.2mg/mL的所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒悬液混合，室温孵育45min后，将这100μL混合液每次加20μL到毛细玻璃管中，再将毛细玻璃管固定在永磁铁表面，磁分离10min后使用滤纸吸出毛细玻璃管中的液体，每次加入20μL PBS溶液吸洗，吸洗5次后，向毛细玻璃管中加入20μL pH＝9.0的氨水，5min后，使用移液器吸出毛细玻璃管中的溶液并转移到1.5mL的离心管中，然后加入PBS溶液定容至400μL，将其转移到100K的Minipore超滤管中，5000rpm*10min离心，再加入PBS重悬至400μ后离心(5000rpm*10min)，如此反复洗涤5次后，得到纯化的所述外泌体悬液。

进一步地，所述步骤9还需要使用ddw或PBS进行超滤洗涤。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述能够得到外泌体的磁性分离方法捕获有外泌体的磁性Al-MOF纳米颗粒，通过使用氨水或低浓度的氢氧化钠等碱性溶液进行针对性消化，从而将外泌体从磁性Al-MOF纳米颗粒上释放下来，可以进一步用于外泌体形态、生物活性等研究以及TEM、NTA等表征检测方法。本发明所述的分离方法操作环境温和，操作方法简单、可控性高，且分离得到的外泌体具有较高的纯度，是一种快速、高效的外泌体磁性分离方法。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的能够得到高纯度外泌体的磁性分离流程示意图；

图2为本发明修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒制备流程示意图；

图3为本发明实施例中所获得外泌体的TEM图；

图4为本发明实施例中所获得外泌体的NTA图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。

如图1-4所示，磁性纳米颗粒的制备：

室温(30)℃下，将5mL超纯水和5mL 0.3mmol/mL FeCl3水溶液装入三颈瓶中，抽真空30min以去除瓶中的空气，连续冲入氮气5min后，在保持氮气流继续和持续搅拌(1000rpm)的情况下，从三颈瓶的右侧口的橡胶密封盖插入pH计，加入2.5mmol的对苯二甲酸二钠盐，充分搅拌溶解(1000rpm×10min)，加入1mmol的FeCl2·4H2O颗粒，充分搅拌溶解(1000rpm×15min)，加入氢氧化钠溶液直至Ph＝11，1000rpm持续搅拌20min后结束反应，使用永磁铁在三颈瓶外吸引磁性纳米颗粒，去除澄清的液体后，使用超纯水反复洗涤5次。

磁性Al-MOF纳米颗粒：

将1g磁性纳米颗粒加入15mL超纯水中，在持续搅拌(1000rpm)的情况下加入5.0gAlCl3·6H2O，搅拌(1000rpm)20分钟后，加入2g NaOH、0.1g 2-氨基对苯二甲酸和3mL甲酸，在70℃的水浴和连续搅拌(1000rpm)条件下反应72h，冷却至室温后，10000rpm离心15min，吸弃上清，加入15mL超纯水超声重悬分散，再次10000rpm离心15min，如此反复洗涤5次后，加入超纯水得到0.2mg/mL的磁性Al-MOF纳米颗粒悬液

磁性Al-MOF纳米颗粒的CD63核酸适配体修饰：

取100μL 0.2mg/mL的磁性Al-MOF纳米颗粒悬液，加入10μL 20μMCD63核酸适配体溶液，吹打混匀后放置室温静置30min，5000rpm离心5min后，吸弃上清，加入100μL灭菌水重悬，再次5000rpm离心5min后，此反复洗涤3次后，加入100μL灭菌水重悬得到表面修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒。

黏膜渗出液中外泌体的磁性分离：

取50μL黏膜渗出液与50μL 0.2mg/mL的修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒悬液混合，室温孵育45min后，将这100μL混合液每次加20μL到毛细玻璃管中，再将毛细玻璃管固定在永磁铁表面，磁分离10min后使用滤纸吸出毛细玻璃管中的液体，每次加入20μL PBS溶液吸洗，吸洗5次后，向毛细玻璃管中加入20μL pH＝9.0的氨水，5min后，使用移液器吸出毛细玻璃管中的溶液并转移到1.5mL的离心管中，然后加入PBS溶液定容至400μL，将其转移到100K的Minipore超滤管中，5000rpm×10min离心，再加入PBS重悬至400μ后离心(5000rpm×10min)，如此反复洗涤5次后，得到纯化的外泌体悬液。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、通过共沉淀法制备一种磁性纳米颗粒；

步骤2、在所述磁性纳米颗粒的表面合成一层Al-MOF，制备成磁性Al-MOF纳米颗粒，并配制成水分散液；

步骤3、在所述磁性Al-MOF纳米颗粒水分散液中加入针对CD63蛋白的核酸适配体，通过磁性Al-MOF纳米颗粒表面的Al³⁺与CD63核酸适配体骨架中的磷酸根之间的静电吸附作用，将CD63核酸适配体固定在磁性Al-MOF纳米颗粒，形成修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒；

步骤4、将所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒与微量生物样本混合，外泌体被捕获在修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒表面；

步骤5、进一步地，将所述捕获有外泌体的磁性Al-MOF纳米颗粒微量溶液加入到一根毛细玻璃管中；

步骤6、进一步地，将所述装有捕获住外泌体的磁性Al-MOF纳米颗粒微量溶液的毛细玻璃管紧靠或固定在永磁铁表面，毛细玻璃管的长度方向与永磁铁表面相平行，静置30min进行磁性分离；

步骤7、用一滤纸或吸管或注射工具将所述永磁铁表面的毛细玻璃管中的溶液排除，并使用纯水或PBS溶液冲洗数遍，洗涤过程中毛细玻璃管仍旧紧贴着永磁铁表面；

步骤8、使用PH值为9的氨水或PH值为11的氢氧化钠碱性溶液通入上一步骤中所述的毛细玻璃管中冲洗，并收集冲洗液，冲洗过程中毛细玻璃管仍旧紧贴着永磁铁表面；

步骤9、将上一步骤所述收集到的冲洗液加入到100K超滤管中进行超滤。

2.如权利要求1所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤1采用的是共沉淀法。

3.如权利要求2所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤1中所述磁性纳米颗粒制备方法是：室温30℃下，将5mL超纯水和5mL 0.3mmol/mL FeCl₃水溶液装入三颈瓶中，抽真空30min以去除瓶中的空气，连续充入氮气5min后，在保持氮气流继续和持续搅拌的情况下，搅拌转速为1000rpm，从所述三颈瓶的右侧口的橡胶密封盖插入pH计，加入2.5mmol的对苯二甲酸二钠盐，充分搅拌溶解，搅拌转速为1000rpm，时间为10分钟，加入1mmol的FeCl₂·4H₂O颗粒，充分搅拌溶解，搅拌转速为1000rpm，时间为15分钟，加入氢氧化钠溶液，1000rpm持续搅拌20min后结束反应，使用永磁铁在所述三颈瓶外吸引所述磁性纳米颗粒，去除澄清的液体后，使用超纯水反复洗涤5次。

4.如权利要求3所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤2中所述磁性Al-MOF纳米颗粒制备方法是：将1g所述磁性纳米颗粒加入15mL超纯水中，在持续1000rpm搅拌的情况下加入5.0g AlCl₃·6H₂O，1000rpm搅拌20分钟后，加入2g NaOH、0.1g2-氨基对苯二甲酸和3mL甲酸，在70℃的水浴和连续1000rpm搅拌条件下反应72h，冷却至室温后，10000rpm离心15min，吸弃上清，加入15mL超纯水超声重悬分散，再次10000rpm离心15min，如此反复洗涤5次后，加入超纯水得到0.2mg/mL的所述磁性Al-MOF纳米颗粒悬液。

5.如权利要求4所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤3中所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒制备方法是：取100μL 0.2mg/mL的所述磁性Al-MOF纳米颗粒悬液，加入10μL 20μM CD63核酸适配体溶液，吹打混匀后放置室温静置30min，5000rpm离心5min后，吸弃上清，加入100μL灭菌水重悬，再次5000rpm离心5min后，此反复洗涤3次后，加入100μL灭菌水重悬得到表面所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤4中样本混合后需要4℃过夜孵育或37℃孵育30min-60min。

7.如权利要求6所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤5中磁性分离的过程是：取50μL黏膜渗出液与50μL 0.2mg/mL的所述修饰有CD63核酸适配体的磁性Al-MOF纳米颗粒悬液混合，室温孵育45min后，将这100μL混合液每次加20μL到毛细玻璃管中，再将毛细玻璃管固定在永磁铁表面，磁分离10min后使用滤纸吸出毛细玻璃管中的液体，每次加入20μL PBS溶液吸洗，吸洗5次后，向毛细玻璃管中加入20μL pH＝9.0的氨水，5min后，使用移液器吸出毛细玻璃管中的溶液并转移到1.5mL的离心管中，然后加入PBS溶液定容至400μL，将其转移到100K的Minipore超滤管中，5000rpm×10min离心，再加入PBS重悬至400μ后离心，离心率为5000rpm，时间为10分钟，如此反复洗涤5次后，得到纯化的所述外泌体悬液。

8.如权利要求7所述的基于磁性MOF纯化分离外泌体的方法，其特征在于，所述步骤9还需要使用ddw或PBS进行超滤洗涤。

Images