CN113215079A

CN113215079A - 一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法

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Publication number: CN113215079A
Application number: CN202110560726.0A
Authority: CN
Inventors: 关瑞礼; 谭晓辉; 方冬; 李学松; 周利群
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113215079B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。本发明提供一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸铵的步骤。本发明从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，具有如下优点：首次验证硫酸铵可以用于mEVs的沉淀，且重新溶解后mEVs仍具有活性；该方法能够提高mEVs的产量，纯度相当，且成本更低，可以用于大规模生产mEVs；未来mEVs可以作为天然的纳米载体，递送蛋白质、药物及功能性RNA等生物活性分子，调节细胞的功能，治疗疾病，具有很大的临床转化前景。

Description

一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由细胞主动向外分泌的具有双层膜结构和生物活性的纳米球状物质，主要由脂质、蛋白质和遗传物质组成。其主要类型包括：外泌体(exosomes，粒径30-150nm)、微囊泡(microvesicles，粒径100-1000nm)、凋亡小体(apoptotic bodies，粒径>1000nm)。EVs的特点是分子结构小，生物相容性高，可用于运输脂质、蛋白质、DNA及RNA等物质，是天然的内源性纳米载体。EVs广泛存在于生物体内，包括植物，哺乳动物和人。原则上，所有的活细胞都会分泌EVs。目前主要从细胞培养基以及血液、尿液、脑脊髓液、乳汁、羊水和腹水等体液中提取EVs。EVs在细胞间的信息传递中起重要作用，参与体内多种生理和病理过程，包括炎症、组织稳态、神经元沟通、免疫系统调节、肿瘤发生与转移等。EVs具有多样化的功能和广泛临床应用前景，可用于疾病诊断、纳米药物递送、靶向治疗、免疫治疗等。作为递送药物和功能性RNA的有效载体，EVs具有明显的优势：广阔而天然的来源、纳米尺寸、含有可用于靶向治疗的膜配体。目前临床转化EVs有很多困境，具体如下：产量问题，目前的大多数方法获取的EVs产量较低，比如超速离心法；纯度问题，许多方法会分离出和EVs大小类似的生物分子，造成潜在的污染；来源问题，尽管EVs来源广泛，但是获取同质性更高的EVs比较困难；规模效益问题，在较低成本下获取大量的EVs是临床转化的一个关键点。

牛奶来源的细胞外囊泡(bovine milk-derived extracellular vesicles，mEVs)在纳米载体方面具有众多优势。首先，牛奶作为日常饮食的一部分，天然的来源对人体具有较好的生物相容性，降低了临床中出现免疫反应的可能性。与细胞疗法相比，mEVs更易储存且安全性较高。其次，牛奶比细胞培养基更容易获得且更有成本效益，能够大规模生产，是纳米药物递送的理想选择。mEVs递送药物可以提高药物的稳定性，体内循环周期长，具有药物代谢动力学的优势。mEVs的磷脂双分子膜具有膜蛋白和靶向配体，比如CD47、CD63、组织相容性复合物Ⅰ/Ⅰ类分子等。更重要的是，mEVs可以保护内容物免受胃肠道中酸性物质和消化酶的侵害，这意味着口服mEVs是合理可行的。

目前，分离EVs的主流方法包括，超速离心法、尺寸排阻法、超滤法、免疫捕获法、聚合物沉淀、以及非对称流场流分离法等。其中，超速离心法所需仪器昂贵，回收率低，会分离出粒径类似的杂质，对EVs有潜在的损害。尺寸排阻法一种将溶液中的分子按其大小(在某些情况下为分子量)分开的色谱法，但是产量及效率较低，不适宜大规模生产。超滤法可以根据粒径或分子量大小快速分离EVs，但是纳米孔径的超滤膜可能影响最终的EVs提取效率。免疫捕获法利用特异性抗体识别EVs表面的标志物来分离EVs，特异性高，但是价格昂贵且不适合处理大体积样本，而且容易丢失抗原表达偏低的EVs。聚合物沉淀法产量高，但是产物中存在大量蛋白质杂质，所需时间较长。非对称流场流分离法是基于层流效应的分离方法，主要缺点是可重复性差，效率低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的分离EVs产量低、效率低、成本高缺陷，从而提供一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。

一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸铵的步骤。

可选的，乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％-90％；

可选的，乳清中加入硫酸铵所得溶液中4℃下，硫酸铵饱和度为2％-90％。

可选的，所述硫酸铵为固体硫酸铵；可选的，所述硫酸铵为粉末状硫酸铵。以4℃下8ml乳清为计，加入固体硫酸铵的量为0.08-4.97。

可选的，乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％-50％时，将溶液于2℃-6℃放置0.5小时-24小时后，离心，收集沉淀；离心条件为：2℃-6℃、3000xg-8000xg离心5min-120min；

可选的，乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％、4％、8％、10％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％或50％；将溶液于4℃放置12小时后，离心，收集沉淀；离心条件为：4℃、5000xg离心60min。

可选的，还包括将沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中。乳清中加入硫酸铵所得的溶液中硫酸铵饱和度为60％-90％时，于2℃-6℃放置0.5h-2h后进行离心，取上清液；离心条件为：2℃-6℃、3000xg-8000xg离心5min-120min；

可选的，乳清中加入硫酸铵所得的溶液中，硫酸铵饱和度为60％、70％、80％或90％时，于4℃放置1h后进行离心，取上清液；离心条件为：4℃、5000xg离心60min。

可选的，取上述重悬液或上清液，排除直径大于200nm的蛋白，得到细胞外囊泡粗提物。

可选的，将细胞外囊泡粗提物进行浓缩脱盐处理；可选的，将细胞外囊泡粗提物使用截留分子量3k-500k、滤膜标称孔径5nm-55nm的浓缩离心管在4℃下5000xg离心1h。

可选的，所述乳清的获得方法包括如下步骤：

1)取脱脂牛奶调整pH为4.6，静置5分钟以上；

2)20℃-24℃下4000xg-8000xg离心30min-120min；

可选的，所述脱脂牛奶为经过巴氏杀菌的脱脂牛奶。

上述的方法制备提取得到的细胞外囊泡。

上述的细胞外囊泡作为递送药物和功能性RNA的载体中的应用。

本发明从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，具有如下优点：

1.首次验证硫酸铵可以用于mEVs的沉淀，且重新溶解后mEVs仍具有活性；

2.该方法能够提高mEVs的产量，纯度相当，且成本更低，可以用于大规模生产mEVs；

3.未来mEVs可以作为天然的纳米载体，递送蛋白质、药物及功能性RNA等生物活性分子，调节细胞的功能，治疗疾病，具有很大的临床转化前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1实验技术路线(上清液加入粉末状硫酸铵固体充分混合，得到硫酸铵饱和度为2％-50％的溶液)；

图2是实施例1不同硫酸铵饱和度提取的mEVs的纯度和产量；

图3是实施例1不同硫酸铵饱和度提取的mEVs的标记蛋白；图A为溶液中硫酸铵饱和度为10％-50％的图像，图B为溶液中硫酸铵饱和度为34％的图像；

图4是实施例1硫酸铵饱和度为34％提取mEVs的理化鉴定；

图A为三次技术重复的mEVs粒径信号强度；

图B为mEVs的粒径分布及相应浓度；

图C为100nm标度尺下mEVs的电镜图象；

图D为200nm标度尺下的电镜图象；

图5实施例1细胞摄取mEVs的鉴定

图A不同温度下细胞摄取mEVs及对照组的情况；

图B不同浓度mEVs的细胞毒性测定；

图C不同mEVs浓度下细胞摄取的情况；

图D不同时间细胞摄取mEVs的情况；

图E不同抑制剂及相应浓度作用下细胞摄取mEVs的情况；

英文简写：DMSO，二甲基亚砜；chlorpromazine，氯丙嗪；Filipin complex，Filipin复合物。

具体实施方式

实施例1

1.牛奶的收集和乳清的制备

1.1市场购买当日生产的冷藏储存运输的巴氏杀菌生牛乳——脱脂牛奶(北京三元食品有限公司)；

1.2取50mL脱脂牛奶在试管中，37℃预热10分钟；

1.3酸化牛奶：加入少许6mol/L盐酸，牛奶/盐酸的体积比约为100：1，调整pH到4.6，静置5分钟；

1.4在22℃下5000xg离心1h，除去酪蛋白，得到相对透明的上清液——乳清；

1.5向上一步中得到的上清液加入粉末状硫酸铵固体充分混合，配置不同硫酸铵饱和度的溶液，本实验采取下表(其余硫酸铵饱和度的溶液用以下网址计算：https:// www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm)。

表1

注：上表的说明：以第二列为例，8ml样本(乳清)加入0.08g硫酸铵固体，混合均匀后，溶液中硫酸铵饱和度为2％；8ml样本(乳清)加入0.97g硫酸铵固体，混合均匀后，溶液中硫酸铵饱和度为22％。

1.6上清液加入粉末状硫酸铵固体充分混合，硫酸铵饱和度为2％-50％(即硫酸铵饱和度为2％、4％、8％、10％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％或50％)的溶液于4℃放置12小时，在4℃下5000xg离心1h，去除上清液，除去乳清杂蛋白，然后将沉淀重新悬浮于10mL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，得重悬液。

上清液加入粉末状硫酸铵固体充分混合，硫酸铵饱和度为60％-90％(硫酸铵饱和度为60％、70％、80％或90％)的溶液于4℃静置1h，在4℃下5000xg离心1h，取上清液，除去乳清杂蛋白。

1.7上一步中的重悬液或上清液依次经0.45μm、0.2μm过滤器过滤，排除直径大于200nm的蛋白；

1.8浓缩脱盐处理：使用截留分子量100k、滤膜标称孔径10nm的离心浓缩管(如产品编号：MAP100C36，美国颇尔集团)在4℃下5000xg离心1h，PBS洗涤一次，即得到浓缩后的mEVs，具体流程图见图1。

经测定，乳清加入粉末状硫酸铵固体后，溶液中硫酸铵饱和度为34％时提取mEVs纯度最高，达到2.7±1.399×10⁹粒子数/μg-蛋白，产量为72.424±39.995μg/mL-乳清，见图2。因此，接下来的鉴定实验采用乳清加入粉末状硫酸铵固体后，溶液中硫酸铵饱和度饱和度为34％。

2.mEVs的鉴定

2.1生化鉴定

使用BCA蛋白质测定试剂盒测量mEVs的蛋白质浓度。通过免疫印迹试验进行mEVs标记蛋白的分析，其中一抗包括抗CD63、抗TSG101和抗Hsp70。还分析了在制备过程中常见共分离的非EVs成分的存在，如Calnexin。

结果发现，乳清加入粉末状硫酸铵固体后，硫酸铵饱和度从10％到50％纯化的mEVs包含EVs标记蛋白，例如CD63、TSG101和Hsp70，标记蛋白的量也随着硫酸铵浓度的增加而增加。硫酸铵饱和度为34％亦是如此，且不含有Calnexin，结果见图3。

2.2理化鉴定

通过纳米颗粒跟踪分析技术来确定mEVs的粒径分布和浓度，使用仪器为NanoSight NS300及配套的NTA软件，版本3.3(英国马尔文帕纳科公司)。进行透射电子显微镜以观察mEVs的形态学特征。流程如下：将EVs样品滴注到铜网上，然后用2％醋酸双氧铀染色5分钟，使用安装在Tecnai G2 Spirit显微镜(美国FEI公司)上的数码相机以80kV的电压采集图像。结果发现，纳米颗粒跟踪分析显示大部分的mEVs的直径大致在60-160nm之间，电镜图象显示mEVs的形态学特征为直径约100nm的球形分子。结果见图4。

2.3蛋白组学鉴定

根据滤膜辅助的样品制备方案，mEVs的蛋白质经过丙酮沉淀，还原烷基化，胰蛋白酶消化和脱盐步骤，通过液相色谱法-质谱联用法分析肽混合物。使用ProteomeDiscoverer软件，版本2.4(美国赛默飞世尔科技公司)进行鉴定。结果见表2。

表2 mEVs蛋白组学主要结果

2.4小RNA测序鉴定

按照制造商的说明，使用QIAseq miRNA Library Kit(德国Qiagen公司)开始进行文库制备。文库扩增采用通用正向引物反向引物，产物经磁珠纯化后用于质控分析与上机测序。结果见表3。

表3 小RNA测序主要结果

2.5细胞摄取mEVs的鉴定

2.5.1细胞培养

人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)购买自美国ScienCell公司。HUVECs在含有5％胎牛血清、1％内皮细胞生长补充剂和1％双抗生素溶液的内皮细胞培养基中进行培养。培养环境：较高的相对饱和湿度(95％)，温度为37℃，二氧化碳含量为5％。在细胞密度90％时通过胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。

2.5.2荧光观察

按照制造商的说明，用CM-Dil(CellTracker^TM；美国Invitrogen公司)标记mEVs。在96孔板中，HUVECs在一定的条件下与CM-Dil标记的mEVs共培养，该条件指的是mEVs的剂量，时间或温度。

2.5.3细胞摄取的机制

为了探索摄取途径的机制，用四种抑制剂预处理人脐静脉内皮细胞30分钟，其中包括盐酸氯丙嗪、filipin复合物、Dynasore、LY294002，DMSO作为对照。然后与CM-Dil标记的mEVs共孵育12小时，并使用荧光显微镜观察。四种抑制剂的作用机理主要是抑制细胞内吞作用和吞噬作用。

2.5.4细胞毒性测定

为了评估mEVs的细胞毒性，将HUVECs接种在96孔板中，并在37℃和5％二氧化碳环境下用不同浓度的CM-Dil标记的mEVs处理12h。使用Cell Counting Kit-8试剂盒测量细胞活性。

结果发现，37℃下在细胞内观察到了丰富的mEVs信号，而阴性对照和4℃下则没有明显的摄取(图5A)。直到80μg/mL和24h为止，HUVECs摄取mEVs呈剂量依赖性和时间依赖性增加(图5C和D)。将mEVs对HUVECs的细胞毒性作用与对照进行了比较，发现细胞活性没有显著变化，几乎保持100％，说明此浓度范围内mEVs无细胞毒性(图5B)。在几种抑制剂作用下，细胞摄取的mEVs有所降低，并且具有浓度依赖性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括：乳清中加入硫酸铵的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％-90％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％-50％时，于2℃-6℃放置0.5小时-24小时后，离心，收集沉淀；所述离心条件为：2℃-6℃、3000xg-8000xg离心5min-120min；

可选的，所述乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％、4％、8％、10％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％或50％时；将所述溶液于4℃放置12小时后，离心，收集沉淀；所述离心条件为：4℃、5000xg离心60min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，得重悬液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，乳清中加入硫酸铵所得的溶液中硫酸铵饱和度为60％-90％时，将所述溶液于2℃-6℃放置0.5h-2h后进行离心，取上清液；离心条件为：2℃-6℃、3000xg-8000xg离心5min-120min；

可选的，乳清中加入硫酸铵所得的溶液中，硫酸铵饱和度为60％、70％、80％或90％时，将所述溶液于4℃放置1h后进行离心，取上清液；离心条件为：4℃、5000xg离心60min。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，取权利要求4中所述的重悬液或权利要求5中所述的上清液，排除直径大于200nm的蛋白，得到细胞外囊泡粗提物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将细胞外囊泡粗提物进行浓缩脱盐处理；可选的，将细胞外囊泡粗提物使用截留分子量3k-500k、滤膜标称孔径5nm-55nm的离心浓缩管在4℃下5000xg离心1h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳清的获得方法包括如下步骤：

1)取脱脂牛奶调整pH为4.6，静置5分钟以上；

2)20℃-24℃下3000xg-8000xg离心5min-120min；

可选的，所述脱脂牛奶为经过巴氏杀菌的脱脂牛奶。

9.权利要求1-8中任一所述的方法制备提取得到的细胞外囊泡。

10.权利要求9所述的细胞外囊泡作为递送药物和功能性RNA的载体中的应用。