CZ20013111A3

CZ20013111A3 - Způsob stanovení rozpustného fibrinu, souprava k provádění tohoto způsobu a pouľití

Info

Publication number: CZ20013111A3
Application number: CZ20013111A
Authority: CZ
Inventors: Bibi Shah Soltan Mirshahi; Jeannette Soria
Original assignee: Societe Diagnostica-Stago; Assistance Publique-Hopitaux De Paris
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2001-08-28
Publication date: 2002-04-17
Also published as: CN102445546A; BR0113558A; CZ2003600A3; FR2813395A1; ES2337879T3; US9081024B2; US20120070855A1; EP1313877A1; KR20030051630A; US20030175839A1; PL361139A1; JP5049448B2; DE60140948D1; HUP0500620A2; JP2004507745A; RU2310200C2; MXPA03001841A; AU8414701A; US8883433B2; AR031383A1

Description

Vynález se týká způsobu stanovení in vit no rozpustného fibrinu generováním specifických degradačních produktů v krevním vzorku, kitu k provádění tohoto způsobu a použití tohoto způsobu nebo kitu ke sledováni vývoje aktivace koagulace a hodnocení účinnosti koagulační léčby.

Dosavadní stav techniky

V průběhu aktivace koagulace nastává generování trombinu, která způsobuje tvorbu nánosů fibrinu a tvorbu rozpustného fibrinu.

V tomto oboru je známou skutečností, že trombin odštěpuje z molekuly fibrinogenu fibrinopeptid A způsobující tvorbu monomerů fibrinu, na kterých jsou odmaskovány polymerační polohy A, které byly ve fibrinogenu maskovány, což přináší interakci mezi polohami A molekuly monomeru fibrinu a polohami a přístupnými stejně tak na fibrinogenu jako na fibrinu. Za druhé dochází k odštěpování fibrinopeptidu B, což má za následek odmaskování r-r’ymeručních poloh B a následně i.nterakc.> meri polohcmj fibrinu a polohami b přístupnými strýé ca? nu fibrinogenu jako na monomerech fibrinu.

Pokud je množství trombinu velmi vysoké (test in vitro), je veškerý fibrinogen transformován na monomery fibrinu, které polymerují následkem interakce poloh

♦ ·

A” a a z jedné strany a poloh B a b z druhé strany za vzniku fibrinového koagula. Naproti tomu, in vivo, je tvorba trombinu mnohem menší. Tvorba monomerů fibrinu je takto mnohem pozvolnější a proto část monomerů fibrinu polymeruje za vzniku fibrinu (trombus) a jiná část reaguje s fibrinogenem, kde jsou polohy a a b přístupné, a nebo s produkty degradace fíbrinogenu za vzniku rozpustného fibrinu, ve kterém jsou monomery fibrinu spojeny s fibrinogenem.

Stanovení rozpustného fibrinu má za cíl zjistit, zda existuje aktivace koagulace u pacienta, přičemž přítomnost rozpustného fibrinu v krvi, zvláště v krevní plazmě, svědčí o této aktivaci.

Toto stanovení je nezbytným doplňkem stanovení

D-dimerů vytvořených fibrinolýzou fibrinového koagula tvořícího trombus, které je rovněž indikátorem procesu aktivace koagulace. Skutečně bylo potvrzeno, že obsah D-dimerů v plazmě je zvýšený dokud se sraženina degraduje in vivo. Proto, pokud je trombus přítomen a degraduje se, bude obsah D-dimerů zvýšený ať už koagulace probíhá či nikoliv; naproti tomu pokud koagulace neprobíhá, obsah rozpustného fibrinu už nestoupá, zatímco pokud koagulace probíhá, stoupá.

Specifické měření obsahu rozpustného fibrinu v plazmě s onledem na obsah D-dimerů umožňuje:

1. stanovit zda proces koagulace probíhá u pacienta ve chvíli kdy je proveden odběr

2. odhadnout koagulolytickou rovnováhu. Obsah základních D-dimerů je skutečně odrazem degradace trombu in vivo·, obsah D-dimerů získaný přídavkem trombolytického činidla do plazmy představuje sumu základních D-dimerů a D-dimerů pocházejících z degradace cirkulujícího fibrinu (neboli rozpustného fibrinu),

Mezi nej starší metody stanovení rozpustného fibrinu patří et/ianolový test (1,2,9) nebo protaminsulfátový test (3,4,5,7). Nicméně tyto testy jsou málo specifické (9,10) a málo citlivé (10). Navíc vysoké obsahy fibrinogenu (> 5 g/1) ruší výsledky získané pomocí et/ianolových a protaminsulfátových testů. Konečně výsledky protaminsulfátových testů mohou být obtížně interpretovatelné (6,8).

Jiný typ stanoveni rozpustného fibrinu je založen na metodě hemaglutinace červených krvinek senzibilizovaných monomery fibrinu podle Largový metody (11,12). Tento typ testu je například komercializovaný společností Diagnostíca Stago pod názvem FS test.

Přestože je tato technika velmi snadná, může někdy postrádat citlivost a hodí se zvláště pro diagnostiku diseminovaných intravaskulárních koagulaci. Naproti tomu nedovoluje stanovit nižší obsahy rozpustného fibrinu (lokalizované trombózy, posouzení účinnosti antikoagulační terapie).

OstatriL metody stanovení rozpustného fibrinu jsou v součastnosti založeny na použiti monoklonálních protilátek detekujících odmaskované epitopy na fibrinu a maskované epitopy na fibrinogenu nebo degradační produkty fibrinu nebo fíbrinogenu (13-14). Nicméně přímá stanovení za použití monoklonálních protilátek vedou k obsahům rozpustného fibrinu, které se mění podle použité komerční protilátky.

Podle předmětného vynálezu se navrhuje pro stanovení koagulo-lytické rovnováhy pacienta postup odlišný od výše uvedených metod používaných v této oblastí, přičemž tento postup je obzvláště jednoduchý a rychlý. Postup podle vynálezu má rovněž lepší citlivost než výše popsaná metoda hemaglutinace. Ve vztahu k testům používajícím monoklonální protilátky představuje výhodu detekce jak cirkulujícího (rozpustného) fibrinu, tak fibrinu jíž degradovaného in vivo a takto umožňuje velmi přesné určení koagulo-lytické rovnováhy.

Postupem podle předmětného vynálezu je rozpustný fibrin přítomný ve vzorku měřen po generování produktů degradace rozpustného fibrinu během inkubace vzorku s aktivátorem plazminogenu, který má vysokou specificitu pro fibrin (PA-Fb sp). Tímto způsobem rozdíl mezi obsahem degradačních produktů získaných degradací rozpustného fibrinu pomocí PA-Fb sp a obsahem degradačních produktů základního fibrinu měřeným před uvedením vzorku do kontaktu s PA-Fb sp dovoluje stanovit obsah rozpustného fibrinu v plazmě v odebraném vzorku.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je tedy způsob stanovení rozpustného fibrinu v bio Logickém vzorku, při které se k tomuto vzorku přidá aktivátor plazminogenu se silnou afinitou pro fibrin (PA-Fb sp) a měří se obsah rozpustného fibrinu ve vzorku stanovením rozdílu mezi obsahem degradačních produktů získaných po degradaci rozpustného fibrinu prostřednictvím PA-Fb sp a základním obsahem degradačních produktů fibrinu stanoveným před přidáním PA-Fb sp do vzorku.

Způsob stanovení rozpustného fibrinu v biologickém vzorku podle vynálezu zahrnuje fáze:

- stanovení produktů degradace fibrinu obsažených v odebraném vzorku krevní plazmy,

- uvedení krevního vzorku do kontaktu s aktivátorem plazminogenu, který má silnou specificitu pro fibrin (PA-Fb sp) za podmínek dovolujících degradaci rozpustného fibrinu obsaženého ve vzorku na jeho degradační produkty,

- stanovení produktů degradace fibrinu ve vzorku inkubovaném s PA-Fb sp

- stanovení rozpustného fibrinu, které odpovídá rozdílu mezi obsahem produktů degradace fibrinu zjištěným po inkubaci s PA-Fb sp a obsahem produktů degradace fibrinu zjištěným v nezpracovaném vzorku.

Činidlo použité pro stanovení degradace produktů je vybráno s cílem stanovit určitou skupinu degradačních produktů. Používají se například protilátky s danou specificitou k určitému typu degradačních produktů.

Biologickým vzorkem je s výhodou biologická kapalina, například vzorek krve nebo plazmy, případně punktát.

Cílem vynálezu je rovněž použití aktivátoru plazminogenu se silnou afinitou pro fibrin (to znamená který aktivuje plazininogen pouze v přítomnosti fibrinu) v postupu stanovení rozpustného fiorinu generováním specifických degradačních produktů. Cílem vynálezu je rovněž kit k praktickému provádění výše uvedeného postupu.

Ve funkci aktivátorů plazminogenu jsou známy četné sloučeniny. Některé z nich degradují stejně tak fibrinogen

* ♦ • ·	• •	Φ ♦ • · « « ·	* · • «	• ♦ • * • ·	• Φ
• *	Φ ♦ ··	« · M	* · ♦ ·	• · « ·	• ·« ·

jako fibrin, například streptokináza a urokináza (15) . Tyto sloučeniny nejsou vhodné pro postup podle vynálezu, protože vedou k degradaci fibrinogenu, která poskytuje produkty degradace fibrinogenu, které interferují s produkty degradace fibrínu.

Druhá skupina aktivátorů plazminogenu je tvořena sloučeninami popsanými jako sloučeniny se silnou specificitou pro degradaci fibrinu ve srovnání s fibrinogenem. Metoda podle vynálezu využívá s výhodou specificitu této druhé skupiny sloučenin.

Některé sloučeniny s takovou specificitou (PA-Fb sp) byly popsány v literatuře. Je znám například:

- tkáňový aktivátor plazminogenu (nebo-li t-PA) nebo jeho deriváty, jako například TNK-tPA, který je mutantem ΐ-PA, který má vysokou specificitu pro fibrin (16);

- aktivátor pocházející ze slin Desmodus rotundus (bat-ΐΡΑ nebo-ii vPA = Vampire bar salivary plasminogen activator) nebo jeho deriváty:

DSPAs = Desmodus rotundus salivary Pas, FEKP = DSPA alfa 1 a alfa 2, EKP = DSPA beta, KP = DSPA gama, (17).

- Stafylokináza (SAK), polypeptid produkovaný kmenem Stafylococcus aureus (18-19) nebo jedním z jeho mutantů (20).

Postup podle tohoto vynálezu se s výhodou provádí na vzorku plazmy. Obsah rozpustného fibrinu je sranoven měřením degradačních produktů vznikajících působením PA Fb sp. Metoda je validována, je-li třeba, diky použití pozitivního průkazného vzorku získaného z normální plazmy zpracované pomocí stopových množství trombinu tak, aby byla navozena aktivace koagulace odpovědná za tvorbu rozpustného fibrinu,

- 7 aniž by došlo k tvorbě sraženiny.

Pro získání pozitivní plazma kontroly je plazma nejprve po určitou dobu inkubována s trombinem nebo jiným aktivátorem koagulace. Proces koagulace, který byl takto nastartován je poté zastaven přídavkem inhibitoru použitého aktivátoru, aby se zabránilo pokračování reakce, V případě, kdy aktivátorem je trombin, se jako inhibitor používá například hirudin nebo heparin.

Inkubační doba plazmy, koncentrace aktivátoru koagulace a inhibitoru pro její zastaveni jsou s výhodou zvoleny tak, aby bylo dosaženo všech etap aktivace koagulace předcházejících začátek tvorby sraženiny.

Inkubace v přítomnosti aktivátoru koagulace (trombinu) se s výhodou provádí po inkubační dobu 2 minuty při okolní teplotě. Inhibitor se poté přidává ve velkém přebytku aby byla jistota, že dojde k zastavení koagulace.

Pokud se jedná o hirudin, používá se tento s výhodou v konečné koncentraci 100 g/ml pro konečnou koncentraci trombinu 0,18 U/ml.

Pokud se jedná o heparin, používá se tento v konečné koncentraci 500 U/ml, pokud je konečná koncentrace použitého trombinu 0.18 U/ml.

Stanovení rozpustného fibrinu podle tohoto vynálezu využívá první etapy degradace rozpustného fibrinu prostřednictvím PA Fb sp následované měřením specifických degradačních produktů vzniklých působením PA Fb sp.

4

444

44« * ♦ • · f· • ♦ · 4· • · ♦4 ··44

Je nezbytné, aby výsledky metody podle vynálezu byly získány co nejrychleji při zachování reprezentativity množství rozpustného fibrinu přítomného ve vzorku. Za tímto účelem musí být podmínky použití PA Fb sp stanoveny tak, aby degradace rozpustného fibrinu byla rychlá a aby nebyla doprovázena kontaminující degradací cirkulujícího plazmatického fibrinogenu, která poskytuje degradační produkty interferující s produkty degradace rozpustného fibrinu.

Dávky PA Fb sp jsou tímto způsobem zvoleny tak, aby navodily nejvýraznější zvýšení obsahu produktů degradace fibrinu v pozitivních průkazných vzorcích a prakticky nulové zvýšení v negativních průkazných vzorcích (to je které nepodstoupily zpracování pomocí aktivátoru koagulace).

V rámci tohoto vynálezu mohou být použity různé aktivátory fibrinolýzy umožňující specifickou degradaci fibrinu. PA Fb sp je s výhodou vybrán ze skupiny tvořené výše uvedenými aktivátory, to je: tPA nebo jeho deriváty, VPA nebo jeho deriváty, stafylokináza nebo některý z jejich mutantů. S výhodou se používá tPA nebo Stafylokináza, zvláště pak tPA.

V podmínkách inkubace vzorků 15 minut při 37 °C se používá konečná koncentrace stafylokinázy v rozmezí 1 až 12 pg/ml. Běžně používaná konečná koncentrace je 10 pg/ml. Inkul ační doba může být pozměněna a její délka je stanoven·; podle povahy a koncentrace použitého PA Fb sp.

tPA se s výhodou používá v rozmezí konečných koncentrací 1 až 2,5 gg/ml. S výhodou se používá koncentrace tPA 2 gg/ml.

· *	4 4	v ··	• · 4	9·
• · • 9 ·	• · · 9 9 0 1 9	« • *·	• · · • · • 9	9 • • · 9

Existují různé degradačni produkty rozpustného fibrinu, které mohou být specificky stanoveny. Podle výhodného způsobu provedení se měří obsah D-dimerů vzniklých působením PA Fb sp na rozpustný fibrin, to znamená stanovuje se koncentrace D-dimerů vzniklých působením PA Fb sp na rozpustný fibrin (D-dimery po působení PA Fb sp - základní D-dimery před působením PA Fb sp).

D-dimery vznikající degradací rozpustného fibrinu v přítomnosti PA Fb sp mohou být stanoveny jakoukoliv běžnou metodou stanovení analytu, jako jsou například metody typu ELISA, citlivé metody prostřednictvím aglutinace latexových částic, imunochromatografické metody, atd. Z různých testů stanovení D-dimerů komerčně dostupných lze uvést například ASSERACHROM D-Di nebo STA LIATEST D-Di, oba dva uvedené na trh firmou Diagnostica Stago. Nicméně v rámci tohoto vynálezu byly podmínky použití testu ELISA ASSERACHROM D-Di s výhodou pozměněny za účelem zkrácení testu (15 minut inkubace s imobilizovanou protilátkou a 15 minut s protilátkou označenou peroxydázou).

Kromě fragmentu DD/E existují další produkty degradace fibrinu, například komplexy YD/DY, YD/DXD, které mohou být stanovovány.

Jak je uvedeno v následujících příkladech (viz příklad č.3), může být metodu pudle vynálezu prováděna u pacientů s aktivací koagulace buď před začátkem terapie, nebo v průběhu anti-koagulačního léčby a nebo po jeho ukončení. Tímto způsobem metoda umožňuje hodnotit nejenom vývoj procesu aktivace koagulace, zvláště v rámci diagnostiky aktivace koagulace, ale rovněž účinnost anti-koagulační ·· · ♦ • · · · ·· · * · · · · · ··· • · · · · « · ·· ··· ·· ·· ·· léčby.

Podle dalšího aspektu je cílem tohoto vynálezu kit pro stanovení rozpustného fibrinu ve vzorku, charakterizovaný tím, že obsahuje:

- pozitivní kontrolu na přítomnost rozpustného fibrinu získanou podle výše popsaného protokolu,

- negativní kontrolu tvořenou plazma průkazným materiálem,

- PA Fb sp v individuálním množství pro jeden odběr nebo v dostatečném množství pro více odběrů,

- činidlo pro stanovení D-dimerů, a

- případně pufr pro ředení vzorků, například pufr fosfátový pH 7,4 obsahující 0,1 % bovinní sérový albumin a 0,05 % Tween 20.

Pozitivní a negativní plazma kontroly jsou s výhodou v lyofilizované formě.

S výhodou používané PA Fb sp je tPA.

D-dimery se stanovují například pomocí činidla pro metodu typu ELISA, jako je ASSERACHROM D-Di, nebo činidla pro citlivý test aglutinace latexových částic jako je STA LIATEST D-Di, přičemž obě metody jsou uvedené na trh firmou Diagnostica Stago.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady slouží k lepšímu objasnění předmětného vynálezu, přičemž uvedené příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

Příklad 1

Výběr koncentrace trombinu použitého pro získání pozitivní plazma kontroly obsahující rozpustný fibrin

Pozitivní plazma kontrola byla připravena podle následujícího protokolu:

Normální plasma

Lidský trombin (Stago ref.00896) v konc.2U/ml

300 μΐ μΐ

Inkubace 2 minuty při teplotě

Hirudin (Knoll) laboratoře.

100 pg/ml (konečná koncentrace) nebo Heparin (Choay)

500 U/ml (konečná koncentrace)

Ověření:

- že neprobíhá tvorba sraženiny ve zkumavce.

- že komerčně dostupný test stanovení rozpustného fibrinu je pozitivní (př.FS test laboratoří Stago).

Mohou být použity dvě možnosti prezentované v tabulce I.

TABULKA I

I-A : Použita zkumavka 2

Číslo zkumavky	1	2	3	4
Normální plazma s citrátem	300 pl	300 pl	300 pl	300 pl
Trombin	30 pl o konc. 4L7ml	30 pl o konc. 2U'mI	30 pl o konc. ILiml	30 pl o konc. 0.5U/ml
Inkubace 2 minuty při okolní teplotě
Přítomnost sraženiny	“7	-	-	-
Heparin nebo hirudin	500jednotek 100 pg	500 jednotek 100 pg	500 jednotek 100 pg	500 jednotek 100 pg

I-B Použita zkumavka 3

Číslo zkumavky	I	2	3	4
Normální plazma s citrátem	300 μΐ	•00 μ!	300 μ!	300 μϊ 1
Trombin	30 μΐ o konc. 4U/ml	30 μΐ o kcnc. 2U/ml	30 μϊ o konc. lU/ml	30 μΐ o konc. 0,5U/ml
Inkubace 10-15 minut při okolní teplotě
Přítomnost sraženiny	4	r
Heparin nebo hirudin	500 jednotek 100 nu _ - ¹	500 jednotek 100 us ______l—*--------------	500 jednotek 100 μ2	500 jednotek 100 μ2

Příklad 2

Stanovení množství PA Fb sp k použití v definovaných inkubačnich podmínkách.

K provedeni postupu podle tohoto vynálezu musí být množství aktivátoru přidávaného ke vzorku takové, aby navodilo výraznou tvorbu D-dimerů v pozitivní plazma kontrole takovou, jaká byla dosažena v příkladu 1, a zanedbatelnou tvorbu D-dimerů v negativní plazma kontrole (vzorek bez přídavku trombinu).

Inkubace průkazných vzorků plazmy a pozitivních plazma kontrol (n=21) byla tedy prováděna s různými dávkami PA Fb sp po dobu 15 minut při 37 °C. Na konci inkubační doby byly >-H irnery stanoveny Liatestem nebo rychlým testem El Jsa (D-Di Stago) (inkubace 15 minut při teplotě 37 “C s fixovanou protilátkou a 15 minut při teplotě 37 °C s odhalenou protilátkou).

Výsledky uvedené v tabulce II byly získány testem ELISA

Výrazně analogické výsledky byly získány za použití Liatestu (n=5).

TABULKA II

Degradace rozpustného fibrinu rostoucím množstvím t-PA a SAK.

	D-dimery (ng'ml)	-----------------------------—, Rozpustný fibrin (nginl)
	Negativní	Pozitivní kontrola	Negativní	Pozitivní kontrola
	kontrola	(zpracovaná	kontrola	(zpracovaná
		trombinem)		trombinem)
Bez přídavku PA Fb sp	375	375
Srafylokináza 10 pg/ml	400	i “50	<. 50	1375
2 pg/ml	390	1615	< 50	1225
1,5 pg/ml	375	1700	<50	1325
1 pg/ml	350	1657	<50	1305
0,5 pg/ml	410	1125	<50	715
t-PA 2 pg/ml	350	1790	<50	1415
1 με/ml	360	1420	<50	1045
0.5 pg/ml	360	1210	<50	835

Vybraná dávka PA Fb sp je ta, která způsobuje:

- zvýšení < 300 ng/ml v nezpracovaných plazma kontrolách (negativní průkazné vzorky), nejvýraznějsí zvýšeni v pozitivních plazma kontrolách.

Z těchto výsledku vyplývá, že výhodné konečné koncentrace PA Fb sp jsou:

- ² gg/ml pro t-PA; za těchto podmínek je množství í^_PA, které by mohlo být neutralizováno PAI zanedbatelné,

- 10 gg/ml pro SAK (nižší dávky SAK způsobily špatnou degradabilitu rozpustného fibrinu u některých pacientů nebo u některých pozitivních kontrol, pravděpodobně z důvodu přítomnosti antistafylokinázy v odběrech, přičemž tato anti-stafylokináza se může objevovat následkem infekce stafylokoky).

Příklad 3

Výsledky získané u zdravých dobrovolníků a u pacientů s podezřením na aktivaci koagulace (z důvodu zvýšení D-dimerů)

Metoda byla prováděna na vzorcích plazmy podle výše uvedeného protokolu: inkubace plazmy po dobu 15 minut při teplotě 37 °C v přítomnosti tPA (2 pg/ml) nebo SAK (10 pg/ml).

Vzniklé D-dimery byly stanoveny testem ELISA tak jak byl popsán výše.

A. Výsledky získané u zdravého dobrovolníka

TABULKA III

	F.S. (ns/ml)
Plasma kontroly + t-PA (n=21)	147 ±100 mými
Plasma kontroly + Ila ^x t-PA (n=21) 1	2128 ± 1219 ns/ml *” 1
	(extrémní hodnoty. 742 - 3660)
Plasma kontroly + SAK (η— 11)	64 ± 82 ng/ml (extrémní hodnoty: 0-215)
Plasma kontroly + Ha + SAK (n= 11)	1700 ± 1880 ngml (extrémní hodnoty: 250 - 5000)

B. Výsledky získané u pacientů se zvýšeným obsahem D-dimeru

Experiment provedený rychlým restem Elisa.

TABULKA IV

Příklady podle vynálezu:

	Obsah D-dimerů po přídavku t-PA (ng/ml)	Obsah D-dimerů před přídavkem t-PA (ng/mlj	Obsah rozpustnéíio fibrinu (ng/ml)
Pacient ze skupiny 1	5420	510	4910
Pacient ze skupiny 2	1316	1234	82
Pacient ze skupiny 3	30162	20699	9463

Závěrečné hodnocení:

Metoda podle tohoto vynálezu dovoluje rozdělit pacienty do tří skupin podle jejich plazmatických obsahů rozpustného fibrinu a D-dimerů. Charakteristiky každé z těchto tří skupin jsou shrnuty v následující tabulce V:

	Rozpustný fibrin (ng/mi)	D-dimerv (ng/ml)	Závěr
i kup inu 1	>500		Tvorba sraženiny která nebyla ještě degradována
Skupina 2	<300		Přítomnost trombu, ale zastavená koagulace
Skupina 3	>500		Koagulace trvá. 1 spojena s degradací sraženiny

·« 4 4« «« «4 44 «44

Jak bylo uvedeno výše, metoda podle tohoto vynálezu dovoluje tímto způsobem nejen sledovat vývoj procesu aktivace koagulace, ale rovněž hodnotit účinnost antikoagulační léčby a odhadnout, zda po zastavení léčby dochází znovu k aktivaci koagulace.

Skupina 1: raná aktivace koagulace se zvýšením rozpustného fibrinu, bez zvýšení D-dimerů.

Skupina 2: pacienti, u kterých je aktivace koagulace zastavena (účinná léčba), ale degradace již vytvořeného trombu pokračuje (obsah rozpustného fibrinu normální, obsah D-dimerů zvýšený).

Skupina 3: pacienti, kteří mají aktivaci koagulace s degradací sraženiny in vivo (simultánní zvýšení obsahu rozpustného fibrinu a D-dimerů): nedostatečně účinná léčba.

Příklad 4

Rekapitulace použité metody:

Činidla:

pufr pH 7,4

Lidský trombin purifikovaný (Stago Ref.00896) t-PA (Boehringer)

Aprotinin. Roztok uchovávat při 4 °C.

Kit D-dimerů.

Použitá metoda je srhnuta v tabulce VI.

TABULKA VI

Protokol použitý pro stanovení rozpustného fibrinu generací

D-Dimerů.

Plazma	200
t-PA (20 pg/ml) (konečná koncentrace 2 pg/ml)	20
uchovat 15 minut při 37°C
Aprotinin	20
Naředit vzorek podle obsahu základních D-dimerů (1/20 - 1/1000)
Destička Asserachrom D-Di
Ředěný vzorek	200
Zakrýt otvory a uchovat 15 minut při 37°C
Promýt 3-krát
Lidský anri-ňagment D onačený peroxydázou	200
Zakrýt otvory a uchovat 15 minut při 37°C
Promýt 3-krát
Substrát OPD/H2O2	200
Počkal 3 minuty velmi přesně u každého vzorku, poté přidat:
bud' H2SO4 3M	50
nebo HCI 1M	100

Měřit absorbanci při 492 nm.

····

- 10 - .»········ ·«· ······ ·· ··* ·· ·· ·· ·

Bibliografie:

1. GODAL H.C., ABILDGAARC U. : Gelstion of solubie fibrin in plasma by ethanoi. Scand. J. Haematol., 3, 342-350, 1966.

2. EREEN F.A., TULLIS J.L. : Ethanoi gelstion : a rapid screening test for intravascular coaauiation. Ann. Intem. Med., 69, 11971206, 1968.

3. LIPINSKl B., WOROWSKI K. : Detection of soluble fibrin monomer complexes in blood by means of protamine sulphate test. Thromb. Diath. Haemorrh., 20,44-49, 1968.

4. SEAMAN A.J. : The recognition of intravascular clotting. Tne plasma protamine paracoagulation tesť. Arch. Intem. Med., 125, 1016-1021, 1970.

5. LATALLO Z.S., WEGRZYNOWICZ S„ EUDZUMKi A.Z. : Effect of protamine sulphate on the solubility of fibrincgen, iis derivatives and otherpiasma proteins. Scand. J. Haematoi., suppl., 13, 151-162,1971.

6. MUSUMECI V.: Ethanoi gelstion test and protamine sulphate test in diagnosis of intravascular coagulaiion. Scand. J. Haematoi., supe!..

12. 197-202. 1971.

7. NiEWlAROWSKI S., GUREWICH V. : Laboratoř·/ identiffoatfon cf ccagufotion The seriál cilutíon protamine sulfáte test for the detection of fibrin monomer ano fibrin cegradsiicn prccucfo'. J. Lac. Oir. Med., 77, 665-676, 1971.

8. KIDDER W.R.. LOGAN L.J., RAPAFORT S.I., FATCH M.J. : Tne plasma protamine paraccaculaticn test - Ciinicai and laboratory evaluaticn. A.J.C.P., 58. 675-686, 1972.

- 19• · ·· » φ · ♦ · · «· · ·

9. GUREWICH V., LIPINSKI B„ LIPINSKA I. : A comparative study of precipitation and paracoagulation by protamine sulphate and ethanci aelation tests. Thromb. Res., 2, 539-556,1973.

10. GERRITS W.B.J., FRAKKE E.M., VAN DER MEER J„ VREEKEN J. : Causes of a negative ethanol aelation test in diffuse imravascular coagulation. Thromc. Diatn. Haemorrn., 31,299-303,1974.

11. LARGO R., HELLER V., STRAUB F.W.: Detectíon of soluble intermediates of the fibrinogen-fibrin conversion using erythrocytes coated with fibrin monomers. Blood, 47, 991-1002, 197.6.

12. SORIA J., SORIA C„ DE RODRIGUEZ S„ HORELLOU M.H.. SAMAMA M., BILSKI-PASQUIER G, : Recherche des complexes solubies de fibrine par un test ďhémagglutinaticn - Applications clinicues. Presse Méd., 6,43, 4045-4043, 1977,

13. DEMPFLE CE„ DOLLMAN M„ LÍLL H., PUZZGVIC 0., DESSAUER A., HEENE DL. : Eindinc cf a new monocional antibody against N-terminal heptapeptide of fibrin aipha-chain to fibrin poiymerization sítě A : effects of fibrinogen and fiorinogen derivatives, and pretreatment of sampies with NaSC^v. E!ccd Coagul. Fibdnclysis, 4, 79-36, 1993.

14. SOE G„ KOHNO I., INUZUKA K„ ITOH Y„ MATSUDA M. : A mcncclcnal anribody that recognizes a neo-antigen exposed in the E domairi of fibrin monomer complexed with fibrinogen or its derivatives : iis applicaticn to the measurementof soluble fibrin in plasma. Elccc. 38. 2109-2117, 1996.

φ • φ ··

	φ Φ Φ ·	• * ΦΦ	• Φ φ ·	φφ
	i ·	• ·	« ♦
Φ Φ		··	··	φφ

15. GUREWICH V., HYDE E., LIPINSKI E. : The resistance cf fibrinogen and solubie fibrin monomer in blood to degradation by a pctent plasminocei activator derived from cadaver limbs. Elood,46, 555-565,1975,

16. CANNON CP, GIESON CM, MCCABE CH, ADGEY AA. SCHWEIGER MJ, SEQUEiRA RF, GROLLIER G, GIUGUANO RP, FREY M. MUELLER HS, STEINGART RM, WEA7ER WD, VAN DE VYERF F, BRAUNWALD E. : TNK-tissue piasminogen sctivator compared with frc-ntloaded altephase in acute myocardial infarcticn results of the TIMI 10B tríal. Thromboiysis in Myocardial Infarction (TIMI) 10B Investiaators, Circulation 98 (25),2805-14,1998.

17. ERINGMANN P, GRUEER D, LIESE A, TOSCHI, L. KRATZCHMAR J, SCHLEUNING WD, DONNER F. : Structural features mediating fibrin selectivity cf vampirebat piasminogen acíivators. J Bioi Chen. 270, 25596-603, 1995.

18. COLLEN D. : Staphylckinase : a potent, uniquely fibrin-selecnve thrombolytic agent. Mat Med, 4 - 279-84, 1998,

19.	SAKHAROV DV, BARRERTT-SERGSHOEFF M.
ΗΕΚΧΞΜΕΞ“:	?· F“ ROKEM DC. : Fibrin-specificity of a piasmL*-
	.· ť.e /.i licrV.civsis sne resccnsNer:ef;S n Litr;.

: comparíson of mne piasminccen acíivators in vitro. i hrome Haemos, 8 605-12, 1999.

20. COLLEN D, EERMA.ERTS R, DECLERCK, F, DE COCK F, DEMARSIN E. JENNE S. LAROCHE Y, LIJNEN HR. SILENCE K. VERSTRE.KEN M. : Reccmbinant staphyiokinase variams with alterec immuncreactivity. I : Consiructicn and charscterizaticn. Circulation, 94, 19/206, 1996.

Claims

1. Způsob stanovení rozpustného fibrinu ve vzorku, vyznačující se tím, že se ke vzorku přidává aktivátor plazminogenu se silnou specificitou pro rozpustný fibrin (PA-Fb sp) a měří se obsah rozpustného fibrinu ve vzorku tak, že se měří rozdíl mezi obsahem degradačních produktů fibrinu získaných po degradaci rozpustného fibrinu působením PA-Fb sp a základním obsahem degradačních produktů fibrinu, stanoveným ve vzorku před přidáním PA-Fb sp.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že měřené degradační produkty fibrinu jsou D-dimery.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že aktivátor plazminogenu se silnou afinitou pro rozpustný fibrin (PA-Fb sp) je specifický pro fibrin.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že PA Fb sp je vybrán ze skupiny tvořené : tPA nebo jeho deriváty, VPA nebo jeho deriváty, stafylokináza nebo některý z jejích mutantů.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je tPA nebo stafylokináza.

6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krevní vzorek je plazma.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že degradační produkty fibrinu jsou stanoveny metodou typu ELISA nebo LIATEST.

«· ·' · ♦ · · · · • · · ·· · ♦

I ··· »· ♦· ·· ··♦

8. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že testovaný vzorek je inkubován po dobu 15 minut při 37 °C v přítomnosti PA-Fb sp.

9. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je tPA v konečné koncentraci 2 g/ml vzorku.

10. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je vybrán ze skupiny Stafylokináza, bat-tPA, VPA, DSPAs, FEKP, EKP, KP.

11. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je stafylokináza v konečné koncentraci 10 g/ml vzorku.

12. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že obsahy degradačních produktů rozpustného fibrinu vzniklých při aktivaci PA-Fb sp jsou stanoveny ve vztahu k pozitivnímu průkaznému materiálu.

13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že pozitivní průkazný materiál je připraven z normální plazmy zpracované tak, aby byla navozena aktivace koagulace in vitro aniž by došlo k tvorbě sraženiny.

14. Pozitivní průkazný materiál použitelný v metodě podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že je tvořen normální plazmou zpracovanou tak, aby byla navozena aktivace koagulace in vitro aniž by došlo k tvorbě sraženiny, přičemž tato plazma je uvedena do kontaktu s aktivátorem plazminogenu, který má silnou afinitu a/nebo specificitu pro rozpustný fibrin za analogických podmínek jako jsou podmínky aplikované na testovaný vzorek.

15. Použití aktivátoru plazminogenu se silnou afinitou pro fibrin (PA-Fb sp) v metodě stanovení rozpustného fibrinu generací specifických degradačních produktů.

16. Použití podle nároku 15, vyznačující se tím, že degradační produkty fibrinu jsou D-dimery.

17. Použití podle nároku 15, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je vybrán ze skupiny tvořené tPA nebo jeho deriváty, VPA nebo jeho deriváty, stafylokinázou nebo některým z jejích mutantů.

18. Použití podle nároku 15, vyznačující se tím, že PA-Fb sp je tPA nebo stafylokináza.

19. Kit pro stanovení rozpustného fibrinu přítomného ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje:

- pozitivní kontrolu na přítomnost rozpustného fibrinu,

- negativní kontrolu tvořenou plazma průkazným materiálem,

- činidlo pro stanovení D-dimerů, a

- případně prostředí pro ředení vzorků.

20. Kit podle nároku 19, vyznačující se tím, že pozitivní a negativní plazma kontroly jsou s výhodou v 1yofi 1izované formě.

21. Kit podle nároku 19, vyznačující se tím, že PA Fb sp je tPA.

* ♦ · 4 · 4 · • • 4 4 • • · ·· 4 • • 4 ·· 94 •

22. Kit podle nároku 19, vyznačující se tím, že činidlo pro stanovení D-dimerů je činidlo pro test ELISA nebo pro citlivý test aglutinace latexových částic typu LIATEST.

23. Použití metody podle některého z nároků 1 až 12, nebo křtu podle některého z nároků 19 až 22 pro sledování vývoje procesu aktivace koagulace a hodnoceni účinnosti anti-koagulační léčby.