JPS61117457A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロトロンビンはかなり以前から知られているように血
液凝固の最終段階に関与するビタミンに依存性血漿蛋白
質である。これは約７２，０００の分子量をもち、約１
２％の炭水化物を含有する。

プロトロンビンは既知のとおりカルシウムの存在下で立
体配座が変化するカルシウム結合性蛋白質でアル。プロ
トロンビンからトロンビンへの蛋白分解を伴う活性化は
正常な止血における重要な工程である。プロトロンビン
は肝臓で合成される。

ここでプロトロンビン前駆物質が翻訳後修飾を受けて、
プロトロンビンの機能形になる。これは”天然プロトロ
ンビン”として知られ、γ−カルボキシグルタミン酸を
含有する。ビタミンに拮抗薬、たとえばワルファリンナ
トリウム（プラウエア州つイルミントンのデュポン社エ
ンド・ラボラトリーズ部門の商標クマツン（Ｃｏｕｍａ
ｄｉｎ　）　ｆ有する製品としても知られている）の存
在下で、ま友はビタミンにの不在下で、血中のプロトロ
ンビン活性は有意に低下する可能性がるる。これはプロ
トロンピッ時間（一段凝血アツセイ法）により間接的に
、またはプロトロンビン欠損基質血漿を用いるプロトロ
ンビン凝血活性の直接測定により測定することができる
。血漿プロトロンビン活性が低い場合、重症の肝疾患を
伴う可能性もある。

、たとえば蛋白質合成障害（肝疾患）、不適当なビタミ
ンに供給（ピタミ／に欠乏症）、またはビタミンにの作
用を抑制する薬物（ワルファリンナトリウム）はヒトそ
の他の哺乳類における血漿プロトロンビン活性を低下さ
せる。

クマツンはワルファリンの闇品名である。クマツンを血
栓性疾患の治療ま之は予防に際し広く行われているよう
に経口抗凝血薬として用いると、これはビタミンに依存
性血液凝固蛋白質、たとえばプロトロンビンの活性を低
下させる。適切なりマシン用量は７”ロトロ／ビン時間
の監視により確立される。プロトロンピッ時間は正常な
血漿に関して得られる時間の１％〜２Ｍ倍に維持される
。

１９６８年に、ワルファリンナトリウムで治療した患者
の血漿中に、ヒト天然プロトロンビンに対比して”異常
プロトロンビン”および”ヒト異常プロトロンビン′°
として知られるプロトロンビンの変形が発見され友。異
常プロトロンピ／がもつプロトロンビン活性は低いが、
多数のプロトロンビン抗血清と交叉反応する。ウシ血液
から異常プロトロンビンが１９７２年に初めて単離され
た。

この種の異常プロトロンビンは等量の天然プロトロンビ
ンの約３％の凝血活性をもつことが認められた。そのほ
か分子量、酸加水分解物の炭水化物組成およびアミノ酸
組成は実質的に実験誤差の範囲内で等しかった。１９７
０年代初期にウシ異常プロトロンビンはプロトロンビン
と異なりバリウム塩に結合せず、カルシウムイオンに結
合しないことが見出された。その後、異常プロトロンビ
ンと天然プロトロンビンとの機能上の相違はこれらの蛋
白質間の構造上の相違に関係があり、完全なプロトロン
ビン機能には無傷のカルシウム結合部位を必要とするこ
とが示された。１９７０年代中期に、それまで知られて
いなかったアミノ酸であるγ−カルボキシグルタミン酸
がウシプロトロンビン中に存在し、これが異常ウシプロ
トロンビンには欠如していることが見出された。このア
ミノ酸はプロトロンビンの凝血活性を完全に発現する之
めに必要であると思われる。異常プロトロンビンは凝血
活性をもたないことが知られており、金属イオンを結合
せず、ｒ−カルボキングルタミン酸を含まない。他の研
究者らは、プロトロンビンが肝臓内でｒ−カルボキシグ
ルタミン酸の代わりにグルタミン酸を含有する前駆物質
の形で合成されること全理論づけた。肝臓内でのカルボ
キシル化過程でグルタミン酸が修飾されてｒ−カルボキ
シグルタミン酸が形成される。この酵素系はビタミンに
’ｚ必要とし、ビタミンに拮抗薬により抑制される。

体液、たとえば血漿中のプロトロンビンおよび異常プロ
トロンビンの水準を測定するための定量的アッセイ法全
開発する九めに、これまで多くの努力がなされてきた。

これらの方法にはこれまで著しい制限があった。ヒト異
常プロトロンビンおよびヒト天然プロトロンビンは共に
５８４個のアミノ酸を含み、それらのうち５７４個はこ
れら２形態において等しく、残り１０個はカルボキシル
基において異なるに丁ぎないという点で、アッセイ法を
考案することは困難であった。これらの蛋白質は、構造
上はほぼ等しいが機能的関与においてはきわめて異なっ
ており、血液凝固に関して異なる役割をもつ。

血液凝固の外因性経路におけるプロトロンビンおよび他
の蛋白質全評価するための既存の方法には、一般的なプ
ロトロンビン時間測定法が含まれる。これは異常プロト
ロンビン水準を検出するものではない。プロトロンビン
の凝血活性の直接アッセイは、被験血漿を種々の割合の
プロトロンビン欠損血漿と混合し、欠いで凝血させ、標
準曲線と比較することにより行われる。天然型の機能性
プロトロンビンのみが測定される。交叉免疫電気泳動法
は異常プロトロンビンおよび天然プロトロンビンの双方
を準定量的に測定するが、供与種が他方を隠蔽するのを
防ぐためには同様な濃度であることが必要であり、従っ
て用途が限定される。

他の困難なかつ技術を要する試験法はローレル（Ｌａｕ
ｒｅｌｌ　）のロケット免疫電気泳動法である。

これは上記２種のプロトロンビン全区別できない。

プロトロンビンのラジオイムノアッセイも行われたが、
これまでに用いられた抗体は異常プロトロンビンにも正
常プロトロンビンにも同等に（ま友はほとんど同等に）
結合し、従って総グａト０／ビ／水準が測定されるにす
ぎず、臨床診断用としては不十分である。蛇毒を用いる
エキス・カリナータス（毒蛇の一種、Ｋｃｈｉａ　ｃａ
ｒｉｎａｔｕｓ　）アッセイ法は総プロトロンビンの測
定に用いられる。

二段プロトロンビンアッセイ法と組合せてこれらのアッ
セイを間接的に異常プロトロンビン水準の推定に用いる
ことができる。

上記アッセイ法のいずれも、特にヒトにおいて異常クロ
トロンビンの存在下でのプロトロンビン、あるいは正常
プロトロンビンの存在下での異常プロトロンビンに関す
る直接的、定量的な、容易に実施される感度の高い特異
的アッセイ法を提供しない。本発明においては蛋白質表
面の特定領域に対する立体配座特異性抗体を用いる研究
を行い、その結果異常プロトロンビンに対して、および
天然プロトロンビンに対して特異的な免疫化学的試薬が
開発された。異常プロトロンビンおよび天然プロトロン
ビンが被験哺乳動物から得られる血清検体のものである
方法が記述され、これにより哺乳動物血漿中の異常プロ
トロンビンま念は天然プロトロンビンの水準ｄｆ　ＩＩ
Ｉ定され、ヒトにおいては異常プロトロンビンの存在は
身体の障害を示す。

好ましい形態においては、ヒトの異常プロトロンビンお
よび正常プロトロンビンの測定は他方の存在下でそれぞ
れに対し特異的な抗体の使用によって行われる。身体の
障害がビタミンに欠乏症である場合、異常プロトロンビ
ンの水準が監視され、あらかじめ定められた水準に維持
される。好ましくは抗凝血薬の投与、たとえばワルファ
リンの投与が要求される場合、投与するワルツアリ／の
目的水準ないしは目的量全指示するものとして天然フｏ
　トｏ　７　ヒフ　ｆｆ監視する。天然グロトロンピ／
の水準をこの方法で定量的に測定することもできる。ヒ
トのビタミンに拮抗薬（たとえばワルファリン）による
抗凝血療法期間中、これらの水準を定量的に測定したの
ち１２〜２４μｊｉ　／　ｍｌの天然プロトロンビン水
準が、使用中の薬物（たとえばワルファリンナトリウム
）をさらに投与することにより維持される。好ましくは
天然プロトロンビンは１０〜２４μｐ／ｄの体液内水率
に維持される。

本発明によればヒト天然プロトロンビンおよびカルシウ
ムの存在下でデス−γ−カルボキシヒト（すなわち異常
）プロトロンビンと反応性テあり、カルシウムイオンの
存在下でヒト天然プロトロンビンとは実質的に非反応性
であるモノクロ−＋ル抗体が提供される。

異常ヒトグロトロンピンに対するポリクローナル抗体と
異なり本発明のモノクローナル抗体はカルシウムイオン
の不在下でヒト天然プロトロンビンと複合体を形成しう
る利点をもつ。本発明のモノクローナル抗体は、インビ
トロ試験用体液中で標準的な実験室条件下、たとえば室
温、標準的大気圧、およびそれらの普通の変動において
反応性であり、複合体を形成する点で好ましい。

定量的および定性的測定値を得るためのイムノアッセイ
を行う方法においては、一般的なイムノアッセイ操作法
を採用することができ、これには酵素結合アッセイ法お
よびラジオイムノアッセイ法が含まれる。

ヒト異常プロトロンビンの存否は、血漿マ之は血清試料
について前記の適宜なモノクローナル抗体との免疫反応
を行ない、そして抗体−抗原複合体の存否を常法により
定性的−１友は定量的に測定することによって測定され
る。

人体内におけるヒト異常プロトロンビンの存在は、肝疾
患状態にある場合、個体をビタミンに拮抗薬などの物質
で処置した場合、ビタミンに欠乏の場合、ま友はカルボ
キシル化障害をも友ら丁代増欠陥の結果以外は、血漿、
血清ま之は他の体液１１１１当几り０．０３μＦを越え
ることはない。実際には液体１　ｄ当たり０．０３μｍ
以下の水準もこの種の疾患を示すものと考えられるが、
このように低い水準全本発明方法により探知することは
できない。異常プロトロンビンの存在はいずれも上記の
疾患および障害を示唆するものと考えられる。

従ってイムノアッセイ法を用いて特定の肝疾患の存否を
判定し、肝疾患を異常プロトロンビンが正常な状態から
変動している特定の他の身体機能不全と区別し、また患
者に投与するワルファリンナトリウムの量を決定して血
栓症または出血の危険性を最小限に抑えることができる
。

第１図は、数種の医学的障害を伴う患者における天然プ
ロトロンビンおよび異常プロトロンビンの血清濃度を示
すグラフである。

第２図は、ビタミンに欠乏症を伴う患者においてビタミ
ンに療法が天然プロトロンビンおよヒ異常フロトロンビ
ンに与える影響を示すグラフである。

第３図は、肝細胞性＆を伴う患者における異常プロトロ
ンビンおよび天然プロトロンビンの血清濃度を示すグラ
フである。

第４図は、肝癌患者３人における異常プロトロンビンお
よびα−フェトプロティンの血清濃度を示すグラフであ
る。

第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各患者における
異常プロトロンビンの血清濃度を示すグラフである。

第６図は、肝癌患者における異常プロトロンビンおよび
α−フェトプロティンの血清濃度を示すグラフである。

第７図は、各種の医学的障害を伴う各患者の血清中にお
ける異常プロトロンビン水準を示すグラフである。

プロトロンビン生合成障害の検出および診断はヒトにお
いて血漿または血清の異常プロトロンビンの測定により
行うことができる。異常プロトロンビンの特異的アッセ
イ全ヒト血漿または血清において採用して、プロトロン
ビン生合成の状態を判定する。この情報は特定の疾患の
状態と相関している可能性がある。

正常血漿：正常な個体から得られる血漿および血清は検
出可能な異常プロトロンビンを含まない。

このアッセイ法の感度および特異性は、異常プロトロン
ビンが０．０３μｙ／　ｔｐｔ１以上となり得ないこと
を示している。正常水準の天然プロトロンビンは約１０
８μｆ　／　ｍｌである。

急性肝炎：急性肝炎を伴う患者から得た血漿および血清
はＯ１１〜６μり／　ｍｌまたはそれ以上に変動する大
量の異常プロトロンビンを含有する。天然プロトロンビ
ンの水準は通常は正常であるが、正常なプロトロンビン
の範囲よりも高くまたは低くなる可能性がある。

硬変：アルコール肝硬変を伴う患者から得た血漿および
血清は高い異常プロトロンビンを含む。

プロトロンビン水準は蛾常は準正常である。

ら得几血漿および血清は検出可能な異常プロトロンビン
を含まない。

不全、腸肝循環障害、栄養欠乏、ま几は抗生物質による
腸内細菌の妨害に基づくビタミンに欠乏症は異常プロト
ロンビンおよびこれに相当するグロトロンピン低下を伴
う。これらの患者はビタミンＫに応答する。

う患者においては異常プロトロンビン水準が高い。

する。水準は低い水準からきわめて高い水準にまで変動
する。天然プロトロンビンの水準は正常であるが、変化
しゃ丁い。

診断の補佐には下記のものが含まれる。

（ａＪ異常肝機能研究によりプロトロンビン時間の延長
を伴う患者は、肝疾患またはビタミンに欠乏症を有する
可能性がある。高水準の異常プロトロンビンおよび中程
度に低い水準のプロトロンビンはビタミンに欠乏症全示
唆する。低い水準の異常プロトロンビンおよび正常な水
準のプロトロンビンは肝疾患を示す。

（ｂｌ患者は気分が悪い。血液学的検査および腎スクリ
ーニングテストはすべて正常である。異常プロトロンビ
ン水準の上昇は潜在性肝疾患を示す。

（Ｃ）黄痘および著しい凝血障害を伴う出血性患者は異
常プロトロンビンの増加を示すことが認められる。これ
は肝疾患の診断を示すものであり、血管内凝血金示すも
のではない。

（（１）ある゛正常な“個体が著しい出血を生じる。プ
ロトロンビン時間が延長している。きわめて高い異常プ
ロトロンビンおよび低いプロトロンビンは、ワルファリ
ンの過剰投与、すなわち不自然なフル７アリン摂取を示
唆する。

（θ）２年前に原発性黒色腫を伴った患者が全身型の症
状を発現している。異常プロトロンビンの増加は癌の肝
浸潤を示唆する。

（ｆｌ　６る患者が再発性血栓寒栓症の抑制の几めワル
ファリンで治療される。天然プロドロ／ビン時間は治療
範囲にあるにもかかわらず、天然プロトロンビンは３６
μｙ／ｌｄであると測定される。

この患者は血栓症の恐れがあると診断される。

ワルファリンの１日量を高め、天然プロトロンビンを定
期的に監視する。

アッセイ法に用いるための本発明の抗体のバイア／Ｉ／
ヲ含むイムノアッセイキラトラ用意することができる。

たとえばヒト異常プロトロンビンに特異的な標識された
、まｋは標識されていない抗体のバイアルを用意し、Ｒ
工Ａその他のイムノアッセイキットに用いる他の材料と
共に包装することができる。この種のキットにおける材
料の容積およびキットの構成部品の数は大幅に変えられ
る。

この種のキットはキットの抗体と抗原−抗体複合体全形
成する抗原の存否および量を測定するイムノアッセイ法
を実施するための指示と共に配布される場合が多い。

これらの免疫化学物質を試薬として用いて、ヒト血漿ま
たは血清中の異常プロトロンビンに関する特異的ラジオ
イムノアッセイ法が開発された。

これらのラジオイムノアッセイ法は標準的な二重抗体沈
殿法および放射性ヨウ素化し之抗原を伴う。

異常プロトロンビンに関するアッセイ法は２ｎ１／４に
及ぶ感度を示す。プロトロンビン１５０μ）の存在下で
の異常プロトロンビン検出限界は０．０３μ７　／　ｓ
ｔｌである。正常な血漿は異常プロトロンビンを含まな
い。低水準（０，２〜８μｙ／　ｍｅ　）の異常プロト
ロンビンは種々の肝疾患に特徴的である（肝炎、硬変、
転移性悪性癌、原発性肝細胞性癌）。対応する低いプロ
トロンとンを伴う低水準ないしは高水準の異常プロトロ
ンビン（１〜１００μＦ　／　Ｒｔ　）はピタミｙ　Ｋ
欠乏の程度と関連する。ワルツアリ／ナトリウムを摂取
している患者は３５μＰ　／　ｍｌの範囲の異常プロト
ロンビン水準、および１０〜３０μＰ　／　ｗｒｌのプ
ロトロンビン水準をもつ。この異常プロトロンビンおよ
びプロトロンビンの測定により、ビタミンに依存性カル
ボキシル化の障害を特色とする疾患全件う患者を確認し
くスクリーニングし）、診断することができる。これら
の測定を経口抗凝血薬療法の監視および制御に用いるこ
ともできる。最後にこれらを用いてプロトロンビン合成
の障害とプロトロンとン異化加速／クリアランスの障害
を区別することができる。

試験は普通は血清ま之は血漿中で行われるが、これを全
血中で行って相当する結果を得ることもできる。

ワルファリン監視について記述したが、池のビタミンに
拮抗薬および抗凝血薬を、フル７アリンの経口使用の監
視に関する本発明方法に従って監視した場合も同様な結
果が得られる。数種の医学的障害を伴う各患者の血清中
における異常プロトロンビン水準を第７図に示す。

調製 パルプ／Ｃ系マウスを、完全型フロイントのアジュバン
ト中に２５μノのヒト異常プロトロンビンを混和し友も
のを皮下注射して免疫した。３０日および３７日後に、
１０μｍの異常プロトロンビンを、食塩水中に注入した
。牌臓細胞のｓｐ　２１０血漿細胞系との融合は、前述
のように２８チポリエチレングリコール２０００ｔ−用
いるコー５−（Ｋｏｈｌｅｒ　）とミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ　）の方法によって行った。細胞を培養し
、選択し、それらの上清液を次のように標準的方法を用
いて同定し友。

抗異常プロトロンビン抗体を分泌する細胞は、異常プロ
トロンビンと天然プロトロンビン（以下、原プロトロン
ビン）を用いる２個の同相イーライザ（ＥＬＩＳＡ）法
で同定し友。プロトロンビンとよりも異常源プロトロン
ビンとずっと大きな反応性を示す孔は、限定希釈によっ
てクローン化し之。

ＪＯＩ−１と命名されたクローンは、異常プロトロンビ
ンには結合するが原プロトロンビンとは極僅か反応する
だけの抗体を生成し友、モノクロナル抗体は、型特異性
抗血清を用いるオフタロニーの免疫拡散法によりＩｇＧ
、として定義されｔ０クローン、ＴＯｌ−１はＡＴＣＯ
に寄託され、ＨＢ８６３８　という受入番号を付けられ
た。

出願人の譲受人であるニューイングランドメディカルセ
ンターは、この培養物を発行され７’Ｃ％許の存続期間
の終了前に元に戻し、死ぬようにする義務を負い、且つ
かかる特許の発行１ＡＴｃｏに届けてその時点で寄託物
が寄託臼から少なくとも３０年間は公衆の用に供し得る
ようにする義務金員う。上記時点までは、寄託物は、３
７０ＦＲ１，１４節および米国特許法１１２節の条件の
下に特許局長官へ寄託去れる。

カルシウム無しの異常プロトロンビンに特異的なＪＯＩ
−１は、次のように行つ友。プロトロンビンを、臭化シ
アンで活性化したセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　
）　４　Ｂにタンノくり質／樹脂量が２１１Ｉｆ／＃Ｉ
／でカップリングさせた。２本のアフイニテイ力ラムを
用意して、６ミリモルのＫＤＴＡの存在または不在でプ
ロトロンビンをカップリングさせ几。

、ＴＯＩ−１培養物上清液をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）
ＰＭ３０膜で４０倍に濃縮し、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ（３ミ
リモル）中に透析した。この物質（１，５ｓｔ／）（ｉ
−ＴＢＳ／ＫＤＴＡ（３１Ｌｌ）と平衡にした後、それ
ぞれプロトロンビン−セファロース　カラム（１，ＯＸ
２、３　ｃｍ　）に加えた。結合した抗体は、同じ緩衝
液で１時間培養した後、Ｔ　Ｂ　ｓ／ｃａ＋＋（１５ミ
リモル）で溶出した。

プロトロンビン結合活性を、直接結合イーライザ（ＥＬ
ＩＳＡ　）法によって測定し友。抗体調製物の連続希釈
液から、標準曲線を作成した。精製したモノクロナル抗
体を乾燥スクロースを用いて、透析管中で濃縮し、８．
７ｓ％ｓＤｓ　ポリアクリルアミドゲル上で純度を測定
しｔ０単離されたｙｏｌ−１抗体は、ＳＤＳおよびデー
ビス（Ｄａｖｉｓ）ゲル電気泳動法では単一バンドとし
て移動した。

抗体−プロトロンビン相互作用に対する２価陽イオンの
効果 直接結合イーライザ法を用いて、抗体−抗原錯体の解離
に対する（ａ＋１、Ｍｇ＋“およびＭｎ＋＋の効果を検
討した。プロトロンビンを含むイムロン（工ｍｍｕｌｏ
ｎ　）エエプレート’１ＴＢｓで２回洗浄した後、２３
℃で２％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｔ　Ｂ　Ｓ／７ミリモルＥＤＴＡ
で３０分間洗浄し友。ケレツクス（Ｃｈｅｌｅｘ　）　
１００　（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）　）を含むカ
ラムを用いて金属を除いてしまった水を用いて作成し７
’（ＴＢＳ　で徹底的に洗浄することによって、ＥＤＴ
Ａ　と混入している金属を孔から除去し友。精製された
特別な抗体を、０１モル　グリシン、ｐＨ２，５で溶出
し友。既定の条件下で、ＪＯＩ−１抗体の総てが組織培
養物上清液から除去された。

結果は、Ｃａ＋１濃度が増加すると、抗体−抗原相互作
用が減少するようになることを示し念。

０９ミリモルＣａＣｌ２で、半最大結合が観測された。

対照的に、４ミリモルＭｎＣ１□で半最大結合が観測さ
れた。高濃度のＭｇ＋＋は、抗体−抗原変位に限定的な
効果を有した。

５ミリモルＣａ１ｌ□の存在または不在における、組織
培養物上清液中のＪＯＩ−１抗体とプロトロンビンおよ
び異常プロトロンビンとの相互作用を、固相サンドウィ
ッチイーライザ法を用いて評価した。ＪＯＩ−１抗体は
、カルシウムイオンの存在ま友は不在において、異常プ
ロトロンと／に結合し友。ｒ−カルボキングルタミン酸
を欠いｅ異常プロトロンビンは、金属結合性を損なわれ
てしまっており、金属によって誘起される構造的遷移を
行わない。対照的に１．ＴＯｌ−１抗体は、ＫＤＴＡの
存在においてのみプロトロンビンに結合し友。５ミリモ
ルのＣａＣｌ２の存在では、抗体のプロトロンビンへの
結合は見られなかった。これらの結果は、異常グロトロ
ンビ／に特異的なこのモノクロナル抗体がプロトロンビ
ンの無カルシウムコンフォーマ−に対してコンフォメー
ション特異性でもめることを示した。

プロトロンピ／に対する抗原性決定基 ＪＯＩ−１抗体と固相に結合した異常プロトロンビンと
の相互作用を抑制するプロトロンビンおよびプロトロン
ビンのポリペプチドフラグメントの能力を、競合イーラ
イザ（ＩＩ、ｌ５Ａ）法を用いて評価した。７ミリモル
ＦｉＤＴＡの存在では、異常プロトロンビンフラグメン
ト（１−３９）フラグメント１およびフロトロンビンは
、Ｊｏｔ−１抗体に効果的に結合した。実験誤差の範囲
内で、ＪＯＩ−１抗体は、これらのポリペプチド上に現
れた抗原性決定基に当量的に結合するように思われた。

反対に、１５ミリモルのＣａ１ｌ□の存在におけるデス
−（１−４４）プロトロンビンは、抗体に結合しなかっ
た。これらの結果は、プロトロンビンおよび異常プロト
ロンビン上でＪｏｌ−１抗体が向けられている抗原性決
定基がプロトロンビンのＮＨ２−末端１−３９アミノ酸
残基内に含まれ、フラグメン）（１−３９）上に完全に
表される。

原発性肝細胞癌を検出するための異常プロトロン上述の
ように、ヒト異常プロトロンビンに反応し且つ族ヒトプ
ロトロンビンとは殆ど反応しない（ポリクロナルまたは
モノクロナル）抗体は、ヒト患者の血液または他の生物
学的試料における異常プロトロンビンの存在を検出する
友め免疫同定法に用いることができ、また異常プロトロ
ンビンの検出によって、肝機能不全の診断を行うことが
できる。本出願人等は、生物学的試料中の異常プロトロ
ンビンを定量することによって、原発性肝細胞癌の診断
を行うこともできることを見い出した。

原発性肝細胞癌は、α−フェトタンパク質、異常ビタミ
ンＢ、□結合剤、エリトロポエチンおよび異常フィブリ
ノーゲンのような迷走性および異所性タンパク質の合成
に関連していることが知られている腫瘍である。これら
のタンパク質の幾つかは、特にα−フェトタンパク質は
、処置および管理を適切にする上で早期の且つ正確な診
断が重要な病気の診断マーカーとして使用されてきた。

高レベルの異常プロトロンビンの存在は、次に詳細に説
明するように、成る点では上記タンパク質の成るものよ
りも丁ぐれた原発性肝細胞癌診断で一カーである。

生検によって肝細胞筋であることが確かめられた４０人
の台湾人患者と２６人の米国人患者について検討した。

治療前に、これらの患者から血清試料を採取した。生検
でＢ型表面抗原陽性の慢性活動性肝炎と診断された２８
人の患者および１７人の肝臓を含む転移性癌患者につい
ても検討し友。

肝細胞癌患者の平均年令は、５４才であった。これらの
患者の６４％は、Ｂ型肝炎表面抗原に陽性であった。Ｂ
型肝炎感染の他の血清マーカー（Ｂ型肝炎表面抗体、肝
炎コア抗体、Ｂｅ型肝炎抗原およびＢｅ型肝炎抗体）を
台湾人患者について測定したところ、５０人中４１人（
８２１がＢ型肝炎に感染していることが明らかになった
。

原７”ロトロンビンおよび異常プロトロンビンヲ、上述
の競合的放射免疫同定法でポリクロナル抗体金柑いて患
者の血清で測定した。同定間の変動は、１０％以下であ
った。α−フェトタンパク質抗原およびＢ型肝炎表面抗
原を、競合的放射免疫同定法（α−７エトーリアキツト
（ａ−Ｆｅｔｏ−Ｒ工ＡＫｉｔ　）　（グイナボット（
Ｄａｉｎａ’ｂｏｔ　）　、東京〕およびアウスリアキ
ット（ＡＵＳＲ工Ａ　ｘｌｔ　）　（アボット　ラボラ
トリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
）シカゴ〕によって血清中で測定した。プロトロンビン
時間を標準法によってクエン酸塩加血漿中で測定した。

データをまとめて、タリンフオ（ＣＩｄＮＦ○）システ
ム（パックス（ＶＡＸ　）Ｉ　Ｉ／７３０コンピュタ−
）によって分析した。

異常プロトロンビンに対する値は、正規分布に従わなか
つ友ので、統計分析に幾何平均の計算を取り入れた。

７６人の肝細胞癌患者における異常プロトロンビン抗原
および原プロトロンビン抗原の分布を、第３図に示す（
異常プロトロンビンの大きさは５桁に亘って変動するの
で、対数目盛りで示している）。これらの患者の９１％
（７６人中６９人）に、異常プロトロンビンが検出され
之。総ての患者での平均は、９００　ｎｇ／ｄ　（範囲
、０−６７．０００）でおった。異常プロトロンビン抗
原ト）ｆＣプロトロンビン抗原との間には、相関はなか
った。原プロトロンビン抗原の平均値は、９０，０００
±２８，０００ｎｇ／ｄであり、これは正常被験者につ
いて測定しｔ値（１０８，０００±１９，０００　ｎｇ
　／ｚｌ　）（Ｐ−０，３４、スチューデントのｔ−検
定）と有意差はなかった。

肝細胞癌患者は、上述のようにビタミンに欠乏症患者が
原プロトロンビン抗原の値が低いのに比べて、正常の原
プロトロンビン抗原の値を有した。

プロトロンビン時間指標も、ビタミンに欠乏症患者では
低下したのに、６６人の患者中４６人が正常であった。

これらの患者での異常プロトロンビンの上昇が潜在的ビ
タミンに欠乏症を反映しているという可能性を除くため
、５人の患者にビタミンＫ（２０キ）ヲ連続２日間非経
ロ的に分割投与し、７日間異常プロトロンビン抗原の値
を測定し、ビタミンに欠乏症の４人の患者の値（第２表
）と比較した。

血清異常プロトロンビン抗原の値はへバトーマ患者では
有意には変化しなかったが、ビタミンに欠乏症患者では
予期したように減少した。

患者群　　　　　　異常プロトロンビン抗原　（ｎｇ／
ｍ／）治療前　　　　　治療後 へバトーマ　　１　　　　　２６０　　　　　　４５２
３　　　３．９００　　　　２，５００４　　　７．０
８０　　　　７，９００ビタミンに欠乏症　１　　　　
　　１，５００　　　　　　　　　５５４　　　　３０
．０００　　　　　　　　９１０総ての患者にビタミン
Ｋを非経口投与し、異常プロトロンビン抗原の値を７日
後に測定した。ヘパトーマ患者には１０キずつ連続２日
間投与し、ビタミンに欠乏症患者には１０ｑ’ｉ１回だ
け投与した。

外科的に癌の切除を受けた２名の患者において、異常プ
ロトロンビンおよびα−フェトタンパク質を測定した。

切除前は、１名の患者は、血清の異常プロトロンビン値
は１１０００　ｎｇ／！ｌ／であったが、切除１月、後
までに１５　ｎｇ　／　ｐｔｌに減少した（第４図）。

１４月後には、患者は臨床的および放射線学的に再発の
兆候はなく異常プロトロンビン抗原は検出されないまま
であった。切除から１７月後、異常プロトロンビン抗原
の濃度が１５０　ｎｇ　／＃ｌ／に増加し、シーティー
（ＣＴ）スキャンの結果へパトーマの再発が見られた。

α−フェトタンパク質の値は、臨床的経過と極僅かしか
相関しなかった。切除後、α−フエトタ／バク質値は２
３０から１１０８ｎ／＋＋ｔ／に減少し、１４月後には
突然１１４７ｎｇ／ゴに増加し、１７月後には癌が再発
したにも拘わらず４０８　ｎｇ／ａｔへと二度目の減少
を示した。

もう−人の患者では、切除後１週間で、異常プロトロン
ビンは６０００から１５０　ｎｇ／−へ減少しだ（第４
図）。この患者は再調査しなかったが、１０月後に臨床
的に再発の兆候があり且つ異常プロトロンビン抗原の濃
度が４２００　ｎｇ／ｍ／となって再入院した。この患
者のα−フェトタンパク質濃度は、臨床的経過を反映し
た。

異常プロトロンビン抗原は、生検でα−フェトタンパク
質陰性肝細胞癌と診断され、組織的化学療法を受けた２
３才の女性についても測定した（第４図）。この患者で
は、腹水の減少、肝の大きさの減少、食欲の向上および
体重の増加などの臨床的応答を有した。異常プロトロン
ビン濃度は、治療前の５５００　ｎｇ　／　ｍｌから３
２０　ｎｇ／ａｔへと減少した。

異常プロトロンビン抗原を、２８名のＢ型肝炎表面抗原
陽性慢性の活動性肝炎、原発性肝細胞癌の発生による障
害と生検で診断された患者について測定した（第５図）
。これらの２８名の患者では、異常プロトロンビン抗原
濃度は、無視し得る程度であった（平均値、ｌＱｎｇ／
ｍ／）。異常プロトロンビン抗原を、肝を含む転移癌を
有する１７名の患者（乳癌　６名、結腸癌　３名、スイ
臓癌　２名、肺癌　３名、リンパ腫　２名、起点不明の
！癌　１名）についても測定したところ、抗原の血清濃
度が４２　ｎ　ｇ　／　ＩＩＩｇの平均値で増加した。

原発性肝細胞癌患者の６７チが、３００　ｎｇ／ｄ以上
の異常プロトロンビン濃度を有した。これは、慢性の活
動性肝炎の総ての患者、−人を除く転移癌患者および以
前検討した急性肝炎と肝硬変の患者の９０％において測
定した異常プロトロンビンの濃度を越えている。（ブラ
ンチヤード（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ　）等、１９８１年、
ニュー　イングランド　ジャーナル　オブ　メデイシン
（ＮｅｗＢｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ　）、第３０５巻、２４２ｓ頁）。

α−フェトタンパク質抗原を、肝細胞癌患者で測定して
、異常プロトロンビン抗原に対してプロットした（第５
図）。２個の抗原の間には、殆ど相関がなかった（ｒ＝
０．３）。４００　ｎｇ／ｍｌ以上のα−フェトタンパ
ク質抗原濃度は、他の殆どの悪性および非悪性疾患にお
いて上昇することが報告されているので、肝細胞癌を強
く示唆暗示するものであると報告された。上記７６名の
患者のうち４８名（６３％）では、α−フェトタンパク
質抗原濃度は４００　ｎｇ／ｄ以上であり、また２８名
は低濃度であり、その１６名（５７％）は異常プロトロ
ンビン濃度は３００ｎｇ／＋ｄ以上であった。両分析結
果をまとめると、６４名（８４％）の患者で血清抗原の
一方または両方の濃度が高く、原発性肝細胞癌を強く暗
示した。

α−フェトタンパク質および以上プロトロンビン抗原濃
度は、肝炎表面抗原の存在または不在には関係しなかっ
た。表面抗原陽性の患者では、血清の異常プロトロンビ
ンの平均値は（９７４ｎｇ／ゴ（範囲、０−６７．００
０）であり、表面抗原陰性の患者では、８０．５　ｎｇ
　／ｒｘｌ　（範囲、〇−２３，０００）であった。

上記結果は、異常プロトロンビンが原発性肝細胞癌に対
する血清腫瘍マーカーであることを示している。この抗
原は、ヘパトーマ患者の大部分に存在し、ビタミンにの
非経口投与によっても消失しない。それ故、これらの患
者はビタミンに欠乏症ではない。更に、異常プロトロン
ビン抗原は、腫瘍を切除したり化学療法によって消失ま
たは減少する。この証拠は異常プロトロンビンがビタミ
ンに依存カルボキシル化におけるヘパトーマ誘発欠損か
ら生じていることを支持する。

上記結果は、異常プロトロンビンの大上昇が、原発性肝
細胞癌と肝臓癌を営む他の肝障害とを区別するのに役立
つことを示している。これはプロトロンビン合成につい
て知られていることと適合　。

し、肝細胞がプロトロンビンを合成してカルボキシル化
するだけであり、異常プロトロンビン抗原の大上昇が肝
細胞の悪性変換にだけ起こる。急性肝炎、慢性活動性肝
炎および肝硬変のような非悪性肝細胞疾患に見られる低
濃度の異常プロトロンビンは、時にはこれらの疾患と肝
細胞癌を区別することを困難にするので、血清１　ｒｒ
ＪＬ轟たり約３００　ｎｇ　（または希釈を用いる場合
には、当量）のいき値をヘパトーマを強く暗示するもの
として示される。しばしば肝細胞癌の前駆体としての慢
性活動性肝炎を特徴づける非常に低濃度の異常プロトロ
ンビンは、異常プロトロンビン抗原全観察している慢性
活動性肝炎患者での悪性変換を検出することができる。

α−フエタンバク質抗原および異常プロトロンビン抗原
は、それぞれ肝細胞癌患者全約３分の２の高確率で同定
することができる。これらの抗原は、悪性肝細胞におけ
る異なる生化学的経路の変更を測定する。−緒に用いる
場合には、両試験は単一の腫瘍マーカーで得られるより
も多くの上方、　　を提供する。ビタミンに欠乏症を診
断的考察として除外することができる場合には、これら
２つの試験は、原発性肝細胞癌患者の８４俤を同定する
ことができ、この疾患の補助的腫瘍マーカーである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、数種の医学的障害を伴う患者における天然プ
ロトロンビンおよび異常プロトロンビンの血清濃度を示
すグラフである。 第２図は、ビタミンに欠乏症を伴う患者においてビタミ
ンに療法が天然プロトロンビンおよび異常プロトロンビ
ンに与える影響を示すグラフである。 第３図は、原発性肝細胞性癌を伴う７６人の患者におけ
る異常プロトロンビンおよび天然プロトロンビンの血清
濃度を示すグラフである。 第４図は、肝癌患者３人における異常プロトロンビン（
黒マル）およびα−フェトプロティンの血清濃度（白丸
）を示すグラフである。患者Ａ及びＢは外科的に膿瘍を
切除した患者である。患者Ｃは混合化学療法を受けてい
る者であり、−貫してＬｏｎｇ／ｄより低レベルのα−
フェトプロティンを有した。 第５図は、３種の異なる肝臓障害を伴う各患者における
異常プロトロンビンの血清濃度を示すグラフである。 第６図は、肝癌患者７６人における異常プロトロンビン
およびα−フェトプロティンの血清濃度を示すグラフで
ある。両抗原の値をま対数で示した。 両抗原の値の相関性は小であった。 第７図は、各種の医学的障害全件う各患者の血清中にお
ける異常プロトロンビン水準を示すグラフである。 （外５名） ５Ｉ薗の浄書（内容に変Ｆなし） サチューセツツ州　０２１５８．ニュート・ロード　８
２ 手　　続　　補　　正　　杏 昭和　乙Ｏ年Ｈ月律日 ２、発明の名称 毛／りＯ−ナル＃丸イネ ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 別紙の通り（９叩１・のｔ植−口面。内防２よもそを、
。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）デス−γ−カルボキシ　ヒトプロトロンビンと反
   応し且つカルシウムイオンの存在でヒト天然プロトロン
   ビンと実質的に不反応性であることを特徴とする、モノ
   クロナル抗体。
2. （２）カルシウムイオンの存在において、前記デス−γ
   −カルボキシ　ヒトプロトロンビンと反応する、特許請
   求の範囲第１項記載のモノクロナル抗体。
3. （３）カルシウムイオンの不在において、ヒト天然プロ
   トロンビンと反応する、特許請求の範囲第１項記載のモ
   ノクロナル抗体。
4. （４）生物学的試料において、ヒト　デス−γ−カルボ
   キシ　プロトロンビンの存在を検出する方法において、
   前記試料を特許請求の範囲第１項記載のモノクロナル抗
   体と接触させ、前記デス−γ−カルボキシ　プロトロン
   ビンと前記モノクロナル抗体との複合体を、前記試料中
   における前記デス−γ−カルボキシ　プロトロンビンの
   存在の指標として検出することを特徴とする方法。
5. （５）前記複合体を、前記試料中における前記デス−γ
   −カルボキシ　プロトロンビンの定量的尺度として測定
   する、特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）前記抗体を検出可能な標識で標識する、特許請求
   の範囲第４項記載の方法。
7. （７）ヒト患者で原発性肝細胞癌を診断する方法におい
   て、前記特許請求の範囲第４項記載の方法を前記患者の
   血清試料で行い、血清１ｍｌ当たり約３００ｎｇ以上に
   相当するデス−γ−カルボキシ　プロトロンビンの濃度
   をもつて原発性肝細胞癌の可能性があると診断すること
   を特徴とする方法。