JPH0441000B2 - - Google Patents

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JPH0441000B2
JPH0441000B2 JP60229763A JP22976385A JPH0441000B2 JP H0441000 B2 JPH0441000 B2 JP H0441000B2 JP 60229763 A JP60229763 A JP 60229763A JP 22976385 A JP22976385 A JP 22976385A JP H0441000 B2 JPH0441000 B2 JP H0441000B2
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vitamin
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Ii Fuyuurii Buruusu
Shii Fuyuurii Baabara
Ei Buranchaado Rita
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NYUU INGURANDO MEDEIKARU SENTAA HOSUPITARUZU Inc
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    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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Description

【発明の詳现な説明】
プロトロンビンはかなり以前から知られおいる
ように血液凝固の最終段階に関䞎するビタミン
䟝存性血挿蛋癜質である。これは玄72000の分子
量をもち、玄12の炭氎化物を含有する。プロト
ロンビンは既知のずおりカルシりムの存圚䞋で立
䜓配座が倉化するカルシりム結合性蛋癜質であ
る。プロトロンビンからトロンビンぞの蛋癜分解
を䌎う掻性化は正垞な止血における重芁な工皋で
ある。プロトロンビンは肝臓で合成される。ここ
でプロトロンビン前駆物質が翻蚳埌修食を受け
お、プロトロンビンの機胜圢になる。これは“倩
然プロトロンビン”ずしお知られ、γ−カルボキ
シグルタミン酞を含有する。ビタミン拮抗薬、
たずえばワルフアリンナトリりムデラり゚ア州
りむルミントンのデナポン瀟゚ンド・ラボラトリ
ヌズ郚門の商暙クマゞンCoumadinを有する
補品ずしおも知られおいるの存圚䞋で、たたは
ビタミンの䞍圚䞋で、血䞭のプロトロンビン掻
性は有意に䜎䞋する可胜性がある。これはプロト
ロンビン時間䞀段凝血アツセむ法により間接
的に、たたはプロトロンビン欠損基質血挿を甚い
るプロトロンビン凝血掻性の盎接枬定により枬定
するこずができる。血挿プロトロンビン掻性が䜎
い堎合、重症の肝疟患を䌎う可胜性もある。たず
えば蛋癜質合成障害肝疟患、䞍適圓なビタミ
ン䟛絊ビタミン欠乏症、たたはビタミン
の䜜甚を抑止する薬物ワルフアリンナトリり
ムはヒトその他の哺乳類における血挿プロトロ
ンビン掻性を䜎䞋させる。 クマゞンはワルフアリンの商品名である。クマ
ゞンを血栓性疟患の治療たたは予防に際し広く行
われおいるように経口抗凝血薬ずしお甚いるず、
これはビタミン䟝存性血液凝固蛋癜質、たずえ
ばプロトロンビンの掻性を䜎䞋させる。適切なク
マゞン甚量はプロトロンビン時間の監芖により確
立される。プロトロンビン時間は正垞な血挿に関
しお埗られる時間の1/2〜1/2倍に維持され
る。 1968幎に、ワルフアリンナトリりムで治療した
患者の血挿䞭に、ヒト倩然プロトロンビンに察比
しお“異垞プロトロンビン”および“ヒト異垞プ
ロトロンビン”ずしお知られるプロトロンビンの
倉圢が発芋された。異垞プロトロンビンがも぀プ
ロトロンビン掻性は䜎いが、倚数のプロトロンビ
ン抗血枅ず亀叉反応する。りシ血液から異垞プロ
トロンビンが1972幎に初めお単離された。この皮
の異垞プロトロンビンは等量の倩然プロトロンビ
ンの玄の凝血掻性をも぀こずが認められた。
そのほか分子量、酞加氎分解の炭氎化物組成およ
びアミノ酞組成は実質的に実隓誀差の範囲内で等
しか぀た。1970幎代初期にりシ異垞プロトロンビ
ンはプロトロンビンず異なりバリりム塩に結合せ
ず、カルシりムむオンに結合しないこずが芋出さ
れた。その埌、異垞プロトロンビンず倩然プロト
ロンビンずの機胜䞊の盞違はこれらの蛋癜質間の
構造䞊の盞違に関係があり、完党なプロトロンビ
ン機胜には無傷のカルシり結合郚䜍を必芁ずする
こずが瀺された。1970幎代䞭期に、それたで知ら
れおいなか぀たアミノ酞であるγ−カルボキシグ
ルタミン酞がりシプロトロンビン䞭に存圚し、こ
れが異垞りシプロトロンビンには欠劂しおいるこ
ずが芋出された。このアミノ酞はプロトロンビン
の凝血掻性を完党に発珟するために必芁であるず
思われる。異垞プロトロンビンは凝血掻性をもた
ないこずが知られおおり、金属むオンを結合せ
ず、γ−カルボキシグルタミン酞を含たない。他
の研究者らは、プロトロンビンが肝臓内でγ−カ
ルボキシグルタミン酞の代わりにグルタミン酞を
含有する前駆物質の圢で合成されるこず理論づけ
た。肝臓内でのカルボキシル化過皋でグルタミン
酞が修食されおγ−カルボキシグルタミン酞が圢
成される。この酵玠系はビタミンを必芁ずし、
ビタミン拮抗薬により抑制される。 䜓液、たずえば血挿䞭のプロトロンビンおよび
異垞プロトロンビンの氎準を枬定するための定量
的アツセむ法を開発するために、これたで倚くの
努力がなされおきた。これらの方法にはこれたで
著しい制限があ぀た。ヒト異垞プロトロンビンお
よびヒト倩然プロトロンビンは共に584個のアミ
ノ酞を含み、それらのうち574個はこれら圢態
においお等しく、残りの10個はカルボキシル基に
おいお異なるにすぎないずいう点で、アツセむ法
を考案するこずは困難であ぀た。これらの蛋癜質
は、構造䞊はほが等しいが機胜的関䞎においおは
きわめお異な぀おおり、血液凝固に関しお異なる
圹割をも぀。 血液凝固の倖因性経路におけるプロトロンビン
および他の蛋癜質を評䟡するための既存の方法に
は、䞀般的なプロトロンビン時間枬定法が含たれ
る。これは異垞プロトロンビン氎準を怜出するも
のではない。プロトロンビンの凝血掻性の盎接ア
ツセむは、被隓血挿を皮々の割合のプロトロンビ
ン欠損血挿ず混合し、次いで凝血させ、暙準曲線
ず比范するこずにより行われる。倩然型の機胜性
プロトロンビンのみが枬定される。亀叉免疫電気
泳動法は異垞プロトロンビンおよび倩然プロトロ
ンビンの双方を準定量的に枬定するが、䟛䞎皮が
他方を隠蔜するのを防ぐためには同様な濃床であ
るこずが必芁であり、埓぀お甚途が限定される。
他の因難なか぀技術を芁する詊隓法はロヌレル
Laurellのロケツト免疫電気泳動法である。こ
れは䞊蚘皮のプロトロンビンを区別できない。
プロトロンビンのラゞオむムノアツセむも行われ
たが、これたでに甚いられた抗䜓は異垞プロトロ
ンビンにも正垞プロトロンビンにも同等にたた
はほずんど同等に結合し、埓぀お総プロトロン
ビン氎準が枬定されるにすぎず、臚床蚺断甚ずし
おは䞍十分である。蛇毒を甚いる゚キス・カリナ
ヌタス毒蛇の䞀皮、Echis carinatusアツセ
む法は総プロトロンビンの枬定に甚いられる。二
段プロトロンビンアツセむ法ず組合せおこれらの
アツセむを間接的に異垞プロトロンビン氎準の掚
定に甚いるこずができる。 䞊蚘アツセむ法のいずれも、特にヒトにおいお
異垞プロトロンビンの存圚䞋でのプロトロンビ
ン、あるいは正垞プロトロンビンの存圚䞋での異
垞プロトロンビンに関する盎接的、定量的な、容
易に実斜される感床の高い特異的アツセむ法を提
䟛しない。本発明においおは蛋癜質衚面の特定領
域に察する立䜓配座特異性抗䜓を甚いる研究を行
い、その結果異垞プロトロンビンに察しお、およ
び倩然プロトロンビンに察しお特異的な免疫化孊
的詊薬が開発された。異垞プロトロンビンおよび
倩然プロトロンビンが被隓哺乳動物から埗られる
血枅怜䜓のものである方法が蚘述され、これによ
り哺乳動物血挿䞭の異垞プロトロンビンたたは倩
然プロトロンビンの氎準が枬定され、ヒトにおい
おは異垞プロトロンビンの存圚は身䜓の障害を瀺
す。奜たしい圢態においおは、ヒトの異垞プロト
ロンビンおよび正垞プロトロンビンの枬定は他方
の存圚䞋でそれぞれに察し特異的な抗䜓の䜿甚に
よ぀お行われる。身䜓の障害がビタミン欠乏症
である堎合、異垞プロトロンビンの氎準が監芖さ
れ、あらかじめ定められた氎準に維持される。奜
たしくは抗凝血薬の投䞎、たずえばワルフアリン
の投䞎が芁求される堎合、投䞎するワルフアリン
の目的氎準ないしは目的量を指瀺するものずしお
倩然プロトロンビンを監芖する。倩然プロトロン
ビンの氎準をその方法で定量的に枬定するこずも
できる。ヒトのビタミン拮抗薬たずえばワル
フアリンによる抗凝血療法期間䞭、これらの氎
準を定量的に枬定したのち12〜24Όmlの倩然
プロトロンビン氎準が、䜿甚䞭の薬物たずえば
ワルフアリンナトリりムをさらに投䞎するこず
により維持される。奜たしくは倩然プロトロンビ
ンは10〜24Όmlの䜓液内氎準に維持される。 本発明によればヒト倩然プロトロンビンおよび
カルシりムの存圚䞋デス−γ−カルボキシヒト
すなわち異垞プロトロンビンず反応性であり、
カルシりムむオンの存圚䞋でヒト倩然プロトロン
ビンずは実質的に非反応性であるモノクロ−ナル
抗䜓が提䟛される。 異垞ヒトプロトロンビンに察するポリクロヌナ
ル抗䜓ず異なり本発明のモノクロヌナル抗䜓はカ
ルシりムむオンの䞍圚䞋でヒト倩然プロトロンビ
ンず耇合䜓を圢成しうる利点をも぀。本発明のモ
ノクロヌナル抗䜓は、むンビトロ詊隓甚䜓液䞭で
暙準的な実隓宀条件䞋、たずえば宀枩、暙準的倧
気圧、およびそれらの普通の倉動においお反応性
であり、耇合䜓を圢成する点で奜たしい。 定量的および定性的枬定倀を埗るためのむムノ
アツセむを行う方法においおは、䞀般的なむムノ
アツセむ操䜜法を採甚するこずができ、これには
酵玠結合アツセむ法およびラゞオむムノアツセむ
法が含たれる。 ヒト異垞プロトロンビンの存吊は、血挿たたは
血枅詊料に぀いお前蚘の適宜なモノクロヌナル抗
䜓ずの免疫反応を行ない、そしお抗䜓−抗原耇合
䜓の存吊を垞法により定性的たたは定量的に枬定
するこずによ぀お枬定される。 人䜓内におけるヒト異垞プロトロンビンの存圚
は、肝疟患状態にある堎合、個䜓をビタミン拮
抗薬などの物質で凊理した堎合、ビタミン欠乏
の堎合、たたはカルボキシル化障害をもたらす代
謝欠陥の結果以倖は、血挿、血枅たたは他の䜓液
ml圓たり0.03Όを越えるこずはない。実際に
は液䜓ml圓たり0.03Ό以䞋の氎準もこの皮の
疟患を瀺すものず考えられるが、このように䜎い
氎準を本発明方法により探知するこずはできな
い。異垞プロトロンビンの存圚はいずれも䞊蚘の
疟患および障害を瀺唆するものず考えられる。埓
぀おむムノアツセむ法を甚いお特定の肝疟患の存
吊を刀定し、肝疟患を異垞プロトロンビンが正垞
な状態から倉動しおいる特定の他の身䜓機胜䞍党
ず区別し、たた患者に投䞎するワルフアリンナト
リりムの量を決定しお血栓症たたは出血の危険性
を最小限に抑えるこずができる。 第図は、数皮の医孊的障害を䌎う患者におけ
る倩然プロトロンビンおよび異垞プロトロンビン
の血枅濃床を瀺すグラフである。 第図は、ビタミン欠乏症を䌎う患者におい
おビタミン療法が倩然プロトロンビンおよび異
垞プロトロンビンに䞎える圱響を瀺すグラフであ
る。 第図は、肝现胞性癌を䌎う患者における異垞
プロトロンビンおよび倩然プロトロンビンの血枅
濃床を瀺すグラフである。 第図は、肝癌患者人における異垞プロトロ
ンビンおよびα−プトプロテむンの血枅濃床を
瀺すグラフである。 第図は、皮の異なる肝臓障害を䌎う各患者
における異垞プロトロンビンの血枅濃床を瀺すグ
ラフである。 第図は、肝癌患者における異垞プロトロンビ
ンおよびα−プトプロテむンの血枅濃床を瀺す
グラフである。 第図は、各皮の医孊的障害を䌎う各患者の血
枅䞭における異垞プロトロンビン氎準を瀺すグラ
フである。 プロトロンビン生合成障害の怜出および蚺断は
ヒトにおいお血挿たたは血枅の異垞プロトロンビ
ンの枬定により行うこずができる。異垞プロトロ
ンビンの特異的アツセむをヒト血挿たたは血枅に
おいお採甚し、プロトロンビン生合成の状態を刀
定する。この情報は特定の疟患の状態ずし盞関し
おいる可胜性がある。 生垞血挿正垞な個䜓から埗られる血挿および
血枅は怜出可胜な異垞プロトロンビンを含たな
い。このアツセむ法の感床および特異性は、異垞
プロトロンビンが0.03Όml以䞊ずなり埗ない
こずを瀺しおいる。正垞氎準の倩然プロトロンビ
ンは玄108Όmlである。 急性肝炎急性肝炎を䌎う患者から埗た血挿お
よび血枅は0.1〜6Όmlたたはそれ以䞊に倉動
する倧量の異垞プロトロンビンを含有する。倩然
プロトロンビンの氎準は通垞は正垞であるが、正
垞なプロトロンビンの範囲よりも高くたたは䜎く
なる可胜性がある。 硬倉アルコヌル肝硬倉を䌎う患者から埗た血
挿および血枅は高い異垞プロトロンビンを含む。
プロトロンビン氎準は通垞は準正垞である。 慢性掻動性肝炎慢性掻動性肝炎を䌎う患者か
ら埗た血挿および血枅は怜出可胜な異垞プロトロ
ンビンを含たない。 ビタミン欠乏症腞におけるビタミン吞収
䞍党、腞肝埪環障害、栄逊欠乏、たたは抗性物質
による腞内现菌の劚害に基づくビタミン欠乏症
は異垞プロトロンビンおよびこれに盞圓するプロ
トロンビン䜎䞋を䌎う。これらの患者はビタミン
に応答する。 肝臓を含む転移性癌肝臓の砎壊を含む癌を䌎
う患者においおは異垞プロトロンビン氎準が高
い。 肝现胞性癌異垞プロトロンビンが䞀様に存圚
する。氎準は䜎い氎準からきわめお高い氎準にた
で倉動する。倩然プロトロンビンの氎準は正垞で
あるが、倉化しやすい。 蚺断の補䜐には䞋蚘のものが含たれる。 (a) 異垞肝機胜研究によりプロトロンビン時間の
延長を䌎う患者は、肝疟患たたはビタミン欠
乏症を有する可胜性がある。高氎準の異垞プロ
トロンビンおよび䞭皋床に䜎い氎準のプロトロ
ンビンはビタミン欠乏症を瀺唆する。䜎い氎
準の異垞プロトロンビンおよび正垞な氎準のプ
ロトロンビンは肝疟患を瀺す。 (b) 患者は気分が悪い。血液孊的怜査および腎ス
クリヌニングテストはすべお正垞である。異垞
プロトロンビン氎準の䞊昇は朜圚性肝疟患を瀺
す。 (c) 黄疞および著しい凝血障害を䌎う出血性患者
は異垞プロトロンビンの増加を瀺すこずが認め
られる。これは肝疟患の蚺断を瀺すものであ
り、血管内凝血を瀺すものではない。 (d) ある“正垞な”個䜓が著しい出血を生じる。
プロトロンビン時間が延長しおいる。きわめお
高い異垞プロトロンビンおよび䜎いプロトロン
ビンは、ワルフアリンの過剰投䞎、すなわち䞍
自然なワルフアリン摂取を瀺唆する。 (e) 幎前に原発性黒色腫を䌎぀た患者が党身型
の症状を発珟しおいる。異垞プロトロンビンの
増加は癌の肝浞最を瀺唆する。 (f) ある患者が再発性血栓症の抑制のためワルフ
アリンで治療される。倩然プロトロンビン時間
は治療範囲にあるにもかかわらず、倩然プロト
ロンビンは36Όmlであるず枬定される。こ
の患者は血栓症の恐れがあるず蚺断される。ワ
ルフアリンの日量を高め、倩然プロトロンビ
ンを定期的に監芖する。 アツセむ法に甚いるための本発明の抗䜓のバむ
アルを含むむムノアツセむキツトを甚意するこず
ができる。たずえばヒト異垞プロトロンビンに特
異的な暙識された、たたは暙識されおいない抗䜓
のバむアルを甚意し、RIAその他のむムノアツセ
むキツトに甚いる他の材料ず共に包装するこずが
できる。この皮のキツトにおける材料の容積およ
びキツトの構成郚品の数は倧幅に倉えられる。こ
の皮のキツトはキツトの抗䜓ず抗原−抗䜓耇合䜓
を圢成する抗原の存吊および量を枬定するむムノ
アツセむ法を実斜するための指瀺し共に配垃され
る堎合が倚い。 これらの免疫化孊物質を詊薬ずしお甚いお、ヒ
ト血挿たたは血枅䞭の異垞プロトロンビンに関す
る特異的ラゞオむムノアツセむ法が開発された。
これらのラゞオむムノアツセむ法は暙準的な二重
抗䜓沈殿法および攟射性ペり玠化した抗原を䌎
う。異垞プロトロンビンに関するアツセむ法は
2nmlに及ぶ感床を瀺す。プロトロンビン
150Όの存圚䞋での異垞プロトロンビン怜出限
界は0.03Όmlである。正垞な血挿は異垞プロ
トロンビンを含たない。䜎氎準0.2〜8Όml
の異垞プロトロンビンは皮々の肝疟患に特城的で
ある肝炎、硬倉、転移性悪性癌、原発性肝现胞
性癌。察応する䜎いプロトロンビンを䌎う䜎氎
準ないしは高氎準の異垞プロトロンビン〜
100Όmlはビタミン欠乏の皋床ず関連す
る。ワルフアリンナトリりを摂取しおいる患者は
35Όmlの範囲の異垞プロトロンビン氎準、お
よび10〜30Όmlのプロトロンビン氎準をも
぀。この異垞プロトロンビンおよびプロトロンビ
ンの枬定により、ビタミン䟝存性カルボキシル
化の障害を特色ずする疟患を䌎う患者を確認し
スクリヌニングし、蚺断するこずができる。こ
れらの枬定を経口抗凝血薬療法の監芖および制埡
に甚いるこずもできる。最埌にこれらを甚いおお
プロトロンビン合成の障害ずプロトロンビン異化
加速クリアランスの障害を区別するこずができ
る。 詊隓は普通は血枅たたは血挿䞭で行われるが、
これを党血䞭で行぀お盞圓する結果を埗るこずも
できる。 ワルフアリン監芖に぀いお蚘述したが、他のビ
タミン拮抗薬および抗凝血薬を、ワルフアリン
の経口䜿甚の監芖に関する本発明方法に埓぀お監
芖した堎合も同様な結果が埗られる。数皮の医孊
的障害を䌎う各患者の血枅䞭における異垞プロト
ロンビン氎準を第図に瀺す。 異垞プロトロンビンに察するモノクロナル抗䜓の
調補 バルブ系マりスを、完党型フロむントのア
ゞナバンド䞭に25Όのヒト異垞プロトロンビン
を混和したものを皮䞋泚射しお免疫した。30日お
よび37日埌に、10Όの異垞プロトロンビンを、
食塩氎䞭に泚入した。免疫されたマりスの脟臓现
胞×107ずSp2血挿现胞系×106
ずの融合は、28ポリ゚チレングリコヌル2000を
甚いお0.5ml䞭で分間行぀た。融合した现胞を、
ヒポキサン−アミノプリテン−チミゞンを含む
最終濃床はそれぞれ、1.360.176および0.38
mgmlRPMI 164020仔りシ血枅に懞濁し、
り゚ルあたり−×105の现胞濃床で接皮した。
接皮した540のり゚ルの43に现胞の生育が芳察
された。现胞を数週間培逊埌、コロニヌを含むり
゚ルから䞊枅を吞匕し、該䞊枅に぀いお抗デス−
γ−カルボキ トロンビン抗䜓掻性をアツセむし
た。陜極のり゚ルの现胞を遞択しお制限垌釈法に
よりクロヌン化し、そしお同じ方法により再クロ
ヌン化した。 抗異垞プロトロンビン抗䜓を分泌する现胞は、
異垞プロトロンビンず倩然プロトロンビン以
䞋、原プロトロンビンを甚いる個の固盞むヌ
ラむザELISA法で同定した。プロトロンビ
ンずよりも異垞原プロトロンビンずず぀ず倧きな
反応性を瀺す孔は、限定垌釈によ぀おクロヌン化
した。JO1−ず呜名されたクロヌンは、異垞プ
ロトロンビンには結合するが原プロトロンビンず
は極僅が反応するだけの抗䜓を生成した。モノク
ロナル抗䜓は、型特異性血枅を甚いるオクタロニ
ヌの免疫拡散法によりIgG1ずしお定矩された。 クロヌンJO1−はATCCに寄蚗され、HB
8638ずいう受入番号を付けられた。 出願人の譲受人であるニナヌむングランドメデ
むカルセンタヌは、この培逊物を発行された特蚱
の存続期間の終了前に元に戻し、死ぬようにする
矩務を負い、䞔぀かかる特蚱の発行をATCCに届
けおその時点で寄蚗物が寄蚗日から少なくずも30
幎間は公衆の甚に䟛し埗るようにする矩務を負
う。䞊蚘時点たでは、寄蚗物は、37 CFR1.14節
および米囜特蚱法112節の条件の䞋に特蚱局長官
ぞ提䟛される。 JO1−抗䜓の粟補 カルシり無しの異垞プロトロンビンに特異的な
JO1−は、次のように行぀た。プロトロンビン
を、臭化シアンで掻性化したセフアロヌス
Sepharose4Bにタンパク質暹脂量がmg
mlでカツプリングさせた。本のアフむニテむカ
ラムを甚意しお、ミリモルのEDTAの存圚た
たは䞍圚でプロトロンビンをカツプリングさせ
た。 JO1−培逊物䞊枅液をアミコンAmicon
PM30膜で40倍に濃瞮し、TBSEDTAミリ
モル䞭に透析した。この物質1.5mlを
TBSEDTMmlず平衡にした埌、それぞれ
プロトロンビン−セフアロヌス カラム1.0×
2.3cmに加えた。結合した抗䜓は、同じ緩衝液
で時間培逊した埌、TBSCa++15ミリモル
で溶出した。 プロトロンビン結合掻性を、盎接結合むヌラむ
ザELISA法によ぀お枬定した。抗䜓調補物
の連続垌釈液から、暙準曲線を䜜成した。粟補し
たモノクロナル抗䜓を也燥スクロヌスを甚いお、
透析管䞭で濃瞮し、8.75SDS ポリアクリルア
ミドゲル䞊で玔床を枬定した。単離されたJO1−
抗䜓は、SDSおよびデヌビスDavisゲル電
気泳動法では単䞀バンドずしお移動した。 抗䜓−プロトロンビン盞互䜜甚に察する䟡陜む
オンの効果 盎接結合むヌラむザ法を甚いお、抗䜓−抗原錯
䜓の解離に察するCa++、Mg++およびMn++の効
果を怜蚎した。プロトロンビンを含むむムロン
ImmulonプレヌトをTBSで回掗浄した
埌、23℃でBSATBSミリモルEDTA
で30分間掗浄した。ケレツクスChelex100
〔バむオラツドBioRad〕を含むカラムを甚い
お金属を陀いおした぀た氎を甚いお䜜成した
TBSで培底的に掗浄するこずによ぀お、EDTA
ず混入しおいる金属を孔から陀去した。粟補され
た特別な抗䜓を、0.1モル グリシン、PH2.5で溶
出した。既定の条件䞋で、JO1−抗䜓の総おが
組織培逊物䞊枅液から陀去された。 結果は、Ca++濃床が増加するず、抗䜓−抗原
盞互䜜甚が枛少するようになるこずを瀺した。
0.9ミリモルCaCl2で、半最倧結合が芳枬された。
察照的に、ミリモルMnCl2で半最倧結合が芳枬
された。高濃床のMg++は、抗䜓−抗原倉䜍に限
定的な効果を有した。 抗䜓−プロトロンビン盞互䜜甚に察するカルシり
ムむオンの効果 ミリモルCaCl2の存圚たたは䞍圚における、
組織培逊物䞊枅液䞭のJO1−抗䜓ずプロトロン
ビンおよび異垞プロトロンビンずの盞互䜜甚を、
固盞サンドりむツチむヌラむザ法を甚いお評䟡し
た。JO1−抗䜓は、カルシりムむオンの存圚た
たは䞍圚においお、異垞プロトロンビンに結合し
た。。γ−カルボキシグルタミン酞を欠いた異垞
プロトロンビンは、金属結合性を損なわれおした
぀おおり、金属によ぀お誘起される構造物遷移を
行わない。察照的に、JO1−抗䜓は、EDTAの
存圚においおのみプロトロンビンに結合した。
ミリモルのCaCl2の存圚では、抗䜓のプロトロン
ビンぞの結合は芋られなか぀た。これらの結果
は、異垞プロトロンビンに特異的なこのモノクロ
ナル抗䜓がプロトロンビンの無カルシりムコンフ
オヌマヌに察しおコンフオメヌシペン特異性でも
あるこずを瀺した。 プロトロンビンに察する抗原性決定基 JO1−抗䜓ず固盞に結合した異垞プロトロン
ビンずの盞互䜜甚を抑制するプロトロンビンおよ
びプロトロンビンのポリペプチドフラグメントの
胜力を、競合むヌラむザELISA法を甚いお
評䟡した。ミリモルEDTAの存圚では、異垞
プロトロンビンフラグメント−39フラグメ
ントおよびフロトロンビンは、JO1−抗䜓に
効果的に結合した。実隓誀差の範囲内で、JO1−
抗䜓は、これらのポリペプチド䞊に珟れた抗原
性決定基に圓量的に結合するように思われた。反
察に、15ミリモルのCaCl2の存圚におけるデス−
−44プロトロンビンは、抗䜓に結合しなか
぀た。これらの結果は、プロトロンビンおよび異
垞プロトロンビン䞊でJO1−抗䜓が向けられお
いる抗原性決定基がプロトロンビンのNH2−末
満−39アミノ酞残基内に含たれ、フラグメント
−39䞊に完党に衚される。 原発性肝现胞癌を怜出するための異垞プロトロン
ビンに察する抗䜓の䜿甚 䞊述のように、ヒト異垞プロトロンビンに反応
し䞔぀原ヒトプロトロンビンずは殆んど反応しな
いポリクロナルたたはモノクロナル抗䜓は、
ヒト患者の血液たたは他の生物孊的詊料における
異垞プロトロンビンの存圚を怜出するため免疫同
定法に甚いるこずができ、たた異垞プロトロンビ
ンの怜出によ぀お、肝機胜䞍党の針断を行うこず
ができる。本出願人等は、生成孊的詊料䞭の異垞
プロトロンビンを定量するこずによ぀お、原発性
肝现胞癌の蚺断を行うこずもできるこずを芋い出
した。 原発性肝现胞癌は、α−プトタンパク質、異
垞ビタミンB12結合剀、゚リトロポ゚チンおよび
異垞フむブリノヌゲンのような迷走性および異所
性タンパク質の合成に関連しおいるこずが知られ
おいる腫瘍である。このらのタンパク質の幟぀か
は、特にα−プトタンパク質は、凊理および管
理を適切にする䞊で早期の䞔぀正確な蚺断が重芁
な病気の蚺断マヌカヌずしお䜿甚されおきた。高
レベルの異垞プロトロンビンの存圚は、次に詳现
に説明するように、或る点では䞊蚘タンパク質の
或るものよりもすぐれた原発性肝现胞癌蚺断マヌ
カヌである。 生怜によ぀お肝现胞癌であるこずが確かめられ
た40人の台湟人患者ず26人の米囜人患者に぀いお
怜蚎した。治療前に、これらの患者から血枅詊料
を採取した。生怜で型衚面抗原陜性の慢性掻動
性肝炎ず蚺断された28人の患者および17人の肝臓
を含む転移性癌患者に぀いおも怜蚎した。肝现胞
癌患者の平均幎什は、54才であ぀あ぀た。これら
の患者の64は、型肝炎衚面抗䜓に陜性であ぀
た。型肝炎感染の他の血枅マヌカヌ型肝炎
衚面抗䜓、肝炎コア抗䜓、Be型肝炎抗原および
Be型肝炎抗䜓を台湟人患者に぀いお枬定した
ずころ、50人䞭41人82が型肝炎に感染し
おいるこずが明らかにな぀た。 原プロトロンビンおよび異垞プロトロンビン
を、䞊述の競合的攟射免疫同定法でポリクロナル
抗䜓を甚いお患者の血枅で枬定した。同定間の倉
動は、10以䞋であ぀た。α−プトタンパク質
抗原および型肝炎衚面抗原を、競合的攟射免疫
同定法α−プト−RIAキツト−Feto−
RIAKit〔ダむナボツトDainabot、東京〕お
よびアりスリアキツドAUSRIA Kit〔アボツ
ト ラボラトリヌズAbbott Laboratoriesシ
カゎ〕によ぀お血枅䞭で枬定した。プロトロンビ
ン時間を暙準法によ぀おク゚ン酞塩加血挿䞭で枬
定した。デヌタをたずめお、クリンフオ
CLINFOシステムバツクスVAX
730コンピナタヌによ぀お分析した。 異垞プロトロンビンに察する倀は、正芏分垃に
埓わなか぀たので、統蚈分析に幟䜕平均の蚈算を
取り入れた。 76人の肝现胞癌患者における異垞プロトロンビ
ン抗原および原プロトロンビン抗原の分垃を、第
図に瀺す異垞プロトロンビンの倧きさは桁
に亘぀お倉動するので、察数目盛りで瀺しおい
る。これらの患者の9176人䞭69人に、異
垞プロトロンビンが怜出された。総おの患者での
平均は、900nml範囲、−67.000であ぀
た。異垞プロトロンビン抗原ず原プロトロンビン
抗原ずの間には、盞関はなか぀た。原プロトロン
ビン抗原の平均倀は、90000±28000nmlであ
り、これは正垞被隓者に぀いお枬定した倀
108000±19000nml−0.34、スチナヌデ
ントの−怜定ず有意差はなか぀た。 肝现胞癌患者は、䞊述のようにビタミン欠乏
症患者が原プロトロンビン抗原の倀が䜎いのに比
べお、正垞の原プロトロンビン抗原の倀を有し
た。プロトロンビン時間指暙も、ビタミン欠乏
患者では䜎䞋したのに、66人の患者䞭46人が正垞
であ぀た。 これらの患者での異垞プロトロンビンの䞊昇が
朜圚的ビタミン欠乏症を反映しおいるずいう可
胜性を陀くため、人の患者にビタミン20mg
を連続日間非経口的に分割投䞎し、日間異垞
プロトロンビン抗原の倀を枬定し、ビタミン欠
乏症人の患者の倀第衚ず比范した。血枅
異垞プロトロンビン抗原の倀はヘパトヌマ患者で
は有意には倉化しなか぀たが、ビタミン欠乏患
者では予期したように枛少した。
【衚】 総おの患者にビタミンを非経口投䞎し、異垞プ
ロトロンビン抗原の倀を日埌に枬定した。ヘパ
トヌマ患者には10mgず぀連続日間投䞎し、ビタ
ミン欠乏症患者には10mgを回だけ投䞎した。 倖科的に癌の切陀を受けた名の患者におい
お、異垞プロトロンビンおよびα−プトタンパ
ク質を枬定した。切陀前は、名の患者は、血枅
の異垞プロトロンビン倀は11000nmlであ぀
たが、切陀ケ月埌たでに15nmlに枛少した
第図。14月埌には、患者は臚床的および攟射
線孊的に再発の兆候はなく異垞プロトロンビン抗
原は怜出されないたたであ぀た。切陀から17月
埌、異垞プロトロンビン抗原の濃床が150n
mlに増加し、シヌテむヌCTスキダンの結果
ヘパトヌマの再発が芋られた。 α−プトタンパク質の倀は、臚床的経過ず極
僅かしか盞関しなか぀た。切陀埌、α−プトタ
ンパク質倀は230から108nmlに枛少し、14月
埌には突然1147n(ã‚š)mlに増加し、17月埌には癌
が再発したにも拘わらず408nmlぞず二床目
の枛少を瀺した。 もう䞀人の患者では、切陀埌週間で、異垞プ
ロトロンビンは6000から150nmlぞ枛少した
第図。この患者は再調査しなか぀たが、10月
埌に臚床的に再発の兆候があり䞔぀異垞プロトロ
ンビン抗原の濃床が4200nmlずな぀お再入院
した。この患者のα−プトタンパク質濃床は、
臚床的経過を反映した。 異垞プロトロンビン抗原は、生怜でα−プト
タンパク質陰性肝现胞癌ず蚺断され、組織的化孊
療法を受けた23才の女性に぀いおも枬定した第
図。この患者では、腹氎の枛少、肝の倧きさ
の枛少、食欲の向䞊および䜓重の増加などの臚床
的応答を有した。異垞プロトロンビン濃床は、治
療前の5500nmlから320nmlぞず枛少し
た。 異垞プロトロンビン抗原を、28名の型肝炎衚
面抗原陜性慢性の掻動性肝炎、原発性肝现胞癌の
発生による障害ず生怜で蚺断された患者に぀いお
枬定した第図。これらの28名の患者では、
異垞プロトロンビン抗原濃床は、無芖し埗る皋床
であ぀た平均倀、10nml。異垞プロトロ
ンビン抗原を、肝を含む転移癌を有する17名の患
者乳癌 名、結腞癌 名、スむ臓癌 
名、肺癌 名、リンパ腫 名、起点䞍明の腺
癌 名に぀いおも枬定したずころ、抗原の血
枅濃床が42nmlの平均倀で増加した。 原発性肝现胞癌患者の67が、300nml以
䞊の異垞プロトロンビン濃床を有した。これは、
慢性の掻動性肝炎の総おの患者、䞀人を陀く転移
癌患者および以前怜蚎した急性肝炎ず肝硬倉の患
者の90においお枬定した異垞プロトロンビンの
濃床を越えおいる。ブランチダヌド
Blanchard等、1981幎、ニナヌ むングラン
ド ゞダヌナル オブ メデむシンNew
England JOurnal of Medicine、第305巻、242
頁。 α−プトタンパク質抗原を、肝现胞癌患者で
枬定しお、異垞プロトロンビン抗原に察しおプロ
ツトした第図。個の抗原の間には、殆ど
盞関がなか぀た0.3。400nml以䞊のα
−プトタンパク質抗原濃床は、他の殆どの悪性
および非悪性疟患においお䞊昇するこずが報告さ
れおいるので、肝现胞癌を匷く瀺唆暗瀺するもの
であるず報告された。䞊蚘76名の患者のうち48名
63では、α−プトタンパク質抗原濃床は
400nml以䞊であり、たた28名は䜎濃床であ
り、その16名57は異垞プロトロンビン濃床
は300nml以䞊であ぀た。䞡分析結果をたず
めるず、64名84の患者で血枅抗原の䞀方た
たは䞡方の濃床が高く、原発性肝现胞癌を匷く暗
瀺した。 α−プトタンパク質および異垞プロトロンビ
ン抗原濃床は、肝炎衚面抗原の存圚たたは䞍圚に
は関係しなか぀た。衚面抗原陜性の患者では、血
枅の異垞プロトロンビンの平均倀は974n
ml範囲、−67000であり、衚面抗原陰性の
患者では、805nml範囲、−23000であ
぀た。 䞊蚘結果は、異垞プロトロンビン原発性肝现胞
癌に察する血枅腫瘍マヌカヌであるこずを瀺しお
いる。この抗原は、ヘパトヌマ患者の倧郚分に存
圚し、ビタミンの非経口投䞎によ぀おも消倱し
ない。それ故、これらの患者はビタミン欠乏症
ではない。曎に、異垞プロトロンビン抗原は、腫
瘍を切陀したり化孊療法によ぀お消倱たたは枛少
する。この蚌拠は異垞プロトロンビンがビタミン
䟝存カルボキシル化におけるヘパトヌマ誘発欠
損から生じおいるこずを支持する。 䞊蚘結果は、異垞プロトロンビンの倧䞊昇が、
原発性肝现胞癌ず肝臓癌を含む他の肝障害ずを区
別するのに圹立぀こずを瀺しおいる。これはプロ
トロンビン合成に぀いお知られおいるこずず適合
し、肝现胞がプロトロンビンを合成しおカルボキ
シル化するだけであり、異垞プロトロンビン抗原
の倧䞊昇が肝现胞の悪性倉換にだけ起こる。急性
肝炎、慢性掻動性肝炎および肝硬倉のような非悪
性肝现胞疟患に芋られる䜎濃床の異垞プロトロン
ビンは、時にはこれらの疟患ず肝现胞癌を区別す
るこずを困難にするので、血枅ml圓たり玄
300nたたは垌釈を甚いる堎合には、圓量
のいき倀をヘパトヌマを匷く暗瀺するものずしお
瀺される。しばしば肝现胞癌の前駆䜓ずしおの慢
性掻動性肝炎を特城づける非垞に䜎濃床の異垞プ
ロトロンビンは、異垞プロトロンビン抗原を芳察
しおいる慢性掻動性肝炎患者での悪性倉換を怜出
するこずができる。 α−プタンパク質抗原および異垞プロトロン
ビン抗原は、それぞれ肝现胞癌患者を玄分の
の高確率で同定するこずができる。これらの抗原
は、悪性肝现胞における異なる生化孊的経路の倉
曎を枬定する。䞀緒に甚いる堎合には、䞡詊隓は
単䞀の腫瘍マヌカヌで埗られるよりも倚くの情報
を提䟛する。ビタミン欠乏症を蚺断的考察ずし
お陀倖するこずができる堎合には、これら぀の
詊隓は、原発性肝现胞癌患者の84を同定するこ
ずができ、この疟患の補助的腫瘍マヌカヌであ
る。
【図面の簡単な説明】
第図は、数皮の医孊的障害を䌎う患者におけ
る倩然プロトロンビンおよび異垞プロトロンビン
の血枅濃床を瀺すグラフである。 第図は、ビタミン欠乏症を䌎う患者におい
おビタミン療法が倩然プロトロンビンおよび異
垞プロトロンビンに䞎える圱響を瀺すグラフであ
る。第図は、原発性肝现胞癌を䌎う76人の患者
における異垞プロトロンビンおよび倩然プロトロ
ンビンの血枅濃床を瀺すグラフである。第図
は、肝癌患者人における異垞プロトロンビン
黒マルおよびα−プトプロテむンの血枅濃
床癜䞞を瀺すグラフである。患者及びは
倖科的に腫瘍を切陀した患者である。患者は混
合化孊療法を受けおいる者であり、䞀貫しお10n
mlより䜎レベルのα−プトプロテむンを有
した。第図は、皮の異なる肝臓障害を䌎う各
患者における異垞プロトロンビンの血枅濃床を瀺
すグラフである。第図は、肝癌患者76人におけ
る異垞プロトロンビンおよびα−プトプロテむ
ンの血枅濃床を瀺すグラフである。䞡抗原の倀は
察数で瀺した。䞡抗原の倀の盞関性は小であ぀
た。第図は、各皮の医孊的障害を䌎う各患者の
血枅䞭における異垞プロトロンビン氎準を瀺すグ
ラフである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  デス−γ−カルボキシ ヒトプロトロンビン
    ず反応し䞔぀カルシりムむオンの存圚でヒト倩然
    プロトロンビンず実質的に䞍反応性であるこずを
    特城ずする、モノクロナル抗䜓。  カルシりムむオンの存圚においお、前蚘デス
    −γ−カルボキシ ヒトプロトロンビンず反応す
    る、特蚱請求の範囲第項蚘茉のモノクロナル抗
    䜓。  カルシりムむオンの䞍圚においお、ヒト倩然
    プロトロンビンず反応する、特蚱請求の範囲第
    項蚘茉のモノクロナル抗䜓。  生物孊的詊料においお、ヒト デス−γ−カ
    ルボキシ プロトロンビンの存圚を怜出する方法
    においお、前蚘詊料をデス−γ−カルボキシ ヒ
    トプロトロンビンず反応し䞔぀カルシりムむオン
    の存圚でヒト倩然プロトロンビンず実質的に䞍反
    応性であるこずを特城ずする、モノクロル抗䜓ず
    接觊させ、前蚘デス−γ−カルボキシ プロトロ
    ンビンず前蚘モノクロナル抗䜓ずの耇合䜓を、前
    蚘詊料䞭における前蚘デス−γ−カルボキシ プ
    ロトロンビンの存圚の指暙ずしお怜出するこずを
    特城ずする方法。  前蚘耇合䜓を、前蚘詊料䞭における前蚘デス
    −γ−カルボキシ プロトロンビンの定量的尺床
    ずしお枬定する、特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。  前蚘抗䜓を怜出可胜な暙識で暙識する、特蚱
    請求の範囲第項蚘茉の方法。
JP60229763A 1984-10-15 1985-10-15 モノクロ−ナル抗䜓 Granted JPS61117457A (ja)

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