JP5049448B2 - 可溶性フィブリンのアッセイ法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、血液試料において特異的分解産物を生成させることにより可溶性フィブリンをアッセイするための方法に関する。
【０００２】
凝固が活性化されると、トロンビンが生成し、これがフィブリン析出物の形成及び可溶性フィブリンの形成を引き起こす。
【０００３】
トロンビンは、フィブリノーゲン分子からフィブリノペプチドＡを解離させることにより、フィブリンモノマーを生成させるが、フィブリン上では（フィブリノーゲンではマスクされていた）「Ａ」重合部位が姿を現し、フィブリンモノマーの「Ａ」部位と、フィブリノーゲン及びフィブリン両方にある接近しやすい「ａ」部位との間の相互作用を引き起こす。次に、フィブリノペプチドＢが放出されることにより、「Ｂ」重合部位が姿を現し、フィブリンモノマーの分子の「Ｂ」部位と、フィブリノーゲン及びフィブリン両方にある接近しやすい「ｂ」部位との間に相互作用を引き起こす。
【０００４】
トロンビンの量が非常に高い（インビトロ試験）とき、全てのフィブリノーゲンは、フィブリンモノマーに変換し、次に「Ａ」と「ａ」、及び「Ｂ」と「ｂ」部位との相互作用により重合して、フィブリンの凝血塊が生じる。しかしインビボでは、トロンビンはそれほど多く生成しない。フィブリンモノマーの生成は、それほど爆発的ではなく、そのため、フィブリンモノマーの一部は、重合してフィブリン（血栓）が生じ、そして更に別の一部は、ａ及びｂ部位が接近しやすいフィブリノーゲンと、又はフィブリノーゲン分解産物と反応して、フィブリンモノマーがフィブリノーゲンと会合した可溶性フィブリンが生じる。
【０００５】
可溶性フィブリンは、患者に凝固活性化物が存在するかどうかを試験するために測定される（血液中、特に血漿中の可溶性フィブリンの存在は、このような活性化の証拠を与える）。
【０００６】
この測定は、血栓を構成するフィブリンのフィブリン溶解により形成されるＤ−ダイマーのアッセイに対して必要な補完であり、そしてこれは、凝固活性化プロセスのマーカーでもある。血漿中のＤ−ダイマー数は、凝血塊がインビボで分解されると増大する。このため、血栓が存在し、かつ分解のプロセスにあるならば、Ｄ−ダイマー数は、凝固が持続しているか、停止しているかに関わらず増大する；これとは対照的に、可溶性フィブリン数は、凝固が停止すればもはや増大することはなく、反対に、凝固が持続するならば増大する。
【０００７】
よってＤ−ダイマー数に対する血漿中の可溶性フィブリン含量の特異的測定により、以下のことが可能である：
１． 試料を採った時点の患者に凝固プロセスが存在するかどうかの決定；
２． 凝固−線溶均衡の評価。基礎Ｄ−ダイマー数はインビボの血栓分解の反映である；血漿に血栓溶解剤を加えた後に得られるＤ−ダイマー数は、基礎Ｄ−ダイマーと循環フィブリンの分解に由来するもの（即ち、可溶性フィブリン）との合計を表す。
【０００８】
引用することができるフィブリンをアッセイするための最も初期の方法は、エタノール試験（１，２，９）又は硫酸プロタミン試験（３，４，５，７）を含む。しかし、これらの試験は、あまり特異的でなく（９，１０）、あまり感度も高くない（１０）。更には、フィブリノーゲン数が大きい（＞５g/l）と、エタノール試験及び硫酸プロタミン試験で得られる結果は混乱する。最後に、硫酸プロタミン試験結果は、解釈するのが難しいことがある（６，８）。
【０００９】
可溶性フィブリンを検出するための更に別の方法は、Largoにより報告（１１，１２）された方法を用いる、フィブリンモノマーで感作した赤血球の血球凝集の技術に基づく。この型の試験は、例えば、ダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）によりＦＳテスト（FS Test）として販売されている。
【００１０】
この技術は、非常に簡単ではあるが、時に感度に欠けていることがあり、特に播種性血管内血液凝固の診断に向いている。しかしこれは、少量の可溶性フィブリンを検出できない（局所的血栓症、抗凝固薬物の有効性の調査）。
【００１１】
現在のところ、可溶性フィブリンをアッセイするための他の技術は、フィブリンの露出エピトープ（そしてフィブリノーゲンではマスクされている）又はフィブリン若しくはフィブリン分解の産物を検出するモノクローナル抗体の使用に基づく（１３〜１４）。しかし、モノクローナル抗体を使用する直接アッセイ法では、使用される市販の抗体に依存して変化する可溶性フィブリン数が得られる。
【００１２】
本発明の著者らは、患者における凝固−線溶均衡を評価するための、特に簡単かつ迅速な、先行技術とは異なるアプローチを提唱する。これは、上述の血球凝集法よりも感度が高い。これは、モノクローナル抗体を使用する試験と比較して、循環フィブリン（可溶性）と、既にインビボで分解したフィブリンを検出するために同一法を利用し、これによって凝固−線溶均衡の非常に正確な評価を与えるという利点を有する。
【００１３】
本発明の方法において、試料中に存在する可溶性フィブリンは、フィブリンに対して高い特異性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）との試料のインキュベーションの間に、可溶性フィブリン分解産物を生成後に測定される。ＰＡ−Ｆｂ ｓｐでの可溶性フィブリンの分解後に得られる分解産物の数と、試料をＰＡ−Ｆｂ ｓｐと接触させる前に測定した基礎フィブリンの分解産物の数の間の差から、測定すべき試料中の血漿可溶性フィブリン数が得られる。
【００１４】
よって本発明は、生物学的試料中の可溶性フィブリンをアッセイするための方法であって、該試料をフィブリンに対して高い親和性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）と接触させ、そしてＰＡ−Ｆｂ ｓｐで可溶性フィブリンを分解後に得られる分解産物の数と、該試料をＰＡ−Ｆｂ ｓｐと接触させる前に測定したフィブリン分解産物の基礎数との差を測定することにより、試料中の可溶性フィブリンの数を測定する方法を提供する。
【００１５】
生物学的試料中の本発明の可溶性フィブリンをアッセイするための方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
・血漿試料に含まれるフィブリン分解産物をアッセイすること；
・血液試料を、フィブリンに対して高い特異性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）と、試料に含まれる可溶性フィブリンをその分解産物へと分解できる条件下で接触させること；
・ＰＡ−Ｆｂ ｓｐとインキュベートした試料中のフィブリン分解産物をアッセイすること；
・ＰＡ−Ｆｂ ｓｐとのインキュベーション後に評価したフィブリン分解産物の数と未処理試料で評価したフィブリン分解産物の数との差に対応する可溶性フィブリンを決定すること。
【００１６】
分解産物をアッセイするのに使用される試薬は、所定の群の分解産物を測定するために選択される。一例として、特定の型の分解産物に対して所定の特異性を持つ抗体が使用される。
【００１７】
生物学的試料は、好ましくは生物学的液体、例えば、血液若しくは血漿試料、又はドレナージによるものである。
【００１８】
本発明はまた、特異的分解産物を生成させることにより、可溶性フィブリンをアッセイするための方法における、フィブリンに対して高い親和性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（即ち、フィブリン中のプラスミノーゲンだけを活性化する）の使用に関する。本発明はまた、上述の方法を実施するためのキットに関する。
【００１９】
幾つかのプラスミノーゲンアクチベーターが知られている。しかしあるものは、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼのように、フィブリノーゲンとフィブリンの両方を分解する（１５）。このような化合物は、フィブリノーゲンの分解を起こして、フィブリノーゲン分解産物を生じさせ、これがフィブリン分解により生じる産物を妨害するため、本発明の方法には適切でない。
【００２０】
プラスミノーゲンアクチベーターの第２の群は、フィブリノーゲンに比較してフィブリンを分解することに対して高い特異性を有することが報告されている化合物により構成される。本発明の方法は、有利にはこの第２群の化合物の特異性を利用する。
【００２１】
このような特異性を持つ種々の化合物（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）は、文献に報告されている。既知の例は以下である：
・組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、又はＴＮＫ−ｔＰＡ（フィブリンに対して非常に高い特異性を持つｔ−ＰＡの変種（１６））のようなその誘導体；
・吸血コウモリ（Desmodus rotundus）唾液由来のアクチベーター（ｂａｔ−ｔＰＡ又はｖＰＡ＝吸血コウモリ（Vampire bat）唾液プラスミノーゲンアクチベーター）又はその誘導体：ＤＳＰＡ＝吸血コウモリ唾液ＰＡ（Desmodus rotundus salivary PA）、ＦＥＫＰ＝ＤＳＰＡアルファ１及びアルファ２、ＥＫＰ＝ＤＳＰＡベータ、ＫＰ＝ＤＳＰＡガンマ（１７）；
・黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）により分泌されるポリペプチドである、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）（１８〜１９）又はその変種の１つ（２０）。
【００２２】
本発明の方法は、好ましくは血漿試料で行われる。可溶性フィブリン数は、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じる分解産物を測定することにより決定される。必要であれば、本方法は、可溶性フィブリンの生成の原因ではあるが凝血塊の形成は引き起こさない凝固活性化を誘導するために、痕跡量のトロンビンで処理した正常血漿から得られる陽性対照を用いて検証される。
【００２３】
陽性血漿対照を得るために、血漿は最初にトロンビン又は他の凝固アクチベーターと共に一定時間インキュベートする。そして開始した凝固プロセスは次に、反応の継続を妨害するためにアクチベーターインヒビターを添加することによりブロックされる。このアクチベーターがトロンビンであるとき、例えば、ヒルジン又はヘパリンがインヒビターとして使用される。
【００２４】
血漿インキュベーション時間並びに凝固アクチベーター及びブロッキングインヒビターの濃度は、有利には凝血塊形成の発生に先立つ全ての凝固活性化段階が得られるように決定される。
【００２５】
凝固アクチベーター（トロンビン）の存在下でのインキュベーションは、好ましくは周囲温度で２分間のインキュベーション時間で行われる。次にインヒビターは、凝固のブロックを保証するために大過剰で加える。
【００２６】
・ヒルジンが使用されるならば、有利には０．１８U/mlの最終トロンビン濃度に対して１００μg/mlの最終濃度で使用される。
・ヘパリンが使用されるならば、使用されるトロンビンの最終濃度が０．１８U/mlであるとき、ヘパリンは５００U/mlの最終濃度で使用される。
【００２７】
本発明の可溶性フィブリンの評価は、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐで可溶性フィブリンを分解し、次にＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じる特異的分解産物を測定する、第１工程を利用する。
【００２８】
試料中に存在する可溶性フィブリンの量を表しているため、本発明の方法の結果をできる限り迅速に得ることが極めて重要である。このために、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの使用の条件は、可溶性フィブリンの分解が迅速であり、かつこのアッセイ法において可溶性フィブリンに由来する分解産物を妨害する分解産物を生じさせる循環血漿フィブリノーゲンの「汚染」分解を伴わないように、決定しなければならない。
【００２９】
ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの用量は、陽性対照におけるフィブリン分解産物数の最大増加、及び陰性対照（即ち、凝固アクチベーターで処理していない）における事実上ゼロ増加を誘導するように選択される。
【００３０】
本発明において、フィブリンの特異的分解を可能にする、種々のフィブリン溶解アクチベーターを使用することができる。有利には、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐは、上に引用されるアクチベーターにより形成される群から選択される、即ち：ｔＰＡとその誘導体、ＶＰＡ又はその誘導体、及びスタフィロキナーゼ又はその変種の１つ。好ましくは、ｔＰＡ又はスタフィロキナーゼ、更に好ましくはｔＰＡが使用される。
【００３１】
試料を３７℃で１５分間インキュベートするとき、使用されるスタフィロキナーゼの最終濃度は、１〜１２μg/mlの範囲である。最終保留濃度は、１０μg/mlである。インキュベーション時間は、調節することができ、その変動は、使用されるＰＡ−Ｆｂ ｓｐの性質と濃度の関数として決定される。
【００３２】
有利には、ｔＰＡが、１〜２．５μg/mlの範囲の最終濃度で使用される。好ましくは、ｔＰＡは、２μg/mlの濃度で使用される。
【００３３】
特異的に検出することができる、種々の可溶性フィブリン分解産物が存在する。好ましい具体例では、可溶性フィブリンに及ぼすＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じるＤ−ダイマー数を測定する（即ち、可溶性フィブリンに及ぼすＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じるＤ−ダイマーの濃度を評価する［（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用後のＤ−ダイマー）−（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用前の基礎Ｄ−ダイマー）］）。
【００３４】
ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの存在下での可溶性フィブリンの分解により生じるＤ−ダイマーは、ＥＬＩＳＡ型の方法、ラテックスビーズ凝集高感度法、免疫クロマトグラフィー法などのような、任意の日常的なアッセイ法を用いてアッセイすることができる。引用できる種々の市販のＤ−ダイマーアッセイ法の例は、アッセラクロムＤ−Ｄｉ（ASSERACHROM D-Di）又はＳＴＡリアテストＤ−Ｄｉ（STA LIATEST D-Di）（両方ともダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）が販売）である。しかし本発明において、アッセラクロムＤ−ＤｉからのＥＬＩＳＡ試験の使用の条件は、有利には試験時間を短縮するように調節されている（固定化抗体と１５分のインキュベーション及びペルオキシダーゼ標識抗体と１５分）。
【００３５】
ＤＤ／Ｅ断片の他に、ＹＤ／ＤＹ、ＹＤ／ＤＸＤ複合体のような、他のフィブリン分解産物が存在するが、これらは評価することができる。
【００３６】
以下の実施例に説明されるように（実施例３を参照のこと）、本発明の方法は、治療開始前又は抗凝固治療中又は抗凝固剤治療を停止後のいずれかに凝固活性化を示している患者で実施することができる。これにより、特に凝固活性化診断において、凝固活性化プロセスの変化を評価できるだけでなく、抗凝固剤治療の有効性を評価することができる。
【００３７】
更に別の側面において、本発明は、試料中の可溶性フィブリンの用量をアッセイするためのキットであって、
・上述のプロトコールを用いて得られる可溶性フィブリンの存在に関する陽性対照；
・対照血漿から構成される陰性対照；
・単一試料用の単一量の、又は複数試料に充分な量のＰＡ−Ｆｂ ｓｐ；
・Ｄ−ダイマーをアッセイするための試薬；及び
・場合により、０．１％のウシ胎仔血清及び０．０５％のトゥイーン２０を含むｐＨ７．４リン酸緩衝液のような、試料を希釈するための緩衝液
を含むことを特徴とするキットに関する。
【００３８】
陽性及び陰性血漿対照は、有利には凍結乾燥される。
【００３９】
好ましいＰＡ−Ｆｂ ｓｐは、ｔＰＡである。
【００４０】
Ｄ−ダイマーは、例えば、アッセラクロムＤ−Ｄｉ（ASSERACHROM D-Di）のようなＥＬＩＳＡ型の方法の試薬、又はＳＴＡリアテストＤ−Ｄｉ（STA LIATEST D-Di）（両方ともダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）が販売）のようなラテックス粒子凝集に対して高感度の試験法の試薬によりアッセイされる。
【００４１】
以下の実施例により、本発明を説明する。
【００４２】
実施例１：
可溶性フィブリンを含む陽性血漿対照を得るために使用されるトロンビン濃度の選択：
陽性血漿対照は、以下のプロトコールを用いて調製した：
正常血漿 ３００μl
ヒトトロンビン（スターゴ（Stago）照合番号００８９６）
２０U/ml ３０μl
インキュベーション、実験室温度で２分
ヒルジン（クノール（Knoll）） １００μg/ml（最終濃度）
又はヘパリン（ショエ（Choay）） ５００u/ml（最終濃度）
【００４３】
確認：
・チューブ内に凝血塊形成がないこと。
・市販の可溶性フィブリン検出試験が陽性であること（例えば、スターゴ（Stago）のＦＳテスト）。
【００４４】
表Ｉに示される２つの可能性を保留することができる。
【００４５】
【表１】
【００４６】
実施例２：
所定のインキュベーション条件下で使用すべきＰＡ−Ｆｂ ｓｐの量の決定
本発明の方法を実施するために、試料に加えるべきアクチベーターの量は、実施例１で得られるように、陽性対照血漿ではＤ−ダイマーの有意な生成を、そして陰性血漿対照（トロンビンで処理していない対照）ではＤ−ダイマーの微々たる生成を誘導するような量でなければならない。
【００４７】
対照血漿及び陽性対照血漿（ｎ＝２１）のインキュベーションは、種々の用量のＰＡ−Ｆｂ ｓｐと共に３７℃で１５分間実施した。インキュベーション時間の終わりに、Ｄ−ダイマーは、リアテスト（Liatest）又は迅速ＥＬＩＳＡ（Ｄ−Ｄｉスターゴ（D-Di Stago））により測定した（捕捉抗体と共に３７℃で１５分間及び描出抗体と共に３７℃で１５分間のインキュベーション）。
【００４８】
ＥＬＩＳＡ試験により表Ｉに示される結果を得た。
【００４９】
リアテスト（Liatest）（ｎ＝５）により実質的に同様の結果を得た。
【００５０】
【表２】
【００５１】
選択されるＰＡ−Ｆｂ ｓｐの用量は、以下を誘導するものである：
・未処理対照血漿（陰性対照）では＜３００ng/mlの増加；
・陽性対照血漿では最大の増加。
【００５２】
これらの結果から、使用すべきＰＡ−Ｆｂ ｓｐの好ましい最終濃度は、以下であると考えられる：
・ｔＰＡでは２μg/ml：このような条件下では、ＰＡＩにより中和することができるｔ−ＰＡの用量は無視してよい；
・ＳＡＫでは１０μg/ml（恐らく試料中の抗スタフィロキナーゼ（この抗スタフィロキナーゼは、ブドウ球菌（staphylococcus）感染の結果として出現しうる）の存在のため、少数の患者又は少数の陽性対照では最低量のＳＡＫによって、可溶性フィブリンの充分な分解性は引き起こせない）。
【００５３】
実施例３：
健常ボランティア及び凝固の活性化の疑い（Ｄ−ダイマーの増加のため）を示す患者において得られる結果
本法は、上述のプロトコールを用いて２つの血漿試料で実施した：ｔＰＡ（２μg/ml）又はＳＡＫ（１０μg/ml）の存在下で３７℃で１５分間血漿をインキュベート。
【００５４】
生成したＤ−ダイマーは、上述のようにＥＬＩＳＡ試験を用いてアッセイした。
【００５５】
Ａ． 健常ボランティアで得られた結果
【００５６】
【表３】
【００５７】
Ｂ． Ｄ−ダイマー数の上昇を示す患者で得られた結果
（迅速ＥＬＩＳＡにより実施した実験）
【００５８】
【表４】
【００５９】
結論：
本発明の方法は、その血漿中の可溶性フィブリン及びＤ−ダイマー数によって、患者を３群に分割することができる。これら３群それぞれの性状は、以下の表Ｖに要約される：
【００６０】
【表５】
【００６１】
上述のように、本発明の方法により、凝固活性化プロセスにおける変化を追跡できるだけでなく、抗凝固薬物の効力を評価することも、また薬物の停止が凝固を再活性化するかどうかを確認することもできる。
【００６２】
グループ１：可溶性フィブリンは増加しているが、Ｄ−ダイマーの上昇はない、初期凝固活性化。
グループ２：凝固活性化は停止している（有効な薬物）が、既に形成された血栓は分解し続けている患者（可溶性フィブリン数正常、Ｄ−ダイマー数上昇）。
グループ３：インビボの凝血塊分解を伴い、凝固活性化を示す患者（可溶性フィブリンとＤ−ダイマーの同時上昇）：充分に有効でない薬物。
【００６３】
実施例４：
利用した方法の要約：
試薬：
ｐＨ７．４緩衝液
精製ヒトトロンビン（スターゴ（Stago）照合番号００８９６）
ｔ−ＰＡ（ベーリンガー（Boehringer））
アプロチニン。４℃の貯蔵溶液。
Ｄ−ダイマーのキット
【００６４】
利用した方法は、表VIに要約される。
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
本発明は、血液試料において特異的分解産物を生成させることにより可溶性フィブリンをアッセイするための方法に関する。
【０００２】
凝固が活性化されると、トロンビンが生成し、これがフィブリン析出物の形成及び可溶性フィブリンの形成を引き起こす。
【０００３】
トロンビンは、フィブリノーゲン分子からフィブリノペプチドＡを解離させることにより、フィブリンモノマーを生成させるが、フィブリン上では（フィブリノーゲンではマスクされていた）「Ａ」重合部位が姿を現し、フィブリンモノマーの「Ａ」部位と、フィブリノーゲン及びフィブリン両方にある接近しやすい「ａ」部位との間の相互作用を引き起こす。次に、フィブリノペプチドＢが放出されることにより、「Ｂ」重合部位が姿を現し、フィブリンモノマーの分子の「Ｂ」部位と、フィブリノーゲン及びフィブリン両方にある接近しやすい「ｂ」部位との間に相互作用を引き起こす。
【０００４】
トロンビンの量が非常に高い（インビトロ試験）とき、全てのフィブリノーゲンは、フィブリンモノマーに変換し、次に「Ａ」と「ａ」、及び「Ｂ」と「ｂ」部位との相互作用により重合して、フィブリンの凝血塊が生じる。しかしインビボでは、トロンビンはそれほど多く生成しない。フィブリンモノマーの生成は、それほど爆発的ではなく、そのため、フィブリンモノマーの一部は、重合してフィブリン（血栓）が生じ、そして更に別の一部は、ａ及びｂ部位が接近しやすいフィブリノーゲンと、又はフィブリノーゲン分解産物と反応して、フィブリンモノマーがフィブリノーゲンと会合した可溶性フィブリンが生じる。
【０００５】
可溶性フィブリンは、患者に凝固活性化物が存在するかどうかを試験するために測定される（血液中、特に血漿中の可溶性フィブリンの存在は、このような活性化の証拠を与える）。
【０００６】
この測定は、血栓を構成するフィブリンのフィブリン溶解により形成されるＤ−ダイマーのアッセイに対して必要な補完であり、そしてこれは、凝固活性化プロセスのマーカーでもある。血漿中のＤ−ダイマー数は、凝血塊がインビボで分解されると増大する。このため、血栓が存在し、かつ分解のプロセスにあるならば、Ｄ−ダイマー数は、凝固が持続しているか、停止しているかに関わらず増大する；これとは対照的に、可溶性フィブリン数は、凝固が停止すればもはや増大することはなく、反対に、凝固が持続するならば増大する。
【０００７】
よってＤ−ダイマー数に対する血漿中の可溶性フィブリン含量の特異的測定により、以下のことが可能である：
１． 試料を採った時点の患者に凝固プロセスが存在するかどうかの決定；
２． 凝固−線溶均衡の評価。基礎Ｄ−ダイマー数はインビボの血栓分解の反映である；血漿に血栓溶解剤を加えた後に得られるＤ−ダイマー数は、基礎Ｄ−ダイマーと循環フィブリンの分解に由来するもの（即ち、可溶性フィブリン）との合計を表す。
【０００８】
引用することができるフィブリンをアッセイするための最も初期の方法は、エタノール試験（１，２，９）又は硫酸プロタミン試験（３，４，５，７）を含む。しかし、これらの試験は、あまり特異的でなく（９，１０）、あまり感度も高くない（１０）。更には、フィブリノーゲン数が大きい（＞５g/l）と、エタノール試験及び硫酸プロタミン試験で得られる結果は混乱する。最後に、硫酸プロタミン試験結果は、解釈するのが難しいことがある（６，８）。
【０００９】
可溶性フィブリンを検出するための更に別の方法は、Largoにより報告（１１，１２）された方法を用いる、フィブリンモノマーで感作した赤血球の血球凝集の技術に基づく。この型の試験は、例えば、ダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）によりＦＳテスト（FS Test）として販売されている。
【００１０】
この技術は、非常に簡単ではあるが、時に感度に欠けていることがあり、特に播種性血管内血液凝固の診断に向いている。しかしこれは、少量の可溶性フィブリンを検出できない（局所的血栓症、抗凝固薬物の有効性の調査）。
【００１１】
現在のところ、可溶性フィブリンをアッセイするための他の技術は、フィブリンの露出エピトープ（そしてフィブリノーゲンではマスクされている）又はフィブリン若しくはフィブリン分解の産物を検出するモノクローナル抗体の使用に基づく（１３〜１４）。しかし、モノクローナル抗体を使用する直接アッセイ法では、使用される市販の抗体に依存して変化する可溶性フィブリン数が得られる。
【００１２】
本発明の著者らは、患者における凝固−線溶均衡を評価するための、特に簡単かつ迅速な、先行技術とは異なるアプローチを提唱する。これは、上述の血球凝集法よりも感度が高い。これは、モノクローナル抗体を使用する試験と比較して、循環フィブリン（可溶性）と、既にインビボで分解したフィブリンを検出するために同一法を利用し、これによって凝固−線溶均衡の非常に正確な評価を与えるという利点を有する。
【００１３】
本発明の方法において、試料中に存在する可溶性フィブリンは、フィブリンに対して高い特異性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）との試料のインキュベーションの間に、可溶性フィブリン分解産物を生成後に測定される。ＰＡ−Ｆｂ ｓｐでの可溶性フィブリンの分解後に得られる分解産物の数と、試料をＰＡ−Ｆｂ ｓｐと接触させる前に測定した基礎フィブリンの分解産物の数の間の差から、測定すべき試料中の血漿可溶性フィブリン数が得られる。
【００１４】
よって本発明は、生物学的試料中の可溶性フィブリンをアッセイするための方法であって、該試料をフィブリンに対して高い親和性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）と接触させ、そしてＰＡ−Ｆｂ ｓｐで可溶性フィブリンを分解後に得られる分解産物の数と、該試料をＰＡ−Ｆｂ ｓｐと接触させる前に測定したフィブリン分解産物の基礎数との差を測定することにより、試料中の可溶性フィブリンの数を測定する方法を提供する。
【００１５】
生物学的試料中の本発明の可溶性フィブリンをアッセイするための方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
・血漿試料に含まれるフィブリン分解産物をアッセイすること；
・血液試料を、フィブリンに対して高い特異性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）と、試料に含まれる可溶性フィブリンをその分解産物へと分解できる条件下で接触させること；
・ＰＡ−Ｆｂ ｓｐとインキュベートした試料中のフィブリン分解産物をアッセイすること；
・ＰＡ−Ｆｂ ｓｐとのインキュベーション後に評価したフィブリン分解産物の数と未処理試料で評価したフィブリン分解産物の数との差に対応する可溶性フィブリンを決定すること。
【００１６】
分解産物をアッセイするのに使用される試薬は、所定の群の分解産物を測定するために選択される。一例として、特定の型の分解産物に対して所定の特異性を持つ抗体が使用される。
【００１７】
生物学的試料は、好ましくは生物学的液体、例えば、血液若しくは血漿試料、又はドレナージによるものである。
【００１８】
本発明はまた、特異的分解産物を生成させることにより、可溶性フィブリンをアッセイするための方法における、フィブリンに対して高い親和性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（即ち、フィブリン中のプラスミノーゲンだけを活性化する）の使用に関する。本発明はまた、上述の方法を実施するためのキットに関する。
【００１９】
幾つかのプラスミノーゲンアクチベーターが知られている。しかしあるものは、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼのように、フィブリノーゲンとフィブリンの両方を分解する（１５）。このような化合物は、フィブリノーゲンの分解を起こして、フィブリノーゲン分解産物を生じさせ、これがフィブリン分解により生じる産物を妨害するため、本発明の方法には適切でない。
【００２０】
プラスミノーゲンアクチベーターの第２の群は、フィブリノーゲンに比較してフィブリンを分解することに対して高い特異性を有することが報告されている化合物により構成される。本発明の方法は、有利にはこの第２群の化合物の特異性を利用する。
【００２１】
このような特異性を持つ種々の化合物（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）は、文献に報告されている。既知の例は以下である：
・組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、又はＴＮＫ−ｔＰＡ（フィブリンに対して非常に高い特異性を持つｔ−ＰＡの変種（１６））のようなその誘導体；
・吸血コウモリ（Desmodus rotundus）唾液由来のアクチベーター（ｂａｔ−ｔＰＡ又はｖＰＡ＝吸血コウモリ（Vampire bat）唾液プラスミノーゲンアクチベーター）又はその誘導体：ＤＳＰＡ＝吸血コウモリ唾液ＰＡ（Desmodus rotundus salivary PA）、ＦＥＫＰ＝ＤＳＰＡアルファ１及びアルファ２、ＥＫＰ＝ＤＳＰＡベータ、ＫＰ＝ＤＳＰＡガンマ（１７）；
・黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）により分泌されるポリペプチドである、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）（１８〜１９）又はその変種の１つ（２０）。
【００２２】
本発明の方法は、好ましくは血漿試料で行われる。可溶性フィブリン数は、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じる分解産物を測定することにより決定される。必要であれば、本方法は、可溶性フィブリンの生成の原因ではあるが凝血塊の形成は引き起こさない凝固活性化を誘導するために、痕跡量のトロンビンで処理した正常血漿から得られる陽性対照を用いて検証される。
【００２３】
陽性血漿対照を得るために、血漿は最初にトロンビン又は他の凝固アクチベーターと共に一定時間インキュベートする。そして開始した凝固プロセスは次に、反応の継続を妨害するためにアクチベーターインヒビターを添加することによりブロックされる。このアクチベーターがトロンビンであるとき、例えば、ヒルジン又はヘパリンがインヒビターとして使用される。
【００２４】
血漿インキュベーション時間並びに凝固アクチベーター及びブロッキングインヒビターの濃度は、有利には凝血塊形成の発生に先立つ全ての凝固活性化段階が得られるように決定される。
【００２５】
凝固アクチベーター（トロンビン）の存在下でのインキュベーションは、好ましくは周囲温度で２分間のインキュベーション時間で行われる。次にインヒビターは、凝固のブロックを保証するために大過剰で加える。
【００２６】
・ヒルジンが使用されるならば、有利には０．１８U/mlの最終トロンビン濃度に対して１００μg/mlの最終濃度で使用される。
・ヘパリンが使用されるならば、使用されるトロンビンの最終濃度が０．１８U/mlであるとき、ヘパリンは５００U/mlの最終濃度で使用される。
【００２７】
本発明の可溶性フィブリンの評価は、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐで可溶性フィブリンを分解し、次にＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じる特異的分解産物を測定する、第１工程を利用する。
【００２８】
試料中に存在する可溶性フィブリンの量を表しているため、本発明の方法の結果をできる限り迅速に得ることが極めて重要である。このために、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの使用の条件は、可溶性フィブリンの分解が迅速であり、かつこのアッセイ法において可溶性フィブリンに由来する分解産物を妨害する分解産物を生じさせる循環血漿フィブリノーゲンの「汚染」分解を伴わないように、決定しなければならない。
【００２９】
ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの用量は、陽性対照におけるフィブリン分解産物数の最大増加、及び陰性対照（即ち、凝固アクチベーターで処理していない）における事実上ゼロ増加を誘導するように選択される。
【００３０】
本発明において、フィブリンの特異的分解を可能にする、種々のフィブリン溶解アクチベーターを使用することができる。有利には、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐは、上に引用されるアクチベーターにより形成される群から選択される、即ち：ｔＰＡとその誘導体、ＶＰＡ又はその誘導体、及びスタフィロキナーゼ又はその変種の１つ。好ましくは、ｔＰＡ又はスタフィロキナーゼ、更に好ましくはｔＰＡが使用される。
【００３１】
試料を３７℃で１５分間インキュベートするとき、使用されるスタフィロキナーゼの最終濃度は、１〜１２μg/mlの範囲である。最終保留濃度は、１０μg/mlである。インキュベーション時間は、調節することができ、その変動は、使用されるＰＡ−Ｆｂ ｓｐの性質と濃度の関数として決定される。
【００３２】
有利には、ｔＰＡが、１〜２．５μg/mlの範囲の最終濃度で使用される。好ましくは、ｔＰＡは、２μg/mlの濃度で使用される。
【００３３】
特異的に検出することができる、種々の可溶性フィブリン分解産物が存在する。好ましい具体例では、可溶性フィブリンに及ぼすＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じるＤ−ダイマー数を測定する（即ち、可溶性フィブリンに及ぼすＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用により生じるＤ−ダイマーの濃度を評価する［（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用後のＤ−ダイマー）−（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの作用前の基礎Ｄ−ダイマー）］）。
【００３４】
ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの存在下での可溶性フィブリンの分解により生じるＤ−ダイマーは、ＥＬＩＳＡ型の方法、ラテックスビーズ凝集高感度法、免疫クロマトグラフィー法などのような、任意の日常的なアッセイ法を用いてアッセイすることができる。引用できる種々の市販のＤ−ダイマーアッセイ法の例は、アッセラクロムＤ−Ｄｉ（ASSERACHROM D-Di）又はＳＴＡリアテストＤ−Ｄｉ（STA LIATEST D-Di）（両方ともダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）が販売）である。しかし本発明において、アッセラクロムＤ−ＤｉからのＥＬＩＳＡ試験の使用の条件は、有利には試験時間を短縮するように調節されている（固定化抗体と１５分のインキュベーション及びペルオキシダーゼ標識抗体と１５分）。
【００３５】
ＤＤ／Ｅ断片の他に、ＹＤ／ＤＹ、ＹＤ／ＤＸＤ複合体のような、他のフィブリン分解産物が存在するが、これらは評価することができる。
【００３６】
以下の実施例に説明されるように（実施例３を参照のこと）、本発明の方法は、治療開始前又は抗凝固治療中又は抗凝固剤治療を停止後のいずれかに凝固活性化を示している患者で実施することができる。これにより、特に凝固活性化診断において、凝固活性化プロセスの変化を評価できるだけでなく、抗凝固剤治療の有効性を評価することができる。
【００３７】
更に別の側面において、本発明は、試料中の可溶性フィブリンの用量をアッセイするためのキットであって、
・上述のプロトコールを用いて得られる可溶性フィブリンの存在に関する陽性対照；
・対照血漿から構成される陰性対照；
・単一試料用の単一量の、又は複数試料に充分な量のＰＡ−Ｆｂ ｓｐ；
・Ｄ−ダイマーをアッセイするための試薬；及び
・場合により、０．１％のウシ胎仔血清及び０．０５％のトゥイーン２０を含むｐＨ７．４リン酸緩衝液のような、試料を希釈するための緩衝液
を含むことを特徴とするキットに関する。
【００３８】
陽性及び陰性血漿対照は、有利には凍結乾燥される。
【００３９】
好ましいＰＡ−Ｆｂ ｓｐは、ｔＰＡである。
【００４０】
Ｄ−ダイマーは、例えば、アッセラクロムＤ−Ｄｉ（ASSERACHROM D-Di）のようなＥＬＩＳＡ型の方法の試薬、又はＳＴＡリアテストＤ−Ｄｉ（STA LIATEST D-Di）（両方ともダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）が販売）のようなラテックス粒子凝集に対して高感度の試験法の試薬によりアッセイされる。
【００４１】
以下の実施例により、本発明を説明する。
【００４２】
実施例１：
可溶性フィブリンを含む陽性血漿対照を得るために使用されるトロンビン濃度の選択：
陽性血漿対照は、以下のプロトコールを用いて調製した：
正常血漿 ３００μl
ヒトトロンビン（スターゴ（Stago）照合番号００８９６）
２０U/ml ３０μl
インキュベーション、実験室温度で２分
ヒルジン（クノール（Knoll）） １００μg/ml（最終濃度）
又はヘパリン（ショエ（Choay）） ５００u/ml（最終濃度）
【００４３】
確認：
・チューブ内に凝血塊形成がないこと。
・市販の可溶性フィブリン検出試験が陽性であること（例えば、スターゴ（Stago）のＦＳテスト）。
【００４４】
表Ｉに示される２つの可能性を保留することができる。
【００４５】
【表１】
実施例２：
所定のインキュベーション条件下で使用すべきＰＡ−Ｆｂ ｓｐの量の決定
本発明の方法を実施するために、試料に加えるべきアクチベーターの量は、実施例１で得られるように、陽性対照血漿ではＤ−ダイマーの有意な生成を、そして陰性血漿対照（トロンビンで処理していない対照）ではＤ−ダイマーの微々たる生成を誘導するような量でなければならない。
【００４７】
対照血漿及び陽性対照血漿（ｎ＝２１）のインキュベーションは、種々の用量のＰＡ−Ｆｂ ｓｐと共に３７℃で１５分間実施した。インキュベーション時間の終わりに、Ｄ−ダイマーは、リアテスト（Liatest）又は迅速ＥＬＩＳＡ（Ｄ−Ｄｉスターゴ（D-Di Stago））により測定した（捕捉抗体と共に３７℃で１５分間及び描出抗体と共に３７℃で１５分間のインキュベーション）。
【００４８】
ＥＬＩＳＡ試験により表Ｉに示される結果を得た。
【００４９】
リアテスト（Liatest）（ｎ＝５）により実質的に同様の結果を得た。
【００５０】
【表２】
選択されるＰＡ−Ｆｂ ｓｐの用量は、以下を誘導するものである：
・未処理対照血漿（陰性対照）では＜３００ng/mlの増加；
・陽性対照血漿では最大の増加。
【００５２】
これらの結果から、使用すべきＰＡ−Ｆｂ ｓｐの好ましい最終濃度は、以下であると考えられる：
・ｔＰＡでは２μg/ml：このような条件下では、ＰＡＩにより中和することができるｔ−ＰＡの用量は無視してよい；
・ＳＡＫでは１０μg/ml（恐らく試料中の抗スタフィロキナーゼ（この抗スタフィロキナーゼは、ブドウ球菌（staphylococcus）感染の結果として出現しうる）の存在のため、少数の患者又は少数の陽性対照では最低量のＳＡＫによって、可溶性フィブリンの充分な分解性は引き起こせない）。
【００５３】
実施例３：
健常ボランティア及び凝固の活性化の疑い（Ｄ−ダイマーの増加のため）を示す患者において得られる結果
本法は、上述のプロトコールを用いて２つの血漿試料で実施した：ｔＰＡ（２μg/ml）又はＳＡＫ（１０μg/ml）の存在下で３７℃で１５分間血漿をインキュベート。
【００５４】
生成したＤ−ダイマーは、上述のようにＥＬＩＳＡ試験を用いてアッセイした。
【００５５】
Ａ． 健常ボランティアで得られた結果
【００５６】
【表３】
Ｂ． Ｄ−ダイマー数の上昇を示す患者で得られた結果
（迅速ＥＬＩＳＡにより実施した実験）
【００５８】
【表４】
結論：
本発明の方法は、その血漿中の可溶性フィブリン及びＤ−ダイマー数によって、患者を３群に分割することができる。これら３群それぞれの性状は、以下の表Ｖに要約される：
【００６０】
【表５】
上述のように、本発明の方法により、凝固活性化プロセスにおける変化を追跡できるだけでなく、抗凝固薬物の効力を評価することも、また薬物の停止が凝固を再活性化するかどうかを確認することもできる。
【００６２】
グループ１：可溶性フィブリンは増加しているが、Ｄ−ダイマーの上昇はない、初期凝固活性化。
グループ２：凝固活性化は停止している（有効な薬物）が、既に形成された血栓は分解し続けている患者（可溶性フィブリン数正常、Ｄ−ダイマー数上昇）。
グループ３：インビボの凝血塊分解を伴い、凝固活性化を示す患者（可溶性フィブリンとＤ−ダイマーの同時上昇）：充分に有効でない薬物。
【００６３】
実施例４：
利用した方法の要約：
試薬：
ｐＨ７．４緩衝液
精製ヒトトロンビン（スターゴ（Stago）照合番号００８９６）
ｔ−ＰＡ（ベーリンガー（Boehringer））
アプロチニン。４℃の貯蔵溶液。
Ｄ−ダイマーのキット
【００６４】
利用した方法は、表VIに要約される。
【００６５】
【表６】
【表７】
Claims (16)
- 血漿試料中の可溶性フィブリンをアッセイするための方法であって、 ・該試料を、フィブリンに対して特異性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）と接触させ、ここでＰＡ−Ｆｂ ｓｐが、最終濃度で試料１ml当たり１〜２．５μgのｔ−ＰＡ又は最終濃度で試料１ml当たり１０μgのスタフィロキナーゼであり、
・該試料を、ＰＡ−Ｆｂ ｓｐの存在下で３７℃で１５分間インキュベーションし、 ・ＰＡ−Ｆｂ ｓｐでの可溶性フィブリンの分解後に得られるフィブリン分解産物の含量と、該試料をＰＡ−Ｆｂ ｓｐとの接触下にもたらす前に測定したフィブリン分解産物の基礎含量との差を測定することにより、試料中の可溶性フィブリンの含量を決定することを含み、ここで測定されるフィブリン分解産物が、Ｄ−ダイマーである方法。 - ＰＡ−Ｆｂ ｓｐが、最終濃度で試料１ml当たり１〜２．５μgのｔＰＡであることを特徴とする、請求項１項記載の方法。
- ＰＡ−Ｆｂ ｓｐが、最終濃度で試料１ml当たり２μgのｔＰＡであることを特徴とする、請求項２項記載の方法。
- ＰＡ−Ｆｂ ｓｐが、最終濃度で試料１ml当たり１０μgのスタフィロキナーゼであることを特徴とする、請求項１項記載の方法。
- フィブリン分解産物が、ＥＬＩＳＡ又はリアテスト（LIATEST）（登録商標）型の方法を用いてアッセイされることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ活性化により生じる可溶性フィブリン中の分解産物含量が、陽性対照に対して測定されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
- 陽性対照が、凝血塊を形成させることなくインビトロで凝固活性化を誘導するように処理した正常血漿から調製されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項記載の方法において使用するための陽性対照であって、凝血塊を形成させることなくインビトロで凝固活性化を誘導するように処理した正常血漿から構成され、そして該血漿を可溶性フィブリンに対して高い親和性及び／又は特異性を有するプラスミノーゲンアクチベーターと、試験試料に適用される条件と類似の条件下で接触に至らせることを特徴とする、陽性対照。
- フィブリン分解産物を生成させることにより可溶性フィブリンをアッセイするための請求項１〜７のいずれか１項記載の方法における、フィブリンに対して高い親和性を持つプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ−Ｆｂ ｓｐ）の使用。
- フィブリン分解産物が、Ｄ−ダイマーであることを特徴とする、請求項９記載の使用。
- 試料中の可溶性フィブリンをアッセイする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法のためのキットであって、
・可溶性フィブリンの存在に関する陽性対照；
・対照血漿から構成される陰性対照；
・単一試料用の単一量の、又は複数試料に充分な量の、ｔ−ＰＡおよびスタフィロキナーゼから選択されるＰＡ−Ｆｂ ｓｐ；
・Ｄ−ダイマーをアッセイするための試薬；及び
・場合により、試料を希釈するための緩衝液
を含むことを特徴とする、キット。 - 陽性及び陰性対照血漿が、凍結乾燥型であることを特徴とする、請求項１１記載のキット。
- ＰＡ−Ｆｂ ｓｐが、ｔＰＡであることを特徴とする、請求項１１記載のキット。
- Ｄ−ダイマーをアッセイするための試薬が、ＥＬＩＳＡの、又は増感ラテックス粒子凝集試験のためのリアテスト（LIATEST）（登録商標）型試験用の試薬であることを特徴とする、請求項１１記載のキット。
- 凝固活性化プロセスにおける変化をモニターするための、及び抗凝固薬物の効力を評価するための、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法の使用。
- 凝固活性化プロセスにおける変化をモニターするための、及び抗凝固薬物の効力を評価するための、請求項１１〜１４のいずれか１項記載のキットの使用。
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