JP2006208119A - 試料の安定化法 - Google Patents

Abstract

【課題】 高密度リポタンパク質（High-density lipoprotein;ＨＤＬ）を含有する試料の安定化法を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）で表される化合物を試料に添加し、試料中の酸化されたＨＤＬの酸化度合いを安定化することを特徴とする酸化ＨＤＬの安定化法を提供する。
【化１】

（Ｉ）
（式中、Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺは、水素原子、水酸基、カルボキシル基、糖残基を示す。）
また、上記方法により安定化された酸化ＨＤＬを含有する試料、酸化ＨＤＬを含有する試料を保管する際、上記方法により安定化された試料として保管する、酸化ＨＤＬを含有する試料の保管法、及び酸化ＨＤＬを免疫学的測定法により測定する方法において、試料として上記記載の方法により安定化した酸化ＨＤＬを含有する試料を使用する、酸化ＨＤＬの免疫学的測定法も提供する。

Description

本発明は、高密度リポタンパク質（High-density lipoprotein;ＨＤＬ）を含有する試料の安定化法に関するものである。

酸化ストレスは、生体の構造や機能を担っている脂質、タンパク質、核酸などを酸化し、生体の構造や機能に損傷を与えることにより、癌、生活習慣病など数多くの疾患の発症に関与している。

なかでも、循環器系疾患発症のリスクファクターとして知られる動脈硬化の進行は、酸化された低密度リポタンパク質（Low-density lipoprotein;ＬＤＬ）との関連が強く示唆されている。酸化ＬＤＬ(もしくは変性ＬＤＬ)は、マクロファージに取り込まれ、動脈壁に蓄積するため、酸化ストレスまたは動脈硬化のリスクマーカーとしての酸化ＬＤＬが広く研究されている。

一方、循環器系疾患発症の予防因子として知られるＨＤＬは、ＬＤＬよりも酸化感受性が高く、自らが酸化されることによってＬＤＬの酸化を抑制したり、増悪因子としての酸化ＬＤＬの作用効果を中和するなど、酸化ストレスのスカベンジャーとしての役割が注目されている。すなわち、酸化ＨＤＬは、酸化ストレスの亢進や酸化ＬＤＬなどの増悪因子の増加を予測または示唆する鋭敏なマーカーとして期待されている。

Kohnoら、2000, Clin Biochem, 33, 243-53 Whalleyら、1990, Biochem. Pharmacol., 39, 1743-1750

従来、このような酸化ＨＤＬを特異的に測定する方法としては、免疫学的測定法等が報告されている。しかしながら、ＨＤＬは前述したとおり、容易に酸化されることから、免疫学的測定法等で正確な測定値を得るためには、試料中のＨＤＬの酸化度合いを採取時以降は変化させずに安定化すること（以下、単に「安定化」と言うこともある）が必要とされていた。

たとえば、酸化ＬＤＬを測定する際、ＥＤＴＡ、ビタミンＥ、テオフィリン、ジピダモール、２，６−ジ−ｔブチル−ｐ−クレゾール（buthylated hydroxytoluene;ＢＨＴ）などの化合物を試料中に添加し、試料中の酸化ＬＤＬを安定化する方法が報告されている（Kohnoら、2000, Clin Biochem, 33, 243-53）。

本発明者らは、酸化ＬＤＬの安定化剤として報告されている上記化合物が酸化ＨＤＬの安定化剤としても利用できるのではないかと考え検討した結果、残念ながらこれらの化合物はＨＤＬの酸化を抑制する効果は認められず、安定化剤としては利用できないことを確認した。その理由としては、ＬＤＬとＨＤＬは共にリポタンパク質であるものの、ＨＤＬの酸化抵抗性はＬＤＬより低く、ＨＤＬはリポタンパク質に含まれている抗酸化物質であるビタミンＥやユビキノール１０の含量も低く、しかもＨＤＬの主要な蛋白成分であるアポリポタンパク質ＡＩが高い酸化感受性を有すること等が考えられるが、確証は得られていない。

また、生体内におけるＬＤＬ酸化の原因の１つとしては、マクロファージによる酸化も指摘されている。すなわち、Whalleyら（1990, Biochem. Pharmacol., 39, 1743-1750）は、モリン、フィセチン、クエルセチン及びゴシペチンがマクロファージによる酸化ＬＤＬの取り込みを抑制し、この抑制はこれら化合物の抗酸化作用によるものと推測している。

しかしながら、これらの化合物がどの程度ＬＤＬの酸化を抑制するのかの定量的な評価は行われていない。また、上述したように、ＥＤＴＡ、ビタミンＥ、テオフィリン、ジピダモール、ＢＨＴなどのように、酸化ＬＤＬの安定化には効果を示すが、酸化ＨＤＬの安定化には全く効果を示さない例もあり、モリン、フィセチン、クエルセチン又はゴシペチンが酸化ＨＤＬの安定剤として利用できるか否かを予想することは全く不可能なことである。さらに、仮に、モリン、フィセチン、クエルセチン又はゴシペチンが酸化ＨＤＬの安定剤として利用できるとしても、免疫学的測定法等の測定に悪影響を及ぼす可能性もあり、上記報告ではそのような検討は全く行われていないし、その示唆もない。

このような状況下、本発明者らは、酸化ＨＤＬの安定化剤として利用可能な化合物を見出すべく、種々の化合物をスクリーニングした結果、フラバノール骨格を有する特定の化合物が酸化ＨＤＬの安定剤として利用できることを見出し、これを基に本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りである。

［１］下記式（Ｉ）で表される化合物を試料に添加し、試料中の酸化されたＨＤＬの酸化度合いを安定化することを特徴とする酸化ＨＤＬの安定化法。

（Ｉ）
（式中、Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺは、水素原子、水酸基、カルボキシル基、糖残基を示す。）

［２］Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺが水素原子又は水酸基である化合物を使用する、［２］記載の方法。
［３］Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３及びＺが水素原子又は水酸基で、Ｙが糖残基である化合物を使用する、［１］記載の方法。

［４］クエルセチン、モリン、ルチンから選ばれた化合物を使用する、［１］記載の方法。
［５］２種以上の化合物を併用する、［１］記載の方法。

［６］クエルセチン及び／又はルチンを使用する、［１］記載の方法。
［７］血液試料である、［１］記載の方法。

［８］上記［１］記載の方法により安定化された酸化ＨＤＬを含有する試料。
［９］酸化ＨＤＬを含有する試料を保管する際、上記［１］記載の方法により安定化された試料として保管する、酸化ＨＤＬを含有する試料の保管法。
［１０］酸化ＨＤＬを免疫学的測定法により測定する方法において、試料として上記［１］記載の方法により安定化した酸化ＨＤＬを含有する試料を使用する、酸化ＨＤＬの免疫学的測定法。

本発明によれば、上記式（Ｉ）で示される化合物、とくにクエルセチン及び／又はルチンを用いることにより酸化ＨＤＬを安定化することができ、しかも式（Ｉ）化合物は免疫学的測定法に何ら影響を及ぼさないことから、このような安定化された試料は長期保管に適しており、このような安定化された試料を用いて免疫学的に酸化ＨＤＬを測定することで、たとえば、採取した時点の酸化ＨＤＬの正確な値を、採取後時間が経っても安定して得ることができるという、格別の効果を有する。

本発明で安定化剤として使用する化合物は、前記式（Ｉ）に含まれる化合物であれば、いずれのものも使用可能であるが、中でも（ａ）群の化合物（Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺが水素原子又は水酸基である化合物）と（ｂ）群の化合物（Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３及びＺが水素原子又は水酸基で、Ｙが糖残基である化合物）が安定化の効果の点で好適である。

（ａ）群の化合物としては、クエルセチン（Quercetin；Ｘ１＝Ｘ３＝水素原子、Ｘ２＝Ｙ＝Ｚ＝水酸基）、ミリセチン（myricetin；Ｘ１＝水素原子、Ｘ２＝Ｘ３＝Ｙ＝Ｚ＝水酸基）、モリン（morin；Ｘ２＝Ｘ３＝水素原子、Ｘ１＝Ｙ＝Ｚ＝水酸基）、ケンペロール（kaempferol；Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝水素原子、Ｙ＝Ｚ＝水酸基）など例示することができ、好ましくはクエルセチン又はモリン、より好ましくはクエルセチンを挙げることができる。

また、（ｂ）群の化合物におけるＹの糖残基としては、グルコース、アラビノース、ラムノースなど単糖残基、ルチノース、グルコビオース、ビシアノース、ラクトースなどの二糖残基を例示することができる。（ｂ）群の化合物を具体的に例示すれば、ルチン（rutin；Ｘ１＝Ｘ３＝水素原子、Ｘ２＝Ｚ＝水酸基、Ｙ＝ルチノース残基）などのフラボノール配糖体を挙げることができる。

このような化合物の中でも、後述実施例に示すように、クエルセチン及び／又はルチンが特に好適であり、使用濃度としては、１００μＭ以上、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲から適宜選定すればよい。なお、上記化合物は、単独で用いてもよく、又は２種以上を併用してもかまわない。併用する場合のそれぞれの使用濃度は組み合わせ毎に、適宜小規模試験により決定すればよい。

本発明の安定化剤を試料に添加し、安定化させた試料を用いた免疫学的測定法による酸化ＨＤＬの測定は、公知の方法に準じて行うことができる（J Lab Clin Med. 2003. 141:378-84、特開平９−３３５２５号公報など参照）。
また、試料を保管する場合、上記の本発明の安定化剤を添加した場合であっても、冷蔵庫等の低温暗所条件下で試料を保存するのが好ましい。

以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。

（１）方法
（１−１）試料
ＨＤＬを含む試料として健常者３名より得た新鮮血清を用いた。採血して得られた血清は使用するまで−８０℃に保存した。また、採取した血液の一部から超遠心法によりＨＤＬを精製し、以下の試験に供した。

（１−２）酸化ＨＤＬの測定
試料中の酸化ＨＤＬの測定は２ステップのイムノアッセイ法により行った(Nakano and Nagata, J Lab Clin Med. 2003. 141:378-84)。すなわち、モノクローナル抗酸化アポリポタンパク質ＡＩ抗体をコートした９６穴マイクロプレートに試験試料を１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させ、未反応成分を洗浄除去した。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗アポリポタンパク質ＡＩ抗体を１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。ＴＭＢ溶液(Scyteck)を１００μｌ毎分注して発色させた後、１Ｎ硫酸にて反応を停止し、４５０ｎｍにおける各ウエル（well）の吸光度を測定し、標準品を参照することで、各検体の酸化ＨＤＬ濃度を定量した。なお、４０ｍＭの2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(ＡＡＰＨ、和光純薬工業)で酸化したアポリポタンパク質ＡＩ（１μｇ）と同等の免疫反応性を示す値を１ユニット（Ｕ）として表した。

（１−３）酸化ＬＤＬの測定
試料中の酸化ＬＤＬの測定は、アポリポタンパク質Ｂのアルデヒド化リジン残基を認識する酸化ＬＤＬ測定ＥＬＩＳＡキット(Mercodia, Sweden)を用いた。

（１−４）試料の酸化
試料の酸化は、以下に示すように、ラジカル発生剤の添加、光暴露及び長期保存により行った。
（ａ）ラジカル発生剤添加
市販のラジカル発生剤であるＡＡＰＨを用い、試料に４０ｍＭになるように添加することで試料の酸化を行った。その濃度以外の場合はその都度表示してある。

（ｂ）光暴露
光暴露は、紫外線（３６５ｎｍ）又は蛍光灯の光を試料に暴露することにより実施した。紫外線暴露は、MINELIGHT LAMP UVGL-58(UVP,USA)を用いて行った。また、蛍光灯の光による酸化は、デスクランプ（ICインバーター、日立）を用い、ルクスメーターにより光量を測定しながら行った。
（ｃ）長期保存
試料を、遮光した状態で、−２０℃、４℃、２３℃、３７℃の各条件下、任意の時間放置することで実施した。

（２）結果
（２−１）各種酸化ストレスの影響
健常人３名より採取した血清に対し、ラジカル発生剤添加、光暴露、長期保存の各種酸化処理を実施し、処理前後の酸化リポタンパク質を測定した。各酸化処理条件下における酸化リポタンパク質の値の処理前後の変動の平均値（倍率）を表１に示す。なお、未処理の時の酸化ＨＤＬ測定値は１．５４±０．５０ Ｕ／ｄｌであり、酸化ＬＤＬ測定値は３９．３±５．７ Ｕ／ｌであった。

表１から明らかなように、ＡＡＰＨによる酸化では酸化ＨＤＬは劇的に増加し、また光暴露でも数十倍の増加が認められた。長期保存でも２−４割増加した。一方、酸化ＬＤＬはすべての条件においてその値は増加せず、ＬＤＬと比較し、ＨＤＬの方は酸化ストレスに対する感受性が極めて高いことが明らかとなった。

カッコ内は、標準偏差を示す。

（２−２）抗酸化物質のスクリーニング
試料中のＨＤＬを安定化する化合物をランダムスクリーニングし、被験化合物の精製ＨＤＬに対する抗酸化効果を評価した。結果の一部を図１に示す。図１から明らかなように、紫外線暴露による酸化処理では、ビタミンＥやＢＨＴなどはＨＤＬに対する抗酸化効果は認められず、酸化ＨＤＬの増加率は５倍以上であったが、フラボノイド化合物（エピカテキンとフィセチンを除く）ではその増加率は５倍以内であった。

次に、カテキン、モリン、ミリセチン、クエルセチン、ルチンおよびタンニンについて、血清ＨＤＬでの安定化効果について検討した。すなわち、これら化合物を血清試料に添加し、紫外線で２４時間照射したところ、カテキンではコントロールとほぼ変わらず、暴露なしの値にくらべ４倍ほど上昇していた。一方、モリン、クエルセチン、ルチン並びにタンニンでは暴露なしの値にくらべ、暴露ありの値は２倍程度と顕著な安定化効果が認められた（図２）。フィセチンとミリセチンについても、安定化効果は認められたが、その効果は他のものと比較し、若干弱いものであった。

安定化物質として有望なルチン、クエルセチン、モリン及びタンニンについて、それぞれの有効濃度を確認するため、濃度依存試験を実施した。
その結果、図３に示すように、ルチン、クエルセチン及びモリンは濃度依存的にその安定化効果を示し、かつコントロールの結果から判断して上記化合物は免疫測定に何ら影響を及ぼさないことが確認された。

さらに、血清に４ｍＭのクエルセチンを添加した場合の安定化効果を、上記と同様に紫外線照射と蛍光灯下という過酷な条件下において経時的に評価した。その結果、図４に示すように、添加群では紫外線暴露でもその酸化ＨＤＬ値はほとんど変化しなかった。また、蛍光灯暴露では２倍程度の上昇のみであった。 これらの結果から、クエルセチンは、血清など生体試料中の酸化ＨＤＬの長期の安定化に効果的であることが確認された。

図１は、紫外線で２４時間暴露後の精製ＨＤＬ中の酸化ＨＤＬ値の増加率（倍率）を示したものである。 図２は、紫外線で２４時間暴露後の血清ＨＤＬ中の酸化ＨＤＬ値を示したものである。 図３は、各種化合物を添加した血清試料を紫外線または蛍光灯で２４時間暴露し後の酸化ＨＤＬの変動を示したものである。なお、各条件で３回実験し、図にはその平均値を示し、エラーバーは３回の測定値の標準偏差を示す。また、白丸（Ｏ）は紫外線暴露を、黒三角（▲）は蛍光灯７００ルクス暴露を、バツ（×）はコントロールを示す。 図４は、４ｍＭクエルセチン添加ならびに未添加の血清試料を紫外線または蛍光灯で暴露し、各酸化ＨＤＬ値を経時的に測定した結果を示したものである。なお、各条件で３回実験し、図にはその平均値を示し、エラーバーは３回の測定値の標準偏差を示す。白丸（Ｏ）はクエルセチン添加で紫外線暴露の結果を、黒丸（●）はクエルセチン未添加で紫外線暴露の結果を；白三角（△）はクエルセチン添加で蛍光灯暴露の結果を、黒三角は（▲）はクエルセチン未添加で蛍光灯暴露の結果をそれぞれ示す。

Claims (10)

1. 下記式（Ｉ）で表される化合物を試料に添加し、試料中の酸化された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の酸化度合いを安定化することを特徴とする酸化ＨＤＬの安定化法。
   

   

   （Ｉ）
   （式中、Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺは、水素原子、水酸基、カルボキシル基、糖残基を示す。）
2. Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３，Ｙ及びＺが水素原子又は水酸基である化合物を使用する、請求項１記載の方法。
3. Ｘ１、Ｘ２，Ｘ３及びＺが水素原子又は水酸基で、Ｙが糖残基である化合物を使用する、請求項１記載の方法。
4. クエルセチン、モリン、ルチンから選ばれた化合物を使用する、請求項１記載の方法。
5. ２種以上の化合物を併用する、請求項１記載の方法。
6. クエルセチン及び／又はルチンを使用する、請求項１記載の方法。
7. 血液試料である、請求項１記載の方法。
8. 請求項１記載の方法により安定化された酸化ＨＤＬを含有する試料。
9. 酸化ＨＤＬを含有する試料を保管する際、請求項１記載の方法により安定化された試料として保管する、酸化ＨＤＬを含有する試料の保管法。
10. 酸化ＨＤＬを免疫学的測定法により測定する方法において、試料として請求項１記載の方法により安定化された酸化ＨＤＬを含有する試料を使用する、酸化ＨＤＬの免疫学的測定法。
    
    
    

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