CN109602006B - 一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物活性物提取技术领域，具体涉及一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，还涉及上述的活性物的应用。本发明的方法包括以下的步骤：外植体灭菌、切片、愈伤组织培养与筛选、细胞悬浮液培养、浓缩干燥得植物细胞活性物Ⅰ；超声提取后浓缩干燥得植物细胞活性物Ⅱ。本发明的方法制备获得的牡丹干细胞活性物可广泛应用于食品及化妆品原料中。本发明的有益效果在于，采用本发明的方法提纯和培养上述的含有牡丹干细胞的活性物，其提取效率高，大大降低牡丹制品的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于植物活性物提取技术领域，具体涉及一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，还涉及上述的活性物的应用。
背景技术
植物是许多重要药用化学物质的来源。许多植物含有抗病毒、抗菌、抗癌和抗氧化等生理活性的化合物，对人类的肿瘤、衰老、心血管等多种疾病的防治具有重要意义。
牡丹是我国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和1500多年的人工栽培历史。牡丹花，花大型美，花朵雍容华贵、华贵，被誉为花中之王。牡丹浑身是宝，但仅根和花做为中药材在中国古医书中记载。但牡丹产相对于玫瑰产业来说仍处于相对落后水平。
获取植物次生代谢产物的方法有许多种，目前多数是从药用植物中直接提取。但是很多药用生长缓慢，次生代谢产物的量低而且许多仅存于特定的植物器官中，难以适应现代制药工业生产的需求，采用化学合成也难以实现原料供应，因为很多次生代谢产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径繁杂，合成成本高。传统的植物细胞培养在工业化生产中还存在很多局限性，本发明提供一种遗传稳定性高，增长快、收益率高的方法，更利于其商业化生产，解决了传统细胞培养存在的易变异、细胞聚集等瓶颈问题。
CN107836349A披露了一种植物干细胞培养方法，其特征在于，所述植物干细胞培养方法的具体步骤如下：
S1、原料选择，挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽、无霉变腐败的玉米，先使用清水对其冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，使用消毒液对其进行消毒，消毒完成后使用烘干机对其进行干燥处理直至水分完全去除；
S2、种子培育，将处理后的种子种入培养基中，在温度为22℃-25℃，湿度为95％-98％的环境下培养3-5天使其发芽；
S3、种子处理，待到种子发芽4-5天后，将含有静止中心的根组织收集起来，去掉根端的根冠，从切口开始截取1-1.2mm长作为外植体；
S4、诱导分离，将外植体放入诱导培养基中，在无菌无毒、恒温的条件下培养25天后，静止中心干细胞被分离出；
S5、培养增殖，将静止中心干细胞放入增殖培养基中，在无菌无毒、恒温的条件下培养5-20天后就可得到大量静止中心干细胞。
以上的方法是针对于玉米种子的干细胞培养，其培养的步骤主要是通过种子培育、处理、诱导和增殖来实现的，而上述的方法并不适用于牡丹干细胞的培养和提纯方法。
CN108219023A公开了一种牡丹叶中抗氧化活性物料的提取及其制备粉末的方法，牡丹叶中抗氧化活性物料的提取方法，其特征在于，具体的操作步骤如下：
步骤1.从牡丹叶中提取具有抗氧化活性的物料；
步骤1.1称取牡丹叶适量，加入纯化水，浸泡得到物料I；
步骤1.2将物料I减压低温回流提取，然后再加入纯化水，继续减压低温回流提取，合并两次的提取液，记作物料II；
步骤1.3将物料II减压浓缩后，高速离心并收集上清液，记作物料III；
步骤1.4将物料III中加入无水乙醇，进行磁力搅拌后离心，收集沉淀部位，烘干得到牡丹叶粗多糖，即为抗氧化活性物料。
以上的方法仅仅是从牡丹叶中提取具有抗氧化活性的物料和牡丹叶粗多糖，对于牡丹茎、牡丹根中的活性物质的提取，上述的申请并未涉及。
整株牡丹中各个不同部位所含有的活性成分是不同的，例如，牡丹根中含有大量的丹皮酚(牡丹酚)，牡丹花中含有大量的黄酮类物质和芍药苷单萜类化合物，因此需要针对整株牡丹对其活性成分进行全面的提取，使活性物质尽可能多的包含有不同功效的成分。
发明内容
本发明提供了一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，通过该方法提取的牡丹干细胞活性物不仅纯度高，而且易于工业化生产。为牡丹产业的深加工提供更广的应用。
本发明提供的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，该方法包含下述步骤：
(1)外植体灭菌：将牡丹植株，洗净，剥离叶片，在醇溶液中振荡，然后水冲洗，再加入次氯酸钠溶液振荡，灭菌，水冲洗；
(2)切片：将(1)中灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开并切片；
(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中的切片放入基本培养基，加入糖类，培养；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中的皂质牡丹愈伤组织加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖类，摇床振荡培养，得悬浮细胞；
(5)减压浓缩，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅰ；
(6)超声提取：真空抽滤步骤(4)悬浮细胞，加入酸性醇溶液，置于超声波合成萃取仪中提取，抽滤，在残渣中加入醇溶液，继续提取；两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(7)减压浓缩至无醇，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ。
优选的，(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗0.5～1h，在超净工作台上先用体积浓度为50～80％的乙醇充分振荡15～60s，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌8～15min，最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开；花、叶片切成lcm×1cm大小，将花蕊、茎、根横切成0.9～1.1mm的薄片；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:7～20的比例加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖含量为15～45g/L的糖类，调pH6～7，放置在转速为60～120rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养15～35天，得悬浮细胞；
(6)超声提取：将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：6～18加入体积分数为40～95％的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液中含体积分数为0.1％的无机酸，然后置于超声波合成萃取仪中超声波提取，提取温度为35～60℃，提取时间为10～60min；超声频率为20～40kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(7)中，干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任一种。
更优选的，一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括以下的步骤：
(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，蘸药皂水刷洗去除表面灰尘，然后用流水冲洗0.5～1h，在超净工作台上先用体积百分比为50～80％的乙醇充分振荡15～60s，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌8～15min，最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开；花、叶片切成lcm×1cm大小，将花蕊、茎、根横切成0.9～1.1mm的薄片；
(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中切片放入基本培养基，和糖含量为15～45g/L的蔗糖、葡萄糖中的至少一种，在25℃、空气相对湿度为40～60％的培养室进行暗培养15～35天；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:7～20的比例加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖含量为15～45g/L的蔗糖、葡萄糖中的至少一种，调pH6～7，放置在转速为60～120rpm/min摇床上，在25℃的黑暗状态下，振荡培养15～35天，得悬浮细胞；
(5)减压浓缩，干燥，得牡丹干细胞活性物Ⅰ；
(6)超声提取：将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：6～18加入体积分数为40～95％的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液中含体积分数为0.1％的盐酸，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为35～60℃，提取时间为10～60min，超声频率为20～40kHz，抽滤，在残渣中以料液比为1：6～18加入体积浓度为40～95％的酸性乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(7)减压浓缩至无醇，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ，干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任一种。
优选的，步骤(3)、(4)中基本培养基为MS、B5、ER、NB、BA中的至少一种。
步骤(4)中外源植物激素为1.0～3.0mg/L 6～苄基腺嘌呤(6～BA)，1.0～3.0mg/L蔡乙酸(NAA)，0.5～1.5mg/L 2，4一二硝基苯氧乙酸(2，4～D)中的至少一种。
更优选的，步骤(6)中：
以料液比为1：10加入体积分数为60％的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液含体积分数为0.1％的盐酸，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为40℃，提取时间为30min；超声频率为25kHz，抽滤，在残渣中以料液比为1：6加入体积浓度为50％的酸性乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液。
采用上述的方法培养提纯获得的牡丹干细胞活性物在食品加工以及化妆品生产中的应用，也是本发明所要保护的范围。
本发明的有益效果在于，采用本发明的方法对牡丹中进行培养和提纯，对牡丹的花、叶片、茎段和根中的活性物分别进行培养和提取，获得了成分较全面的活性物，如挥发油、黄酮类物质、牡丹酚、烯类、酯类等，所获得的活性物具有多种功用，可广泛的应用于食品和化妆品中，尤其是所获得的抗氧化活性物质，其抗氧化活性强。
附图说明
图1为实施例1中牡丹干细胞活性物Ⅰ的照片；
图2为实施例1中牡丹干细胞活性物Ⅰ的细胞和其构成部分；
图3为牡丹干细胞活性物Ⅱ的LC-MS色谱图
图4为实施例4中进入到皮肤表皮层的牡丹干细胞活性物Ⅰ，小于100μm(细胞是深色的区域)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括下述步骤：
(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗1h，在超净工作台上先用60％乙醇充分振荡35S，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌12min。最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株选取花瓣，将花切成lcm×1cm大小的薄片；
(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中切片放入MS培养基中，加入糖含量为30g/L的蔗糖，在温度为25℃，空气相对湿度为40～60％的培养室进行暗培养15天；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:10的比例加入MS液体培养基和3.0mg/L 6～苄基腺嘌呤(6～BA)，并加入糖含量为30g/L的蔗糖、葡萄糖或混合物，调pH为6.5，放置在转速为100rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养20天，得悬浮细胞；
(5)超声提取：将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：8加入体积分数为60％的酸性乙醇溶液(含体积分数为0.1％的盐酸)，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为40℃，提取时间为30min；超声频率为25kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(6)真空抽滤步骤(4)悬浮细胞，减压浓缩，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ。
附图1牡丹干细胞活性物Ⅱ，图2牡丹干细胞活性物Ⅱ的细胞和其构成部分。
实施例2
一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包含下述步骤：
(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗1h，在超净工作台上先用60％乙醇充分振荡35S，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌12min。最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株选取牡丹叶，将牡丹叶切成lcm×1cm大小的薄片；(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中切片放入B5培养基中，加入糖含量为40g/L的蔗糖，在温度为25℃，空气相对湿度为40～60％的培养室进行暗培养18天；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料。以料液比1:10的比例加入MS液体培养基和3.0mg/L蔡乙酸(NAA)，并加入糖含量为30g/L的蔗糖、葡萄糖或混合物，调pH为6.8，放置在转速为120rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养18天，得悬浮细胞；
(5)超声提取：将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：12加入体积分数为65％的酸性乙醇溶液(含体积分数为0.1％的盐酸)，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为45℃，提取时间为35min；超声频率为30kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(6)减压浓缩至无醇，冷冻干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ。
对牡丹干细胞活性物Ⅱ进行LC-MS分析，色谱图如图3所示，本发明产品中所含有的活性物质大约有6种。确定这6种化合物的化学结构，它们分别是1：6′-O-D葡萄糖芍药内酯苷；2：芍药内酯苷；3：β-gentiobiosylpaeoniflorin；4：芍药苷；5：苯甲酸；6：芍药苷元。
实施例3
一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包含下述步骤：
(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗1h，在超净工作台上先用60％乙醇充分振荡35S，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌12min。最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株选取花蕊，将花蕊切成1mm左右的的薄片；
(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中切片放入ER培养基中，加入糖含量为40g/L的蔗糖，在温度为25℃，空气相对湿度为40％～60％的培养室进行暗培养25天；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料。以料液比1:12的比例加入ER液体培养基和0.5mg/L 2，4一二硝基苯氧乙酸(2，4～D)，并加入糖含量为40g/L的葡萄糖，调pH为6.2，放置在转速为90rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养20天，得悬浮细胞；
(5)超声提取：将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：8加入体积分数为60％的酸性乙醇溶液(含体积分数为0.1％的盐酸)，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为50℃，提取时间为25min；超声频率为20kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
(6)减压浓缩至无醇，真空烘干得牡丹干细胞活性物Ⅱ。
实施例4
一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括下述步骤：
(1)外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗1h，在超净工作台上先用60％乙醇充分振荡35S，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2％次氯酸钠溶液充分振荡灭菌12min。最后用无菌水冲洗4次备用；
(2)切片：灭菌后的植株选取花瓣，将花切成lcm×1cm大小的薄片；
(3)愈伤组织培养：取步骤(2)中切片放入MS培养基中，加入糖含量为30g/L的蔗糖，在温度为25℃，空气相对湿度为40～60％的培养室进行暗培养15天；
(4)细胞悬浮液培养：选取步骤(3)中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:10的比例加入MS液体培养基和3.0mg/L 6～苄基腺嘌呤(6～BA)，并加入糖含量为30g/L的蔗糖、葡萄糖或混合物，调pH为6.5，放置在转速为100rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养20天，得悬浮细胞；
(5)将步骤(4)悬浮细胞真空抽滤后，减压浓缩，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅰ。
实施例5
本发明的活性物质在化妆品中的应用，具体如下：
发明人根据实施例1添加0.05％制作护肤产品，对使用产品后皮肤颜色含量进行测试。选取50名志愿者对产品使用前、产品使用4周和8周后，对面部色斑区、非色斑区及左右前臂外侧进行皮肤颜色测试，结果见表1。
统计方法：t检验
显著性："+":显著性差异(p≤0.05)；"--":非显著性差异(p>0.05)
表1.产品使用前、产品使用4周及8周后皮肤颜色(L*值和ITAo值)统计结果。
由表1看出，与初始值比较，在产品使用4周及8周后，面部斑区L*值分别显著增加11.54和13.88，ITAo值显著增加3.93和5.86；在产品使用8周后面部非斑区L*值和ITAo值分别显著增加4.66和2.09。与非斑区比较，在产品使用4周后，面部斑区L*值和ITAo值呈显著性改善。
与初始值比较，在产品使用4周及8周后，手臂产品区L*值分别显著增加7.15和13.88，ITAo值分别显著增加3.93和5.86，手臂空白区L*值分别未显著增加0.11和-0.01，ITAo值分别未显著增加0.10和0.36；与空白区相比，手臂产品区L*值和ITAo值在产品使用4周和8周后均呈显著性改善。
实施例6
实施例1～4中的活性物质的抗氧化能力的测定
采用DPPH法测定实施例2-3中的产品抗氧化能力，具体方法如下：精确称取不同浓度的样品2ml置于试管中，再加入2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，摇匀，室温放置30分钟，测定A517,即为样品A样品(用2mL乙醇与2mL样品溶液混匀后调零，以排除试样本身颜色的影响)，向2mL乙醇中加入2mLDPPH溶液，测定A517，即为A对照，根据以下的公式计算样品的清除率：
清除率η％＝(A对照—A样品)/A对照×100％
表2实施例2～3中不同浓度的样品对DPPH自由基的清除率
注：以上的1％、2％、3％是指的各样品的质量浓度；
本发明通过测实施例中的产品清除DPPH自由基能力，发现各样品对于DPPH自由基的清除能力都较强。高浓度组对于DPPH自由基清除率达到了88％左右。
Claims (7)
1.一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括以下的步骤：
（1）外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，用毛笔蘸药皂水刷洗表面灰尘，然后用流水冲洗0.5～1h，在超净工作台上先用体积浓度为50～80%的乙醇充分振荡15～60s，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2%次氯酸钠溶液充分振荡灭菌8～15min，最后用无菌水冲洗4次备用；
（2）切片：灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开；花、叶片切成lcm×1cm大小，将花蕊、茎、根横切成0.9～1.1mm的薄片；
（3）愈伤组织培养：取步骤（2）中的切片放入基本培养基，加入糖类，培养；
（4）细胞悬浮液培养：选取步骤（3）中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:7～20的比例加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖含量为15～45g/L的糖类，调pH6～7，放置在转速为60～120rpm/min摇床上，在25℃黑暗状态下，振荡培养15～35天，得悬浮细胞；
其中，外源植物激素为1.0～3.0mg/L 6～苄基腺嘌呤(6～BA )，1.0～3.0mg/L蔡乙酸(NAA)，0.5～1.5mg/L 2，4一二硝基苯氧乙酸(2，4～D)中的至少一种；
（5）真空抽滤步骤（4）悬浮细胞，减压浓缩，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅰ；
（6）超声提取：真空抽滤步骤（4）悬浮细胞，加入酸性醇溶液，置于超声波合成萃取仪中提取，抽滤，在残渣中加入醇溶液，继续提取；两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
（7）减压浓缩至无醇，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ。
2.如权利要求1所述的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，（6）超声提取：将步骤（4）悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：6～18加入体积分数为40～95%的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液中含体积分数为0.1%的无机酸，然后置于超声波合成萃取仪中超声波提取，提取温度为35～60℃，提取时间为10～60 min；超声频率为20～40 kHz，抽滤，在残渣中加入乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液。
3.如权利要求1所述的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，（7）中，干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任一种。
4.如权利要求1所述的一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，包括以下的步骤：
（1）外植体灭菌：选取生长健壮、无病虫害的完整牡丹植株，洗净，剥离叶片留至2～3片，蘸药皂水刷洗去除表面灰尘，然后用流水冲洗0.5～1h，在超净工作台上先用体积百分比为50～80%的乙醇充分振荡15～60 s，倒掉乙醇后，立即用无菌水冲洗1～2次，再用2%次氯酸钠溶液充分振荡灭菌8～15min，最后用无菌水冲洗4次备用；
（2）切片：灭菌后的植株将花、叶片、茎段和根分开；花、叶片切成lcm×1cm大小，将花蕊、茎、根横切成0.9～1.1mm的薄片；
（3）愈伤组织培养：取步骤（2）中切片放入基本培养基，和糖含量为15～45g/L的蔗糖、葡萄糖中的至少一种，在25℃、空气相对湿度为40～60%的培养室进行暗培养15～35天；
（4）细胞悬浮液培养：选取步骤（3）中生长旺盛、结构疏松、状态相似的皂质牡丹愈伤组织，作为细胞悬浮培养的材料，以料液比1:7～20的比例加入液体培养基和外源植物激素，并加入糖含量为15～45g/L的蔗糖、葡萄糖中的至少一种，调pH6～7，放置在转速为60～120rpm/min摇床上，在25℃的黑暗状态下，振荡培养15～35天，得悬浮细胞；
（5）减压浓缩，干燥，得牡丹干细胞活性物Ⅰ；
（6）超声提取：将步骤（4）悬浮细胞真空抽滤后，以料液比为1：6～18加入体积分数为40～95%的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液中含体积分数为0.1%的盐酸，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为35～60℃，提取时间为10～60 min，超声频率为20～40kHz，抽滤，在残渣中以料液比为1：6～12加入体积浓度为40～95%的酸性乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液；
（7）减压浓缩至无醇，干燥得牡丹干细胞活性物Ⅱ，干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干中的任一种。
5.如权利要求4所述一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，步骤（3）、（4）中基本培养基为MS、B5、ER、NB、BA中的至少一种。
6.如权利要求4所述一种牡丹干细胞活性物的培养提纯方法，其特征在于，步骤（6）中以料液比为1：10加入体积分数为60%的酸性乙醇溶液，该乙醇溶液含体积分数为0.1%的盐酸，置于超声波合成萃取仪中提取，进行超声波提取，提取温度为40℃，提取时间为30 min；超声频率为25 kHz，抽滤，在残渣中以料液比为1：6加入体积分数为60%的酸性乙醇溶液，继续提取，其提取条件同前一次超声波提取；待两次超声波提取之后，合并两次的提取液；并减压浓缩至无醇，得浓缩液。
7.采用权利要求1的方法培养提纯获得的牡丹干细胞活性物在食品加工以及化妆品生产中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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