KR20120023684A - 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 예정된 제타 전위의 엑소좀에 근거한 전하 인력 매커니즘에 의해, 초상자성 산화철 나노 입자(Fe₃O₄)를 이용하여 혈소판으로부터 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 생물학적 시료 내에 포함된 음전하를 띠는 엑소좀에 전기적 인력에 의해 연결되도록, 예정된 양전하로 미리 합성된 산화철 나노 입자를 사용하는 단계를 포함한다. 인큐베이션을 수행하는 동안, 상기 양이온성 자성 나노 입자(cationic magnetic nanoparticle)는 정전기적 상호작용에 의해 상기 엑소좀 막의 표면에 흡수된다. 상기 기술의 성공은 유세포 분석기를 통하여 상기 엑소좀의 특성 해석(Characterization)에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법은 엑소좀의 본래의 형태적 및 구조적 특성을 변화시킴이 없이 엑소좀을 분리하고 여과할 수 있다는 점에서 엑소좀을 분리하는 목적에 적합하다.

Description

산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법{METHOD FOR ISOLATING EXOSOMES FROM BIOLOGICAL SOLUTIONS USING IRON OXIDE NANOPARTICLES}

본 발명은 예정된 제타 전위의 엑소좀에 근거한 전하 인력 매커니즘(attraction charge mechanism)을 통해, 초상자성 자철석 나노 입자(superparamagnetic magnetite nanoparticles)(Fe₃O₄)를 이용하여 혈소판에서 유래된 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.

엑소좀은 서로 다른 유형의 정상 세포 및 암세포(그 중에서도 특히, 림프구, 혈소판, 수지상 세포, 신경 세포, 비만 세포, 장세포, 대식 세포)에 의해 생성된, 광범위한 신호 전달 능력을 갖는 마이크로 입자의 일종이다. 엑소좀은 대략적으로 직경이 100 nm이며, 내재성 단백질, 핵산 및 지질을 함유하는 단백질막과 결합된 지질 이중층으로 구성되어 있다. 최근의 연구들은 면역 내성(immune tolerance)을 촉진하는 능력뿐만 아니라 보다 효과적인 면역 반응을 유도하는 충분한 능력을 보여준다. 이와 같은 성질들에 의해, 먼저 반응하는 세포 엑소좀에 기초한 항암 백신의 제조가 제안되었다. 보다 최근에는, 엑소좀이 혈관 형성, 혈관 세포의 사멸(apoptosis) 및 심장 세포의 기능 장애를 촉진할 수 있고, 심지어 세포 사이에서 유전적 정보를 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 엑소좀이 프리온(prion) 및 미코박테리아 질환(mycobacterial disease)을 전염시킬 수 있는 것으로 여겨지고 있다.

상기와 같이 엑소좀의 중요성이 명백함에도 불구하고, 엑소좀을 연구하고 이용하기 위하여 생물학적 물질로부터 엑소좀을 분열 및 분리하고, 엑소좀의 구조적 및 기능적 성질을 보존하는 것이 문제이다. 엑소좀을 분리하는 전통적인 방법은 매우 어렵고 느리며, 그 입자를 구조적으로 보존하는 것이 보장되지 않는다. 본래의 생물학적 용액으로부터, 일련의 원심 분리를 수행하는 것은 세포, 파편 및 입자가 그들의 상대적인 밀도 및 크기에 따라 침전되는 것을 보장한다.

표준 프로토콜 내에서, 세포 용액으로부터 엑소좀을 얻기 위하여, 상기 용액을 1000 g에서 5분 동안 원심 분리하여 세포 및 거대 파편들을 제거한다; 그 다음 4℃, 18,000 g에서 30분 동안 연속적으로 원심 분리하여 큰 하부 세포(subcell) 입자, 세포 사멸체 및 불필요한 세포 기관을 제거한다; 그 다음 곧바로, 마이크로 소포(microvesicular) 분획물의 상등액을 1 ㎛, 500 nm 및 220 nm의 나일론 막을 통하여 연속적으로 여과한 다음, 엑소좀 "펠렛(pellet)"을 얻기 위하여 4℃, 100,000 g에서 90분 동안 다시 원심 분리한다. 상기 펠렛은 그 사용을 위하여 다시 현탁될 수 있다.

본원 명세서상의 모든 결과는 혈소판에서 유래된 엑소좀으로부터 얻어진 것이다. 선행 연구들은 폐혈증의 임상적 상태에서, 혈소판 엑소좀이 혈관 및 심장 기능 장애와 관련이 있을 수 있음을 보여준다. 상기 엑소좀은 많은 양의 CD63 (테트라스파닌, tetraspanin)을 발현하고, 그 표면에 약간의 아넥신(annexin) V를 보인다.

본 발명에서 사용하는, 산화철 나노 입자로부터 유래된 엑소좀을 분리하는 방법의 원리를 보다 잘 이해하기 위하여, "제타 전위"에 관해 간략히 설명할 필요가 있다.

액체와 접촉하고 있는 거의 모든 거시적 물질 또는 미립자 물질들은 그의 표면에 전기적 전하를 띤다. 이러한 전하는 상기 입자 표면에서의 이온의 분리, 특히, 상기 입자 표면에서의 상기 용액의 이온 흡착의 차이로부터 나타날 수 있다. 상기 입자 표면의 상기 액체 전하는 상기 표면에 상대-이온(counter-ion)의 농도가 증가하면서, 그들 주변에 있는 이온의 분배에 영향을 미친다. 따라서, 상기 액체와 상기 입자의 경계면에 전기적 이중층이 형성된다.

이러한 이중층은 두 가지 영역으로 분리된다: 표면에 강하게 연결된 이온을 포함하는 내부 영역, 및 이온의 분배가 정전기적인 힘(electrostatic force) 및 열적 이동(thermic movement) 사이의 균형에 의하여 결정되는 외부 영역으로 분리된다. 이러한 방식으로, 상기 표면으로부터 충분히 긴 정도의 거리의 증가를 수반하면서, 상기 용액의 전위에 도달할 만큼 상기 영역의 전위가 감소한다. 이러한 전위를 제로 전위라 한다.

전기장에서, 각각의 입자 및 이에 가장 강하게 연결된 이온들은 그들 자체가 하나의 단위체로서 움직이며, 이러한 단위체 및 그 주변 환경 사이의 경계면에서의 전위를 제타 전위라 부른다. 따라서, 제타 전위는 현탁액의 안정성 또는 콜로이드 에멀젼을 예측하고 조절하는 데에 사용될 수 있는 이러한 전하의 유용한 지표가 된다. 상기 제타 전위가 클수록, 상기 전하를 띤 입자들이 다른 입자들로부터 물리쳐지며, 이러한 힘은 집단을 이루려는 자연적인 경향을 뛰어넘는다는 사실에 기인하여 상기 현탁액은 더 안정해질 수 있다.

제타 전위는 직접적으로 측정될 수 없다. 따라서, 제타 전위가 계산될 수 있는 일종의 간접적인 측정 방법이 사용된다. 최근에 사용 및 인정되고 있는 기술은 두 개의 전극을 구비한 튜브에 희석된 콜로이드 현탁액을 넣고 상기 현탁액에 전기적 전위를 적용하는 전기 영동 이동도(electrophoretic mobility)를 이용하는 것이다. 상기 입자는 전기적 전하를 띠는 액체와 함께 반대 전하의 전극 방향으로 이동할 것이다. 상기 전기장을 따라 교체되는 속도의 비율을 m²/V.s로 나타내고, 전기 영동 이동도라고 부른다. 상기의 값을 공식(주로 사용되는 것으로 스몰루호프스키(Smoluchowski) 또는 디바이(Debye) 근사값)에 넣어 제타 전위를 계산한다.

본원 발명의 개요

상기 기술의 현재 상황을 분석하여, 본 발명자는 예정된 제타 전위의 엑소좀에 근거한 전하 인력 매커니즘을 통해 초상자성 자철석 나노 입자 (Fe₃O₄)를 이용하여 혈소판에서 유래된 엑소좀을 분리하는 방법을 개발하였다.

상기 방법은 기본적으로, 생물학적 시료 내에 포함된 음전하를 띠는 엑소좀에 전기적 인력에 의해 연결되도록, 예정된 양전하로 미리 합성된 산화철 나노 입자를 사용하는 단계; 상기 나노 입자에 연결된 엑소좀을 분리하기 위하여 상기 물질을 자기장에 노출시키는 단계; 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 엑소좀의 특성 해석(Characterization)을 함으로써 의해 상기 기술의 성공을 확인하는 단계로 이루어진다.

상기 방법은 엑소좀을 분리하고 여과하려는 목적에 적합한 것으로 나타났으며, 엑소좀의 형태적 및 구조적인 본래의 특성의 범위내에서 변화는 관찰되지 않았다.

본 발명 대한 보다 구체적인 이해를 돕기 위한 목적으로, 상기의 설명을 보충하기 위하여 종래의 방법에 대하여 상세히 설명하고 본 발명의 새로운 방법의 효과를 증명하는 분석을 나타내는 도면을 함께 제시한다.
도 1은 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 물질로부터 유래된 엑소좀을 분리하는 본원 발명의 새로운 방법을 나타내는 플로우 차트이다.
도 2는 제타 전위 이론의 함수 식을 나타낸 것이다.
도 3은 혈소판의 분해 (PBS)로부터 유래되어 트롬빈에 노출시킨 마이크로 입자(5 UI/ml)-상등액 1-에서 측정되어 얻어진 제타전위 대(versus), LPS에 노출된 혈소판으로부터 얻어진 엑소좀(100 ng/ml)-상등액 2-의 제타 전위 차이를 나타내는 그래프이다.
도 4는 대응하는 형광 표지가 표시된 도트-플롯(Dot-plot)을 나타낸 것이다. 항체와 함께 PBS 버퍼에 담긴 철 나노 입자가 약하게 검출된 첫 번째 도면은, 의미있는 형광 물질(인공 산물)이 적게 나타나 있고; 두 번째 도면은, 첫 번째 경우에서 발견되어 "백그라운드"로 이미 제거된 시료 자체가 검출된 것이다.
도 5는 혈소판 분해에 의해 얻어진 마이크로 입자와 비교하여, 엑소좀의 표면 마커, CD63, CD3, 및 CD9의 발현과, 아넥신 V 및 HLA-DR의 적은 양의 발현을 유세포 분석에 의한 차등 검출(differential detection)을 통해 분명하게 보여주는 그래프이다. 양자의 경우에서, 입자는 철 나노 입자에 의해 얻어졌다.

상기 도면을 참조하여, 본원 발명은 "산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법"에 관한 것으로, 초상자성 자철석 나노 입자 (Fe₃O₄)를 이용하여 혈소판에서 유래된 엑소좀을 분리하는 방법, 보다 구체적으로는 예정된 제타 전위의 엑소좀에 근거한 전하 인력 매커니즘을 통하여 수행되는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 생물학적 시료 내에 포함된 음전하를 띠는 엑소좀에 전기적 인력에 의해 연결되도록, 예정된 양전하로 미리 합성된 산화철 나노 입자를 사용하는 단계; 상기 나노 입자에 연결된 엑소좀을 분리하기 위하여 상기 물질을 자기장에 노출시키는 단계; 유세포 분석기(flow cytometry)를 통한 엑소좀의 특성 해석(Characterization)에 의해 상기 기술의 성공을 확인하는 단계로 이루어진다.

따라서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것으로 정의될 수 있다:

(a) 혈소판을 자극하여 전형적인(typical) 엑소좀을 발생시키고 입자를 조절하는 단계;

(b) 엑소좀(상등액 2) 및 입자(상등액 1)를 포함하는 시료를 제타 전위 측정하에 두어 충분한 음전하 전위를 노출시키되, 엑소좀과 입자가 상이한 음전하 전위를 갖는(엑소좀: -61±21.1 mV, 혈소판 분해 입자: -9.2±3 mV, 평균±ep, n=4, p<0.05) 단계;

(c) FeCl₃.6H₂O의 0.25 몰 수성용액에 수산화 암모늄을 첨가함으로써 Fe^{3 +}를 신속하게 가수 분해하는 것으로 이루어진 방법에 따라 산화철 초상자성 나노 입자의 용액을 합성하고, 그 침전물을 투석하여 극소 미립자(~200Å)를 함유한 콜로이드 현탁액을 형성하는 펩티제이션을 수행하는 단계;

(d) 계면활성제로서 노닐페놀 에톡실레이트(Nonylphenol Ethoxylate)의 존재하에서 디에틸암모늄 히드록시드에 의한 알코올성 용액의 가수 분해를 통하여, 산화철계 나노미터 크기의 입자(50-100Å)를 제조하는 단계;

(e) 엑소좀을 함유하는 2 ml 용액에 대하여 철이 200 ㎍/ml 농도로 포함된 0.1 ml의 용액의 비율로, 상기 시료를 철 나노 입자와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하는 단계;

(f) 1시간 후, 상기 물질을 LS-MidiMACS (Miltenyi사 제품) 칼럼 내에서 자기장에 노출시켜 PBS를 이용한 용리 및 물리적인 힘(상기 칼럼 자체의 피스톤)에 의하여 상기 나노 입자와 연결된 상기 엑소좀을 분리시키는 단계;

(g) 유세포 분석기(Flow cytometry(CMF))를 수행함으로써, CD9의 약간의 발현 및 아넥신(Annexin) V의 매우 적은 양의 발현과 함께, CD63의 높은 발현(도 4)을 통하여 엑소좀의 수득(도 3)을 확인하는 단계.

본원 명세서에 제시된 신규한 방법은, 독창적인 방법의 공정을 통하여 초원심분리 공정을 수행하는 동안 끌려온 단백질을 오염시키고 마이크로 입자의 초미세구조를 변형시키는 원심 분리 및 여과를 필요로 하지 않으며 펠렛을 형성함이 없이 엑소좀을 빠르게 수득할 수 있다는 점에서, 엑소좀의 분리에 관한 상당한 진보를 나타낸다. 한편, 철 나노 입자가 중간에 첨가된다. 철 나노 입자가 단지 엑소좀의 외부 표면에 연결되는 것인지, 아니면 엑소좀에 의해 결합되는 것인지는 아직 분명하지 않다. 이러한 내용은 철 물질을 분리하는 방법의 후속전인 개발에 의해 설명될 수 있을 것이다.

본 특허청구범위에서 사용된 용어는 객관적으로 해석하되, 제한적인 의미로 해석되지 아니하며, 본 특허청구범위에서 명백히 언급된 기본 원리로부터 벗어남이 없이 본원 발명의 세부적인 구조 및 형태를 변경하여 수행하는 것이 가능하다.

Claims (5)

1. 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법에 있어서, 상기 방법은 초상자성 자철석 나노 입자(Fe₃O₄)를 이용하는 혈소판을 포함하며, 상기 방법은 예정된 양전하를 갖도록 미리 합성된 산화철 나노 입자가, 생물학적 시료 내에 포함된 음전하를 띠는 엑소좀에 전기적 인력에 의해 연결되는, 예정된 제타 전위의 엑소좀에 근거한 전하 인력 매커니즘을 통해 수행되고, 상기 물질을 자기장에 노출시켜 상기 나노 입자에 연결된 엑소좀을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
   (a) 혈소판을 자극하여 전형적인(typical) 엑소좀을 발생시키고 입자를 조절하는 단계;
   (b) 엑소좀(상등액 2) 및 입자(상등액 1)를 포함하는 시료를 제타 전위 측정하에 두어 충분한 음전하 전위를 노출시키되, 엑소좀과 입자가 상이한 음전하 전위를 갖는(엑소좀: -61±21.1 mV, 혈소판 분해 입자: -9.2±3 mV, 평균±ep, n=4, p<0.05) 단계;
   (c) FeCl₃.6H₂O의 0.25 몰 수성용액에 수산화 암모늄을 첨가함으로써 Fe^{3 +}를 신속하게 가수 분해하는 것으로 이루어진 방법에 따라 산화철 초상자성 나노 입자의 용액을 합성하고, 그 침전물을 투석하여 극소 미립자(~200Å)를 함유한 콜로이드 현탁액을 형성하는 펩티제이션을 수행하는 단계;
   (d) 계면활성제로서 노닐페놀 에톡실레이트(Nonylphenol Ethoxylate)의 존재하에서 디에틸암모늄 히드록시드에 의한 알코올성 용액의 가수 분해를 통하여, 산화철계 나노미터 크기의 입자(50-100Å)를 제조하는 단계;
   (e) 엑소좀을 함유하는 2 ml 용액에 대하여 철이 200 ㎍/ml 농도로 포함된 0.1 ml의 용액의 비율로, 상기 시료를 철 나노 입자와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하는 단계;
   (f) 1시간 후, 상기 물질을 LS-MidiMACS (Miltenyi사 제품) 칼럼 내에서 자기장에 노출시켜 PBS를 이용한 용리 및 물리적인 힘(상기 칼럼 자체의 피스톤)에 의하여 상기 나노 입자와 연결된 상기 엑소좀을 분리시키는 단계;
   (g) 유세포 분석기(Flow cytometry(CMF))를 수행함으로써, CD9의 약간의 발현 및 아넥신(Annexin) V의 매우 적은 양의 발현과 함께, CD63의 높은 발현을 통하여 엑소좀의 수득을 확인하는 단계.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 혼합된 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 얻는 것을 특징으로 하는, 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 분리되지 않은 형태의 엑소좀을 얻는 것을 특징으로 하는, 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 단백질성 물질과 분리되지 않은 엑소좀을 얻는 것을 특징으로 하는, 산화철 나노 입자를 이용하여 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
   

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