JPH02112763A - 可溶性橋かけフィブリン重合体のアッセイ - Google Patents
可溶性橋かけフィブリン重合体のアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、一部Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎａｔｔｔｓｔａ
ｍ ｏｆＨｍａｌｔｈＫよる補助の下の仕事の途中でな
され九本発明は、血栓症の危険のある患者の診断並にこ
のような患者の治療の効果のモニターにおいて用いられ
る新規なアッセイに関する。さらに詳しくは、本発明は
、プラスミノーゲン活性体例えば組織プラスミノーゲン
活性体Ｃｔ−ＦＡ）又は活性プラスミンにより患者サン
プル例えば血漿を生体外で処理して可溶性フィブリン重
合体のＤ−二量体生成物を生じさせることを含む可溶性
橋かけフィブリン重合体のｆを測定する新規な方法に関
し、生じたＤ−二量体の量は、患者の血清中のＯＴ浴性
檎かけフィブリン重合体の量に直接比例し、その量はト
ロンビン及び因子Ｘ■活性化即ち進行中の血栓症の指標
であり、そしてそれは高凝固性の状態を示す。
ｍ ｏｆＨｍａｌｔｈＫよる補助の下の仕事の途中でな
され九本発明は、血栓症の危険のある患者の診断並にこ
のような患者の治療の効果のモニターにおいて用いられ
る新規なアッセイに関する。さらに詳しくは、本発明は
、プラスミノーゲン活性体例えば組織プラスミノーゲン
活性体Ｃｔ−ＦＡ）又は活性プラスミンにより患者サン
プル例えば血漿を生体外で処理して可溶性フィブリン重
合体のＤ−二量体生成物を生じさせることを含む可溶性
橋かけフィブリン重合体のｆを測定する新規な方法に関
し、生じたＤ−二量体の量は、患者の血清中のＯＴ浴性
檎かけフィブリン重合体の量に直接比例し、その量はト
ロンビン及び因子Ｘ■活性化即ち進行中の血栓症の指標
であり、そしてそれは高凝固性の状態を示す。
多くの努力が、近年フィブリノーゲンの活性化生成物を
測定する方法を開発するために費された。その理由は、
フィブリンへのフィブリノーゲンの転換は、前血栓症状
態及び播種性の血管向凝固を含む多くの異る病理学上の
症状に関係があるからである。それにもかかわらず、循
環するフィブリン（可溶性フィブリン）を直接測定する
現在利用できる方法は、それらが行うのが難しか又は感
度及び特異性を欠くため実際的ではない。このような方
法は、とりわけ、ヒト血漿中の可溶性フィブリンの化学
的精製及びクロマトグラフィ・アッセイ又は−遅の希釈
プロタミンサルフェートテストよりなる。
測定する方法を開発するために費された。その理由は、
フィブリンへのフィブリノーゲンの転換は、前血栓症状
態及び播種性の血管向凝固を含む多くの異る病理学上の
症状に関係があるからである。それにもかかわらず、循
環するフィブリン（可溶性フィブリン）を直接測定する
現在利用できる方法は、それらが行うのが難しか又は感
度及び特異性を欠くため実際的ではない。このような方
法は、とりわけ、ヒト血漿中の可溶性フィブリンの化学
的精製及びクロマトグラフィ・アッセイ又は−遅の希釈
プロタミンサルフェートテストよりなる。
理論的には、フィブリン形成は、放出されたフィブリノ
ペプチドの測定により間接的に検出できる。しかし、分
析するのが難しいこととは別に、フィブリノペプチドは
短い半減期を有しそして可溶性フィブリンの直接測定と
同じ情報を与えない。
ペプチドの測定により間接的に検出できる。しかし、分
析するのが難しいこととは別に、フィブリノペプチドは
短い半減期を有しそして可溶性フィブリンの直接測定と
同じ情報を与えない。
又プラスミノーゲンのｔ−ＰＡ触媒化活性化に基づいて
得たフィブリンの刺激作用に基づく方法も提案されてい
る（Ｗｉｍａｎら、ＴｈｒｏｔｙＬｂｏｓｉａ ａｎ
ｄ ｌ１ａａｒｎｏｓｔａｔｔｓ１９８６．５５二（２
） １８９ ）。このアッセイでは、ｔ−ＰＡ活性は可
溶性フィブリンの存在下で増大しそして逆計算されて可
溶性フィブリンの濃度を示す。しかし終点の測定は、フ
ィブリンの劣化フラグメントよりもむしろプラスミン感
受性発色体に対するｔ−ＰＡＫよる酵素活性の一つであ
る。
得たフィブリンの刺激作用に基づく方法も提案されてい
る（Ｗｉｍａｎら、ＴｈｒｏｔｙＬｂｏｓｉａ ａｎ
ｄ ｌ１ａａｒｎｏｓｔａｔｔｓ１９８６．５５二（２
） １８９ ）。このアッセイでは、ｔ−ＰＡ活性は可
溶性フィブリンの存在下で増大しそして逆計算されて可
溶性フィブリンの濃度を示す。しかし終点の測定は、フ
ィブリンの劣化フラグメントよりもむしろプラスミン感
受性発色体に対するｔ−ＰＡＫよる酵素活性の一つであ
る。
又、橋かけフィブリンの独特な抗原性決定子に対して生
じたモノクロナール抗体を利用してフィブリノーゲンの
劣化生成物により影響されることなく橋かけフィブリン
の劣化生成物を特異的に測定する免疫アッセイを用〜・
ろことも提案され【いる（Ｒｙｔａｔｔら、Ｔｈｒｏｔ
ｎｂ、 Ｒａｇ、 １９８３．３１ ニア６７〜７ｇ
）（Ｗｈｉｔａｋａｒら、Ｊ、Ｃ１１ｓ。
じたモノクロナール抗体を利用してフィブリノーゲンの
劣化生成物により影響されることなく橋かけフィブリン
の劣化生成物を特異的に測定する免疫アッセイを用〜・
ろことも提案され【いる（Ｒｙｔａｔｔら、Ｔｈｒｏｔ
ｎｂ、 Ｒａｇ、 １９８３．３１ ニア６７〜７ｇ
）（Ｗｈｉｔａｋａｒら、Ｊ、Ｃ１１ｓ。
ＰａｔｈｏＬ 、 １９８４．３７：８８２〜７）（Ｇ
５／ハ％ａ７１ら、Ｔｈｒｏｔｎｂｏａｉａ ａｎｄ
Ｈａａｍｏａｔａａｉａ、１９８７．５８：２３１ｆ
ｉ約）。Ｄ−二量体は、安定であってプラスミンによる
次の消化に抵抗する橋かけフィブリンの劣化生成物の一
つである。Ｄ−二量体の上昇した血清又は血漿の菫は、
病理学的フィブリン溶解を有する患者そしてストレプト
キナーゼ誘発血＠溶解後＃ｍ静脈血栓症又は肺動脈塞栓
症の患者に見い出される（Ｌｍ替ら、Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｃ，
。
５／ハ％ａ７１ら、Ｔｈｒｏｔｎｂｏａｉａ ａｎｄ
Ｈａａｍｏａｔａａｉａ、１９８７．５８：２３１ｆ
ｉ約）。Ｄ−二量体は、安定であってプラスミンによる
次の消化に抵抗する橋かけフィブリンの劣化生成物の一
つである。Ｄ−二量体の上昇した血清又は血漿の菫は、
病理学的フィブリン溶解を有する患者そしてストレプト
キナーゼ誘発血＠溶解後＃ｍ静脈血栓症又は肺動脈塞栓
症の患者に見い出される（Ｌｍ替ら、Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｃ，
。
１９８６、νｏ１．１１／ｉ６６．１３２０〜４）。そ
のため、この技術は、フィブリン溶解の終点例えば病塊
学的血栓症又はプラスミノーゲン油性体を用いる治療中
にモニターすることのみに有用な可能性がある。
のため、この技術は、フィブリン溶解の終点例えば病塊
学的血栓症又はプラスミノーゲン油性体を用いる治療中
にモニターすることのみに有用な可能性がある。
そのため、フィブリンを形成する増大した傾向を反映す
る前血栓症状態又はいわゆる「高凝固可能状態」の有用
な反映として、例えば患者の血漿中の可溶性フィブリン
濃度の生体外測定に用いることのできる急速且簡単なア
ッセイを提供することが、極めて望１れている。アッセ
イは、日常的な実験室の使用のためでなければならず、
大量のサンプルを非常に正確にｍｌ＋定しなければなら
ない。
る前血栓症状態又はいわゆる「高凝固可能状態」の有用
な反映として、例えば患者の血漿中の可溶性フィブリン
濃度の生体外測定に用いることのできる急速且簡単なア
ッセイを提供することが、極めて望１れている。アッセ
イは、日常的な実験室の使用のためでなければならず、
大量のサンプルを非常に正確にｍｌ＋定しなければなら
ない。
サンプル例えば血漿へのプラスミノーゲン活性体の添加
により生成するフラグメントＤ−二量体に関するテスト
材料の増大する反応性を測定する診断免疫アッセイは、
患者サンプル中の橋かけフィブリン重合体の初めの濃度
を測定するのに用いられる。従って、生体外でのＤ−二
量体への可溶性フィブリンの劣化後のＤ−二量体の血漿
８度は、生体内の条件下の循環する橋かけフィブリン１
合体の簡単な間接的な目安として用いることができよう
。
により生成するフラグメントＤ−二量体に関するテスト
材料の増大する反応性を測定する診断免疫アッセイは、
患者サンプル中の橋かけフィブリン重合体の初めの濃度
を測定するのに用いられる。従って、生体外でのＤ−二
量体への可溶性フィブリンの劣化後のＤ−二量体の血漿
８度は、生体内の条件下の循環する橋かけフィブリン１
合体の簡単な間接的な目安として用いることができよう
。
本発明を工、患者す／プル中の橋かけ可溶性フィブリン
重合体を生体外で測定する方法において、該サンプルと
蛋白分解酵素とを接触させて該フィブリン重合体のＤ−
二量体フラグメントな発生させ、セして該Ｄ−二量体の
盆を測定することよりなる方法に関する。
重合体を生体外で測定する方法において、該サンプルと
蛋白分解酵素とを接触させて該フィブリン重合体のＤ−
二量体フラグメントな発生させ、セして該Ｄ−二量体の
盆を測定することよりなる方法に関する。
本発明は、さらに患者サンプル中の橋かけ可溶性フィブ
リン重合体を生体外で測定する方法において、該サンプ
ルと蛋白分解酵素とを接触させ１該フィブリン重合体の
Ｄ−二量体フラグメントを発生さゼ、そして該Ｄ−二二
量に特異的な免疫アッセイの使用により該Ｄ−二量体の
量を測定することよりなる方法に関する。
リン重合体を生体外で測定する方法において、該サンプ
ルと蛋白分解酵素とを接触させ１該フィブリン重合体の
Ｄ−二量体フラグメントを発生さゼ、そして該Ｄ−二二
量に特異的な免疫アッセイの使用により該Ｄ−二量体の
量を測定することよりなる方法に関する。
本発明は、文責に局限された一連の容器を受容するよう
に区分された担体よりなる患者サンプル中のＤ−二量体
の量をアッセイするための診断キットにおいて、（α）
橋かけ可溶性フィブリン重合体を含む標準の測定され
た友を富有する第一の容器； ｔｂ） 蛋白分解酵素の測定された量を含有する第二
の容器、及び （Ｃ） 該Ｄ−二量体に対し”Ｃ特異的な抗体を含有
する第三の容器 よりなる診断キットに関する。
に区分された担体よりなる患者サンプル中のＤ−二量体
の量をアッセイするための診断キットにおいて、（α）
橋かけ可溶性フィブリン重合体を含む標準の測定され
た友を富有する第一の容器； ｔｂ） 蛋白分解酵素の測定された量を含有する第二
の容器、及び （Ｃ） 該Ｄ−二量体に対し”Ｃ特異的な抗体を含有
する第三の容器 よりなる診断キットに関する。
本発明は、前述の利点を有する新規な診断アッセイを提
供し、それはプラスミノーゲン活性体（例えばｔ−ＦＡ
）又は活性プラスミンによる患者サンプルを生体外で処
理し１Ｄ−二量体を発生きせることを営む。このテスト
の結果は、血栓症にかかった又は血栓症の危険のある患
者に対する診断を行いそしてその評価を非常に助け、さ
らにこのよ５な患者の治療の効果をモニターするのに非
常に有用でるる。形成されたＤ−二量体の量は、Ｄ−二
量体に関して特異的な免疫アッセイにより測定される。
供し、それはプラスミノーゲン活性体（例えばｔ−ＦＡ
）又は活性プラスミンによる患者サンプルを生体外で処
理し１Ｄ−二量体を発生きせることを営む。このテスト
の結果は、血栓症にかかった又は血栓症の危険のある患
者に対する診断を行いそしてその評価を非常に助け、さ
らにこのよ５な患者の治療の効果をモニターするのに非
常に有用でるる。形成されたＤ−二量体の量は、Ｄ−二
量体に関して特異的な免疫アッセイにより測定される。
発生したＤ−二量体の量は、患者のサンプル中に存在す
る可溶性フィブリン重合体に直接比例し、その量はトロ
ンビン及び因子ｘＩＩＩ活性化活性化性中の血栓症の指
標でありそして高凝固可能な状態を示す。
る可溶性フィブリン重合体に直接比例し、その量はトロ
ンビン及び因子ｘＩＩＩ活性化活性化性中の血栓症の指
標でありそして高凝固可能な状態を示す。
本発明は従って短時間中の患者サンプルの実際的な測定
手段を提供し、日常的な実験案の使用並に非常な正確さ
での大量のサンプルの測定に適用できる。必要な材料は
、簡単で、容易に移動でき、大小のセンターで適用可能
であり、たとえ病院でも適用できしかも大規模な自動化
に適用できる。高１Ｊｌｔ！ｉ１可能性のマーカーとし
１の債かけフィブリン重合体の使用は、非常に実際的な
アプローチを与え、それは複雑な凝固経路の中間段階を
取扱うのよりむしろクロット形成に向う最終の経路を取
扱う点でそうである。それ故、本発明は患者サンプル中
の血漿橋かけフィブリン重合体濃度の簡単且間接的な測
定法として用いることのできるＤ−二量体に対する生体
外劣化を提供する。このようなサンプルは、それに限定
されないが、血液、血清、血漿、尿、脳を髄液、腹水、
浸出液及び戸出液並にこのような材料の生体外画分を含
む。テストは、血栓の発達にともなう前血栓症障害、並
に心筋梗塞、肺動脈塞栓症及び深部静脈血栓症のような
血栓症障害を評価するのに有用である。フィブリン形成
にともなう他の柄理学的症状例えば腫瘍、炎症性及び免
疫学的障害並に術後状態及び他の外傷、並に他の種々の
病理学的状態も又多量の橋かけフィブリンをともなう。
手段を提供し、日常的な実験案の使用並に非常な正確さ
での大量のサンプルの測定に適用できる。必要な材料は
、簡単で、容易に移動でき、大小のセンターで適用可能
であり、たとえ病院でも適用できしかも大規模な自動化
に適用できる。高１Ｊｌｔ！ｉ１可能性のマーカーとし
１の債かけフィブリン重合体の使用は、非常に実際的な
アプローチを与え、それは複雑な凝固経路の中間段階を
取扱うのよりむしろクロット形成に向う最終の経路を取
扱う点でそうである。それ故、本発明は患者サンプル中
の血漿橋かけフィブリン重合体濃度の簡単且間接的な測
定法として用いることのできるＤ−二量体に対する生体
外劣化を提供する。このようなサンプルは、それに限定
されないが、血液、血清、血漿、尿、脳を髄液、腹水、
浸出液及び戸出液並にこのような材料の生体外画分を含
む。テストは、血栓の発達にともなう前血栓症障害、並
に心筋梗塞、肺動脈塞栓症及び深部静脈血栓症のような
血栓症障害を評価するのに有用である。フィブリン形成
にともなう他の柄理学的症状例えば腫瘍、炎症性及び免
疫学的障害並に術後状態及び他の外傷、並に他の種々の
病理学的状態も又多量の橋かけフィブリンをともなう。
第１図は、トロンビンの添加後の血漿中の債かけフィブ
リン重合体を示す。
リン重合体を示す。
第２図は、凝固時間に関連するトロンビン添加後の血漿
中の橋かげフィブリン重合体の増加の足型を示す。
中の橋かげフィブリン重合体の増加の足型を示す。
第３Ａ図は、血漿中のフィブリノーゲン及び橋かけフィ
ブリン重合体のｔ−ＰＡｇｊ発劣化を示す。
ブリン重合体のｔ−ＰＡｇｊ発劣化を示す。
第３Ｂ図は、フィブリン重合体及びフィブリノーゲン／
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較である
。
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較である
。
第４図は、トロンビン及び／又はｔ−ＰＡＪＡ埋前及び
後の１）−二量体ＥＬＩＳＡアッセイの血漿免疫活性を
示す。
後の１）−二量体ＥＬＩＳＡアッセイの血漿免疫活性を
示す。
第５図は、トロンビン及び／又はｔ−ＦＡとのインキュ
ベーション後の血漿フィブリノーゲンの変化を示ス。
ベーション後の血漿フィブリノーゲンの変化を示ス。
本発明は、生体外で患者サンプル例えば血漿へのプラス
ミノーゲン活性体例えばｔ−ＰＡの添加後の可溶性橋か
けフィブリン重合体の劣化により生ずる蛋白分解誘導体
特にフラグ二量体クー二童体（Ｌ）ｌ））の童を０１１
足する有効なアッセイ法を提供できるという発見に基づ
く。蛋白分解誘導体への槁かけフィブリン重合体の劣化
は、特異的抗体を用いる徨々の免役学的技術により測定
できる、十分に規定された分子体であるフラグメントＤ
Ｉ）に対する簡単な検出技術により活用される分子的変
化を誘発する。僑かけフィブリン重合体はこれらの免疫
学的システムではもしあったとしても殆んど反応せず、
そのため材料の例えばｔ−ＰＡ処理後のフラグメントＤ
ＤＫ関するテスト材料の増大した反応性は、患者サンプ
ル中の橋かけフィブリン重合体の初めの濃度と直接関係
する。従って患者サンプル中の循環する矯かけフィブリ
ン重合体の初めの濃度の定量は、血栓症の危険のある患
者の診断を助ける生体外のテストにより達成される。
ミノーゲン活性体例えばｔ−ＰＡの添加後の可溶性橋か
けフィブリン重合体の劣化により生ずる蛋白分解誘導体
特にフラグ二量体クー二童体（Ｌ）ｌ））の童を０１１
足する有効なアッセイ法を提供できるという発見に基づ
く。蛋白分解誘導体への槁かけフィブリン重合体の劣化
は、特異的抗体を用いる徨々の免役学的技術により測定
できる、十分に規定された分子体であるフラグメントＤ
Ｉ）に対する簡単な検出技術により活用される分子的変
化を誘発する。僑かけフィブリン重合体はこれらの免疫
学的システムではもしあったとしても殆んど反応せず、
そのため材料の例えばｔ−ＰＡ処理後のフラグメントＤ
ＤＫ関するテスト材料の増大した反応性は、患者サンプ
ル中の橋かけフィブリン重合体の初めの濃度と直接関係
する。従って患者サンプル中の循環する矯かけフィブリ
ン重合体の初めの濃度の定量は、血栓症の危険のある患
者の診断を助ける生体外のテストにより達成される。
生理学上の柔性の下で、フィブリン形成は、血管内では
止血栓の形成又は血管外では炎症性病巣の何れかに存在
する。しかし、可溶性フィブリン循環物の低濃度及び増
大した濃度は、血栓症的疾患を有する患者に同定され、
血漿フィブリノペプチド賃（より又測定されるトロンビ
ン活性の全身的効果を反映する。可溶性フィブリンは、
又トランスグルタミナーゼへの因子Ｘ■のトロンビン開
裂を助け、それは隣接するフィブリン重合体のγ鎖の対
の間に分子間共■橋かけを形成する。本発明者らは、正
常人の血漿中のｒ鎖僑かけフィブリン重合体の低濃度及
び急性心筋梗塞を示した患者の有意な増加なＶ証した（
Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃ’５ｒｃｓｂｌａｔ ｈｏｎ＊
１９８７ ＋ ７５ ＋ １１７０〜１１７７ ）。
止血栓の形成又は血管外では炎症性病巣の何れかに存在
する。しかし、可溶性フィブリン循環物の低濃度及び増
大した濃度は、血栓症的疾患を有する患者に同定され、
血漿フィブリノペプチド賃（より又測定されるトロンビ
ン活性の全身的効果を反映する。可溶性フィブリンは、
又トランスグルタミナーゼへの因子Ｘ■のトロンビン開
裂を助け、それは隣接するフィブリン重合体のγ鎖の対
の間に分子間共■橋かけを形成する。本発明者らは、正
常人の血漿中のｒ鎖僑かけフィブリン重合体の低濃度及
び急性心筋梗塞を示した患者の有意な増加なＶ証した（
Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃ’５ｒｃｓｂｌａｔ ｈｏｎ＊
１９８７ ＋ ７５ ＋ １１７０〜１１７７ ）。
血栓症的疾患の治療におけるフィブリン分解の薬理学上
の刺激は、血栓崩壊の所望の効果に腑えて、種々の程度
の循環するフィブリノーゲンの劣化をもたらす。安定化
したフィブリン中のｒ＠インペプチド橋かけは分子のこ
の部分をプラスミン劣化に抵抗性とするために、欄かけ
フィブリンの１ラスミン劣化生成物は、フィブリノーゲ
ンのそれらとは構造上異る。前述したように、この差は
クロット分解の潜在的なマーカーとして循＠づ゛る僑ρ
・けフィブリン％異性劣化生成物を測定する数種の方法
の開発にオリ用されている。本発明は、定量的免疫学的
アッセイにおいて橋かけフィブリン劣化生１ｉｉ、物に
ズｊし″′Ｃ，特異的な抗体を利用する。
の刺激は、血栓崩壊の所望の効果に腑えて、種々の程度
の循環するフィブリノーゲンの劣化をもたらす。安定化
したフィブリン中のｒ＠インペプチド橋かけは分子のこ
の部分をプラスミン劣化に抵抗性とするために、欄かけ
フィブリンの１ラスミン劣化生成物は、フィブリノーゲ
ンのそれらとは構造上異る。前述したように、この差は
クロット分解の潜在的なマーカーとして循＠づ゛る僑ρ
・けフィブリン％異性劣化生成物を測定する数種の方法
の開発にオリ用されている。本発明は、定量的免疫学的
アッセイにおいて橋かけフィブリン劣化生１ｉｉ、物に
ズｊし″′Ｃ，特異的な抗体を利用する。
橋かけフィブリン劣化生成物例えばフラグメントＤＤに
存在する橋かけ部位に近（・エピトープに向５抗体ＤＤ
−３Ｂ６／２２ （ＲｙｌａＨら及びＷルｉ＠ａｋａｒ
ら、前述ンは、本方法において好ましくは用いられるが
、フィブリンとよりむしろＤ−二量体又は他の劣化生成
物と好ましく反応する他の抗体も又用いられる。槁かけ
フィブリン重合体及び橋かけフィブリン劣化生成物はと
もにｒｒ橋かけを宮むので、両方がこの抗体と反応する
かもしれない可能性が存在する。しかし、このＩ’ＴＤ
性の問題は、Ｆ記に豆証されるようＫ、問題ではない（
実験参ＩＪｆＡ）。橋かけフィブリン重合体の形成は、
低濃度のトロンビンへの血漿の曝露により生体外で誘発
され、可溶性フィブリン重合体の反応性は、ｒｒ鎖僑か
けと反応するモノクローナル抗体を用いるｒ１！Ｉ素結
合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価される。さら
に、フィブリンがＤ−二量体へ転換している血漿のｔ−
ＦＡ処理サンプル及びトロンビン曝露血漿は、γγ鎖橋
かけに対する抗体による同一の免疫吸着アッセイで反応
性につい′ｃｆ′Ｆｇｆｉすれる。フィブリン重合体の
トロンビン誘発形成及びｔ−ＰＡ諺発劣化による免疫反
応性の変化は、血栓部ば治療中のフィブリン及びフィブ
リノーゲン劣化生成物の研凭の解釈、韮に血漿倫かけフ
ィブリン重合体を検出するアッセイの開発Ｋｍ要な意味
を有する。
存在する橋かけ部位に近（・エピトープに向５抗体ＤＤ
−３Ｂ６／２２ （ＲｙｌａＨら及びＷルｉ＠ａｋａｒ
ら、前述ンは、本方法において好ましくは用いられるが
、フィブリンとよりむしろＤ−二量体又は他の劣化生成
物と好ましく反応する他の抗体も又用いられる。槁かけ
フィブリン重合体及び橋かけフィブリン劣化生成物はと
もにｒｒ橋かけを宮むので、両方がこの抗体と反応する
かもしれない可能性が存在する。しかし、このＩ’ＴＤ
性の問題は、Ｆ記に豆証されるようＫ、問題ではない（
実験参ＩＪｆＡ）。橋かけフィブリン重合体の形成は、
低濃度のトロンビンへの血漿の曝露により生体外で誘発
され、可溶性フィブリン重合体の反応性は、ｒｒ鎖僑か
けと反応するモノクローナル抗体を用いるｒ１！Ｉ素結
合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価される。さら
に、フィブリンがＤ−二量体へ転換している血漿のｔ−
ＦＡ処理サンプル及びトロンビン曝露血漿は、γγ鎖橋
かけに対する抗体による同一の免疫吸着アッセイで反応
性につい′ｃｆ′Ｆｇｆｉすれる。フィブリン重合体の
トロンビン誘発形成及びｔ−ＰＡ諺発劣化による免疫反
応性の変化は、血栓部ば治療中のフィブリン及びフィブ
リノーゲン劣化生成物の研凭の解釈、韮に血漿倫かけフ
ィブリン重合体を検出するアッセイの開発Ｋｍ要な意味
を有する。
詳細な説明及び下記の実施例において、下記の材料及び
方法が用いられたことを注意丁べさである。
方法が用いられたことを注意丁べさである。
蛋白。ヒトフィブリノーゲン（グレードＬ）は、ＨａＬ
ｅｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａａｓｍｏｎｔ、Ｔ
Ｘ）から入手し、９３チ凝固町舵でめった。フィブリノ
ーゲン濃度は、１５．１の吸光係数を用いて２８０ ｎ
ｍでの光学密度の測定により測定した。ヒトトロンビン
（３２０ＯＮＩＨＵ／１１ｇ）は、Ｃ，’ａ１ｂｉｏｃ
ｈａｍ −Ｂｅルｒｉｎｇ Ｃ”ａｒｐ、（Ｌａ
）ｔ）ｌｌａ、ＣＡノより、ヒルジン及びウシ血清アル
ブミンはｓｉｇｎαＣｈｅｍｉｃａＥＣｏ、（Ｓｔ、Ｌ
ｏｓｉｓ、ＮＯ）から、アプロチニンは４％４ｏｂａｙ
Ｃ’にａｍｉｃａＬ Ｃｏ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ
Ｙ）から、そして組織プラス７ミーゲン活性体（１００
，０００１ＵＩＷＧりはＢｓｒｒｏｓｇｈｓ Ｗａｌ
ｌｃｏｍａ （、’ｏ、（Ｒａ５−αｒｃルＴｒｉａ
ｎｇｌｅ Ｐαデｋ ＪＷＣ）から入手した。ヒツジ抗
ヒトフィブリノーゲン１ｇＧは、Ｃａｐｐａｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（（、’ｏｃｋｒａｎｖｉ Ｌ Ｊ
ａ 、 Ｆ Ａ ）から得た。Ｍ製Ｌ タ因子ＸＩＩ
ＩｆｌｋＡ物（／ｉ ｂ ｒｏ ｃｔａｍｍｉｎ）（ヒ
ト胎型かも製造）は、Ｈａｋｒｉｎｇｗｍｒｋａ／ｌｌ
ｏａｃｈｓｔ−Ｒｏｓｓｓｇｌ（Ｓｏｍｇｒｖｉｌｌｇ
ｖＮりにより提供された。因子Ｘ１１１は、カゼインへ
のダンンルカタ゛ベリン導入によりアッセイされ、そし
て油性は、１００％として規定されたプールされた正常
の血漿に関して表示された。
ｅｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａａｓｍｏｎｔ、Ｔ
Ｘ）から入手し、９３チ凝固町舵でめった。フィブリノ
ーゲン濃度は、１５．１の吸光係数を用いて２８０ ｎ
ｍでの光学密度の測定により測定した。ヒトトロンビン
（３２０ＯＮＩＨＵ／１１ｇ）は、Ｃ，’ａ１ｂｉｏｃ
ｈａｍ −Ｂｅルｒｉｎｇ Ｃ”ａｒｐ、（Ｌａ
）ｔ）ｌｌａ、ＣＡノより、ヒルジン及びウシ血清アル
ブミンはｓｉｇｎαＣｈｅｍｉｃａＥＣｏ、（Ｓｔ、Ｌ
ｏｓｉｓ、ＮＯ）から、アプロチニンは４％４ｏｂａｙ
Ｃ’にａｍｉｃａＬ Ｃｏ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ
Ｙ）から、そして組織プラス７ミーゲン活性体（１００
，０００１ＵＩＷＧりはＢｓｒｒｏｓｇｈｓ Ｗａｌ
ｌｃｏｍａ （、’ｏ、（Ｒａ５−αｒｃルＴｒｉａ
ｎｇｌｅ Ｐαデｋ ＪＷＣ）から入手した。ヒツジ抗
ヒトフィブリノーゲン１ｇＧは、Ｃａｐｐａｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（（、’ｏｃｋｒａｎｖｉ Ｌ Ｊ
ａ 、 Ｆ Ａ ）から得た。Ｍ製Ｌ タ因子ＸＩＩ
ＩｆｌｋＡ物（／ｉ ｂ ｒｏ ｃｔａｍｍｉｎ）（ヒ
ト胎型かも製造）は、Ｈａｋｒｉｎｇｗｍｒｋａ／ｌｌ
ｏａｃｈｓｔ−Ｒｏｓｓｓｇｌ（Ｓｏｍｇｒｖｉｌｌｇ
ｖＮりにより提供された。因子Ｘ１１１は、カゼインへ
のダンンルカタ゛ベリン導入によりアッセイされ、そし
て油性は、１００％として規定されたプールされた正常
の血漿に関して表示された。
放射症ラベル。フィブリノーゲンは、フィブリノーゲン
１紅当’） ０．０２ ｓｒ （７）：Ｉ−ドゲン及び
１００ ＊Ｃ４””！（２０■／ＩＬｔ）を用いて０．
０５ｆｎｃｉ／ηの比活性にヨードケン技術によりラベ
ルされた。ラベルされたフィブリノーゲンは、９３％ク
ロット可能で、ジスルフィド結合減少後ＳＤＳ、７ｓポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で同じ電気泳動的易動性
を示した。ヒツジ抗ヒトフィブリノーゲンＩＱＧは、ラ
クトロバ−オキシダーゼ法（ｋｌｃＬｒｃｈｃＬｌｏ’
ｎ％Ｂ＊Ｊ、Ｊ、、Ｂｉｏｃ五−ｍ、Ｊ、、１９６９，
１１３：２９９）を用いて０．４ｔＩ％Ｃｉ ／ＩＦ、
Ｉ の比活性にラジオヨード化した。結合及び遊離の沃
素は、セファデックスＧ −２５（Ｐｈａｒｍαｃｉａ
Ｆｉｎｓ Ｃｈｍｍｓｃａｌｓ＊Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
、ＮＪ）のクロマトグラフィによるラベル後分離した。
１紅当’） ０．０２ ｓｒ （７）：Ｉ−ドゲン及び
１００ ＊Ｃ４””！（２０■／ＩＬｔ）を用いて０．
０５ｆｎｃｉ／ηの比活性にヨードケン技術によりラベ
ルされた。ラベルされたフィブリノーゲンは、９３％ク
ロット可能で、ジスルフィド結合減少後ＳＤＳ、７ｓポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で同じ電気泳動的易動性
を示した。ヒツジ抗ヒトフィブリノーゲンＩＱＧは、ラ
クトロバ−オキシダーゼ法（ｋｌｃＬｒｃｈｃＬｌｏ’
ｎ％Ｂ＊Ｊ、Ｊ、、Ｂｉｏｃ五−ｍ、Ｊ、、１９６９，
１１３：２９９）を用いて０．４ｔＩ％Ｃｉ ／ＩＦ、
Ｉ の比活性にラジオヨード化した。結合及び遊離の沃
素は、セファデックスＧ −２５（Ｐｈａｒｍαｃｉａ
Ｆｉｎｓ Ｃｈｍｍｓｃａｌｓ＊Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
、ＮＪ）のクロマトグラフィによるラベル後分離した。
履ｔの最終濃度に溶解し、塩化カルシウムを０．０２５
モル／ｌの最終濃度に加え、そし℃因子Ｘ■を１２率位
／ ｍｌの濃度に加えた。トロンビンを次に０．００２
５卑位／成の最終濃度になるように加え、溶液を１０〜
４５分の間隔で３７℃でインキュベートし、トロンビン
活性を２単位／紅の最終濃度にヒルジンを加えることに
より阻害した。
モル／ｌの最終濃度に加え、そし℃因子Ｘ■を１２率位
／ ｍｌの濃度に加えた。トロンビンを次に０．００２
５卑位／成の最終濃度になるように加え、溶液を１０〜
４５分の間隔で３７℃でインキュベートし、トロンビン
活性を２単位／紅の最終濃度にヒルジンを加えることに
より阻害した。
血液サンプル。同意を得たのち血液を正常のボランティ
アからくえん酸ナトリウム（０，４％最終濃度）に集め
、血漿を４℃で１５分間３５００Ｆで遠心分離後赤血球
から分離した。
アからくえん酸ナトリウム（０，４％最終濃度）に集め
、血漿を４℃で１５分間３５００Ｆで遠心分離後赤血球
から分離した。
電気泳動的分析。フィブリノ−ケン及びフイフリン誘導
体を５ＤＳ２％アガロース電気泳動（Ｃ’ｏｎｎａｇル
ａｎ、Ｄ、Ｇ、。
体を５ＤＳ２％アガロース電気泳動（Ｃ’ｏｎｎａｇル
ａｎ、Ｄ、Ｇ、。
１９８５、Ｂｌｏｏｄ、６５：５８９１ン後の血漿中で
同定シタ。血漿は、ｘ、ｒｔｓ ｓＤｓ を含むｐＨ７
（１）０．０１Ｍホスフェートバッファー中に１＝２０
で希釈しそして１時間６０℃又は５分間１００℃で加熱
することにより電気泳動につい１調整した。１０μＢの
サンプルを、１０℃に冷却しつつフラットベツド電気泳
動装置（Ｐｈαデ倶αｃ ｉ ａ ＦｉｎｅＣん−ｍｉ
ｃ（Ｌｉ２．Ｐｉ８ｅ（Ｌｔ（Ｌｖαｖ、ＮＪ）上で１
５０ボルトで電気泳動した。電気体動を、トラッキング
染料力５）０ｃｍ移動するまで行った。ゲルスキャニン
グは９％１１ｇ−５ｃａｎノｒ、（Ｉｉａｔａｎａ
Ｌａｂｏｒａｃｏｒｉａｇ、ＢａａｓｍｏｎｔＪＸ
）により行った。
同定シタ。血漿は、ｘ、ｒｔｓ ｓＤｓ を含むｐＨ７
（１）０．０１Ｍホスフェートバッファー中に１＝２０
で希釈しそして１時間６０℃又は５分間１００℃で加熱
することにより電気泳動につい１調整した。１０μＢの
サンプルを、１０℃に冷却しつつフラットベツド電気泳
動装置（Ｐｈαデ倶αｃ ｉ ａ ＦｉｎｅＣん−ｍｉ
ｃ（Ｌｉ２．Ｐｉ８ｅ（Ｌｔ（Ｌｖαｖ、ＮＪ）上で１
５０ボルトで電気泳動した。電気体動を、トラッキング
染料力５）０ｃｍ移動するまで行った。ゲルスキャニン
グは９％１１ｇ−５ｃａｎノｒ、（Ｉｉａｔａｎａ
Ｌａｂｏｒａｃｏｒｉａｇ、ＢａａｓｍｏｎｔＪＸ
）により行った。
ウェスタンｅフロティングは、ＴｒａｎｓｂＬｏｔ Ｃ
ａ１ｌ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒ
４ｃｋｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて、ＴＯｖｂｉｎら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
ａ１ｌ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒ
４ｃｋｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて、ＴＯｖｂｉｎら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
７６−：４３５０，１９７９）の方法の変法を用い℃行
った。
った。
ニトロセルロースペーパー（孔径０，２％ｍ 、 Ｓｃ
ｈｌａｉｃｈｍｒａｎｄ ５ｃｈｔｓａｔ１．Ａａａｎ
ａ、Ｎ） ノへの移動は、２０℃で３時間６０ボルトで
０．０９６Ｍグリシン及び２０％（マ／リメタノールを
含むｐＨ８，３の０．０１＆）リス塩酸バッファー 中
”’ｃ” ｒｘされた。ニトロセルロースペーパーハ、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び３％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清
アルブミンを含むｐＨ７，３の０．０５Ｍホスフェート
バッファー中で２４時間３℃でインキュベートした。こ
れを除き、ペーパーを、０１５Ｍ塩化ナトリウム、３％
（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン及び０．０５ ％ （
Ｖ／Ｖ ） Ｔｗｓａｘ ２０及び２Ｘ１０−’Ｃ，１
２ｓＩ−ラベルヒツジ抗ヒトフィブリノ−ケン１σＧを
富むｐＨ７，３の０．０５Ａｆホスフエートバツフアー
５０ＷＬｔとともに緩（ロッキングしつつ２０℃で２時
間インキュベートした。ニトロセルロースペーパーを、
次にそれぞれの況浄に１０分間プラットフォーム振盪機
での緩い撹拌を用いて０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０
．０５ （Ｖ／Ｖ ） Ｔｗａａｎ２０をｆむｐＨ７，
５の０．０５Ａｆホスフ工−トバツフアー４Ｑｍずつで
６回洗浄した。乾燥後、ペーパーを７２時間以内の露出
時間によりＫｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ フィルム（Ｅａ
ｓ ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈａｓ ｔ ａｙ、
ＮＹ ）を用いてオートラジオグラフィで処理した。
ｈｌａｉｃｈｍｒａｎｄ ５ｃｈｔｓａｔ１．Ａａａｎ
ａ、Ｎ） ノへの移動は、２０℃で３時間６０ボルトで
０．０９６Ｍグリシン及び２０％（マ／リメタノールを
含むｐＨ８，３の０．０１＆）リス塩酸バッファー 中
”’ｃ” ｒｘされた。ニトロセルロースペーパーハ、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び３％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清
アルブミンを含むｐＨ７，３の０．０５Ｍホスフェート
バッファー中で２４時間３℃でインキュベートした。こ
れを除き、ペーパーを、０１５Ｍ塩化ナトリウム、３％
（Ｗ／Ｖ ）ウシ血清アルブミン及び０．０５ ％ （
Ｖ／Ｖ ） Ｔｗｓａｘ ２０及び２Ｘ１０−’Ｃ，１
２ｓＩ−ラベルヒツジ抗ヒトフィブリノ−ケン１σＧを
富むｐＨ７，３の０．０５Ａｆホスフエートバツフアー
５０ＷＬｔとともに緩（ロッキングしつつ２０℃で２時
間インキュベートした。ニトロセルロースペーパーを、
次にそれぞれの況浄に１０分間プラットフォーム振盪機
での緩い撹拌を用いて０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０
．０５ （Ｖ／Ｖ ） Ｔｗａａｎ２０をｆむｐＨ７，
５の０．０５Ａｆホスフ工−トバツフアー４Ｑｍずつで
６回洗浄した。乾燥後、ペーパーを７２時間以内の露出
時間によりＫｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ フィルム（Ｅａ
ｓ ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈａｓ ｔ ａｙ、
ＮＹ ）を用いてオートラジオグラフィで処理した。
ＥＬＩＳＡ０橋かげフィブリン劣化生成物を、因子ＸＩ
ＩＩＧ仲介橋かけの近くの部位と反応するモノクロナー
ル抗体（ＤＤ７３Ｂ６）を用いてＥＬＩＳＡ（Ｄｉｍｅ
ｒ Ｔａｎｇ。
ＩＩＧ仲介橋かけの近くの部位と反応するモノクロナー
ル抗体（ＤＤ７３Ｂ６）を用いてＥＬＩＳＡ（Ｄｉｍｅ
ｒ Ｔａｎｇ。
Ａｍａｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｇｒａａ
ｎｗｉｃル、ＣＴ ）により測定した（Ｒｙｌａｔｔら
及びＷｈｉｔａｋａｒら、前述）。
ｎｗｉｃル、ＣＴ ）により測定した（Ｒｙｌａｔｔら
及びＷｈｉｔａｋａｒら、前述）。
予めコートしたプレートを用い、結果は、４０ｎｇ／Ｉ
Ｌｔ〜ｓ ｏ ｏ ｎｇ／ｒｔｔ の濃度で製造者によ
り提供される精製したフラグメントＤｌ）により作成し
た椋準凹繊を用い℃計算した。血漿は、＊−ＦＡとのイ
ンキュベーション前に未希釈でそし℃インキュベーショ
ン後１；５の希釈でアッセイしち 〔実施例〕 本発明は、下記の特定の実施例に関連して詳しく記述さ
れよう。
Ｌｔ〜ｓ ｏ ｏ ｎｇ／ｒｔｔ の濃度で製造者によ
り提供される精製したフラグメントＤｌ）により作成し
た椋準凹繊を用い℃計算した。血漿は、＊−ＦＡとのイ
ンキュベーション前に未希釈でそし℃インキュベーショ
ン後１；５の希釈でアッセイしち 〔実施例〕 本発明は、下記の特定の実施例に関連して詳しく記述さ
れよう。
実施例
正常の血漿Ｃ０，０２５Ｕ／ν最終濃度）への低濃度の
トロンビンの添加は、オートラジオグラム（第１図）に
示されるように、クロット形成前橋かけフィブリン重合
体に次第に増大をもたらす。トロンビン添加前（時間０
）、フィブリン重合体及び痕跡量の三量体に相当するバ
ンドは、１１ｓノ放射能ラベルされたフィブリノーゲン
中に存在するロトロンビン添加後しかしクロット形成前
、三量体のバンドはより明らかになり、より大きな重合
体の形が見られる。
トロンビンの添加は、オートラジオグラム（第１図）に
示されるように、クロット形成前橋かけフィブリン重合
体に次第に増大をもたらす。トロンビン添加前（時間０
）、フィブリン重合体及び痕跡量の三量体に相当するバ
ンドは、１１ｓノ放射能ラベルされたフィブリノーゲン
中に存在するロトロンビン添加後しかしクロット形成前
、三量体のバンドはより明らかになり、より大きな重合
体の形が見られる。
最大の変化は、クロット形成（０９２クロット時間）前
の最後のサンプルに生じ、そのとぎ６個までの重合体の
形が見られそし℃成る蛋白は２チアガロースゲルに入る
ことができない。
の最後のサンプルに生じ、そのとぎ６個までの重合体の
形が見られそし℃成る蛋白は２チアガロースゲルに入る
ことができない。
トロンビンの添加後の血漿中の橋かけフィブリン重合体
の形成は、第１図に示される。１！ゝｌ放射能ラベルさ
れたフィブリノーゲンを含むプールされた正常の（えん
酸処理血漿は、トロンビン（０，０２５Ｕ ／ｒｎｔ最
終謎度）及び塩化カルシウム（１０ｍＡｆ最終ｗ度＞と
ともにインキュベートされる。間隔を％ｔ、・て一部を
取り出しセしてＳＤＳ含有希釈剤中でイ。に希釈しそし
て１時間６０℃に加熱することＫより電気泳動について
潤製した。１０μｌのサンプルを電気泳動し、オートラ
ジオグラムは３日間の露出時間により乾燥後作成する。
の形成は、第１図に示される。１！ゝｌ放射能ラベルさ
れたフィブリノーゲンを含むプールされた正常の（えん
酸処理血漿は、トロンビン（０，０２５Ｕ ／ｒｎｔ最
終謎度）及び塩化カルシウム（１０ｍＡｆ最終ｗ度＞と
ともにインキュベートされる。間隔を％ｔ、・て一部を
取り出しセしてＳＤＳ含有希釈剤中でイ。に希釈しそし
て１時間６０℃に加熱することＫより電気泳動について
潤製した。１０μｌのサンプルを電気泳動し、オートラ
ジオグラムは３日間の露出時間により乾燥後作成する。
時間／クロッティング時間は、サンプルが引き出される
時間を観察されたクロッティング時間により割ったもの
を示す。矢は、適用穴の位置を示す。
時間を観察されたクロッティング時間により割ったもの
を示す。矢は、適用穴の位置を示す。
ｎｓ１放射能ラベルされたフィブリノーゲンの使用は、
染色及び電気原動後の固定したゲルを切断し、次に個々
の切片をカウントし℃それぞれの重合体のバンドの割合
を測定することによりフィブリン重合体形成の正確な定
量を行う（第２図ン。トロンビンの象加前に、８％の放
射能ラベルが僑かけ二量体として移動しセしｉ：８．２
％が三量体プラスより大きな重合体として移動した。橋
かけ重合体の割合は、トロンビンの添加後段々に増大し
、見ることのできるフィブリン形成直前に存在する２０
％二量体並に２７チ全倫かげ重合体のピークを生ずる。
染色及び電気原動後の固定したゲルを切断し、次に個々
の切片をカウントし℃それぞれの重合体のバンドの割合
を測定することによりフィブリン重合体形成の正確な定
量を行う（第２図ン。トロンビンの象加前に、８％の放
射能ラベルが僑かけ二量体として移動しセしｉ：８．２
％が三量体プラスより大きな重合体として移動した。橋
かけ重合体の割合は、トロンビンの添加後段々に増大し
、見ることのできるフィブリン形成直前に存在する２０
％二量体並に２７チ全倫かげ重合体のピークを生ずる。
二量体濃度における統計上有意な増加は、０．５クロッ
ティング時間で生じ、全倫かけ重合体濃度では０．２５
クロッティング時間で生ずる。三量体より大きな重合体
の形は、それらが合計の７％を示す０．９クロッティン
グ時間でｏＴ視的なりロット形成の直前に最も多い。同
じ実験が、ＥＤＴＡ（０１チ最終濃度）により抗凝固さ
れしかも塩化カルシウムを添加しない血漿を用いて行わ
れるとき、重合体形成の増大は見られない。
ティング時間で生じ、全倫かけ重合体濃度では０．２５
クロッティング時間で生ずる。三量体より大きな重合体
の形は、それらが合計の７％を示す０．９クロッティン
グ時間でｏＴ視的なりロット形成の直前に最も多い。同
じ実験が、ＥＤＴＡ（０１チ最終濃度）により抗凝固さ
れしかも塩化カルシウムを添加しない血漿を用いて行わ
れるとき、重合体形成の増大は見られない。
第２図は、クロッティング時間に関連してトロンビン添
加後の血漿中の橋かけフィブリン重合体の増加の定量を
詳しく示す。トロンビン（０，０２５〜０． Ｉ Ｕ／
ｇ 、最終ン及び塩化カルシウム（１０ｍＪ（、最終）
を、１ノ放射能ラベルしたフィブリンを含むプールした
正常の血漿に加える。
加後の血漿中の橋かけフィブリン重合体の増加の定量を
詳しく示す。トロンビン（０，０２５〜０． Ｉ Ｕ／
ｇ 、最終ン及び塩化カルシウム（１０ｍＪ（、最終）
を、１ノ放射能ラベルしたフィブリンを含むプールした
正常の血漿に加える。
一部を３７℃のインキュベーション中クロット形成前に
間隔をおいて取り出し、電気泳動用に調製する。Ｃｏｃ
ｎｎａｓｓｉａＢ ｌ ｍ ｇによる染色後、単量体、
二量体及びより大きな重合体に相当するバンドは、ゲル
から切断されそしてカウントされる。時間／クロッティ
ング時間は、最終のクロッティング時間により割られた
サンプルの取り出しの時間を示す。
間隔をおいて取り出し、電気泳動用に調製する。Ｃｏｃ
ｎｎａｓｓｉａＢ ｌ ｍ ｇによる染色後、単量体、
二量体及びより大きな重合体に相当するバンドは、ゲル
から切断されそしてカウントされる。時間／クロッティ
ング時間は、最終のクロッティング時間により割られた
サンプルの取り出しの時間を示す。
時間０値との比較した統計的に有意な増大を示す。傘、
ｐ（０，０５；奉傘＊ ｐ＜ｏ、ｏ ｌ ； ＊傘＊
、 ｐ＜０．００５゜可溶性フィブリン重合体のプラス
ミン劣化は、１２１１ 放射能ラベルフィブリン重せ体
の標品が加えられる正常血漿へのｔ−ＦＡの添加後電気
泳動的に行われる（第３図〕。
ｐ（０，０５；奉傘＊ ｐ＜ｏ、ｏ ｌ ； ＊傘＊
、 ｐ＜０．００５゜可溶性フィブリン重合体のプラス
ミン劣化は、１２１１ 放射能ラベルフィブリン重せ体
の標品が加えられる正常血漿へのｔ−ＦＡの添加後電気
泳動的に行われる（第３図〕。
１６μ？／ｒｒＬｌのｔ−ＦＡでフィブリノーゲンのバ
ンドは変化しないが、二量体のバンドは２４時間で５丁
（なり、さらに移動し、フラグメントＸＸへの劣化と一
致する。５５及び１００μ？／Ｍのｔ−ＦＡで、フィブ
リノーゲンは初めの３時間内でフラグメントＸに劣化す
るが、次により長（・インキュベーション中存在し、よ
り小さいフラグメントＹ１Ｄ及びＥへの小さい開裂を示
す。フィブリノーゲン及びフラグメントＸのプラスミン
抵抗性とは対照的に、倫かけフイブリンニ量体の劣化は
早（生ずる。５５μｆ／ｍｌ及び１００μｙ７員ｔのｔ
−ＰＡで、多くのフィブリン重合体は１時間で劣化し、
フィブリノーゲンより人ぎなフラグメント又は小さい二
量体はより長いインキュベーション後に残存する。
ンドは変化しないが、二量体のバンドは２４時間で５丁
（なり、さらに移動し、フラグメントＸＸへの劣化と一
致する。５５及び１００μ？／Ｍのｔ−ＦＡで、フィブ
リノーゲンは初めの３時間内でフラグメントＸに劣化す
るが、次により長（・インキュベーション中存在し、よ
り小さいフラグメントＹ１Ｄ及びＥへの小さい開裂を示
す。フィブリノーゲン及びフラグメントＸのプラスミン
抵抗性とは対照的に、倫かけフイブリンニ量体の劣化は
早（生ずる。５５μｆ／ｍｌ及び１００μｙ７員ｔのｔ
−ＰＡで、多くのフィブリン重合体は１時間で劣化し、
フィブリノーゲンより人ぎなフラグメント又は小さい二
量体はより長いインキュベーション後に残存する。
フィブリン重合体及びフィブリノーゲンの劣化速度は、
ゲルスキャニング後に比較され、テストされ’Ｅｔ−Ｆ
Ａのすべての讃度で、二量体の劣化は単量体よりさらに
早い（第３Ｂ図）。１６μ？／ａｔ のｔ−ＦＡで、
３時間で単量体には減少は生じない力ｊ、二値体は初め
の６４チに低下した。
ゲルスキャニング後に比較され、テストされ’Ｅｔ−Ｆ
Ａのすべての讃度で、二量体の劣化は単量体よりさらに
早い（第３Ｂ図）。１６μ？／ａｔ のｔ−ＦＡで、
３時間で単量体には減少は生じない力ｊ、二値体は初め
の６４チに低下した。
単量体と二量体との間の劣化の差は、高い酵素０度でよ
り大さくなり、６８％のｓｉｔ体に比べて１００μｖ／
酊のｔ−ＦＡで僅かｌＯ−の二量体が３時１ｉｔＪで残
存するにすき゛ない。
り大さくなり、６８％のｓｉｔ体に比べて１００μｖ／
酊のｔ−ＦＡで僅かｌＯ−の二量体が３時１ｉｔＪで残
存するにすき゛ない。
フィブリノーゲン及び僑かけフィブリン重合体のｔ−Ｐ
Ａ誘発劣化は、第３Ａ及び３Ｂ図に示される。１６μｆ
／／ｒｕｔ、５５μｒ／Ｕ及び１００μｙ７ａｔ の
濃度の組懺プラスミノーゲン活性体は、倫かけフィブリ
ン重合体の＋ｔ’ｓ１放射ｈ１放射層１ラベルを含むプ
ールした正常の血漿ＫＭＪえる。３７℃のインキュベー
ション中、一部’ｌ＋Ｆａ示した時間で取り出しそして
電気原動用に調製する。染色及び乾燥後、オートラジオ
ダラムを６日間露出する。２チアガロースゲルシステム
は、フィブリノーゲンより小さいフラグメントの制限さ
れた分１０を有し、フラグメントＹ及びＤＤは重複して
分割できず、フラグメントＥはＡ鎖の劣化生成物ととも
に移動する。
Ａ誘発劣化は、第３Ａ及び３Ｂ図に示される。１６μｆ
／／ｒｕｔ、５５μｒ／Ｕ及び１００μｙ７ａｔ の
濃度の組懺プラスミノーゲン活性体は、倫かけフィブリ
ン重合体の＋ｔ’ｓ１放射ｈ１放射層１ラベルを含むプ
ールした正常の血漿ＫＭＪえる。３７℃のインキュベー
ション中、一部’ｌ＋Ｆａ示した時間で取り出しそして
電気原動用に調製する。染色及び乾燥後、オートラジオ
ダラムを６日間露出する。２チアガロースゲルシステム
は、フィブリノーゲンより小さいフラグメントの制限さ
れた分１０を有し、フラグメントＹ及びＤＤは重複して
分割できず、フラグメントＥはＡ鎖の劣化生成物ととも
に移動する。
第３Ｂ図は、フイブリンニ量体及びフィブリノーゲン／
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較を示す
。
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較を示す
。
３時間ｔ−ＦＡインキュベーションに相当する第３Ａ図
のレーンがスキャンさね、フイブリンニ量体及びフィブ
リノーゲン／フィブリン単量体の劣化速度が時間０サン
プルとの比較でＨｔ算される。ゲルシステムはフィブリ
ノーゲン、フィブリン単量体及びフラグメン）Ｘの間を
区別しないので、これらは−緒に測定され、そし℃示さ
れる低下は、より小さなフラグメントＹ１１）又はＥへ
のコイルされたコイル開破を示す。同様に、フィブリン
重合体より小さいがフィブリノーゲンより大きいプラス
ミン誘導体はゲルスキャニング孜俯を用いて別々に測定
することが雛しいので、フイブリン二量体に関する価は
、フィブリノーゲンより太きいすべてのバンドを表し、
それＫより残りのフィブリン重合体を過大評価し肪ちで
ある。
のレーンがスキャンさね、フイブリンニ量体及びフィブ
リノーゲン／フィブリン単量体の劣化速度が時間０サン
プルとの比較でＨｔ算される。ゲルシステムはフィブリ
ノーゲン、フィブリン単量体及びフラグメン）Ｘの間を
区別しないので、これらは−緒に測定され、そし℃示さ
れる低下は、より小さなフラグメントＹ１１）又はＥへ
のコイルされたコイル開破を示す。同様に、フィブリン
重合体より小さいがフィブリノーゲンより大きいプラス
ミン誘導体はゲルスキャニング孜俯を用いて別々に測定
することが雛しいので、フイブリン二量体に関する価は
、フィブリノーゲンより太きいすべてのバンドを表し、
それＫより残りのフィブリン重合体を過大評価し肪ちで
ある。
ｔ−ＦＡとの１時間インキュベーション後のプールサレ
タ正常な血漿中のＥ Ｌ Ｉ Ｓ ＡによろＤ−二量体
の０度（２回の実験の十拘り ０．００１ １００（Ｊ
、０１ ３２５［１１
３５０ ４０にｌ ２７００
血漿倫かげフィブリン重合体がトロンビン露出後増大し
そし″′ｃ重合体のプラスミン劣化力ＳフラグメントＤ
Ｄを生成するので、フラグメントＤＤは、トロンビン処
理前及び後に１−ＦＡとの血漿のインキュベーション後
足型されて、ｔ−ＦＡによるプラスミン劣化前及び後に
見掛けのＤ−二量体濃度に対する増大したフィブリン重
合体の効果を求める。血漿Ｄ−二二量の反応性は、讃度
依存の形で１時間のｔ−ＰＡＫよる生体外処理後増大し
、１００μ？／ｒｎｌより多いｔ−ＦＡでは平らになる
（第１表）正常のくえん酸処理血漿中の平均のＤ−二社
体義度は、５０．３±４．５ｎ９／ＩＬＬであり、２５
℃で２０分間トロンビン（０，０５単位／ａｔ、最終濃
度）とのインキュベーション後変化しない。１）ｌ）濃
度を工ｔ−Ｐ、４（２１）ｉｌμｙ／紅）とのインキュ
ベーション後平均３，５６０±１２３５ ｎＷ／ｒｔｔ
ｔに顕著に増大する。トロンビンへの露出後、ｔ−ＰＡ
インキュベーションは、平均１８．５８０±１１，７８
０ ｎＶ ／ＵｔへＤ−二鎗体濃夏にお−・℃より大き
（増大させる。ｔ−ＰＡ消化後のＤＤ濃度の増大は、す
べての血漿サンプルに生じ、トロンビン処理の前及び後
で消化されたものの間に重複はない。
タ正常な血漿中のＥ Ｌ Ｉ Ｓ ＡによろＤ−二量体
の０度（２回の実験の十拘り ０．００１ １００（Ｊ
、０１ ３２５［１１
３５０ ４０にｌ ２７００
血漿倫かげフィブリン重合体がトロンビン露出後増大し
そし″′ｃ重合体のプラスミン劣化力ＳフラグメントＤ
Ｄを生成するので、フラグメントＤＤは、トロンビン処
理前及び後に１−ＦＡとの血漿のインキュベーション後
足型されて、ｔ−ＦＡによるプラスミン劣化前及び後に
見掛けのＤ−二量体濃度に対する増大したフィブリン重
合体の効果を求める。血漿Ｄ−二二量の反応性は、讃度
依存の形で１時間のｔ−ＰＡＫよる生体外処理後増大し
、１００μ？／ｒｎｌより多いｔ−ＦＡでは平らになる
（第１表）正常のくえん酸処理血漿中の平均のＤ−二社
体義度は、５０．３±４．５ｎ９／ＩＬＬであり、２５
℃で２０分間トロンビン（０，０５単位／ａｔ、最終濃
度）とのインキュベーション後変化しない。１）ｌ）濃
度を工ｔ−Ｐ、４（２１）ｉｌμｙ／紅）とのインキュ
ベーション後平均３，５６０±１２３５ ｎＷ／ｒｔｔ
ｔに顕著に増大する。トロンビンへの露出後、ｔ−ＰＡ
インキュベーションは、平均１８．５８０±１１，７８
０ ｎＶ ／ＵｔへＤ−二鎗体濃夏にお−・℃より大き
（増大させる。ｔ−ＰＡ消化後のＤＤ濃度の増大は、す
べての血漿サンプルに生じ、トロンビン処理の前及び後
で消化されたものの間に重複はない。
第４図は、トロンビン及び／又はｔ−ＰＡによる処理の
前及び後のＤ−二量体ＥＬＩＳＡアッセイにおける血漿
免疫活性を示す。１０人の正常の人々から採取された（
えん酸処理血漿に８けるＤ−二量体濃度は、５０．３±
４．５ｎ？／１１ｔ（平均上５Ｄ）（左）であり；３７
℃で１時間ｔ−ＦＡ（２００μｍ／ｖ、最終濃度）との
インキュベーション後、濃度は３，５６０±１．２３８
ｎ？／ＩＬｔである。同一の血漿は又３７℃で２０分間
トロンビン（０，０５Ｕ／Ｗ１ｔ、最終濃度）とともに
インキュベートする。ｔ−ＰＡととのインキュベーショ
ン前、Ｄ−二量体反応性（５），５±７．５ ｎ１７ｍ
）において変化がないが、全サンプルに関する価は、
を−ＦＡインキュベーション後非常に増大して平均１８
，５８０±１１．７８ Ｏｎｒ ／ｗｔｔとなる。
前及び後のＤ−二量体ＥＬＩＳＡアッセイにおける血漿
免疫活性を示す。１０人の正常の人々から採取された（
えん酸処理血漿に８けるＤ−二量体濃度は、５０．３±
４．５ｎ？／１１ｔ（平均上５Ｄ）（左）であり；３７
℃で１時間ｔ−ＦＡ（２００μｍ／ｖ、最終濃度）との
インキュベーション後、濃度は３，５６０±１．２３８
ｎ？／ＩＬｔである。同一の血漿は又３７℃で２０分間
トロンビン（０，０５Ｕ／Ｗ１ｔ、最終濃度）とともに
インキュベートする。ｔ−ＰＡととのインキュベーショ
ン前、Ｄ−二量体反応性（５），５±７．５ ｎ１７ｍ
）において変化がないが、全サンプルに関する価は、
を−ＦＡインキュベーション後非常に増大して平均１８
，５８０±１１．７８ Ｏｎｒ ／ｗｔｔとなる。
トロンビン及びｔ−ＰＡＱの変化は、抗フィブリノーゲ
ン抗血清によるウェスターン・ブロッティング後見られ
るゲルパターンに反映される（第５図）。正常な血漿は
、大量のフィブリノーゲン及びう丁い二量体バンドを示
し；トロンビン曝露後は、より多い二量体が見られそし
て５種のより大きな橋かけ重合体に相当するバンドが存
在する。ｔ−ＰＡとのインキュベーション後、重合体に
相当するバンドは存在せず、完全な劣化を確証し、そし
℃フィブリノーゲンより小さいフラグメントのみが存在
する。
ン抗血清によるウェスターン・ブロッティング後見られ
るゲルパターンに反映される（第５図）。正常な血漿は
、大量のフィブリノーゲン及びう丁い二量体バンドを示
し；トロンビン曝露後は、より多い二量体が見られそし
て５種のより大きな橋かけ重合体に相当するバンドが存
在する。ｔ−ＰＡとのインキュベーション後、重合体に
相当するバンドは存在せず、完全な劣化を確証し、そし
℃フィブリノーゲンより小さいフラグメントのみが存在
する。
第５図は、トロンビン及び／又はｔ−ＦＡとのインキュ
ベーション後の血漿フィブリノーゲンの変化を示す。単
一の正常の血漿サンプルは、第４図におけるようにトロ
ンビン（３７℃で２０分間０．０５Ｕ／駐八 ｔ−ＦＡ
（３７℃で１時間２００μ７／紅）又はトロンビン次に
ｔ−ＰＡにょり処理される。５ＤＳ２％アガロースゲル
電気泳動後、ウェスターンブロッティングは抗フィブリ
ノーゲン抗血清を用いて行われる。
ベーション後の血漿フィブリノーゲンの変化を示す。単
一の正常の血漿サンプルは、第４図におけるようにトロ
ンビン（３７℃で２０分間０．０５Ｕ／駐八 ｔ−ＦＡ
（３７℃で１時間２００μ７／紅）又はトロンビン次に
ｔ−ＰＡにょり処理される。５ＤＳ２％アガロースゲル
電気泳動後、ウェスターンブロッティングは抗フィブリ
ノーゲン抗血清を用いて行われる。
前述の実験は、低濃度のトロンビンへの１０露及び／又
はｔ−ＰＡによるフィブリン分解の活性化から生ずる血
漿フィブリノーゲンに対する数独の効果を示す。第一に
、トロンビン及び因子Ｘｌｆｆの組合わさった作用から
生ずる生体外のクロット形成＝ｉＪに司溶性稿かけフィ
ブリン重合体に連続的且有意な増加が存在する（第１及
び２図参照）。第二に、フィブリン重合体はフィブリノ
ーゲンよりも急速に省化しく第３図）、不醪性フィブリ
ンにより立証されるｔ−ＰＡのフイフリン％異性が町浴
性橋かけフィブリン夏合体により保持されることを示す
。第三に、フラグメントＤ Ｄ ｔｉｃ ｉ６げるｒ鎖
橋かけエピトープと反応する七ツクローナル抗体ＤＤ／
３Ｂ６は、トロンビン添加前又は後血漿の同一の反応性
により示されるように、フィブリン重合体の同一の橋か
けγ＊Ｑ部位と反応しない（第４図）。これは、橋かけ
部位が抗体により妨害されること、又は劣化にともなう
追加の確認する特徴はＤＤ／３Ｂ６による抗体反応性の
決定に重要であることを示す。第四に、血漿ＯＴ浴注性
フィブリン劣化生成物が抗体により認識され（第４及び
５図〕；それ故血液に存在するフラグメントＤＤが溶解
したクロットからそしてこのような重合体から肪導でき
る。
はｔ−ＰＡによるフィブリン分解の活性化から生ずる血
漿フィブリノーゲンに対する数独の効果を示す。第一に
、トロンビン及び因子Ｘｌｆｆの組合わさった作用から
生ずる生体外のクロット形成＝ｉＪに司溶性稿かけフィ
ブリン重合体に連続的且有意な増加が存在する（第１及
び２図参照）。第二に、フィブリン重合体はフィブリノ
ーゲンよりも急速に省化しく第３図）、不醪性フィブリ
ンにより立証されるｔ−ＰＡのフイフリン％異性が町浴
性橋かけフィブリン夏合体により保持されることを示す
。第三に、フラグメントＤ Ｄ ｔｉｃ ｉ６げるｒ鎖
橋かけエピトープと反応する七ツクローナル抗体ＤＤ／
３Ｂ６は、トロンビン添加前又は後血漿の同一の反応性
により示されるように、フィブリン重合体の同一の橋か
けγ＊Ｑ部位と反応しない（第４図）。これは、橋かけ
部位が抗体により妨害されること、又は劣化にともなう
追加の確認する特徴はＤＤ／３Ｂ６による抗体反応性の
決定に重要であることを示す。第四に、血漿ＯＴ浴注性
フィブリン劣化生成物が抗体により認識され（第４及び
５図〕；それ故血液に存在するフラグメントＤＤが溶解
したクロットからそしてこのような重合体から肪導でき
る。
数棟の技術を用いて、低濃度の可溶性フィブリンが正常
の血漿中に見い出され、血栓症疾患の被が増大する。血
漿フイブリノベプナドＡｒｓ度（血栓症疾患で増大ハエ
、フィブリノ−ケンからのフイブリノペブテドＡの開裂
におけろトロンビンの作用を反映し、そして全身的トロ
ンビン作用の感受性マーカーであるが血漿可溶性フィブ
リンの間接的目安でろる。急性心筋梗塞後の１０倍の増
大及び０．６〜０６７〜／ｄｉの正常の血漿中の可溶性
フィブリンの濃度が、フイブリノーゲンアフイニテイク
ロマトグラフイを用いて見い出されて、トロンビン開裂
により曝露されたＱＩＷ−ｐｒｏ−ａｒｇ部位を含むフ
ィブリン分子を精製する。発作又は心筋梗塞の患者のＯ
Ｔ＠性フィブリンの増加は、ゲル濾過クロマトグラフィ
後大きな早（溶離するフィブリノーゲン抗原の増大によ
り推論される。
の血漿中に見い出され、血栓症疾患の被が増大する。血
漿フイブリノベプナドＡｒｓ度（血栓症疾患で増大ハエ
、フィブリノ−ケンからのフイブリノペブテドＡの開裂
におけろトロンビンの作用を反映し、そして全身的トロ
ンビン作用の感受性マーカーであるが血漿可溶性フィブ
リンの間接的目安でろる。急性心筋梗塞後の１０倍の増
大及び０．６〜０６７〜／ｄｉの正常の血漿中の可溶性
フィブリンの濃度が、フイブリノーゲンアフイニテイク
ロマトグラフイを用いて見い出されて、トロンビン開裂
により曝露されたＱＩＷ−ｐｒｏ−ａｒｇ部位を含むフ
ィブリン分子を精製する。発作又は心筋梗塞の患者のＯ
Ｔ＠性フィブリンの増加は、ゲル濾過クロマトグラフィ
後大きな早（溶離するフィブリノーゲン抗原の増大によ
り推論される。
第１及び２図で同定される橋かけフィブリン重合体は、
因子Ｘ１１１αの追加の作用を要してフィブリン単量体
のｒ鎖を橋かけする。三、四のファクターは、凝固の活
性化中トロンビン及び因子ＸＵｔαのこのような協同作
用の概念を支持する。生体外の血漿の自然発生的なりク
ツティング中、フィブリノペブテドの開裂及び因子Ｘｌ
［［の活性化は密接に関連した現象である。フィブリン
へのトロンビン及び因子Ｘ１ｌｌの両方の結合は、血漿
中のフィブリン重合体によるトロンビン触媒化因子ｘｔ
ｎα形成の増大を説明できる。従来の研究は、血栓症疾
患の患者から得られる血漿の抽出物中のγ頚二量体を同
定することにより循環する橋かけフィブリン重合体につ
いて間接的な証拠を提供する。電気泳動技術を用い℃、
本発明者は、正常な血漿中の橋かけフィブリン単量体の
低濃度及び急性心筋梗塞の患者の有意な上昇を直接立証
した。
因子Ｘ１１１αの追加の作用を要してフィブリン単量体
のｒ鎖を橋かけする。三、四のファクターは、凝固の活
性化中トロンビン及び因子ＸＵｔαのこのような協同作
用の概念を支持する。生体外の血漿の自然発生的なりク
ツティング中、フィブリノペブテドの開裂及び因子Ｘｌ
［［の活性化は密接に関連した現象である。フィブリン
へのトロンビン及び因子Ｘ１ｌｌの両方の結合は、血漿
中のフィブリン重合体によるトロンビン触媒化因子ｘｔ
ｎα形成の増大を説明できる。従来の研究は、血栓症疾
患の患者から得られる血漿の抽出物中のγ頚二量体を同
定することにより循環する橋かけフィブリン重合体につ
いて間接的な証拠を提供する。電気泳動技術を用い℃、
本発明者は、正常な血漿中の橋かけフィブリン単量体の
低濃度及び急性心筋梗塞の患者の有意な上昇を直接立証
した。
組藏プラスミノーゲン活性体は、フィブリンについて高
（・親和性を有しそして選択的にフィブリン結合プラス
ミノーゲンを活性化し、性質は生理学的フィブリン分解
を局在化するのに働きセして又治療剤とし℃のｔ−ＰＡ
の相対的フィブリン選択性の理論上の基礎を形成する。
（・親和性を有しそして選択的にフィブリン結合プラス
ミノーゲンを活性化し、性質は生理学的フィブリン分解
を局在化するのに働きセして又治療剤とし℃のｔ−ＰＡ
の相対的フィブリン選択性の理論上の基礎を形成する。
ｏＴＴ性フィブリンは又ｔ−ＰＡによるプラスミノーゲ
ンの活性化を刺激しそし℃この観察はｏ７溶性フィブリ
ンを測定する可能性のある方法とし℃開発されている。
ンの活性化を刺激しそし℃この観察はｏ７溶性フィブリ
ンを測定する可能性のある方法とし℃開発されている。
従って本発明者は、単量体に比べて可溶性橋かけフィブ
リン二量体の選択的劣化を立証しく第３図）、ｔ−ＰＡ
のフィブリン特異性と一枚する。可溶性橋かけフィブリ
ン重合体に比べて固体フィブリンに関するｔ−ＰＡの相
対的親和性は知られていないが、ｔ−ＰＡの治療的投与
はフィブリノーゲンよりむしろ倫かけフィブリン重合体
の劣化をもたらすように見える。橋かけフィブリン重合
体は、ｔ−ＰＡ投投与全全身的溶解状態の発展中劣化さ
れる血漿「フィブリノーゲン」の最初の成分であろう。
リン二量体の選択的劣化を立証しく第３図）、ｔ−ＰＡ
のフィブリン特異性と一枚する。可溶性橋かけフィブリ
ン重合体に比べて固体フィブリンに関するｔ−ＰＡの相
対的親和性は知られていないが、ｔ−ＰＡの治療的投与
はフィブリノーゲンよりむしろ倫かけフィブリン重合体
の劣化をもたらすように見える。橋かけフィブリン重合
体は、ｔ−ＰＡ投投与全全身的溶解状態の発展中劣化さ
れる血漿「フィブリノーゲン」の最初の成分であろう。
可溶性橋かけフィブリン重合体の劣化は、特にフィブリ
ン分解治療の設定に「フィブリン特異性」劣化生成物の
ためのアッセイの結果を評価するのに考えなければなら
ない。
ン分解治療の設定に「フィブリン特異性」劣化生成物の
ためのアッセイの結果を評価するのに考えなければなら
ない。
γ鎖倫かけエピトープに向うモノクローナル抗体は、可
溶性僑かけフィブリンのこの部位と殆んど反応性を有し
ないように見えるが、フィブリンのプラスミン劣化は顕
著に免疫活性を増大させる（第４図）。フィブリン分解
剤例えばストレプトキナーゼの投与により、血漿フィブ
リノーゲンの顕著な劣化が生ずる。血漿橋かゆフィブリ
ン重合体の同時の劣化は、恐ら（血漿Ｄ−二量体の得ら
れた上昇とともに生ずる。血漿フィブリノーゲンは、又
フィブリン選択性剤例えばｔ−ＰＡの投与により低下し
、そして血漿橋かげフィブリン重合体がフィブリノーゲ
ンに比べて選択的に劣化するので（第３図）、血漿Ｄ−
二量体の増加が同様にこの条件下で予想されよう。正常
なものへのｔ−ＰＡの投与は、本発明で用いられたのと
は異る抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定し℃、９８０
ｎｒ／紅へ血漿Ｄ−二二量を増加することが報告されて
いる（ ＤｇｃＬｅｒｃｋ、Ｐ、ら、Ｔ ｈｒｏｍｂ
−Ｈａｍｒｎｏａｔ、 ５８ ： ２８１ 、１９８７
）。急性心筋梗塞に対する血栓崩壊治療後、Ｉ ５００
ｎｆ ／ｍｅ 〜Ｉ Ｏ，７３２Ｂｆ／ｒｎｌの広い
範囲のＤ−二量体濃度が、種々の技術を用いて報告され
ている。ここに提出されたデータ（第４図）は、これら
の上昇の人ぎな部分ρＳ可溶性フィブリン重合体の劣化
から誘導したことを示唆している。対照的に、２４．２
００ ｎｆ／１！１！及び６４．００ Ｏｎｆ ／ｌｔ
ｌと（・うより高い量（深部静脈血栓症に対するフィブ
リン分解治療後に測定される）そして肺動脈塞栓症に関
する１ ００．００ Ｏｎｔ／紅以内は、血漿ｉ＝Ｊ溶
性フィブリン重合体から完全に生ぜず、七し℃血栓の溶
解からの追加の倫かけフィブリン劣化生成物を必要とし
よう。
溶性僑かけフィブリンのこの部位と殆んど反応性を有し
ないように見えるが、フィブリンのプラスミン劣化は顕
著に免疫活性を増大させる（第４図）。フィブリン分解
剤例えばストレプトキナーゼの投与により、血漿フィブ
リノーゲンの顕著な劣化が生ずる。血漿橋かゆフィブリ
ン重合体の同時の劣化は、恐ら（血漿Ｄ−二量体の得ら
れた上昇とともに生ずる。血漿フィブリノーゲンは、又
フィブリン選択性剤例えばｔ−ＰＡの投与により低下し
、そして血漿橋かげフィブリン重合体がフィブリノーゲ
ンに比べて選択的に劣化するので（第３図）、血漿Ｄ−
二量体の増加が同様にこの条件下で予想されよう。正常
なものへのｔ−ＰＡの投与は、本発明で用いられたのと
は異る抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定し℃、９８０
ｎｒ／紅へ血漿Ｄ−二二量を増加することが報告されて
いる（ ＤｇｃＬｅｒｃｋ、Ｐ、ら、Ｔ ｈｒｏｍｂ
−Ｈａｍｒｎｏａｔ、 ５８ ： ２８１ 、１９８７
）。急性心筋梗塞に対する血栓崩壊治療後、Ｉ ５００
ｎｆ ／ｍｅ 〜Ｉ Ｏ，７３２Ｂｆ／ｒｎｌの広い
範囲のＤ−二量体濃度が、種々の技術を用いて報告され
ている。ここに提出されたデータ（第４図）は、これら
の上昇の人ぎな部分ρＳ可溶性フィブリン重合体の劣化
から誘導したことを示唆している。対照的に、２４．２
００ ｎｆ／１！１！及び６４．００ Ｏｎｆ ／ｌｔ
ｌと（・うより高い量（深部静脈血栓症に対するフィブ
リン分解治療後に測定される）そして肺動脈塞栓症に関
する１ ００．００ Ｏｎｔ／紅以内は、血漿ｉ＝Ｊ溶
性フィブリン重合体から完全に生ぜず、七し℃血栓の溶
解からの追加の倫かけフィブリン劣化生成物を必要とし
よう。
従って、生体外のｔ−ＦＡ劣化後のＤ−二量体の血漿濃
度は、儂壊する欄かけフィブリン１合体の間接的な目安
とじ℃用いることができる。Ｍｒ１９５，０００を有す
るフラグメントｌ）Ｄは、＆ｒ６８０．０００を有する
フィブリン二量体の３０％を示す。急性心筋梗塞にかか
った患者では、本発明者は、正常人の０．８％に比べて
３６〜４．０％のフィブリン二量体の血漿濃度を電気泳
動技術を用（・て見い出した。生体外の血漿のｔ−ＦＡ
劣化後の３．５６０ ｒ＆ ／ａのＤ−二量体という観
察（第・１図月家、僑かげフィブリン二量体の最初の１
ｔ、８６７ ｎｌ／”ｌを要し、その量は正常人の以
前の測定と両立しうる、僅か０．４％の全血漿フィブリ
ノーゲンのみを示す血漿フィブリン重合体の劣化により
提供されよう。同様に、生体外のトロンビン曝露後１８
，５８０−／αとい５値（第４図）は、２，１チの血漿
フィブリノーゲンを示ｊ６１，９００ ｄ／’Ｉｌｌの
血漿橋かげフィブリンから誘導される。これらの値は、
Ｄ−二量体への生体外の劣化が前述した面漿橋かけフィ
ブリン重合体濃度の簡単な間接的な目安として用（・る
ことかできることを明らかにする。
度は、儂壊する欄かけフィブリン１合体の間接的な目安
とじ℃用いることができる。Ｍｒ１９５，０００を有す
るフラグメントｌ）Ｄは、＆ｒ６８０．０００を有する
フィブリン二量体の３０％を示す。急性心筋梗塞にかか
った患者では、本発明者は、正常人の０．８％に比べて
３６〜４．０％のフィブリン二量体の血漿濃度を電気泳
動技術を用（・て見い出した。生体外の血漿のｔ−ＦＡ
劣化後の３．５６０ ｒ＆ ／ａのＤ−二量体という観
察（第・１図月家、僑かげフィブリン二量体の最初の１
ｔ、８６７ ｎｌ／”ｌを要し、その量は正常人の以
前の測定と両立しうる、僅か０．４％の全血漿フィブリ
ノーゲンのみを示す血漿フィブリン重合体の劣化により
提供されよう。同様に、生体外のトロンビン曝露後１８
，５８０−／αとい５値（第４図）は、２，１チの血漿
フィブリノーゲンを示ｊ６１，９００ ｄ／’Ｉｌｌの
血漿橋かげフィブリンから誘導される。これらの値は、
Ｄ−二量体への生体外の劣化が前述した面漿橋かけフィ
ブリン重合体濃度の簡単な間接的な目安として用（・る
ことかできることを明らかにする。
抛々のプラスミノーゲン活性体がＤ−二量体を缶底する
のに本発明で用いることができることは理解されよう。
のに本発明で用いることができることは理解されよう。
般に、任意の蛋白分解酵素例えばストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼ、トリプシンなどが用いられる。既に示し
たようにｇ−ＰＡ及びプラスミ／が好ましい。
ウロキナーゼ、トリプシンなどが用いられる。既に示し
たようにｇ−ＰＡ及びプラスミ／が好ましい。
本発明が免疫アッセイのモノクローナル抗体に制限され
ないことも又理解されよう。従つ工フイブリノーゲン又
はフィブリンに対するよりもＤ−二量体に対して特異的
な任意の抗体が用いられる。既に述べたよ５に、適切な
モノクローナル抗体が好ましい。以下のキットの記載に
関し℃、免疫アッセイキットに２種のタイプがあり、そ
の一つはサンドウイテ・アプローチを用いる直接アッセ
イである。これらのキットは、標準物、表面上で通常不
動化される第一の抗体（即ち捕獲抗体ン及び単一の発生
物によりラベルされた第二の抗体のセットを含む。ラベ
ルは任意の検出可能な物例えば放射注物、酵素、蛍光団
、化学団などである。
ないことも又理解されよう。従つ工フイブリノーゲン又
はフィブリンに対するよりもＤ−二量体に対して特異的
な任意の抗体が用いられる。既に述べたよ５に、適切な
モノクローナル抗体が好ましい。以下のキットの記載に
関し℃、免疫アッセイキットに２種のタイプがあり、そ
の一つはサンドウイテ・アプローチを用いる直接アッセ
イである。これらのキットは、標準物、表面上で通常不
動化される第一の抗体（即ち捕獲抗体ン及び単一の発生
物によりラベルされた第二の抗体のセットを含む。ラベ
ルは任意の検出可能な物例えば放射注物、酵素、蛍光団
、化学団などである。
免疫アッセイの第二のタイプは、競合タイプである。こ
れらのキットは、標準物、ラベルした抗原及び特異的抗
体を含む。キットは、又特異的バッファー、基質、分離
剤及びコントロールを含む。キットは、前述の患者サン
プルを処理するための採取装置又は化学品を含むことが
できる。本発明では、試料は血漿でめりそして従来の技
術により採取される。このキットは、試料（サンプル）
を処理のためのプラスミノーゲン活性体又は活性プラス
ミンを含むだろう。
れらのキットは、標準物、ラベルした抗原及び特異的抗
体を含む。キットは、又特異的バッファー、基質、分離
剤及びコントロールを含む。キットは、前述の患者サン
プルを処理するための採取装置又は化学品を含むことが
できる。本発明では、試料は血漿でめりそして従来の技
術により採取される。このキットは、試料（サンプル）
を処理のためのプラスミノーゲン活性体又は活性プラス
ミンを含むだろう。
第１図は、トロンビンの添加後の血漿中の橋かけフィブ
リン重合体を示す。 第２図は、凝固時間に関連するトロンとン祭加後の血漿
中の僑かけフィブリン重合体の増加の定量を示す。 第３Ａ図は、血漿中のフィブリノーゲン及び倫かけフィ
ブリン重合体のｔ−ＦＡ誘発劣化を示す。 第３Ｂ図は、フィブリン重合体及びフィブリノーゲン／
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較である
。 第４図は、トロンビン及び／又はｔ−ｐＡ処理前及び後
のＤ−二量体ＥＬＩＳＡアッセイの血漿免疫活性を示す
。 第５図は、トロンビン及び／又はｔ−ＦＡとのインキュ
ベーション後の血漿フイブリノーゲ／の変化を示す。 Ｘ＞０田 ）１ｆ（
リン重合体を示す。 第２図は、凝固時間に関連するトロンとン祭加後の血漿
中の僑かけフィブリン重合体の増加の定量を示す。 第３Ａ図は、血漿中のフィブリノーゲン及び倫かけフィ
ブリン重合体のｔ−ＦＡ誘発劣化を示す。 第３Ｂ図は、フィブリン重合体及びフィブリノーゲン／
フィブリン単量体のプラスミン劣化の速度の比較である
。 第４図は、トロンビン及び／又はｔ−ｐＡ処理前及び後
のＤ−二量体ＥＬＩＳＡアッセイの血漿免疫活性を示す
。 第５図は、トロンビン及び／又はｔ−ＦＡとのインキュ
ベーション後の血漿フイブリノーゲ／の変化を示す。 Ｘ＞０田 ）１ｆ（
Claims (13)
- （１）患者サンプル中の橋かけ可溶性フィブリン重合体
を生体外で測定する方法において、該サンプルと蛋白分
解酵素とを接触させて該フィブリン重合体のＤ−二量体
フラグメントを発生させ、そして該Ｄ−二量体の量を測
定することよりなる方法。 - （２）蛋白分解酵素が組織プラスミノーゲン活性体又は
プラスミンである請求項１記載の方法。 - （３）患者サンプル中の橋かけ可溶性フィブリン重合体
を生体外で測定する方法において、該サンプルと蛋白分
解酵素とを接触させて該フィブリン重合体のＤ−二量体
フラグメントを発生させ、そして該Ｄ−二量体に特異的
な免疫アツセイの使用により該Ｄ−二量体の量を測定す
ることよりなる方法。 - （４）蛋白分解酵素が組織プラスミノーゲン活性体又は
プラスミンである請求項３記載の方法。 - （５）プラスミンがプラスミノーゲン活性体によるプラ
スミンへのプラスミノーゲンの転換により生成する請求
項２又は４記載の方法。 - （６）プラスミノーゲン活性体が組織プラスミノーゲン
活性体である請求項５記載の方法。 - （７）フィブリン重合体よりもＤ−二量体と好ましく反
応する抗体が該免疫アツセイに用いられる請求項３記載
の方法。 - （８）モノクローナル抗体が該免疫アツセイに用いられ
る請求項３記載の方法。 - （９）モノクローナル抗体が（ＤＤ／３Ｂ６）である請
求項８記載の方法。 - （１０）密に局限された一連の容器を受容するように区
分された担体よりなる患者サンプル中のＤ−二量体の量
をアツセイするための診断キットにおいて、 （ａ）橋かけ可溶性フィブリン重合体を含む標準の測定
された量を含有する第一の容器； （ｂ）蛋白分解酵素の測定された量を含有する第二の容
器、及び （ｃ）該Ｄ−二量体に対して特異的な抗体を含有する第
三の容器 よりなる診断キット。 - （１１）抗体がモノクローナル抗体である請求項１０記
載のキット。 - （１２）モノクローナル抗体が（ＤＤ／３Ｂ６）である
請求項１０記載のキット。 - （１３）蛋白分解酵素が組織プラスミノーゲン活性体又
はプラスミンである請求項１０記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21357288A | 1988-06-24 | 1988-06-24 | |
| US213572 | 1988-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02112763A true JPH02112763A (ja) | 1990-04-25 |
| JP2657417B2 JP2657417B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=22795625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1159825A Expired - Lifetime JP2657417B2 (ja) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | 可溶性橋かけフィブリン重合体のアッセイ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0347933B1 (ja) |
| JP (1) | JP2657417B2 (ja) |
| AT (1) | ATE111532T1 (ja) |
| DE (1) | DE68918170T2 (ja) |
| DK (1) | DK313889A (ja) |
| ES (1) | ES2060698T3 (ja) |
| IE (1) | IE67430B1 (ja) |
| PT (1) | PT90941B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004507745A (ja) * | 2000-08-28 | 2004-03-11 | ソシエテ・ディアグノスティカ−スタゴー | 可溶性フィブリンのアッセイ法 |
| JP2009536331A (ja) * | 2006-05-05 | 2009-10-08 | ディアグノスチカ・スタゴ | 可溶性フィブリン及びｄ−ダイマーの測定による静脈血栓塞栓症の検出 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453359A (en) | 1988-06-13 | 1995-09-26 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers |
| FR2703788B1 (fr) * | 1993-04-09 | 1996-12-20 | Jacques Toledano | Dispositif et procede anti-idiotype de detection immunologique. |
| SE9403833D0 (sv) * | 1994-11-08 | 1994-11-08 | Global Hemostasis Inst Mgr Ab | Analysförfarande och kit |
| CN102206276B (zh) * | 2001-06-26 | 2013-07-17 | 艾根生物医学有限公司 | 血纤维蛋白d-二聚体片段特异性的、来源于dd-3b6/22的人源化抗体 |
| DE10247876A1 (de) * | 2002-10-14 | 2004-05-13 | Aventis Behring Gmbh Intellectual Property/Legal | Verfahren zur Bestimmung von Multimeren von Plasmaproteinen |
| WO2006118195A1 (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | 安定化フィブリンのプラスミン分解物の免疫学的分析方法 |
| CN110007094B (zh) * | 2019-04-29 | 2022-04-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 人d-二聚体定量检测卡及其临床应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183696A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-10-18 | エイジェン・バイオメディカル・リミテッド | 架橋フイブリン誘導体特異性モノクロ−ナル抗体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3430906A1 (de) * | 1984-08-22 | 1986-02-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von fibrinmonomer in plasma |
| IL83631A0 (en) * | 1986-08-25 | 1988-01-31 | American Biogenetic Sciences | Monoclonal antibodies to fibrin |
-
1989
- 1989-06-21 IE IE201089A patent/IE67430B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-22 PT PT90941A patent/PT90941B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 DK DK313889A patent/DK313889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-06-23 ES ES89111471T patent/ES2060698T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-23 DE DE68918170T patent/DE68918170T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-23 EP EP89111471A patent/EP0347933B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-23 AT AT89111471T patent/ATE111532T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 JP JP1159825A patent/JP2657417B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59183696A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-10-18 | エイジェン・バイオメディカル・リミテッド | 架橋フイブリン誘導体特異性モノクロ−ナル抗体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004507745A (ja) * | 2000-08-28 | 2004-03-11 | ソシエテ・ディアグノスティカ−スタゴー | 可溶性フィブリンのアッセイ法 |
| JP2009536331A (ja) * | 2006-05-05 | 2009-10-08 | ディアグノスチカ・スタゴ | 可溶性フィブリン及びｄ−ダイマーの測定による静脈血栓塞栓症の検出 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK313889D0 (da) | 1989-06-23 |
| DE68918170T2 (de) | 1995-03-02 |
| IE892010L (en) | 1989-12-24 |
| PT90941B (pt) | 1994-11-30 |
| PT90941A (pt) | 1989-12-29 |
| EP0347933B1 (en) | 1994-09-14 |
| ES2060698T3 (es) | 1994-12-01 |
| IE67430B1 (en) | 1996-04-03 |
| EP0347933A2 (en) | 1989-12-27 |
| DK313889A (da) | 1989-12-25 |
| JP2657417B2 (ja) | 1997-09-24 |
| EP0347933A3 (en) | 1990-10-17 |
| ATE111532T1 (de) | 1994-09-15 |
| DE68918170D1 (de) | 1994-10-20 |
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