CN116687966A - 一种治疗脚气的药剂、分离方法及盛纳装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗菌药物技术领域，公开了一种治疗脚气的药剂、分离方法及盛纳装置，所述治疗脚气的药剂包含银纳米粒子的植物细胞外囊泡。所述治疗脚气的药剂的分离方法包括以下步骤：将硝酸银溶液与植物源细胞外囊泡分离基质混合孵育，并添加硼氢化钠溶液；孵化过程中银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中杂质，通过离心方法分离细胞外囊泡，在此分离条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离。既实现了具有抗真菌能力的植物源细胞外囊泡的高效分离，又实现了植物源细胞外囊泡与银纳米粒子的协同抗真菌功能，利用该方法获得的植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物具有高效的、广谱抗真菌效果，对于脚气真菌感染的治疗有着显著的效果。

Description

一种治疗脚气的药剂、分离方法及盛纳装置

技术领域

本发明属于抗菌药物技术领域，尤其涉及一种治疗脚气的药剂、分离方法及盛纳装置。

背景技术

近期，植物来源的细胞外囊泡在抗真菌方面表现出巨大优势。相比于单一的抗真菌药物，植物源细胞外囊泡包含多种抗真菌成份(如小分子、核酸、抗菌肽等)，其抗真菌效果更佳。此外，植物源细胞外囊泡具有优良的生物相容性，安全性更高。但是，植物源细胞外囊泡应用于临床抗真菌病例中还存在问题。首先，植物源细胞外囊泡缺乏有效的分离纯化手段，其临床转化面临规模化量产的问题。目前超高速离心方法是细胞外囊泡分离的“金标准”方法，虽然该方法能够获得纯度较高的细胞外囊泡，但是该分离方法所需设备条件较高，分离过程繁琐，而且分离效率较低(甚至低于5％)。相比而言，商业化分离试剂盒操作简便，且细胞外囊泡分离效率高，但是试剂盒成本很高，不适于临床转化应用。其他分离方法如色谱法、微流控法等都很难实现细胞外囊泡的规模化分离。总之，目前细胞外囊泡分离缺乏高效、简单的手段。其次，目前报道的具有抗真菌能力的植物源细胞外囊泡不具备广谱性，导致其应用范围受限。植物源细胞外囊泡主要依赖其携带的抗真菌成份实现抗真菌功能。特别是植物源细胞外囊泡携带的小分子核酸在抗真菌方面具有重要功能。这一抗真菌机制导致特定的植物源细胞外囊泡只能杀灭某些种类的真菌，极大限制了植物源细胞外囊泡的应用范围。因此，植物源细胞外囊泡真正应用于临床需要解决其高效分离纯化和广谱抗真菌两大问题。

另外目前市场上脚气治疗产品形态大多分为两类，一类为膏状脚气治疗产品，另一种为液体喷雾式脚气治疗产品。这两类产品形态在使用时存在一些缺点，膏状类脚气治疗产品在使用时患者一般用手或棉签均匀涂抹到病患处，因脚气为真菌感染疾病，易传染，如果用手将药膏涂抹到病患处，极易造成交叉感染，从而导致患者感染手癣和股癣等真菌性皮肤疾病；如果采用棉棒方式涂抹，大部分药物会附着在棉棒上，极易造成药物的浪费。液体喷雾式脚气产品在使用时，喷嘴喷出药物时呈现一个扇形的喷雾，喷嘴距离病患处较远喷雾时，病患处所能喷的药物相对较少，以致达不到相应的治疗效果，且未喷到病患处的药物就白白浪费掉了；如果距离病患处较近进行喷雾，因喷嘴一次喷雾的药物量是一定的，就会导致除附着在病患表面药物有效外，其他药物就会浪费掉。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：脚气治疗产品在使用时易传染，导致患者感染手癣和股癣等真菌性皮肤疾病。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种治疗脚气的药剂、分离方法及盛纳装置。

本发明是这样实现的，一种治疗脚气的药剂，所述治疗脚气的药剂包含银纳米粒子的植物细胞外囊泡，植物细胞外囊泡为具有抗真菌能力植物分泌于细胞外的囊泡成份，其包含蛋白质、脂质、糖类、基因等众多成份，这些成份相互协同，具有抗真菌能力，其中银纳米粒子与植物细胞外囊泡的质量比为1：1-1：10000。

进一步，所述治疗脚气的药剂的分离方法包括以下步骤：

1)将硝酸银溶液与植物源细胞外囊泡分离基质混合孵育，并添加硼氢化钠溶液；

2)取一定量的植物材料并清洗干净，加入PBS缓冲液并震荡，将植物用研磨器研磨破碎。待破碎结束后，离心并收集上清液，同时对上清液进行抽滤除杂，获得粗提液。利用BCA试剂盒测定粗提液的蛋白质含量，并利用该蛋白质含量实现对粗提液的间接定量；

3)取60ml粗提液于圆底烧瓶中，放入恒温磁力搅拌器中，调节温度为25-60℃，加热并搅拌；

4)在上述溶液中加入1-4000μL柠檬酸钠作为稳定剂，再取浓度为0.1M硝酸银1-1200μL加入其中(银离子与植物细胞外囊泡的质量比为1：1-1：10000)，温度控制在25-60℃，持续搅拌；

5)在上述溶液中，快速加入1-600μL浓度为1M硼氢化钠溶液，可以观察到溶液迅速变为橙色，温度控制在25-60℃，持续搅拌1-24h，使硼氢化钠完全反应；

6)向上述溶液中加入2.0M的羟胺1-600μL，并逐滴加入0.1M硝酸银溶液1-1500μL，使银纳米粒子继续生长，可观察逐渐增长的银纳米颗粒使烧瓶中反应溶液颜色加深；

7)将温度控制在25-60℃，匀速搅拌，反应1-24h；

8)反应结束后，将上述溶液进行离心，离心速度分别为500-1000×g、1000-5000×g、5000-10000×g、10000-15000×g，并分别收取离心产物；

9)孵化过程中银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中杂质，通过离心方法分离细胞外囊泡，在此分离条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离。

本发明的另一目的在于提供一种所述治疗脚气的药剂的盛纳装置，所述盛纳装置包括：脚气棒头和脚气棒柄；脚气棒柄设计为中空设计，脚气棒头通过折断位与脚气棒柄连接。

进一步，所述脚气棒柄其内部灌有脚气药剂，同时在脚气棒柄前端有的折断位。

进一步，所述脚气棒头内部进行了开槽处理，外部缠绕消毒棉。

进一步，所述脚气棒头的结构边角弧形处理。

本发明的另一目的在于提供一种盛纳装置的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：当沿着折断位将脚气棒柄折断后，其内的脚气药剂在重力的作用下流到脚气棒头，脚气棒头缠绕的消毒棉将脚气药剂进行吸附住，然后使用将脚气药剂涂抹到病患处。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：银纳米粒子是一种具有广谱抗真菌能力的纳米材料，其具有良好的生物相容性，在生物医药领域具有广泛应用。现有研究证明，银纳米粒子与生物大分子(如蛋白质等)具有良好的结合能力。植物细胞外囊泡表面具有丰富的蛋白质、糖类等生物大分子，为银纳米粒子的结合提供了可能。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：本发明将硝酸银溶液与植物源细胞外囊泡分离基质混合孵育，并添加硼氢化钠溶液，孵化过程中银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中杂质，但是细胞外囊泡结合的银纳米粒子数量较多。同时，银纳米粒子结合细胞外囊泡会增加整个体系的质量，此时通过常规离心方法可以分离细胞外囊泡，而且在此分离条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离，因此该方法分离获得的植物源细胞外囊泡纯度高。利用本发明的方法获得的植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物兼具了植物源细胞外囊泡和银纳米粒子两者的抗菌能力。植物源细胞外囊泡自身携带抗真菌成份，而银纳米粒子可以利用纳米尺寸效应或者其释放的银离子实现抗真菌功能。更为重要的是，两者的结合具备协同效应，银纳米粒子对真菌膜的作用会促进植物源细胞外囊泡携带成份进入真菌内部，从而实现更好的抗真菌效果。即植物源细胞外囊泡与银纳米粒子的结合实现了“1+1＞2”的抗真菌效果。

本发明提出的一种基于银纳米粒子的植物细胞外囊泡分离方法，既实现了具有抗真菌能力的植物源细胞外囊泡的高效分离，又实现了植物源细胞外囊泡与银纳米粒子的协同抗真菌功能，利用该方法获得的植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物具有高效的、广谱抗真菌效果，对于脚气真菌感染的治疗有着显著的效果。

附图说明

图1是本发明实施例提供的治疗脚气的药剂的分离方法流程图；

图2是本发明实施例提供的治疗脚气的药剂的分离方法原理图；

图3是本发明实施例提供的盛纳装置结构示意图；

图4是本发明实施例提供的脚气棒头结构示意图；

图5是本发明实施例提供的盛纳装置使用效果图；

图6是本发明实施例提供的伊曲康唑和植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物对白色假丝酵母菌、黑曲霉、镰孢菌三种真菌的90％最低抑菌浓度图。

图中：1、脚气棒头；2、脚气棒柄；3、脚气药剂；4、折断位；5、开槽；6、消毒棉。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的治疗脚气的药剂包含银纳米粒子的植物细胞外囊泡。

如图1所示，本发明实施例提供的治疗脚气的药剂的分离方法包括以下步骤：

S101：将硝酸银溶液与植物源细胞外囊泡分离基质混合孵育，并添加硼氢化钠溶液；

S102：孵化过程中银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中杂质，通过离心方法分离细胞外囊泡，在此分离条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离。

如图2和图3所示，本发明实施例提供的盛纳装置包括：脚气棒头1和脚气棒柄2；脚气棒柄2设计为中空设计，其内部灌有脚气药剂3，同时在脚气棒柄2前端有的折断位4，折断位4处做了相应的工艺处理，使其在使用时很容易进行折断；在脚气棒头1部分内部进行了开槽5处理，外部缠绕了消毒棉6，脚气棒头1部分的结构边角做了弧形处理，以免在使用时划伤皮肤。

如图4所示，当沿着折断位4将脚气棒柄2折断后，其内的脚气药剂3在重力的作用下流到脚气棒头1，进而脚气棒头1部分缠绕的消毒棉6将脚气药剂3进行吸附住，然后患者就可以直接使用将脚气药剂3涂抹到病患处；患者使用完脚气棒头1后直接将其扔到垃圾桶即可，此设计有效避免了患者交叉感染，同时解决了脚气药剂3的浪费问题。

本发明采用白色假丝酵母菌、黑曲霉、镰孢菌三种真菌对植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物的抗真菌效果进行了检测，并与常用抗真菌药物伊曲康唑进行了比较。

本发明实施例的两个具体实施例为：

实施例1：

步骤一：准备含有硝酸银的溶液，与植物源细胞外囊泡分离基质混合并孵育，并添加硼氢化钠溶液。这个步骤中，硝酸银和硼氢化钠会反应生成银纳米粒子。

步骤二：选择一定量的植物材料，清洗后加入PBS缓冲液并震荡，然后用研磨器将植物研磨破碎。离心后收集上清液，并进行抽滤除杂，获得粗提液。用BCA试剂盒测定粗提液的蛋白质含量，用这个蛋白质含量可以实现对粗提液的间接定量。

步骤三：将粗提液放入恒温磁力搅拌器中，控制温度为25-60℃，加热并搅拌。

步骤四：加入柠檬酸钠作为稳定剂，然后添加硝酸银(银离子与植物细胞外囊泡的质量比为1：1-1：10000)，控制温度在25-60℃，持续搅拌。

步骤五：在溶液中，快速加入硼氢化钠溶液，溶液会迅速变为橙色。持续搅拌1-24小时，使硼氢化钠完全反应。

步骤六：在溶液中加入羟胺，并逐滴加入硝酸银溶液，使银纳米粒子继续生长，可以观察到银纳米粒子的颜色加深。

步骤七：控制温度在25-60℃，持续搅拌1-24小时。

步骤八：反应结束后，将溶液进行离心，分别在500-1000×g、1000-5000×g、5000-10000×g、10000-15000×g的离心速度下离心，并收取离心产物。

步骤九：在孵化过程中，银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中的杂质，通过离心方法分离细胞外囊泡。在这个离心条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离，从而得到富含银纳米粒子的植物细胞外囊泡。

实施例2：

步骤一：准备含有硝酸银的溶液，与植物源细胞外囊泡分离基质混合并孵育，这一步骤主要是为了让银离子和植物细胞外囊泡进行足够的接触和反应。

步骤二：在一个单独的实验瓶中，准备柠檬酸钠溶液并添加到步骤一的混合溶液中。柠檬酸钠在这里充当稳定剂，可以防止银纳米粒子在生成过程中过早聚集。

步骤三：选择一定量的植物材料，清洗后加入PBS缓冲液并震荡，然后用研磨器将植物研磨破碎。离心后收集上清液，并进行抽滤除杂，获得粗提液。

步骤四：将粗提液放入恒温磁力搅拌器中，控制温度为25-60℃，加热并搅拌。

步骤五：将步骤一和步骤二的混合溶液缓慢加入步骤四的搅拌器中。然后快速加入硼氢化钠溶液，这时溶液会迅速变为橙色，表示银纳米粒子开始生成。持续搅拌1-24小时，使硼氢化钠完全反应。

步骤六：在溶液中加入羟胺，并逐滴加入硝酸银溶液，这一步骤可以促使银纳米粒子的继续生长。

步骤七：控制温度在25-60℃，持续搅拌1-24小时。

步骤八：反应结束后，将溶液进行离心，分别在500-1000×g、1000-5000×g、5000-10000×g、10000-15000×g的离心速度下离心，并收取离心产物。

步骤九：在孵化过程中，银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中的杂质。通过离心方法分离细胞外囊泡，在这个离心条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离，从而得到富含银纳米粒子的植物细胞外囊泡。

本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

如图6所示，通过与抗真菌药物伊曲康唑比较，植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物具有比伊曲康唑更低的90％最低抑菌浓度，表明植物源细胞外囊泡/银纳米粒子复合物具有更优异的抗真菌效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种治疗脚气的药剂，其特征在于，包含银纳米粒子的植物细胞外囊泡，植物细胞外囊泡为具有抗真菌能力植物分泌于细胞外的囊泡成份，成份相互协同，具有抗真菌能力，其中银纳米粒子与植物细胞外囊泡的质量比为1：1-1：10000。

2.如权利要求1所述治疗脚气的药剂的分离方法，其特征在于，所述治疗脚气的药剂的分离方法包括以下步骤：

1)将硝酸银溶液与植物源细胞外囊泡分离基质混合孵育，并添加硼氢化钠溶液；

2)取一定量的植物材料并清洗干净，加入PBS缓冲液并震荡，将植物用研磨器研磨破碎；待破碎结束后，离心并收集上清液，同时对上清液进行抽滤除杂，获得粗提液，利用BCA试剂盒测定粗提液的蛋白质含量，并利用该蛋白质含量实现对粗提液的间接定量；

(3)取60ml粗提液于圆底烧瓶中，放入恒温磁力搅拌器中，调节温度为25-60℃，加热并搅拌；

(4)加入1-4000μL柠檬酸钠作为稳定剂，再取浓度为0.1M硝酸银1-1200μL加入其中(银离子与植物细胞外囊泡的质量比为1：1-1：10000)，温度控制在25-60℃，持续搅拌；

(5)在上述溶液中，快速加入1-600μL浓度为1M硼氢化钠溶液，可以观察到溶液迅速变为橙色，温度控制在25-60℃，持续搅拌1-24h，使硼氢化钠完全反应；

(6)溶液中加入2.0M的羟胺1-600μL，并逐滴加入0.1M硝酸银溶液1-1500μL，使银纳米粒子继续生长，可观察逐渐增长的银纳米颗粒使烧瓶中反应溶液颜色加深；

(7)将温度控制在25-60℃，匀速搅拌，反应1-24h；

(8)反应结束后，将上述溶液进行离心，离心速度分别为500-1000×g、1000-5000×g、5000-10000×g、10000-15000×g，并分别收取离心产物；

(9)孵化过程中银纳米粒子会结合植物源细胞外囊泡和基质中杂质，通过离心方法分离细胞外囊泡，在此分离条件下，杂质/银纳米粒子复合物不能分离。

3.一种如权利要求1所述治疗脚气的药剂的盛纳装置，其特征在于，所述盛纳装置包括：脚气棒头和脚气棒柄；脚气棒柄设计为中空设计，脚气棒头通过折断位与脚气棒柄连接。

4.如权利要求3所述的盛纳装置，其特征在于，所述脚气棒柄其内部灌有脚气药剂，同时在脚气棒柄前端有的折断位。

5.如权利要求3所述的盛纳装置，其特征在于，所述脚气棒头内部进行了开槽处理，外部缠绕消毒棉。

6.如权利要求3所述的盛纳装置，其特征在于，所述脚气棒头的结构边角弧形处理。

7.一种如权利要求3所述盛纳装置的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：当沿着折断位将脚气棒柄折断后，其内的脚气药剂在重力的作用下流到脚气棒头，脚气棒头缠绕的消毒棉将脚气药剂进行吸附住，然后使用将脚气药剂涂抹到病患处。