ES2337879T3 - Procedimiento de dosificacion de la fibrina soluble. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de dosificación de la fibrina soluble en una muestra, en el que se coloca dicha muestra en presencia de un activador del plasminógeno de fuerte especificidad con la fibrina soluble (PA-Fb sp) específico de la fibrina en las condiciones de utilización del activador seleccionadas para evitar la degradación del fibrinógeno plasmático circulante y se mide el contenido de la muestra en fibrina soluble, midiendo la diferencia entre la proporción de productos de degradación específicos de la fibrina obtenidos después de la degradación de la fibrina soluble por incubación con el PA-Fb sp y la proporción de base de los productos de degradación de la fibrina, determinada sobre dicha muestra antes de su puesta en presencia con el PA-Fb sp.
Description
Procedimiento de dosificación de la fibrina
soluble.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de dosificación de la fibrina soluble mediante la
generación de productos de degradación específicos en una muestra
sanguínea.
Durante la activación de la coagulación, se
genera trombina que provoca la formación de depósitos de fibrina y
la formación de fibrina soluble.
En efecto, la trombina desprenderá de la
molécula de fibrinógeno el fibrinopéptido A que provoca la
generación de monómeros de fibrina sobre los cuales los sitios de
polimerización "A" que estaban enmascarados en el fibrinógeno
son desenmascarados, provocando con ello una interacción entre los
sitios "A" de una molécula de monómero de fibrina con los
sitios "a" accesibles tanto en el fibrinógeno como en la
fibrina. En 2º tiempo, se produce la liberación del fibrinopéptido
B, que provoca un desenmascaramiento de los sitios de polimerización
"B" que provoca la interacción entre los sitios "B" de
una molécula de fibrina con los sitios "b" accesibles tanto en
el fibrinógeno como en los monómeros de fibrina.
Cuando la cantidad de trombina es muy importante
(ensayo in vitro), todo el fibrinógeno se transforma en
monómeros de fibrina que se polimerizan a consecuencia de la
interacción de los sitios "A" y "a" por un lado, y
"B" y "b" por otro lado, para dar el coágulo de fibrina.
Por el contrario, in vivo, la generación de trombina es mucho
menos importante. La generación de monómeros de fibrina resulta así
mucho menos explosiva y por ello una parte de los monómeros de
fibrina polimerizarán para dar fibrina (trombo) y otra parte
reaccionará con fibrinógeno en el que los sitios a y b son
accesibles o con unos productos de degradación del fibrinógeno,
para dar fibrina soluble en la que unos monómeros de fibrina son
asociados con fibrinógeno.
La determinación de la fibrina soluble tiene
como objetivo estudiar si existe una activación de la coagulación en
un paciente, siendo testigo de esta activación la presencia de
fibrina soluble en la sangre, en particular en el plasma.
Esta determinación es un complemento necesario
para la dosificación de D-dímeros formados por la
fibrinolisis de la fibrina que constituye el trombo, que constituye
asimismo un marcador del proceso de activación de la coagulación.
En efecto, se aumenta el contenido plasmático en
D-dímeros mientras el coágulo se degrada in
vivo. Por ello, si el trombo está presente y se está degradando,
el porcentaje de D-dímeros aumentará, tanto si
persiste la coagulación como si ésta está interrumpida: por el
contrario el de fibrina soluble no aumentará si la coagulación es
interrumpida y por el contrario aumentará si la coagulación
persiste.
La medición específica del contenido plasmático
en fibrina soluble con respecto al contenido en
D-dímeros permite por lo tanto:
- 1.
- determinar si un proceso de coagulación está presente en un paciente en el momento en que se realiza la extracción.
- 2.
- evaluar el balance coagulo-lítico. En efecto, la proporción de D-dímeros de base es el reflejo de la degradación del trombo IN VIVO; la proporción de D-dímeros obtenida después de añadir el agente trombolítico en el plasma representa la suma de los D-dímeros de base y la que procede de la degradación de la fibrina circulante (o fibrina soluble).
Entre los procedimientos de dosificación de la
fibrina soluble más antiguos, se pueden citar el ensayo con etanol
(1, 2, 9) o el ensayo con sulfato de protamina (3, 4, 5, 7). Sin
embargo, estos ensayos son poco específicos (9, 10) y poco
sensibles (10). Además, unas proporciones elevadas de fibrinógeno
(> 5 g/l) perturban los resultados obtenidos con los ensayos con
etanol y con sulfato de protamina. Por último, los resultados de los
ensayos con sulfato de protamina pueden ser difíciles de interpretar
(6, 8).
Otro tipo de detección de la fibrina soluble se
basa en una técnica de hemaglutinación de glóbulos rojos
sensibilizados con unos monómeros de fibrina según el procedimiento
de Largo (11, 12). Este tipo de ensayo es, por ejemplo,
comercializado por la compañía Diagnostica Stago bajo la
denominación de FS Test.
Sin embargo esta técnica de realización, aunque
fácil, puede carecer a veces de sensibilidad y se presta sobre todo
al diagnóstico de coagulaciones intravasculares diseminadas. No
permite, por el contrario, detectar contenidos más bajos de fibrina
soluble (trombosis localizadas, exploración de la eficacia de una
terapia anticoagulante).
En la actualidad, las otras técnicas de
dosificación de la fibrina soluble se basan en la utilización de
anticuerpos monoclonales que detectan unos epítopos desenmascarados
en la fibrina y enmascarados en el fibrinógeno o los productos de
degradación de la fibrina o del fibrinógeno (13-14).
Sin embargo, las dosificaciones directas utilizando anticuerpos
monoclonales dan unas proporciones en fibrina soluble que varían
según el anticuerpo comercial utilizado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los autores de la presente invención proponen un
enfoque diferente a los preconizados en el estado de la técnica,
particularmente sencillo y rápido, para apreciar el balance
coagulo-lítico de un paciente. Este enfoque posee
una mejor sensibilidad que el procedimiento por hemaglutinación
descrito anteriormente. Presenta la ventaja, con respecto a los
tests que utilizan anticuerpos monoclonales, de detectar de la misma
forma la fibrina circulante (soluble) y la que ya se ha degradado
IN VIVO, lo que permite de esta forma obtener una evaluación
muy exacta del balance coagulo-lítico.
Según el procedimiento de la presente invención,
se mide la fibrina soluble presente en una muestra después de la
generación de productos de degradación de la fibrina soluble,
durante la incubación de la muestra con un activador del
plasminógeno que tiene una fuerte especificidad con respecto a la
fibrina (PA-Fb sp). Así, la diferencia entre la
proporción de productos de degradación obtenida después de la
degradación de la fibrina soluble por el PA-Fb sp y
la de los productos de degradación de la fibrina de base, medida
antes de la puesta en contacto de la muestra con el
PA-Fbsp, permite medir el contenido plasmático en
fibrina soluble en la muestra.
Por lo tanto, la invención tiene por objeto un
procedimiento de dosificación de la fibrina soluble en una muestra
biológica en la que se pone dicha muestra en presencia de un
activador del plasminógeno de fuerte afinidad con la fibrina
(PA-Fb sp) y se mide el contenido de la muestra en
fibrina soluble midiendo la diferencia entre la proporción de los
productos de degradación obtenidos después de la degradación de la
fibrina soluble por el PA-Fb sp y la proporción de
base de los productos de la degradación de la fibrina determinada
antes de la puesta en contacto de la muestra con el
PA-Fb sp.
El procedimiento de dosificación de la fibrina
soluble según la invención en una muestra biológica, comprende las
etapas siguientes:
- -
- dosificar los productos de degradación de la fibrina contenidos en la muestra de plasma extraída,
- -
- poner contacto la muestra sanguínea con un activador de plasminógeno que tiene una fuerte especificidad con la fibrina (Pa-Fb sp) en unas condiciones que permiten que la fibrina soluble contenida en la muestra, sea degradada en sus productos de degradación, seleccionándose las condiciones de utilización del activador para evitar la degradación del fibrinógeno plasmático circulante,
- -
- dosificar los productos de degradación de la fibrina en la muestra incubada con el Pa-Fbsp,
- -
- determinar la fibrina soluble que corresponde a la diferencia entre el contenido en productos de degradación de la fibrina evaluado después de la incubación con el PA-Fb sp y el contenido en productos de degradación de la fibrina, evaluado en la muestra no tratada.
El reactivo utilizado para dosificar los
productos de degradación se selecciona para medir un grupo
determinado de productos de degradación. Por ejemplo, se utilizan
unos anticuerpos de especificidad determinada con respecto a un tipo
particular de productos de degradación.
Preferentemente, la muestra biológica es un
líquido biológico, por ejemplo una muestra de sangre o de plasma, o
incluso un líquido de punción.
Se describe asimismo en la presente memoria la
utilización de un activador del plasminógeno de fuerte afinidad con
la fibrina (i.e. que solo activa el plasminógeno en el seno de la
fibrina) en un procedimiento de dosificación de la fibrina soluble
mediante la generación de productos de degradación específicos.
Prevé asimismo un kit para la realización del procedimiento citado
anteriormente.
Se conocen numerosos compuestos activadores del
plasminógeno. Algunos, sin embargo, degradan tanto el fibrinógeno
como la fibrina, tales como por ejemplo la estreptoquinasa y la
uroquinasa (15). Estos compuestos no están adaptados al
procedimiento de la invención puesto que producen una degradación
del fibrinógeno dando lugar a unos productos de degradación del
fibrinógeno que interfieren con los que resultan de la degradación
de la fibrina.
Un segundo grupo de activadores del plasminógeno
está constituido por unos compuestos descritos como que presentan
una fuerte especificidad para degradar la fibrina, con respecto al
fibrinógeno. El procedimiento de la invención utiliza para su
realización, ventajosamente, la especificidad de este segundo grupo
de compuestos.
Se han descrito en la bibliografía diferentes
compuestos que presentan una especificidad de este tipo (PA Fb sp).
Se conocen por ejemplo:
- \blacklozenge
- el activador tisular del plasminógeno (o t-PA) o sus derivados como, por ejemplo, el TNK-tPA que es un mutante del t-PA que tiene una gran especificidad con respecto a la fibrina (16);
- \blacklozenge
- el activador procedente de la saliva de Desmodus rotundus (bat-tPA o vPA= Vampire bar salivary plasminogen activator) o sus derivados:
- DSPA= Desmodus rotundus salivary PA, FEKP=DSPA alfa 1 y alfa 2, EKP=DSPA beta, KP=DSPA gamma, (17).
- \blacklozenge
- La Estafiloquinasa, (SAK), polipéptido segregado por el Staphylococcus aureus (18-19) o uno de sus mutantes (20).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se realiza el procedimiento según la presente
invención preferentemente sobre una muestra de plasma. La proporción
de fibrina soluble es determinada por la medición de los productos
de degradación resultantes de la acción del PA Fb sp. El
procedimiento es validado si es necesario gracias a la utilización
de un testigo positivo obtenido a partir de un plasma normal
tratado con unas trazas de trombina de manera que se induce una
activación de la coagulación responsable de la generación de
fibrina soluble, sin desembocar sin embargo en la formación de un
coágulo.
Para la obtención del plasma de control
positivo, el plasma se incuba en primer lugar con trombina u otro
activador de la coagulación durante un tiempo determinado. El
proceso de coagulación que ha sido desencadenado de esta forma es
bloqueado a continuación mediante la adición de un inhibidor del
activador utilizado para evitar que la reacción prosiga. En el caso
en que este activador es la trombina, se utiliza por ejemplo como
inhibidor la hirudina o la heparina.
El tiempo de incubación del plasma y las
concentraciones en activador de la coagulación y en inhibidor para
el bloqueo son determinadas ventajosamente de manera que se obtienen
todas las etapas de activación de la coagulación que preceden al
inicio de la formación del coágulo.
Se lleva a cabo la incubación en presencia de
activador de la coagulación (trombina) durante un tiempo de
incubación de 2 minutos, a temperatura ambiente. El inhibidor es
añadido a continuación en exceso para estar seguros de bloquear la
coagulación.
- \blacklozenge
- Si se trata de la hirudina, ésta se utiliza ventajosamente a una concentración final de 100 \mug/ml para una concentración final en trombina de 0,18 U/ml.
- \blacklozenge
- Si se trata de la heparina, ésta se utiliza a 500 U/ml en la concentración final cuando la concentración final en trombina utilizada es de 0,18 U/ml.
La evaluación de la fibrina soluble según la
presente invención emplea una primera etapa de degradación de la
fibrina soluble por el PA Fb sp, seguida de una medición de los
productos de degradación específicos resultantes de la acción del PA
Fb sp.
Es indispensable que los resultados del
procedimiento según la invención puedan ser obtenidos lo más
rápidamente posible, siendo al mismo tiempo representativos de la
cantidad de fibrina soluble presente en la muestra. Para ello, las
condiciones de utilización del PA Fb sp deben ser determinadas de
manera que la degradación de la fibrina soluble sea rápida y que no
venga acompañada de una degradación "contaminante" del
fibrinógeno plasmático circulante, dando lugar a unos productos de
degradación que interfieran con los procedentes de la fibrina
soluble en la dosificación.
Así, las dosis de PA Fb sp se seleccionan de
manera que se induce el aumento de la proporción de productos de
degradación de la fibrina más importante en los testigos positivos y
un aumento prácticamente nulo en los testigos negativos (i.e. que
no han sido sometidos a un tratamiento mediante un activador de la
coagulación).
Se pueden utilizar, en el marco de la presente
invención, diferentes activadores de la fibrinolisis que permiten
la degradación específica de la fibrina. Ventajosamente, se
selecciona el PA Fb sp de entre el grupo constituido por los
activadores citados anteriormente, a saber: el tPA o sus derivados,
el VPA o sus derivados, la estafiloquinasa o uno de sus mutantes.
Preferentemente se utiliza el tPA o la estafiloquinasa, y más
preferentemente, el tPA.
En unas condiciones de incubación de las
muestras de 15 minutos a 37ºC, la concentración final de
estafiloquinasa utilizada está comprendida entre 1 y 12 \mug/ml.
La concentración final considerada es de 10 \mug/ml. El tiempo de
incubación puede ser modificado y su variación estará determinada en
función de la naturaleza y de la concentración de la PaFbsp
utilizada.
Se utiliza ventajosamente el tPA en un intervalo
de concentraciones finales comprendido entre 1 y 2,5 \mug/ml.
Preferentemente, el tPA se utiliza a 2 \mug/ml.
Existen diferentes productos de degradación de
la fibrina soluble que pueden ser detectados específicamente. Según
un modo de realización preferido, se miden la proporción de
D-dímeros resultantes de la acción del PA Fb sp
sobre la fibrina soluble, i.e. se evalúa la concentración en
D-dímeros resultante de la acción del PA Fb sp
sobre la fibrina soluble (D-dímeros después de la
acción del PA Fb sp-D-dímeros de
base antes de la acción del PA Fb sp).
Los D-dímeros resultantes de la
degradación de la fibrina soluble en presencia de PA Fb sp, pueden
ser dosificados según cualquier técnica habitual de dosificación de
analito tales como por ejemplo unos procedimientos de tipo ELISA,
unos procedimientos sensibles por aglutinación de bolas de látex,
unos procedimientos de inmunocromatografía, etc. Entre los
diferentes ensayos de dosificación de los D-dímeros
disponibles en el mercado, se pueden citar por ejemplo el
ASSERACHROM D-Di o el STA LIATEST
D-Di, ambos comercializados por Diagnostica Stago.
Sin embargo, en el marco de la presente invención, las condiciones
de utilización del ensayo ELISA del ASSERACHROM D-Di
han sido modificadas ventajosamente para acortar el ensayo (15 min.
de incubación con el anticuerpo inmovilizado y 15 minutos con el
anticuerpo marcado con peroxidasa).
Además del fragmento DD/E, existen otros
productos de degradación de la fibrina tales como los complejos
YD/DY, YD/DXD que pueden ser evaluados.
Como se ha ilustrado en los siguientes ejemplos
(véase el ejemplo 3), el procedimiento de la invención se puede
realizar en enfermos que presentan una activación de la coagulación
o bien antes del inicio de una terapia, o bien durante un
tratamiento anticoagulante, o bien después de la interrupción de la
terapia anticoagulante. Así, permite apreciar no solo la evolución
de un proceso de activación de la coagulación, en particular en el
marco del diagnóstico de activación de la coagulación, sino también
la eficacia de una terapia anticoagulante.
Según otro aspecto, se describe en la presente
memoria un kit (conjunto) de dosificación de la fibrina soluble en
una muestra, caracterizado porque comprende:
- \blacklozenge
- un control positivo para la presencia de fibrina soluble obtenido según el protocolo descrito anteriormente,
- \blacklozenge
- un control negativo constituido por un plasma testigo.
- \blacklozenge
- PA-Fb sp en cantidad individual para una extracción o en cantidad suficiente para unas extracciones múltiples,
- \blacklozenge
- un reactivo para la dosificación de los D-dímeros, y
- \blacklozenge
- eventualmente un tampón de dilución de las muestras tal como un tampón fosfato pH 7,4 que contiene 0,1% de suero bovino albúmina y 0,05% de Tween 20.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plasmas de control positivos y negativos se
encuentran de manera ventajosa en forma liofilizada.
El PA-Fb sp utilizado
preferentemente es el tPA.
Los D-Dímeros son dosificados
por ejemplo con un reactivo para un procedimiento de tipo ELISA, tal
como ASSERACHROM D-Di, o un reactivo para un ensayo
sensible de aglutinación de partículas de látex tal como STA LIATEST
D-Di, ambos comercializados por Diagnostica
Stago.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El plasma de control positivo se prepara según
el siguiente protocolo:
- Plasma normal
- 300 \mul
- Trombina humana (Stago ref. 00896) a 2 U/ml
- 30 \mul
Incubación de 2 min. a la temperatura del
laboratorio.
- Hirudina (Knoll)
- 100 \mug/ml (concentración final)
- o heparina (Choay)
- 500 ug/ml (concentración final)
\vskip1.000000\baselineskip
Verificar:
- -
- que no se ha formado ningún coágulo en el tubo.
- -
- que un ensayo de detección de la fibrina soluble disponible en el mercado sea positivo (por ejemplo FS test del laboratorio Stago).
Se pueden considerar dos posibilidades
presentadas en la tabla I.
\newpage
I-A: Tubo 2 considerado
\vskip1.000000\baselineskip
I-A: Tubo 3 considerado
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar el procedimiento de la invención,
la cantidad de activador a añadir a la muestra debe ser tal que
induzca una generación de D-dímeros importante en el
plasma de control positivo, tal como el obtenido en el ejemplo nº 1,
y una generación de los D-dímeros no significativa
en un plasma de control negativo (testigo no tratado con
trombina).
Por lo tanto, se ha realizado una incubación de
los plasmas testigo y de plasmas de control positivos (n=21) con
diferentes dosis de PA Fb sp durante 15 minutos a 37ºC. Al final del
tiempo de incubación, se determinan los D-dímeros
mediante Liatest o mediante ELISA rápido (D-Di
Stago) (incubación de 15 minutos a 37ºC con el anticuerpo de captura
y de 15 minutos a 37ºC con el anticuerpo de revelación).
Los resultados presentados en la tabla I se han
obtenido con el ensayo ELISA.
Se obtienen unos resultados sustancialmente
análogos con el Liatest (n=5).
\vskip1.000000\baselineskip
La dosis de pA Fb sp escogida es la que
induce:
- -
- un aumento <300 ng/ml en los plasmas de control no tratados (testigos negativos),
- -
- el aumento más importante en los plasmas de control positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
De estos resultados se desprende que las
concentraciones finales preferidas de PA Fb sp a utilizar son:
- -
- 2 \mug/ml para el t-PA: en estas condiciones, la dosis de t-PA susceptible de ser neutralizada por los PAI es despreciable.
- -
- 10 \mug/ml para la SAK (dosis inferiores de SAK han inducido una mala degradabilidad de la fibrina soluble en ciertos enfermos o ciertos controles positivos, debido seguramente a la presencia de antiestafiloquinasa en la muestra, antiestafiloquinasa que puede aparecer como consecuencia de una infección por estafilococos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza el procedimiento sobre unas muestras
de plasma, según el protocolo indicado anteriormente: incubación de
los plasmas durante 15 minutos a 37ºC en presencia de tPA (2
\mug/ml) o de SAK (10 \mug/ml).
Los D-dímeros generados son
dosificados mediante un ensayo ELISA tal como se ha descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento realizado mediante Elisa rápido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento según la invención permite
separar los enfermos en tres grupos, en función de sus contenidos
plasmáticos en fibrina soluble y en D-dímeros. Las
características de cada uno de estos tres grupos se resumen en la
tabla V siguiente.
Como se ha indicado anteriormente, el
procedimiento de la invención permite así no solo seguir la
evolución de un proceso de activación de la coagulación sino también
evaluar la eficacia de una terapia anticoagulante, y apreciar si con
la interrupción de la terapia se produce de nuevo la activación de
la coagulación.
- Grupo 1:
- activación de la coagulación precoz con aumento de la fibrina soluble, sin aumento de los D-Dímeros.
- Grupo 2:
- enfermos para los que se interrumpe la activación de la coagulación (terapia eficaz), pero el trombo ya formado continúa degradándose (contenido en fibrina soluble normal, proporción de D-dímeros aumentada)
- Grupo 3:
- enfermos que presentan una activación de la coagulación con degradación del coágulo in vivo (aumento simultáneo de la fibrina soluble y de los D-Dímeros): terapia insuficientemente eficaz.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón pH 7,4
Trombina humana purificada (Stago Ref.
00896)
t-PA (Boehringer)
Aprotinina. Conservar la solución a 4ºC.
Kit de D-Dímeros.
El procedimiento utilizado se resume en la tabla
VI.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (14)
1. Procedimiento de dosificación de la fibrina
soluble en una muestra, en el que se coloca dicha muestra en
presencia de un activador del plasminógeno de fuerte especificidad
con la fibrina soluble (PA-Fb sp) específico de la
fibrina en las condiciones de utilización del activador
seleccionadas para evitar la degradación del fibrinógeno plasmático
circulante y se mide el contenido de la muestra en fibrina soluble,
midiendo la diferencia entre la proporción de productos de
degradación específicos de la fibrina obtenidos después de la
degradación de la fibrina soluble por incubación con el
PA-Fb sp y la proporción de base de los productos de
degradación de la fibrina, determinada sobre dicha muestra antes de
su puesta en presencia con el PA-Fb sp.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los productos de degradación de la
fibrina medidos son los D-dímeros.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el PA-Fb sp se
selecciona de entre el grupo constituido por: el tPA o sus
derivados, el VPA o sus derivados, la estafiloquinasa o uno de sus
mutantes.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el PA-Fb sp es el tPA o
la estafiloquinasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra sanguínea es plasma.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los productos de degradación de la
fibrina se dosifican según un procedimiento de tipo ELISA, o
LIATEST.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra a
ensayar se incuba durante 15 minutos a 37ºC en presencia de
PA-Fb sp.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
PA-Fb sp es el t-PA utilizado en un
intervalo de concentraciones finales comprendido entre 1 y 2,5
\mug/ml.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
PA-Fb sp es el tPA a una concentración final de 2
\mug/ml de muestra.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
PA-Fb sp se selecciona de entre la Estafiloquinasa,
la bat-tPA, VPA, la DSPA, la FEKP, el EKP y la
KP.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
PA-Fb sp es la estafiloquinasa a una concentración
final de 10 \mug/ml de muestra.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las
proporciones de productos de la degradación de la fibrina soluble
que resultan de la activación del PA-Fb sp se
aprecian con respecto a un testigo positivo preparado a partir de un
plasma normal tratado mediante un activador de la coagulación y a
continuación por un inhibidor de dicho activador para evitar la
formación de un coágulo.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el testigo
positivo se prepara a partir de un plasma normal tratado con
trombina de manera que se induce una activación de la coagulación
in vitro y a continuación con hirudina o heparina, para
evitar la formación de un coágulo.
14. Utilización del procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para seguir la evolución
de un proceso de activación de la coagulación y evaluar la eficacia
de una terapia anticoagulante.
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