PT90941B - Processo para a determinacao in vitro de polimeros de fibrina soluveis de ligacao cruzada - Google Patents

Description

MEMoRIA PESOSITIVft

Ests invsnto rslâcicna-s-s com um ensaio polímeros da fibrina para utilização no diagnóstico sorrendo o risco de trombose e mom torizaçao dos tratamento nesses doentes. Mais particularmente, rei ativo a.

de doestos efeitos do o prosem isinvsnto relaoiona-se com um ensaio com polímeros da fitrina, solúveis, de ligação cruzada, em amostras de doentes enro1rendo o tratamento in vitro da amostra com um encima proteolítico tal coco t —F’A o qus produz o fragmento dímerc-D dos polímeros. de N.bro~õ solúveis. A go.antidads de dímero-D formado é determinada, de preferência, por meio cie um imunoensaic específico ec; relsceão ?t; Nesro-D,, A medição do dímero-D constitui assim um rOfisao útil do estado de Ni doío saunauí; idade e o teste podo osr útil sara · avaliação cie o-‘: baçSes sre-troa;bRt içai ou tnsúúNsaa tais somo,, o< oRarL? dia nosà rd 10, a eíNaolia pulmonar e f.scaatssos veno a a prsTunza, assim somo para a avaliapao de iormasao Pe Neore aoi.úvai nos estados neopl ãsiooa , cie per 'curescRies num Nfumas e inflamatórias,, ou o ostras sifo.açÓss pa. to 1 óç i s as , e para

Λ

3U iíve iÇ i*tC

D invente aqui descrito foi realmdQ no decurso as ano patrocinado sn garte pelo National instituis of Health,,

U oresents invento reiaoione—se com um m ensaio psro utilização no diãqnóstic;

doer; tes iiTEõdl um alto risoo tronibosa e com s monitorização dos efeitos do tratamen to desses doentes,, Mais par t ic u 1 aroen te , o presente invento re 1 ao i orna-se com um novo método para a medição da quantidade de oolímeros da fibrina de ligação cruzada solúveis envolvendo o tratamento in vitro de amostra do doente, por exemplo plasma, com um activador do ρ1asrninoqènio tal como aotivado-r de tsc i di- ρ 1 asminoq en i o (t-Pfi) ou plasmina activa a fim de produzir produtos dímerosi-E> de políoeroe de fitrina solúveis, sendo a quantidade ds dímero-D produzida directamente proporcional á quantidade de polímeros de fibrina de ligação cruzada no soro do doente, sendo· a quantidade indicativa· da trombina e do factor XIII de activação, isto é trombose en evúIlçSi, ç.is pode indicar na estado de hipercoaguab · 11dado,

Tãm sido realizados muitos ssfjrrr; r r rú. d .? d i desenvolver métodos para a medição de produtos de acsivacão dc: ‘u Zr inogen i o „ A razão encontra-se no facto da conversão do fibrinogénio em fibrina perder estar envolvida em muitas siíuazdee patológicas. diferentes, incluindo o estado prètrombót ico e a coagulação mtravascu1 ar disseminada. Contudo, cr c i · “ c u 1 a c ã c ( f i. b rim olúveC nSo o prártic!

realização difícil e sofrerem de falta vz-e;_:ipr:odad“, Ess.es mó-todos consist çvuzunsAo química e no ensaco zromstcq ΓίΟ coesma humano ou mima série de teste' ri e o rodam i n a

métodos imas	-
da f1brina
visto serem	d t-?
b i 1 i d e. d e e	de·
re irtriz,	n e
fibrina solo	//ei

ci o u· a I f a t c

Teórioamente, s. formação de fibrina pode detestada indifectsiaente por determinação de fibrinopeotidos libertados. Coíitudu, para além de serem de análise difícil, os fibrinspeptidos- tém meias-vidas curtas e podem nao dar a mesma informação que a determinação direota da fibrina. solúvel,,

Foi também; proposto utilizar um método baseado no efeito estimu 1 atório da fibrina obtida na activsção do plasmi.no··· génio catalisada pelo t-PA (Wiman et al . , Th rombos is and Haemos·tatis 1983, 55:(2) 139). Neste ensaio a actividade do i-PA aumenta. na presença da fibrina solúvel e pode ser pósteriormente calculada a fim de indicar a concentração de fibrina solúvel.. Contudo, a determinação final, é uma determinação da actividade ensimáticã pelo t-PA num substrato cromogénico sensível à. plasmin* em·, vez de um fragmento de degradação da. fibrina.

Foi. também proposto utilizar imunoensaios que utilizam anticorpos monoclonais produzidos contra os únicos determinantes antigénicos da fibrina de ligação cruzada a fim de medir espscí·ficamente os produtos de degradação da fibrina de ligação cruzada sem sofrer influência dos produtos de degradação do f i br i.ncgen cu Vv 1 s_t_t e t a 1 Thranb. Res. 1983, 3_1_;7A7—78) ( Whi ta ter e t al_„ , 3 ,

V lin..__Patho 1 . 1934;; 37 : 382-7) ( Ga f f ney e t a 1 . , Throiiibosis_and

P ·· e mestas i s 1937; 53:231, resumo) , 0 dímerc-D é um dos produtos de degradação da fibrina. de ligação sricsds que é estável e resiste além disso à digestão pela plasmina. Níveis elevados no soro ou no plasma de dímero-D foram encontrados em doentes com f l.iirinol3.se patológica e após trombolise induzida. cor estrsptcgumase em doentes com trscross venosa gro^und-a ou com snisolis. pulmonar ÍLeo et al „ . 3 . A. C . C , , Vol . 1 , No, A , 1320—4:· , lesir, ssfs fim ico e ps tens i a. 1 men te útil apenas . a msniteri·racão do produto final da fibrinoliss, por exemplo.

dsi r ao Se

txoípbo 1 ise f i i o 1 óg ící ou. eoe tora o e ou t ·. - uti 1 iu-voc; uo o i v eoieroO COO ulãSOIODqsniO,

Set 1-3. -5 s· S1m » u .1 t s iTisei 11e Oe^sJálVSÍ , pru^bíClL-liât onouio rápido e simples que pudessí usado para me d1030

LiiS iO vitro da concentracSc fibrina solúvel, po exemplo no o hamado estado de reflectindo uma ensaio deve serdo doente representando um reflexo útil da hipercoaguabi1 idade ou estado pré-trombótic tendencia aumentada para formar fibrina. 0 elaborado para técnicas laboratoriais de rotina e para a determi naçSo de qrande número da amostras e com qrande exactid'âo.

Um imunoensaio diagnóstico para a medição da reactividade aumentada de um material de testa para o fragmenta dímero-D produzida pela adição de um activador de plasminogénio à amostra, tal come plasma, pede ser usado para determinar a concentração original de polímero de fibrina de ligação cruzada na amostra do doente. Assin, s concent^uçao de dímero-D no plasma a seguir ò dsgsoí eç óío du fibrina. eolúvo! em dímerc-D i_n -f i1re pode ser usoos coãj uíis sis pies medição in d i ruo ta. do polímero ds fibrinu du ligscúís cruzada o;oi circolucuo nu situação in viue.

presente invente relaciona-se com ue process determinação i η ν 1, t ro de polímeros de fibrina de ligação sα 1 ú ve i. s n uma aoes t ra d e u m d o e ~ te -g ue eon preen d e e f a. o e tar u referida amostra com um enzima proteolitico a proOuoir o i raq men to; dúsr-;~D cies rufsridoo pol insros de edioSdo du uuoniidudi de referido díno pero e·.

cnnuda con fnofim d o

U presen te onvenún r s 1. eo ione--se aind a coo un nunim η·' 3 n detaroi.nacao :n ο_ί.ύοϋ doo· rele-erco de fiaere de 1 eeocif? cr.uads solinais nuns ancsfra de ue doente que ceeereende o; foce·· contactar a referida; amostra com um enzima proteolitico para

produzir o fragmento dimero-D dos referidos- polímeros ds íinrina a a medi, pão quantidade do referido dimero-D pele utilização o;

um iiunoensdio específico ea relação ao referido dímero-D.

D presente invente também se relaciona cc-ι um este diagnóstico para avaliação da quantidade de dímero-D numa amostra de um doente compreendendo uai veiculo que é compartimentado a fio de receber uisa série de recipientes conipletãmente fechados cjt.j.€-;· compreende:

(a) um primeiro recipiente contendo uma quantidade medida padrão contendo polímeros de fibrina solúveis de ligação o ruzada, < t> > um segundo recipiente conte medida de um encima proteo1itico, e uma quantidad:

recipiente contendo um antii - i d o d í me r o ·· D .

presente invento proporciona um novo ensaio diaqr.óstico apresar; tando as vantagens precedentes o que envolve o tralsrerto m biÇjtro da amostra do doente com ti.n activaisr do plasminogénio (tal como t-F'A) ou plasmina aciiva, a fim cie produzir o dímero-D„ Os resultados deste teste podem proporcionar esclarecimento e grandemente facilitar a avaliação dos cmlss co-n trombose o correndo o risco de trombose e podem ser muito úteis na monitorização dos efeitos do tratamento desses doentes. A quantidade de dímsrm-u formada a¹ determinada por u.m imunoensaio esnscffico em n?]oc8o ac: dímero--D. A Quantids.de de direm-D pvnúruú A iusoúieús proporcional aos polímeros de ^itr.una solúveis nroseotes ms amostras do doente cuja qusncncaoe é nijiralioi ria. úm d i - s da activação ú faodor A 1 I 1 „ iodo a ίηοηύοο em aroluçSo e pode indicar um estado ds hi per c caqusbi · 1 idade

O presente inventa proporciona ssson um oeio para determinações práticas de amestras de doente em curtos períodos de tempo, sendo aplicável, nas técnoao laboratoriais da rotina e ne determ inação de qrandes números de amostras e com qrande ;acbidão. Us material· neo isárd.os são simples, f ác i 1 man te transportáveis, aplicáveis em centres qrandes e pequenos e mesmo nos consultórios médicos e podem ser submetidos a automatização em grande escala. A utilização de polímeros de fibrina de ligação cruzada como marcadores da bipercoaguabilidade proporciona um método muito prático visto relacionar-se com a via final para a.

in tírrepresen te formação do coágulo, em vez de se relacionar coe passos diários num mecanismo de coagulação complexo. Assim, o invento proporciona uma degradação i_n vi tro até dímero-D que piode ser usada como uma simples medição indirecta da concentração do polímero de fibrina de lisqação cruzada do plasma em amostras do doente. Essas amostras incluem mas não se limitam a, sangue, soro, plasma.., urina, líquido cerebroraquidia.no, ascite, exsudado e transudado e fracções in vi tro desses materiais. 0 teste pode ser útil para a avaliação das perturbações pré-trombóticas que se assczi.am ao desenvolvimento de trombes, e pe;~ tu r Paç Ees trombóticas tais como enfarto do miocárdio, embolia pulmonar e trombose venosa profunda, Dutras situações patológicas associadas à formação de fibrina, tais como nscplasias, perturbações inflamatórias e isunológicas, assim; como o estádio pós-operatório e outros tzmcatiiiUs, s outros estados patológicos doasses, ornaism também estar associadas a níveis elevados de fibrina de ligação C r.;0Sja ,

A Aguo 1 iodos? os. polímeros de fibrina de li; smaOa no pilasse, e coguis d aii.çaci do troei ima ms da libro, na

adi.cão ds r rsmsiris

íO tsijjú da GiaSiÍE^Sa η τ :quíg fibrinogênio e do; p ί as i5ã.

A indica. a degradação induzida per t ·: A de polimeras; de fibrina de ligaçao sruzâda no

A figura 33 è aina comparação dos níveis ds degradação plasmáfcica do dimero da fibrin-a e do monómero do fibrinogénio/fi·□ i- ina.

A figura 4 indica a imunoreactividade do plasma nua ensaio ELISA antes e depois do tratamento cora trorabina e/ou t-l-A„

A f i q a. r a niia apos indica as alterações n cora trorabina e/ou t~PA.

f i trino o eni i_« d o presente invento baseia-se na descoberta possível proporcionar ura método de ensaio eficaz pana quantidade de derivado proteolítico, específicamente dímero-D íDD>, produzido pala degradação de polímeros de do ligação cruzada a. seguir a adição de um activador do génio, por ememplo t-F'A a ama amostra do dosas, cor de que ê medir a f raqraente f i br me. p1asminomamp lo piuiam, i_n v i t rn, A degradação des polímeros de fibrina de ligação oraiada em derivados p? ro tso 1i1 icos mdao alterações moleculares que podem ser e:ρ 1 oradas cora simples técnicas ce de too: ção em relação ao fragmento DD e gsal é ama entidade loisas· Im bem definida çae pede ser isiad qe.- várias técnicas imu.noaíiioas asando ura anticorpo específico., Os polímeros de f norma.

ça a ç e s o o a c o o a n a. d a no t man ológicas e, desse modo, a r;sc t.m ι. dade aumentada de an nstme' do c; s tr- - · e-mçen ao impem; DP, npía D'stmaitn com pa’ cm amplo, do vatmial, repranania toma relação directa. com a.

ncocen t r as nal do políne de madre, de ligação rrasada

ns s+ostrs do dconte. Assim uma quan 1.1 f i o sçSo ·· concsn traçSax o dos polímeros ds fibrina de ligação cracada em circulação .na amostrs do doente é conseguida por meio de um teste en v.i.tno o quai facilita o diagnóstico de doentes oorrendo o risco d e t r ο m b cs s e .

Eíti ccndiçóee fisiológicas, e forsaçâa de fibrina s localizada quer intravascularirients na formação de tampões hemostáticos quer e:: t ra v asco I armen te nos focos in f 1 ania t óri os . Ccnh-do, circulam baixas concentrações de fibrina solúvel, e foram identificadas concentraçSes aumentadas em doentes com doença trodóioos reflectindo um efeito sistémico da actividade da trembins que pode também ser medidc pelos níveis de fibrinopeptidos plasmaticcs. A fibrina solúvel também facilita a clivagem da trombina do factor XIII numa transg1utaminase a qual pode formar ligações cruzadas covalentes intermoleculares entre os pares ds cadeia Γ de monómeros de fibrina adjacentes. Demonstrámos recentemente < F r ancis et a 1 . , Circulation 1-37 ; 75:1.170-1177) uma bair a ccn-grtração ria fosca de fibrina de ligação cruoada de cadeia 7 no clasma de indivíduos norma is; s um; aumento sino i f ica f ι .o aa;; doentes presentes- aoa enfarto amada do miocárdio,.

A estimulação farmacológica da fibrinolise no trecoooto da:· doença trombó tios resulta num grau variável de degradação do fibrinogénio em circulação até ao desejado efeito ds urombolise. Porque a ligaçao cruzada isopept i.dica da cadeia Γ na fit— ma esta bi 1 i c a aa torno esta porção da molécula resistente a lisou e.dação ο Ia. · á 1 uc a. , os produto;;; de degradação plssraliccs da íibr-Lus cte ligação crucada. ciz.fere; es tratara 1 nen ce coc do uoeioureij, Tal e.rn Po a. ça i. an ter iornen is .indicado esta diference foi oanloreda no dacaerhuusntn de vários métodos do roadiçáo ou; judoar, :.ρ_τ, degrau ação específicos em relação a ^ibroa ds ligação crussodã em ouLcculação coimo potencisis maroado-rea; da 1 iuae

□ o coágulo. G oreosoce invento utiliza anticorpos esoecífccoo relação aos produtos da degradação da citrina de legação cruzada õíc erau.o? imanoIóg.icos quantitativos.

□ ar.tizorpo DD-33Ó/22 i Hy1at t st a 1 and VJhitaksr et ctl. ? su bu a < que é dirigido ocn- um opi topo próximo do sitio da legação cruzada Γ presente nos produtos de degradação da fibrina ds ligação cruzada tal· como o fragmento DD é do preferência usado no presente processo, mas podem também ser usados outros anticorpos reactivos preferencia 1mente com dínero-D ou outros produtos ;·· degradação em · ;.u ds com fibrina. Come- os polímeros de ^fcbrc.na de? ligação cruzada e os produtos de degradsução da fibrina ds

.í; Pc-	c ruza.	da	c c n tã	7n	cVFi Lúb?	.-λ	I inação eruzad	a	ΓΓ, existe a
ibi	1 idade	de	ambos	P	ode rem	re	agir com este an	ti	corpo. Lontu—
est	e pu-ob	1 -?? rU -t?.	n P o	eu	is te,	tal	como e índicad	O	a seguir ívsr
• r i e	η c i a ) .	,··	f o r ít-, a		o d e	PO	límero de fibr	l n	a de ligação

crucada é induzida jn ÇLLsdiL. por exposição do plasma a baixas concentrações de trorobina; a reactividade dos polímeros de citrina sclórcis é avaliada m -u;-r de imuroabsorção ligcdc a enzima (ELI ranço um anticorpo irionoclonal remctivc· oom rabeia cio liga tratadas com t e c on -nor 1i da n no mesmo ensai ligação cruza formação iridts d e g r a d u ç ã o i n d caa escudos.

aLara o ds ção cruzada ΓΓ„ Além disso, as amostras cie —PA o ç> plasma, exposta a trombins, om que a o a ι.m — r D , -ao a.vs.i lados quanto a sara reac o do imunoabsorção com anticorpo contra a c da ΓΓ. As al terações ua imo.ncu^_saqtivid ida grela trombina de polímeros da feb-urr acide ocr ç-F'A apresentam importantes imo de interoretação de onodutos de deçrad

Lamenta cie arraies para caíscLe pelim

P f r.

1i v ade ade ic asma bruma idace i a d e c ca com da cio plasma

Na desorioao

dstal se e no exempla q aev tsi--5e em oonsidera.cãci que foram usadas os materiais e métodos que se sequem:

Protsinas. 0 fibrinogénio humano (grau L) foi comprado aos Helena Laboratories <Beaumont, TX) tenda uma capacidade de coagulação de 93i„ A concentração da fibrinogénio foi determinada por medição da densidade óptica a 23è nm usando um coeficiente de extinção de 15,1. A trombina humana (3200 NIH U/mq) foi comprada, a Ca 1biochem-Behring Corp. (La Jolla, CA 5, hirudina e albumina do soro bovina foram compradas a Sigma Chemical Co. (St, Louis, MO), aprotinina foi comprada a Mobay Chemical Co. (New York, NY), e o estivador do plasmincçénio dos tecidos (IAO.ãõO IU/mg) foi comprado a Burroughs Wellcome Co. (Research Triangle Parir, NC). □ f ibrinogénio IgG an ti —humano da. cabra foi obtido a partir de Ca.ppel Laboratories (Cochranville, ΡΆ) . 3 concentrado da factor XIII purificado (Fibrogammin), preparado a partir da placenta humana, foi. fornecido por Behrinqwerl:e/'Noeohst-Poussel· (SoiT:3;-vilIo, IMJ ) . 0 Factor XIII foi ensaiado por incorporação de oadaverma dansil em caseína e a actividade foi. sçreisu cei relação a plasma normal reunido definido como 1007.

Hareacão__com Rádio. 0 fibrinogénιo foi marcada on a de ,0 o m C i / m q I por ml de fibrinoqénio capacidade dm Iectrofo rs t i c a técnica do iodogénio com uma actividade específi usando , ' mg de icdoqénic e 100 uCi fibrinogénio < 20 mg/m15, U qo-ιqu 1 aca.o de S‘-.í'z, e revelou a o b r m 3 n g _{p r}- _e ] ,_Ξ, _c c , _c ç _c-, _rs marcado tinha ume ι mesma mobilidade * liqaca'.? do di-adíare na foi r a d i.o e.od ι n ado ab rodo o méteu o da lactr;

em q e 1 d ,3 p o 11. a a: r χ 1 a,,-, i d a a 7 7 a. ρo s .o, D f i. te inogén io IgO inti-^:uãauma actividade tueaiduno, de , · rerc ; ida ss ( Lu rq_hn ere. s , . J_» . , q o d o L i. v u a f ri r am

: μ ã r 3. d ΰ ·3. μ ό S Πΐ r 3 0' -ί. Ο μ C r CU Ο ! i ã t p r a Τ 1. Ξ· 'harmac ia Fins Chemioa. 1 s , Piscat-away, U .

òephack

Presaracãg de__oolíi&grss -is ti.brina» 0 fibrinogénia foi dissolvido s.té uma concentração final de lb mg/ml , adicionou-ss cálcio até uma concentração final de ,025 moI/L o factor XIII até uma concentração de 12 unida.dss/ml . fidicionou-se então trombina até uma concentração final de ,0025 unidades/al, sendo a solução incubada, a 37*(j durante intervalos de 10

a.

minutos, actividade da trombina foi inibida pela adição de birudina uma concentração final de duas unidades/ml.

até

Amostras de___Sangue. Após obtenção de consentisento informado, foi recolhido sangue de voluntários normais que se adicionou a citrato de sódio (,4’X. da concentração final) e ci plasma, foi separada dos glóbulos vermelhos após centrifugação a. 3,500 q durante 15 minutos a 4’-C„

Análise Electroforstica Derivados do fibrinoqêni

f i b r ι n a	f o r a m	identificados no	ρ 1 asma.	3C u	e 1 e c t r o f o r e s e
ag-u- ose	5DS a	5% (Connaqhari , D.G.	1 085;	B1 ood	85:5801!. 0 pias
foi prep	arado	ρ a ra elec trof o r e se	por diluição	a 1 ; 20 em -gsp
d ' 3 «5 f a t o	, 0 ί Μ ,	pH 7, contendo 1,7	/1 d &	r—· zu-‘-z tf	a q u. e c e n d o a 1 0 0
durante	5 π í i n li	t o s o u 6 õ* C d u r a n t e	uma hora.	Amostrai; de lú
foram su.	bme 1 id	as a electrOTorese	a 1õú	vol t	s num aparelho
ei estrof		de base plana	C Hharmacia	Fine Cheucfll

- ica tauay , Nd ) coes rouese até o coran i ueiu i i;dc coe ue tu:

>.r ref ec i men to até 10'^:‘5, Manteve-se a electroí.educador ter migrado it cm» restreis fcoi. tc-Scun X··, (Hclcre esbsuca fom i es , Escuso',

A ianch-3 a ocidente foi realiiada usando uma modificado método de Towbin e co 1 aborsderes (Proc, Nat 1, AcecL Sc: c

1owbin

USA 76.· 4350 , 1979), usando

Laborátariss, Richmond, CA), nitrocelulcse (tamanho ds poro um Transblot Coli íoicd transferãncia para papel ds um, Scnleioioer and mml', reene, 73) fo i roíalizada em tampão clorídrico Tris , él> , pH contendo glicina a i í , j í' a a. U- .

, ãóórí e u0'< (v/v> de metanol

6« voltr u papel de nitroee1u1ose foi incubado d a r a n t e a 3 '71' durante 24 horas em tampao fosfato ,Oom, pH 7,3, contendo cloreto de sódio , 1514 (p/v) íe asbumina de :ovino, hsts foi removido, e o papel foi incubado durante 2 horas a 20*C com balanço suave com 5ã ml de tampão fosfato ,757, pH 7,3, contendo cloreto de sódio ,1511, 3'. (ρ/v) de albumina do soro bovino e ,057 ( \·/ v ) de Tween 2ã e 2 de cabra marcado com Ci : lã 125 de IçG de fibrincgénic anti-humano I. 0 papel de nitrocelulcse foi então lavado cofli 6 volumes cada um com 40 ml de tampão fosfato ,757, 7,5, contendo cloreto de sódio ,157 e , ã5 (v/v> de Tween 27 usando agitação suave num agitador de plataforma durante lã minutos para cada lavagem. Após a secâgens, o nanei foi processado para autora-dioçrafia usando filme Kodab X-0m.?.t ÍEastnar roda¹-), Rochester, NY) con tempos de ernosirão até· 72 horas, ris pr,jd .Unos de deqr adaçãi.

q-uzada foram métodos com um ELISA (Dimer Test, ôoor oca; Doaqncsfic, Grsornnsh, CT) utilizando um anticorpo sn'cn)r'ah (DD/Tuó) reactivo com um sítio próximo da ligacao cruzada mecioaob pele fsetor XIII 1 F: y 1 att et a 1 - and 7 h 11 a b e r pf al_, , s n p r~ a )

Fcna· usadas placas c

-revestidas e os resultados foras calco; lados Lsardo uma o.;r\a padrão preparada com írazosniz DD ouro focacio cuçomincUn pelo fabricante em concentac;Ó-ss be Au np 'cl a 7,777 n g / íii 1 „ U pd. asma foi ensaiado não diluído anisa· da meu nas 7o

U mvornato so a; ri to com o.·;· detalhe so cru ;o.o:

earplo específico cor

-o.

— ^:'L0

A adição de uma baixa concentração do trc-mbirta a plasisa normal í concen tração fi.nal .‘/ml· 5 resulta a rc gresoivo sa formação de · F .. a. u r a 1 ) , polímeros de fibrina de ligação cruzada antes da coágulo, te! coino é indicado no au to r ad i cg rara

Antes da adição de trcmbina (tempo õ), faixas· correspondendo ao d ímero de fibrina e um vestígio de trimerci estão 1 ⁵1 presentes no fibrinogènio radiomarcado com . Após adiçao de trombina, mas antes da formação de coágulo, a. faixa de dímero torna-se mais proeminente e são observadas formas poliméricas maiores. A maior alteração ocorre na última amostra antes da coagulação (com um tempo cie coagulação de ,92) , quando podem ser observados seis formas poliméricas e uma certa porção de proteína não consegue entrar nos 22 de agarose a 27..

A formação de polímeros de fibrina de ligação cruzada no plasma a seguir ά adição de trombina A indicada na Figura 1 tlasma citratado normal reunido contendo fibrinoqénio radiomarJ -\C7 cado com *~-j ,a incubado com trombina. (concentração final ,225 2/ml ; e clcrstc de cálcio concen tração final 10 mM) . Cem miervslcjs, porçSes alicuotas são retiradas e preparadas para electroforese fazendo ama diluição 1/20 em diluente contendo SDC e

aquecendo a 60	-'C duran	te	u m a	hora. Amostras	de 10 u1 sã	o subme	t	1 -
cias a e 1 ectroforese e	ã	au	toradlograma e	ara parada	segui		do
secagem com um	tempo d	e e	cm	i rão de 3 o ia s-,	0 tempo t	empo/c oe.	q	Ο-
iação indica a	t e m p a n	a g	uai	a ama eti·'a A ra	tirada dm	1 d 1 d O a	(??	ι. O
tampe de ceacu	facão o	.— -	rvac	a , A a a t a c f 7 d i	ca a loca	11c aç ãa		do
rac ipinn ice. ta	a p J 1 c a ç	ãa «

7.cação ta f i barogén ia radcomarcata aaa psnfíala uma quantificação exacta da ferraç/o de polímero 7 i or ma. cortando en; i ami nas o gei fixado apciS calara, ção

eisctroforese s sm ::..rr cantárida ss Itxirss imdrr.dums rama deterRÍnar a proqorção de ca.de. faies de polífp.sro (Figura 2). Antes .; _; edição ds tronoma, 37 do produ to rareado cco radio eia! seb a. forma de dímero de ligação criizeda s 3,27 sob a forma de d í mero mais; polímeros maiores. A prooorção de po 3. ínerc de ligação cruzada áumenta progressivamente seguindo a adição de trombina, com um pico de 227 de dímero e 277 de polímera de ligação cruzada total presente justamente antes da forsiação de fibrina visível·. Ur aumento s conoentracão de dímero ocorre tempo de coaqulacão ,7 guando r< observa qualquer aumento na formação

A i- ι g u r a.

soKrta de oo 3. imerc;

adicionados a plasma ncera! reunido í η^!~ oco . Forcoes al. íquotas são reti antes da formação de coágulo durante das gara e1eotroforese, A so?... .c Coomassi.e „ f arras c orrespoodendo a r

. st ic.emente siq	n 1 f 1 c	Ct t Í	vo no
:empo de coagul	ãÇ a O	EC	e n e.
ligação cruzada	no	tem	p 0 d e
maiores que* dímero	são	íT Ο ί Ξ-
11- m a ç ã □ v i s í v s 1	ÍJ CC i’_I	V	10 n 0
'esentam 77 do	total	. N	d Ο Ξ O
: de polímero q	van d o	a	ãv-?o -no.
isma anticoa.qul	3. d 0	com	EDTA
.ção ds cloreto	de cá	1c 1	0 ,
ladamente a gua.	n 11 τ 1	.q -	d. T- d -
iqaeã‘0 cruzara	no pl	ocl bõ Ti	r speu
.empo de coagula	c dc.	Tr	on d mo
de cá 1 c 10 ί f m	a 1 1 ύ	mH	rám
contendo fibrin	a rad	1 OíT	O. rc éd O.
r a. d a s com c s· r t	os intervales
	_
' l· ~ C U. b ..ci i,. ·>.-rd. /		m-	LLjj.m a-
c? ·_ Ο I Lí cd. L. c?. Lí	L2'í	Ac	ul do
iomimaro, di. mer	c e		:rmrs

c on tad a s . U ter p<

eu mo; ores são reti. radas do q; lacto i.ndioa o tempo sis? d e ?? o o g u 1 a p ã m ί ι n a 1 , S ã. c oiço ; f ι e o t i v a; r e m e lj r p a r' o r t ,ÍP: O, V < ui):; UUU. J: 1 e o-a o ísivada da amostra d3rs.di.da p-lr fu.p 1 n d i e o d o s a u m e n t o s e · t o. 13. s 11 c a o _: n d do sos o d; 'rlrrs õ do temer s, r . õmr..

BAD 0R1G'^nAL

A Q h?Q Γ éd 5.C sol 3

pl s.sn;â fcics □ cl· imeros f i 0 r 1 □ O.

;equi d í : t r o f crsl· ;□ à;nente sdiç«o de t-PA so plssísa normal ao qual se adicionou uma preparação oe polímero de fibrina radioroarcario con? ‘'I (Fiqsra 3) , A 13pg/ml ds t-PA a ^:3í:? de fibrinogénio r.So se altera, mas a às 24 horas e migra mais, consistenfaiia de dímero é mais frac;

temente loííí a degradação sm fragmento e iõo gg/mi ds t-PA, o fibrinogénio é degradado até o fragmento X no espaço das primeiras trs mas persiste entã-o durante períodos incubaçSo mais longos, revelando pouca clivagem sem fr«amentos Y, D e Ξ mais psqoenos,, Em contraste com a resistência pl asmática dc lie ligação crucada ocorre rápidam-sn'

do	dímero d	e f	s b r i n a
35	ml s 100	35 d	c 1 de
eg r	oadada em	o m a	ho ra

ιοί pequena í iiliSrO iíe fragmentos maiores do que fibrinogénio permanecendo após incubações mais longas. As tacai de dcqradaçào do dímero de fibrina e do fibrinogén; · sáo cooperadas seguindo o rastreio em gel, e rom todas as conceniraçYos dí ίΤ· ο π o í r? ·;? r c; '·. -- ;. g u. r^- í'pj õo.j Π · Π í? r άΐ· v a1or ori p ina1.

degradação lio disso;; e cais '

33; . Aí 13 pg/ml de t.-i-A, não eiis te dmηοιρϋι horas enquanto que o cinero diocnoi ate 343 do s diferença na deoredação entre o mon3mero e o li .1 r ei' o S mai or cw cmcsnireçOes d; apenas 103 de dioero permanecendo ás so c. co o a r ac áo ccct .3tí3 de sonomers ·>

encima mais elevadas com horas e. í 00 co/mi. de t/Y r eun s ig aç

A degradação de f ibr incisén i pião mede cn doe ida po;~ t-PA ecti vedoí cc η 1 asm inog ér? i ai, 33 and , e 100 gg/m ii? con tem o uri õ? cmada radiomarcsdos com ‘I. Durante a inouoas são retiradas porçSes aliguotas nos tempos ondicaCcs e são ρ m o a r a ç a o ci o cio imo r o s d e po 1 i ma ros ci e f i o r io a n J i c a li a n a s 3 i g u. r a s 3 A e m cor c cn c r aç 3a?o ·jai o n a lii. a o cias o a normal de c i. is·-1na. cie

r^G^^V

pequenos do que -fibr inogén io; fragmentes Y e DD ficam sobrepostose não podem ser separados s Fragmento E migra oom produtos de degradação da cadeia A.

A Figura 3B indica uma comparação das taxas de degradação plasmática do dímero de fibrina e do fibrinogénio/monómero de fibrina. As alas na Figura 3A corrsspcndsndo à incubação de t-PA às três horas são exploradas, e a taxa de degradação do dímero de fibrina a do fibrinegénio/monúmero de fibrma são calculadas em comparação coet o tempo O da amostra. Como o sistema gel não distingue entre iibr.inogénio, monómero de fibrina e fragmento X, estes são medidos em conjunte, e a diminuição indicada representa clivagem de corda enrolada concêntrica am fragmentos Y, D, ou Ξ mais pequenos. De um modo semelhante, como derivados plasaáticas mais pequenos que o d.ímsro da fibrina mas maiores do qus o fibrinogénio são difíceis de medir secar s.demen ta usando a cecn2.cs do exploração em gel, o valor pa-ca o ;x:.nsro ca fitma . ap n .· todas as faixas 112.0-00 do que c f 1 or s noqèn 10, censo osssn noso tsní ir 1 a

-eun id·:

i a s J

A CCjí'lSu ϊΓ3ί..5!.· da dime oóõ anu hara de incubai

Concentração t—P; μ d / e 1

;d dom pcc? LLÍbb ta,! ãlatta ncutal t-PA íisédii de 2 acaanínConcentração dc díoero-D plasmático o c; / m 1 , 00 1 ,01 , 1

0

100

40O

100 “T ··. r“

3Õ0

500

10Θ0

270 0

Coido os polímeros cie fibrina cie ligação cruzada do olssma aiiRientaia apPs exposição à trombina, e como s. oíegoeoiaoiso ρ 1 asnat io a Au polímercre produz p-aqaacda PD, o fragaaaba 23- é avaliado quantitativaaiente a seguir à ircubspse de piasaa coo t-PA antes a depois do tratajsento com trombina a -fio cie dsterainar o efeito ce eco ímercs de Tibrirs s umee tados; sobre a οοοοιχί-IraçP: aparante cie uísero-D, ae tes s depois da degradação plasots.ca selo t~P’A. A reactividade cio d í mero-D do cisses surert? ac-ós

trombin a ( concen ti-ao)

dn i.d.adiíd/ffl 1 ) iran ta ísinutos a 25-C (Fiqura 4) , A concsntra.cão DD ausenta acentuadamente até um valor médio ta 3,563 ± 1235 ng/ml· após iõv..t.íçg:j com i-l - (233 pg/mi)„ A seguir à exposição ã trombina, a incubação coo t~PA produc um adoento ainda oaior na concentração cio d£ir.ero-D até um valor médio de 16.580 ± 11,783 ng/ml. Um aumento na concentração DD o seguir à digestão de t-PA ocorre em todas as ascstras de plasma sem sobreposição entre os que foram digeridos antes e depois do tratamento oom trombina.

A Figura 4 indica a imonoreactividade num ensaio ELISA de dimero-D antes e depois do tratamento com trombina e/ou t-PA „ A concentração do dímerc-D no plasma citratado colhido de 13 indivíduos normais é de 53,3 ± 4,5 nq/ml (média ± 3D) resguarda) ;; após incubação com t-PA (concentração final, 233 pq/m1>durante uma hora a 37 °C, a concentração é de 3.563 ± 1.233 nq/ml·. Os; mesmos plasmas são então incubados cora trombina (concentração final ,35 sAb? durante 23 minutes a 37'33. Antes da inc-csçic com t—PA, não existe qualquer alteração na reactividade do dímero—D (51,5 ± 7,5) ng/ml, nas valores pai-a todas as· amostras aunariam acen tuadamsn te a seguir a incubação- com t-PA até u.m valo* médio de ί8,583 ± 11,38/ no/ml.

As alterações após trombine. e t-PA são refles tidas no modelo de gel observado após mancha ocidental com anca soro antifibrinogénio (Figura 5), 0 plasma normal indica um fibrinoçénio ossado e uma fama de d £mera fraca; após sapcsirão /. trombina, é observado mais dímero e encontram-se presentes fainas cor rssgon-iendo a cinco gtuasOS maiores de ligação irior;.,, A Ç-aA, as- !?'.< corresponsendo a pol mia-os o oiui i. :-manda uma oomoiota écraó? s 3 ir , a fragiaentos mais pequenos do que fihuinc— inouoaçao com encom 1 ram--se a jo-o t-as·, monas estão presentes oém io.

oeq u1i iGlUAt

H i lOUra π d 1 ί

s. a tsraçi ,υί’Ί Jú JÍ! ί IO d Ci p i. -USm3.

aq-A incubsçSo com trombina e/ou t-Fft, Uma única amostra de qlãass normal é tratada tal como na Figura ú cem trcm.ba.na ( , úoi Uáni diranta 2õ minutos- a 37 viu, t—F'A ( 2úõ uq/ol dirarte 1 hora a 37^2) ou trombina seguida por t--F'A„ A sequer à e I es tre f orese em gol de aqarose a 27 E.l. a mancha Ocidental é realizada usando u.m an t leora an t if ibrinogènío >

As- e o por i e no i as anteriores demonstram vários efeitos sobre o fibrinogénio do plasma resultando da exposição a um haz. ra concen tração de trombin-s e/ou activaruo da f ibrinol ise por t-PA, Em primeiro lugar, há um aumente progressivo e significativo nos polímeros de fibrina de ligação cruzada solúveis antes da formaçao de coágulo ijg. v i t r o íter Figuras 1 e 2) resultando da acção combinada da trombina e do factos XIII» Em sequndo iuqar, os polímeros de fibrina são degradados mais rápidamente do qua o indicando que a eseecificidade da fibrinogénio (fiqura 3), librara do t-?-’A, demonstrada com fibrana a. n solúvel, retida pelos polímeros cie fibrina do liqacão cruzada solúveis. Em tarccj.ro lugar, o anticorpo monoclonal 22/233, reactivo esc; o epitopo da cadeia de ligação cruzada Γ no fragmento 32, nao reage com o mesmo sitio da cadeia de la.gação crucajc 1' nos polímeros du Tiorina tal como s indicado· cela ceara oeaotividade do íoiasma srtsc cã'_i. depois da adiçao de troratoro. eigurã 4), Isto andaço. ou que o sitio da ligação cruzada· está obstruido pelo anticorpo ou que? caractadstacss o or â i rmac aon a i s aCacacnaaa assooaadas com deqracEgso ·;·· de iroao ~ taano i a crúaca çara, a determinação da '.'•idade cie anú.caa^rc·? com 32/33.0. 3r çusrtaa lagar, os; prcr.ú.rrs S-O 'are; ca· ptasoa sao rcccc tcc i ctos e c.i/ i assi.cr, o /·· acai mera O.o ala? prasentã no pelo arúacor ηηηοίο cedd osso Ir.· ido , aÂúN i. 1_ ÚJ F '

Eõ - fibr.

Í -- ód C

ÍÀE 1 2. 'FE'/

no

Usando várias técnicas, terso encontradas no pl·asna normal baixas concentrações de fibrina solúvel, com quantidaces aumentadas na doença trombótica,, A concentração piasTbtiss; de f ί. fi r i no çeq t i d o A acção da trombína elevada nas doenças trobóticas, reflecte a na separação do fibrinepeptido A do fibrino— génio e constitui um marcador sensível da acção da trombma sistémica, mas constitui uma medição indirecta da fibrina soldrel do plasma. Uma concentração de fibrina solúvel no plasma normal de ,6 a ,7 mg/dl e um aumenta de lõ vecas apús enfarto agudo do miocárdio foram encontrados usando crematoqrafca de afinidade com o fίbrinogénio a fim de purificar o sitio pli-pro-arg contendo moléculas de fibrina exposto por clivagem de troeibina. Um aumento na fibrina solúvel em doentes com acidente vascular cerebral ou com enfarte do miocárdio foi inferido por um aumento em antigenio fibrinogénia com grande eluição precoce após cromatografia de filtração em qel, par

Os polímeros de fibrina de lipa.çào cruzada idsnt nas Figuras 1 e 2 requerem a acção adicional· do factor a 1 l g a ç S o c r u c a d a d a s v · r ί os r aç f o r as a ç·oi am o trombma e do f setor^- XI ÍI seiúsrrs de f s cr a o sias ί o :or.ceitp dessa arção coordenada d u r a n t e a a c t i v a ç ã o d a c c a o u I a ?

lf

Durante coagulação expontânea da plasma in. v i t r o, a cliveoem f ;. U-inopsp t idos; e a aotevação do facfor XI II imsUcuss fendo· incirnsmenta relacionados. fi 1 losçác ds? amboío a srcofíira. ;

• ino srrlirnr a aumento .?· formaçãc?

^: ?n. c t a a XIII à f i b r fscPon XIII. ca ta 1 is?ads· nela trcebina celsa. cío 1 Demos de fio •a?' al· osoa, Estudem anteriores p r epo^c i on ar em ura ev.i.da incbosscs liuanfo ã oroedaçáo cis; pc 1 i.ms-çs da mUrm m D.g cr.n??aU i den Ui. i i c and o dimeros de cadeia Γ em erccaccos ce pU •ntticXes a parte- os Ciscias cm Soara i rambú ti o: s, , Uss-P: tscrccs electroforéticá demonstrámos directamente uma b concentração de dioo?-s ,· fibrina Η·ο I inação c.-ucada no oi

Λ a, ã ??:

□ o -

πΰί’ΐϊΐ e uma slãvaçSã eiqui.f ioativa nus dosní.ss cuu sniará deu · 2 ·' .':··'22 u. o .

□ aclivsdor do plesnirogenio n.;s òsessios tso uma qramds afinidade para a fibrina e activa pref erenc lalmente o nlaomino-génio ligado a fibrina, propriedadss sstas que servem para localizar fibrinolise fisio1ógioae que formam a base teórica; para a -alãt.ivá selectividade de fibrina para t~F'A somo um aqente terapêutico. A fibrina solúvel também estimula a activação do pi asminogénio pelo t-F'A a esta observação foi explorada como um método potencial para a medição da fibrina solúvel. Assim demonstramos a degradação preferencial do dímero de fibrina de ligação cruzada solúvel em comparação com o monómero (Figura 3>, consisten te co;n a especif idade da fibrina para t-r'ft. Embora não seja conhecida a afinidade relativa do t-~F'A para a fibrina sólida s»m comparação com polímeros de fibrina de ligação cruzada solúveis, a administração terapêutica de t—PA, resultaria em de polímeros de fibrma de ligação cruzada de premf ibr inogén .i o. Os polímeros de fibrma. de liceçao onstituiriam o componente inicial do f i br inogén io do ser dearadado durante o desenvolvimento do estado Dítico

D 3. Γ 3 q lj. p?

degradação mo ia ao c r u c a d n ο I asma

USU âfóU , .Ο ί Ui 2. 12 de t-F'A„

A oegredação dos polímeros de fibrins de legação ux-ucada solúveis tem que ser considerada para avaliação 00222.

resuItades	de	ensai	O C -3 r' £	proctu 12'· '	de d ep r ed 022 2022; “	sspec f io:;	22 d 22
f 22 bi- Ϊ ÍU 22' .,	pa;	-1 i c v 1		no : ..	beis 2: men to da.	t 2 a c A 2.	t 2 C 22.
f 1. br mo 1 í t	i c a	-V,	3 33 túi	;; a e 222 a n	ti corpo 2X 222 0 22 X2 1	2222 2 1. d 2XV2	2 A A 2'

resctividsde co;?? este :;vPo em detíneírea ce rquqúb enrede ;u.có.ú-·· imaroresc ti vidade 'Figura 4 > . Com a sdisinistração de um sxuenta Cu. Prinol ít e co tal 000222 a estrept 2:2 quinase , ocorre 20 na acentixada

t?m ο'-ί-'μμΜ.

ά e g r a d a - a o do f i o r i o a g S n ϊ. a do ρ 1 asna , ci a; a d eg r a a a. ç 3 o o a n c ou. t a ' - t o do oolimero da ^;:aa-'- de I iqa.çaa cruzada da plasma acorre piravávs 1 mente caa uma resultante elevação mo dímero-D no plaoer, □ dibminoqénio da plasma também diminui agentes selectivos de fibrina tais cano polímeros de fibrina de ligação cruzada da plasma se degradam preferencialmente sobre fibrinogénio (Figura 3), um aumento na díimero-D do plasma seria também de esperar nestas circunstancias.

com a administração de t~PA e , visto que as

A administração de t-PA a individuo-e normais foi referida como aumentando os níveis de dímero-D do plasma até 9B0 ng/ml tal como foi medida por ura ELISA usando antibióticos diferentes das aqui utilizados (Dec1 erak, Ft et a 1. , Thromb. Kaemost 58:231, 1987). Após terapêutica trombolítica para enfarta agudo da miocárdio, uma ampla gama de concentrações de dímero-D variando entre 1

-,fU?

ng/ml e IA, ng/ml foi referida usando várias técn i<

US sugerem que uma grande parte deq r,u.0 dados aqui apresentados (Fioura 4) a s t a s e I e v a ç £ e s p a d e d e r i v a r d a

fibrina d	f.d	1 igação	cru. c ad a	UO
e 1 evades	cí	te 24.2 y 0	ng/ml e	de
11 c u f i b r	ii	n a 1 í 11 o a	para a	ttno

? η o s a p r o f υ n aí í da palinoro de as níveis mais ís após terap'ã'ua t é 1 ã Ά . 0 0 C ng/nl para a embolia pulmonar não poderiam sei- intairarsnte originadas a partir dos- polímeros de fibrina solúveis qõ nla.sma e necessitariam de produtos cie degradação de fibrina de lipipão cruzada adicionais a partir de lise do trombo.

H õã S J. iT'i =. uf. 3. Ut i Θ) ' 3.U do p 1 ccf dadiccl	eui	d .	mero-u a	Sb: dU 1 /
deuraducao de t-PA m vitro pode ser	usad	a	como í.fiTi-:	? m e d i c a
indirscie do poluera de fibrina de li o a	Ç cf O	c Γ	uracia em	oircula
'dm. 0 fragmento . com α_ i85.000 repões	t-:n t ?’.		00 de um	dímeco n

fibrina co® Μ όΒϋ,,ΘΟό. Em doentes apresentados com enfarto s~ado r tio miocurcio trrcn iramos usando uma técnica e I ec f ro ^_ί;ο ^:~o t o. c a. um concentração de dímero de fibrina no plasma de /,□-/„(/; em comparação com ,87, têm indivíduos normais. Esta observação de bad original /, õóu nq/ml de dírero-D léduiA (Figura 4) eeee

oradação da¹ i—PA r squsrsr im a 1 o r inicial plasma. ir de 1 1 IP nç/ml de dícerc de fibrina de ligaçao irisada, uma. quantidade que pede ser proporcionada per degrada· de polímero de fibrin;

dã plasma representando apenas ,4 A de fibrinogénia total do plasma Í3 o lp compatível com mediçóes anteriores ?' indivíduos; normais. De um modo semelhante, et pós exposição da trombina in. vi.tro o valor IS.cgy og/ml (Figura 41 derivaria de vlr-AA rg/nl de fibrina. de ligação cruzada do plasma, representando D, 1/1 dc fibrinogénio do plasma. Estes valores mostram olaramente cue uma dearadsção in vitro en; dímero-D eotíe s.er ivads ceímo uma ζιΑονη indiresta simples ccncan tração de zniírsrz ds fibrina i iqaçâo f o „ rrusada do plasma tal como foi aqui anteriormente descriD invento uma ser tomado em turr· èrie de activadoí' proouzi produ too d ímeros -d ,

Em en z ima. pro teo 1 í t zcs;

tripsira, etc,Tal como o .. r h e /’. ρ i v smi.ua , tal como f o i i u diz • ideracãc que se pede usar neste es do plasininogénio a fim de qeral, pode ser usado qualquer s; s t n s p t Zi zí u i n a s e , u r o q u. ι n a s; e , dc anteriormente são preferidos

Deve também ser tomado em consideração que o presente invento não se limita a anticorpos monoclanais no imunosnsaio, Assim, pode seu usado qualquer anticorpo que seja específico para dimaro-D em vaz ue o ser para o Aivincrínio ou fibrina. Tal como foi. indicado anteriormente, é contudo preferido um anticorpo morrooíonai spnoor isdo = Ao çs se zebau · m;a i \ i - zi z ' do zvvijz a o :^_esen tad az aqui e sequir e sabidi que os estojos zqv? ormazzaiz zilo zps zlzo.z; Azoi, sraoco q zoo.meiro um ensaia d..rezíz Οι/ utilize · técnica de aaninzrz, Esiez izmzizz condia uma séu.s zés eíementzr?; pad nm i z ados - z;m primeiro anticorpo i. iszz é antu lego de captura; nsu a ι-o··, qo imcia i 1 a. z ado sõb'ã uma superfície rad original

s um segundo anticorpo naresio ccs um gerador ds sinal, 0 nau-cador pode ser p...-· 1 q - r entidade dstsctavel tal seno an ílsnsrá: rediosctivo, um enzima, f 1 uoro d oro, Quinacfarn, etc, □ segundo tipo de imunoensaio ê do tipo competi s ivo „ Estes estojos ozrtjg antigénio marcado e anticorpo especifico, oad ror i z ados. Os estojos podem também conter tampSss,, substratos, agentes de separação e controlos, específicos. Os estojos podem conter dispositivos ou produtos puí micos de coles pão para tratar a aisostra do doente aqui anteriormente indicada. Neste invento o aspéciser. pode ser plas.ua s pode ser extraído por meio de técnicas convencionais. Este estojo deverá conter um estivador dc plasninogénio ou plas,Tiir,a activa a fisi de tratar o especimen (amostra > ,

BAD ORIGINAL

Claims (3)

1. ΡΞ 1 ν I NDICêõSES

   Is.- Prãcssêo para a determinação iη vitro de sNoí a de fibrina solúveis, de ligação cruzada, aresta do doente, caracterizado por conspreender o contacto da referida amostracoR um enzima, proteolítico a. fim de produzir o fragmento dimero-D dos reforidos polímero: referido dímero~D.

   de fibrina e a medida da quantidade do
2. 2ã, - Processo de acordo com a rei vindicação· 1, caracterizado por o enzima proteolítico ser activador do o 1 asminocén.ií dos tecidos cu plasmina.
3. 3d.- Processo para a determinação in_ vi t ro dos polímeros de fibrina solúveis de ligação cruzada, nuna anos tra d; doente, caracterizado por compreender o contacto da referid·; amostra com um enzima proteolítico a. fim de produzir o fraorenín dímero-D dos referidos polímeros de fibrina e a medida da guantid a d e d o r z f e r i d o d í n e r o - D , especifico o;

   e 1 a. u t .1 l· i ··?.' Processo de acordo con a re i v i nd i o soão 3. c s n. f .n ηνία por o enzima proteolítico ser activador do plasmnoqeni doa; t e c i d o s o u o 1 a s η i n a , •te.-- rraLtíS-'-.ύ no svurdo com a= ; ei v i; o ic soões D ia carac ter i iodo pcu- a plasnina ser proo.n ida po;- conversão, rd. sn iviogdn m en plasnina por neio de ur activado do plaiov 1 ti 1 c

   ORIGINAL risaoc as r G‘ 5, Ci Ο i v e C O m f i b r i n a „

   - em-m. ds ccm a rai ,a-sdã, na referido i mu.n aen a a , nm sacicor; '< dímere--D , ds preferencia sobre pai irei nn S, ida

   Sã Processo de acordo cora a reivindicação 3, caracterizado per ser usado no refaride snaneeneaia am anficoroo orne· c I e n a i .

   'b. - Processo de acordo nem a r-saainsiiascse 3, caraccsrizado por e anbacerpe monec lona! ser iDD/3EPt,

   133,.- Eqaiaamisn to í’’kit> da diagnóstico para o snsaic da Quantidade ds dímero-D numa saoscrs. de doente, qij.e cormrserdí er ve iicc; 1 e ,, ···.·,·'·: aam;p ar cimen tada a f im de receber uma séria ds recipientes c eme 1 e t a men te fechados, caracterizado por cosipreen' a ' um primeiro reciçeenia contendo uma quantidade nodids de padra.o, conítãSij poii!T:sros da ΐιοππο sol u - e s. a , cia· ; jpapá.c rnu cana , ;b ; aa ss-pebc rseiçcsnfs contende um a Quantidade nadeis. Pé am en oima proceeIi c cco, a

   C e: f Cie tsrosiro rscipisntã contando am anticorpo ssosoifcci am --elõcSo so referido dínsero-D.

   lib„- ucr.ii pamen to, de _: . aam a rei van d c a aa b o; lã, csOctarrcsdo por e sntianae ssn um anticorpo meneei anal,, ι a a , ~ n d v i p a m p n o a d e a. a a p a a a maasá? cee’ e anticcrpa saroolane. as;

   BAD ORIGINAL

   13õ,- Eoui pumeri to ce acordo coo a rei vind ics.çScí lf: crrao: tenoado por o enoioa crotso I .1 tico ser aotiurjrr do plaen rooenio doe tecidos ou clasmina.

   Lis-doa,, 22 de Junho cie 1933