JPH0246899B2 - Kotaioryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、例えば血液に含まれる薬物あるいは
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法
に関するものである。
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法
に関するものである。
(従来の技術)
血清、尿等の体液成分の微量成分は、病気の診
断や治療経過の判定などの有力な手段となつてい
る。そこで、体液成分を分析する種々の方法が開
発され、それらのなかで免疫学的な分析法が感度
及び特異性にすぐれているところから日常の検査
に多用されている。
断や治療経過の判定などの有力な手段となつてい
る。そこで、体液成分を分析する種々の方法が開
発され、それらのなかで免疫学的な分析法が感度
及び特異性にすぐれているところから日常の検査
に多用されている。
抗原と抗体との間の非常に高い親和力を利用し
たこの免疫学的分析法には、標識物質として放射
性同位元素を用いたラジオイムノアツセイ、酵素
を用いた酵素免疫測定法等がある。しかしなが
ら、このうちラジオイムノアツセイは放射性同位
元素を用いるところから、限られた施設での使
用、廃液の処理、短かい有効期間など様々な問題
を有している。そこで、酵素免疫測定法がこれら
の問題のない簡便な方法として一般に利用されて
いる。
たこの免疫学的分析法には、標識物質として放射
性同位元素を用いたラジオイムノアツセイ、酵素
を用いた酵素免疫測定法等がある。しかしなが
ら、このうちラジオイムノアツセイは放射性同位
元素を用いるところから、限られた施設での使
用、廃液の処理、短かい有効期間など様々な問題
を有している。そこで、酵素免疫測定法がこれら
の問題のない簡便な方法として一般に利用されて
いる。
本発明者らは、この酵素免疫測定法を改良して
さらに感度を高めかつ繁雑な操作の少ない分析法
を開発すべく種々検討の結果、測定対象である抗
原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する抗
体との結合物に、測定対象である抗原決定基具有
物質と、酵素とを接触させると、抗原決定基具有
物質の量に応じて酵素活性が変化することを見出
し、この内容を既に特許出願(特願昭58−38975
号(特開昭59−164960号))した。そしてその際、
該抗原決定基具有物質と同じ抗原決定基具有物質
もしくは該抗原決定基具有物質の重合物又は前記
の抗原決定基具有物質又は酵素に対する抗体の第
2抗体を前記の結合物にさらに接触させるとさら
に高感度で測定できるようになることを見出し、
この内容も特許出願(特願昭58−51494号(特開
昭59−178360号)及び同51495号(特開昭59−
178361号))した。
さらに感度を高めかつ繁雑な操作の少ない分析法
を開発すべく種々検討の結果、測定対象である抗
原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する抗
体との結合物に、測定対象である抗原決定基具有
物質と、酵素とを接触させると、抗原決定基具有
物質の量に応じて酵素活性が変化することを見出
し、この内容を既に特許出願(特願昭58−38975
号(特開昭59−164960号))した。そしてその際、
該抗原決定基具有物質と同じ抗原決定基具有物質
もしくは該抗原決定基具有物質の重合物又は前記
の抗原決定基具有物質又は酵素に対する抗体の第
2抗体を前記の結合物にさらに接触させるとさら
に高感度で測定できるようになることを見出し、
この内容も特許出願(特願昭58−51494号(特開
昭59−178360号)及び同51495号(特開昭59−
178361号))した。
(発明が解決しようとする問題点)
従来の酵素免疫測定法の場合はラジオイムノア
ツセイに比し操作が煩雑であり、感度も劣つてい
た。
ツセイに比し操作が煩雑であり、感度も劣つてい
た。
本発明者らの開発した上記の方法は操作が簡単
であり、感度もラジオイムノアツセイをむしろ上
まわるものであつたが、2種の抗体の結合物を利
用しているため、この結合物の調製に手間を要す
るという問題があつた。
であり、感度もラジオイムノアツセイをむしろ上
まわるものであつたが、2種の抗体の結合物を利
用しているため、この結合物の調製に手間を要す
るという問題があつた。
(問題点を解決するための手段)
本発明者らは、このような問題点を解決するべ
くさらに検討を進め、前記の抗体の結合物にかわ
りに測定対象の抗原決定基具有物質及び酵素の両
者に結合性を有する抗体を利用する方法を案出す
るに至り、この方法は前記の問題をことごとく解
決したものであることを見出して本発明を完成し
た。
くさらに検討を進め、前記の抗体の結合物にかわ
りに測定対象の抗原決定基具有物質及び酵素の両
者に結合性を有する抗体を利用する方法を案出す
るに至り、この方法は前記の問題をことごとく解
決したものであることを見出して本発明を完成し
た。
すなわち、本発明は、測定対象の抗原決定基具
有物質と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合
物とを、溶液中で該抗原決定基具有物質及び該酵
素の両者に結合性を有する抗体又はこの抗体と高
分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前記
酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。
有物質と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合
物とを、溶液中で該抗原決定基具有物質及び該酵
素の両者に結合性を有する抗体又はこの抗体と高
分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前記
酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合は、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合は、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質(以下、リガンドという)
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。リガンドは、後述する抗体に結合したと
きにその後測定する酵素活性に与える影響の大き
なものがよく、その点で分子量1万ダルトン以上
のものが本発明の方法に特に好適である。しかし
ながら、後述するリガンドと高分子化合物との結
合物あるいはリガンドの重合物を測定対象のリガ
ンドとともに抗体に作用させることにより低分子
のリガンドも高感度で測定できる。このような低
分子リガンドの例としては、ジゴキシン、テオフ
イリン、フエノバルビタール、フエニトイン、ペ
ニシリン、アミカシン等の薬物、プロスタグラン
ジン、テストステロン、プロゲステロン、サイロ
キシン等のホルモンなどを挙げることができる。
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。リガンドは、後述する抗体に結合したと
きにその後測定する酵素活性に与える影響の大き
なものがよく、その点で分子量1万ダルトン以上
のものが本発明の方法に特に好適である。しかし
ながら、後述するリガンドと高分子化合物との結
合物あるいはリガンドの重合物を測定対象のリガ
ンドとともに抗体に作用させることにより低分子
のリガンドも高感度で測定できる。このような低
分子リガンドの例としては、ジゴキシン、テオフ
イリン、フエノバルビタール、フエニトイン、ペ
ニシリン、アミカシン等の薬物、プロスタグラン
ジン、テストステロン、プロゲステロン、サイロ
キシン等のホルモンなどを挙げることができる。
酵素はその抗体が得られるものであればよい。
大部分の酵素は動物体に投与することによつてそ
の体内に抗体を形成するから本発明の方法に使用
できる。動物由来の酵素であつても、異種動物に
投与することによつて通常抗体を得ることが出来
るから例外ではない。酵素は、活性の測定方法が
簡単なもののほうが好都合である。酵素の例とし
ては、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ヘキ
ソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスタフアターゼ、ペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチン
キナーゼ、リボヌクレアーゼ、ペニシリナーゼな
どを挙げることができる。
大部分の酵素は動物体に投与することによつてそ
の体内に抗体を形成するから本発明の方法に使用
できる。動物由来の酵素であつても、異種動物に
投与することによつて通常抗体を得ることが出来
るから例外ではない。酵素は、活性の測定方法が
簡単なもののほうが好都合である。酵素の例とし
ては、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ヘキ
ソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスタフアターゼ、ペルオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチン
キナーゼ、リボヌクレアーゼ、ペニシリナーゼな
どを挙げることができる。
酵素を後述する抗体と反応させても活性があま
り変らないときは、酵素を予め高分子化合物と結
合させて高分子化してから用いるのがよい。高分
子化合物は、分子量が1万ダルトン以上でかつ水
溶性のものが適当である。高分子化合物の例とし
ては、可溶性デキストラン、カルボキシメチル化
デキストラン、アミノ化デキストラン、アミロー
ス等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フエリチン等の蛋白質、ポリエチレング
リコールなどを挙げることができる。これらは、
酵素と結合させた状態で所定の条件を具備してい
ればよく、例えば牛血清アルブミンのような比較
的低分子のものであつても、それを自家重合させ
るなどして高分子化したものであつてもよい。
り変らないときは、酵素を予め高分子化合物と結
合させて高分子化してから用いるのがよい。高分
子化合物は、分子量が1万ダルトン以上でかつ水
溶性のものが適当である。高分子化合物の例とし
ては、可溶性デキストラン、カルボキシメチル化
デキストラン、アミノ化デキストラン、アミロー
ス等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フエリチン等の蛋白質、ポリエチレング
リコールなどを挙げることができる。これらは、
酵素と結合させた状態で所定の条件を具備してい
ればよく、例えば牛血清アルブミンのような比較
的低分子のものであつても、それを自家重合させ
るなどして高分子化したものであつてもよい。
高分子化は、酵素以外に後述する抗体について
行なつてもよく、また、酵素及び抗体の両方とも
高分子化してもよい。
行なつてもよく、また、酵素及び抗体の両方とも
高分子化してもよい。
酵素と高分子化合物との結合方法は双方の官能
基を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カレボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサイシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は1:1に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行ない必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。
基を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カレボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサイシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は1:1に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行ない必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。
リガンド及び酵素の両者に結合性を有する抗体
(抗リガンド抗酵素抗体)は細胞融合法を利用し
て作製することができる。この場合、まずマウス
に酵素をアジユバンドとともに数回腹腔等に注射
し、脾臓細胞を取り出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させ
る。そして、この融合細胞のなかから酵素に対す
る抗体を産生するものをクローニングによつてモ
ノクローン細胞として増殖させる。次に、この細
胞をHAT感受性にするために8−アザグアニン
含有倍地で培養し、増殖した細胞を下記の細胞融
合に用いる。一方、リガンドをアジユバンドとと
もに数回マウス腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り
出す。この細胞をポリエチレングリコール等を用
いて上記の酵素に対する抗体を産生する細胞と融
合させる。そして、この融合細胞をHAT培地等
で選別し、当該抗酵素リガンド抗体を産生するも
のをクローニングによりモノクローン細胞として
増殖させ、得られたモノクローン細胞をマウス腹
腔内で増殖させることにより目的とする抗体を大
量に製造することができる。上記の方法において
酵素とリガンドを入れ替えてもよいことはいうま
でもない。
(抗リガンド抗酵素抗体)は細胞融合法を利用し
て作製することができる。この場合、まずマウス
に酵素をアジユバンドとともに数回腹腔等に注射
し、脾臓細胞を取り出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させ
る。そして、この融合細胞のなかから酵素に対す
る抗体を産生するものをクローニングによつてモ
ノクローン細胞として増殖させる。次に、この細
胞をHAT感受性にするために8−アザグアニン
含有倍地で培養し、増殖した細胞を下記の細胞融
合に用いる。一方、リガンドをアジユバンドとと
もに数回マウス腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り
出す。この細胞をポリエチレングリコール等を用
いて上記の酵素に対する抗体を産生する細胞と融
合させる。そして、この融合細胞をHAT培地等
で選別し、当該抗酵素リガンド抗体を産生するも
のをクローニングによりモノクローン細胞として
増殖させ、得られたモノクローン細胞をマウス腹
腔内で増殖させることにより目的とする抗体を大
量に製造することができる。上記の方法において
酵素とリガンドを入れ替えてもよいことはいうま
でもない。
この抗リガンド孔酵素抗体は、前述の酵素と同
様、高分子化合物に結合させて高分子化したほう
がよい場合もある。その場合は、高分子化合物に
は前述のもののなかから適宜用いればよく、結合
方法も前述と同様でよい。
様、高分子化合物に結合させて高分子化したほう
がよい場合もある。その場合は、高分子化合物に
は前述のもののなかから適宜用いればよく、結合
方法も前述と同様でよい。
抗リガンド抗酵素抗体あるいはその高分子化物
は、ゲル過、カチオン交換樹脂、アニオン交換
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフイ
ー、アフイニテイークロマトグラフイーなどを適
宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結乾
燥する。
は、ゲル過、カチオン交換樹脂、アニオン交換
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフイ
ー、アフイニテイークロマトグラフイーなどを適
宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結乾
燥する。
測定対象のリガンドと、酵素又はその高分子化
物を、溶液中で前記の抗リガンド抗酵素抗体又は
その高分子化物と接触させる。その際、溶液の温
度は20〜45℃程度、そしてPHは通常4〜9.5程度
が適当である。PHを一定に保つために、必要によ
り、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用
いてもよい。酵素又はその高分子化物及び抗リガ
ンド抗酵素抗体又はその高分子化物の適当な量
は、それらの種類、リガンドの種類、あるいは接
触時の条件などによつて異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。抗リガンド抗酵素抗体に対す
るリガンド及び酵素の接触順序は問うところでは
なく、いずれが先にあつてもあるいは同時であつ
てもよい。
物を、溶液中で前記の抗リガンド抗酵素抗体又は
その高分子化物と接触させる。その際、溶液の温
度は20〜45℃程度、そしてPHは通常4〜9.5程度
が適当である。PHを一定に保つために、必要によ
り、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用
いてもよい。酵素又はその高分子化物及び抗リガ
ンド抗酵素抗体又はその高分子化物の適当な量
は、それらの種類、リガンドの種類、あるいは接
触時の条件などによつて異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。抗リガンド抗酵素抗体に対す
るリガンド及び酵素の接触順序は問うところでは
なく、いずれが先にあつてもあるいは同時であつ
てもよい。
抗リガンド抗酵素抗体に、測定対象のリガンド
とともに、同じリガンドと高分子化合物との結合
物あるいはリガンドの重合物を作用させることに
より、特に低分子リガンドも高感度で測定するこ
とができる。高分子化合物は前述の酵素の高分子
化において述べたもののなかから適宜選択すれば
よく、結合方法も同様でよい。
とともに、同じリガンドと高分子化合物との結合
物あるいはリガンドの重合物を作用させることに
より、特に低分子リガンドも高感度で測定するこ
とができる。高分子化合物は前述の酵素の高分子
化において述べたもののなかから適宜選択すれば
よく、結合方法も同様でよい。
一方、抗リガンド抗酵素抗体とともに、測定対
象のリガンドに対して結合性を有しかつ酵素に対
して結合性を有しない抗体(抗リガンド抗体)を
測定対象のリガンドに作用させることによつてさ
らに測定感度を高めることができる。そのほか、
酵素に対して結合性を有しかつ検体のリガンドに
結合性を有しない抗体(抗酵素抗体)を抗リガン
ド抗酵素抗体とともに酵素に作用させても同様で
ある。
象のリガンドに対して結合性を有しかつ酵素に対
して結合性を有しない抗体(抗リガンド抗体)を
測定対象のリガンドに作用させることによつてさ
らに測定感度を高めることができる。そのほか、
酵素に対して結合性を有しかつ検体のリガンドに
結合性を有しない抗体(抗酵素抗体)を抗リガン
ド抗酵素抗体とともに酵素に作用させても同様で
ある。
これらの抗体はいずれも一般の抗体を取得する
公知の方法に準じて取得することができる。例え
ば兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの温
血動物に、リガンド又は酵素を体重1Kg当り0.3
〜2mg程度1〜数回背中皮下、フツトパツド、大
腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動物
の体内に抗体を形成させればよい。この抗体はペ
プシン等の蛋白分解酵素でF(ab′)2、Fab′、Fab
などに分解して用いてもよい。これらの抗体は、
前記のフラグメントであると否とを問わず、血清
からIgGを取得する公知の方法、例えば硫安沈澱
法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイニテイークロマトグラフイーなどで適宜精
製してから用いる。
公知の方法に準じて取得することができる。例え
ば兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの温
血動物に、リガンド又は酵素を体重1Kg当り0.3
〜2mg程度1〜数回背中皮下、フツトパツド、大
腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動物
の体内に抗体を形成させればよい。この抗体はペ
プシン等の蛋白分解酵素でF(ab′)2、Fab′、Fab
などに分解して用いてもよい。これらの抗体は、
前記のフラグメントであると否とを問わず、血清
からIgGを取得する公知の方法、例えば硫安沈澱
法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイニテイークロマトグラフイーなどで適宜精
製してから用いる。
一方、これらの抗体はモノクローナル抗体とし
て取得することもできる。その場合には、マウス
に前記のリガンドあるいは酵素をアジユバンドと
ともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出し
てポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生すものをクローニング
によつてモノクローン細胞として増殖させ、得ら
れたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖させ
ることによつてモノクローナル抗体を大量に製造
することができる。
て取得することもできる。その場合には、マウス
に前記のリガンドあるいは酵素をアジユバンドと
ともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出し
てポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生すものをクローニング
によつてモノクローン細胞として増殖させ、得ら
れたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖させ
ることによつてモノクローナル抗体を大量に製造
することができる。
これらの抗体を高分子化合物と結合させて使用
することによつて測定感度がさらに向上する場合
がある。高分子化合物は前述の酵素の高分子化に
おいて述べたもののなかから適宜選択すればよ
く、結合方法も同様でよい。
することによつて測定感度がさらに向上する場合
がある。高分子化合物は前述の酵素の高分子化に
おいて述べたもののなかから適宜選択すればよ
く、結合方法も同様でよい。
リガンドと高分子化合物との結合物、リガンド
の重合物、抗リガンド抗体、抗酵素抗体あるいは
これらの抗体と高分子化合物との結合物と、リガ
ンド、酵素、抗リガンド抗酵素抗体との添加順序
は問うところではなく、いずれが先であつてもあ
るいは全部を一時に加えてもよい。
の重合物、抗リガンド抗体、抗酵素抗体あるいは
これらの抗体と高分子化合物との結合物と、リガ
ンド、酵素、抗リガンド抗酵素抗体との添加順序
は問うところではなく、いずれが先であつてもあ
るいは全部を一時に加えてもよい。
これらの接触を行なわせたのちには酵素活性を
測定して検体中のリガンドの量を算出する。酵素
活性の測定方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。例えば、酵素にグルコース−6−リン酸脱水
素酵素を用いた場合には、上記の接触を行なわせ
た反応系にグルコース−6−リン酸及びNADP+
を含む基質溶液を加えて反応させ、生成する
NADPHを波長340nmの吸光度の増加から求め
ればよい。また、ヘキソキナーゼを用いた場合に
は、反応系にグルコース、ATP、NADP+及びグ
ルコース−6−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液
を加えて反応させ、やはりNADPHの生成量を
測定することによつて求めればよい。
測定して検体中のリガンドの量を算出する。酵素
活性の測定方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。例えば、酵素にグルコース−6−リン酸脱水
素酵素を用いた場合には、上記の接触を行なわせ
た反応系にグルコース−6−リン酸及びNADP+
を含む基質溶液を加えて反応させ、生成する
NADPHを波長340nmの吸光度の増加から求め
ればよい。また、ヘキソキナーゼを用いた場合に
は、反応系にグルコース、ATP、NADP+及びグ
ルコース−6−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液
を加えて反応させ、やはりNADPHの生成量を
測定することによつて求めればよい。
(作用)
本発明の方法においては、抗リガンド抗酵素抗
体に対してリガンド及び酵素を競争反応させ、リ
ガンドが結合するとその立体障害により酵素の抗
リガンド抗酵素抗体への結合が制限されることを
利用している。そして、この作用を増幅するため
に、抗リガンド抗酵素抗体あるいは酵素の高分子
化、さらにはリガンドの高分子化物あるいは抗リ
ガンド抗体、抗酵素抗体などの導入を行なつてい
る。
体に対してリガンド及び酵素を競争反応させ、リ
ガンドが結合するとその立体障害により酵素の抗
リガンド抗酵素抗体への結合が制限されることを
利用している。そして、この作用を増幅するため
に、抗リガンド抗酵素抗体あるいは酵素の高分子
化、さらにはリガンドの高分子化物あるいは抗リ
ガンド抗体、抗酵素抗体などの導入を行なつてい
る。
(実施例)
実施例 1
(i) 抗グルコース−6−リン酸脱水素酵素マウス
IgG(α−G6PDH IgG)の作製 抗原として酵母由来のG6PDH(オリエンタ
ル酵母工業(株)製)を用いた。このG6PDHの1
mg/mlの溶液をフロイントの完全アジユバント
と等容混合してエマルジヨンとし、その0.1ml
を8週令のBALB/Cマウスの腹腔に1週間
おきに3回注射した。それからさらに1週間後
に尾静脈に50μg/0.1mlのG6PDH溶液を注入
し、3日後に脾臓を摘出した。
IgG(α−G6PDH IgG)の作製 抗原として酵母由来のG6PDH(オリエンタ
ル酵母工業(株)製)を用いた。このG6PDHの1
mg/mlの溶液をフロイントの完全アジユバント
と等容混合してエマルジヨンとし、その0.1ml
を8週令のBALB/Cマウスの腹腔に1週間
おきに3回注射した。それからさらに1週間後
に尾静脈に50μg/0.1mlのG6PDH溶液を注入
し、3日後に脾臓を摘出した。
この脾臓を摩砕して脾臓細胞を分離し、ポリ
エチレングリコール1500を用いてマウスミエロ
ーマNS1と細胞融合させた。
エチレングリコール1500を用いてマウスミエロ
ーマNS1と細胞融合させた。
得られた融合細胞を96ウエルのプレートに分
注し、HAT培地で培養した。各ウエルの細胞
をG6PDHを固相に固定化したプレートを用い
たELISA法で調べて、G6PDHに反応性を有す
るマウスIgGを含むと思われる5ウエルを見出
した。この5ウエルの細胞を限界希釈法で希釈
してクローニングし、ELISA法を応用した阻
害測定法で調べて、G6PDHの異なる抗原決定
基を認識していると思われる2つの細胞株を得
た。この細胞の産生する抗体は阻害抗体であつ
た。
注し、HAT培地で培養した。各ウエルの細胞
をG6PDHを固相に固定化したプレートを用い
たELISA法で調べて、G6PDHに反応性を有す
るマウスIgGを含むと思われる5ウエルを見出
した。この5ウエルの細胞を限界希釈法で希釈
してクローニングし、ELISA法を応用した阻
害測定法で調べて、G6PDHの異なる抗原決定
基を認識していると思われる2つの細胞株を得
た。この細胞の産生する抗体は阻害抗体であつ
た。
(ii) G6PDH及びヒトIgGの両方に結合性を有す
る抗体(抗ヒトIgG抗G6PDH抗体)の作製 (i)項で得られた抗G6PDHマウスモノクロー
ン細胞を10-4M8−アザグアニン及び10%ウシ
胎児血清を含有するRPMI培地で培養した。3
日ごとに培地を交換し、生存した細胞を上記培
地を入れた96ウエルプレートを用いてクローニ
ングした。そのなかで抗G6PDH抗体を産生す
る細胞をモノクローンとして培養を続け、目的
のHAT感受性抗G6PDH抗体産生マウスモノ
クローン細胞を得た。
る抗体(抗ヒトIgG抗G6PDH抗体)の作製 (i)項で得られた抗G6PDHマウスモノクロー
ン細胞を10-4M8−アザグアニン及び10%ウシ
胎児血清を含有するRPMI培地で培養した。3
日ごとに培地を交換し、生存した細胞を上記培
地を入れた96ウエルプレートを用いてクローニ
ングした。そのなかで抗G6PDH抗体を産生す
る細胞をモノクローンとして培養を続け、目的
のHAT感受性抗G6PDH抗体産生マウスモノ
クローン細胞を得た。
次に、1mg/mlヒトIgG PBS溶液をフロイ
ントの完全アジユバンドと等容混合してエマル
ジヨンとし、その0.1mlを8週令のBLAB/C
マウスの腹腔に1週間おきに3回注射した。そ
れからさらに1週間後に尾静脈に50μg/0.1ml
のヒトIgG PBS溶液を注射し、3日後に脾臓
を摘出した。
ントの完全アジユバンドと等容混合してエマル
ジヨンとし、その0.1mlを8週令のBLAB/C
マウスの腹腔に1週間おきに3回注射した。そ
れからさらに1週間後に尾静脈に50μg/0.1ml
のヒトIgG PBS溶液を注射し、3日後に脾臓
を摘出した。
この脾臓を摩砕して脾臓細胞を分離し、ポリ
エチレングリコール1500を用いて上記のHAT
感受性抗G6PDH抗体産生マウスモノクローン
細胞と細胞融合させた。
エチレングリコール1500を用いて上記のHAT
感受性抗G6PDH抗体産生マウスモノクローン
細胞と細胞融合させた。
得られた融合細胞を96ウエルプレートに分注
してHAT培地で培養した。各ウエルの培養液
をG6PDHあるいはヒトIgGを固相に固定化し
たプレートを用いてELISA法により調べて
G6PDH及びヒトIgGの両方に反応性を有する
マウスIgGを含むと思われる10ウエルを見出し
た。この10ウエルを限界希釈法で希釈してクロ
ーニンングし、ELISA法により両者に結合性
を有する抗体を産生するクローンを取り出し
た。
してHAT培地で培養した。各ウエルの培養液
をG6PDHあるいはヒトIgGを固相に固定化し
たプレートを用いてELISA法により調べて
G6PDH及びヒトIgGの両方に反応性を有する
マウスIgGを含むと思われる10ウエルを見出し
た。この10ウエルを限界希釈法で希釈してクロ
ーニンングし、ELISA法により両者に結合性
を有する抗体を産生するクローンを取り出し
た。
この細胞株をそれぞれ10%FCS−RPMI培地
で増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを
注射したBALB/Cマウスの腹腔へ107個づつ
注入して、2週間後に腹水約10mlを採取した。
で増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを
注射したBALB/Cマウスの腹腔へ107個づつ
注入して、2週間後に腹水約10mlを採取した。
この腹水を45%飽和の硫安で塩析し、生成し
た沈澱物を分離した。この沈澱物を少量のリン
酸緩衝液PH7.0で溶解し、同緩衝液で平衡化し
たセフアクリルS−300カラムでゲル過して
IgG分画を分取した。
た沈澱物を分離した。この沈澱物を少量のリン
酸緩衝液PH7.0で溶解し、同緩衝液で平衡化し
たセフアクリルS−300カラムでゲル過して
IgG分画を分取した。
(iii) 高分子化抗ヒトIgG抗G6PDHマウスIgGの作
製 デキストランT500(フアルマシア社製、平均
分子量50万)50mgを1mlの水に溶解し、この溶
液に0.1M過ヨウ素酸ナトリウム水溶液0.2mlを
加えて4℃で1夜反応させた。これに0.15mlの
エチレングリコールを加えて5分間反応させた
後1mM酢酸ナトリウム緩衝液(PH5.0)で平
衡化したセフアデツクスG−25カラムでゲル
過し、素通り分画を集めた。この分画に前項で
作製した抗ヒトIgG抗G6PDH抗体20mgを10m
M炭酸緩衝液(PH9.5)に溶解した溶液を加え、
PHを9.5に調整してから室温で2時間反応させ
た。0.4%水素化ホウ素ナトリウム水溶液0.5ml
を加えてさらに4℃で2時間反応させ、この反
応物を20mMリン酸緩衝液PH7.0に対して透析
した。透析物をセフアクリルS−300カラムで
ゲル過して高分子部分を分画し、デキストラ
ンと抗ヒトIgG抗G6PDH抗体との結合物分画
を得た。
製 デキストランT500(フアルマシア社製、平均
分子量50万)50mgを1mlの水に溶解し、この溶
液に0.1M過ヨウ素酸ナトリウム水溶液0.2mlを
加えて4℃で1夜反応させた。これに0.15mlの
エチレングリコールを加えて5分間反応させた
後1mM酢酸ナトリウム緩衝液(PH5.0)で平
衡化したセフアデツクスG−25カラムでゲル
過し、素通り分画を集めた。この分画に前項で
作製した抗ヒトIgG抗G6PDH抗体20mgを10m
M炭酸緩衝液(PH9.5)に溶解した溶液を加え、
PHを9.5に調整してから室温で2時間反応させ
た。0.4%水素化ホウ素ナトリウム水溶液0.5ml
を加えてさらに4℃で2時間反応させ、この反
応物を20mMリン酸緩衝液PH7.0に対して透析
した。透析物をセフアクリルS−300カラムで
ゲル過して高分子部分を分画し、デキストラ
ンと抗ヒトIgG抗G6PDH抗体との結合物分画
を得た。
(iv) ヒトIgGの測定
前項で得られた抗体−デキストラン結合物
30μgに各種濃度のヒトIgG溶液を加え、37℃
で30分間加温後、グルコース−6−リン酸脱水
素酵素(G6PDH)1μgを含有する溶液50μ
を加えた。30分後に0.5mM、グルコース−6
−リン酸、0.5mM NADP及び20mM
MgCl2を含む0.1Mグリシルグリシン緩衝液
(PH8.5)1.0ml加えて30℃における波長340nm
の吸光度の増加速度を求めたところ第1図に示
す結果が得られた。
30μgに各種濃度のヒトIgG溶液を加え、37℃
で30分間加温後、グルコース−6−リン酸脱水
素酵素(G6PDH)1μgを含有する溶液50μ
を加えた。30分後に0.5mM、グルコース−6
−リン酸、0.5mM NADP及び20mM
MgCl2を含む0.1Mグリシルグリシン緩衝液
(PH8.5)1.0ml加えて30℃における波長340nm
の吸光度の増加速度を求めたところ第1図に示
す結果が得られた。
実施例 2
(i) G6PDH及びテオフイリンの両方に結合性を
有する抗体の作製 実施例1の(i)項で作製した抗G6PDHマウス
モノクローン細胞を実施例1の(ii)項の前段と同
様に処理してHAT感受性抗G6PDH抗体産生
マウスモノクローン細胞を得た。
有する抗体の作製 実施例1の(i)項で作製した抗G6PDHマウス
モノクローン細胞を実施例1の(ii)項の前段と同
様に処理してHAT感受性抗G6PDH抗体産生
マウスモノクローン細胞を得た。
次に、1mg/mlのヒトIgG PBS溶液のかわ
りに1mg/mlのヘモシアニンに結合させたテオ
フイリン溶液を用いたほかは実施例1(ii)項中段
〜後段と同様にして、G6PDH及びテオフイリ
ンの両者に結合性を有する抗体を産生するクロ
ーンを得、さらにIgG分画を分取した。
りに1mg/mlのヘモシアニンに結合させたテオ
フイリン溶液を用いたほかは実施例1(ii)項中段
〜後段と同様にして、G6PDH及びテオフイリ
ンの両者に結合性を有する抗体を産生するクロ
ーンを得、さらにIgG分画を分取した。
(iii) デキストラン−テオフイリン結合物の調製
分子量約200万のデキストラン1gを1N水酸
化ナトリウムの90%エタノール溶液50mlに懸濁
し、この溶液にクロル酢酸1gを加えて37℃で
16時間撹拌した。反応後、沈澱物を取し、エ
タノールで十分洗浄してから水に溶かし、この
水溶液をセフアデツクスG−25を充填したカラ
ムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出
してきた素通り分画であるカルボキシメチルデ
キストラと分画を集めて凍結乾燥した。
化ナトリウムの90%エタノール溶液50mlに懸濁
し、この溶液にクロル酢酸1gを加えて37℃で
16時間撹拌した。反応後、沈澱物を取し、エ
タノールで十分洗浄してから水に溶かし、この
水溶液をセフアデツクスG−25を充填したカラ
ムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出
してきた素通り分画であるカルボキシメチルデ
キストラと分画を集めて凍結乾燥した。
このカルボキシメチルデキストラン500mgを
ジオキサン中に懸濁させ、N−ヒドロキシサク
シンイミド500mg及び水溶性カルボジイミド500
mgを加えて室温で一夜撹拌した。沈澱物をグラ
スフイルターを用いて取し、ジオキサンで十
分洗浄してからエーテルで洗浄した。洗浄物を
乾燥させてカルボキシメチルデキストランのサ
クシンイミドエステルを得た。
ジオキサン中に懸濁させ、N−ヒドロキシサク
シンイミド500mg及び水溶性カルボジイミド500
mgを加えて室温で一夜撹拌した。沈澱物をグラ
スフイルターを用いて取し、ジオキサンで十
分洗浄してからエーテルで洗浄した。洗浄物を
乾燥させてカルボキシメチルデキストランのサ
クシンイミドエステルを得た。
このカルボキシメチルデキストランのサクシ
ンイミドエステル200mgを0.1Mヘキサメチレン
ジアミン溶液(PH8.0)に加え、室温で2時間
撹拌した。続いて、セフアデツクスG−25のカ
ラムを用いてゲル過を行ない、素通り分画を
凍結乾燥してアミノ化デキストランの凍結乾燥
品を得た。
ンイミドエステル200mgを0.1Mヘキサメチレン
ジアミン溶液(PH8.0)に加え、室温で2時間
撹拌した。続いて、セフアデツクスG−25のカ
ラムを用いてゲル過を行ない、素通り分画を
凍結乾燥してアミノ化デキストランの凍結乾燥
品を得た。
3カルボキシテオフイリン10mg及び先に調製
しておいたアミノ化デキストラン100mgを水に
溶かし、PH6.0に調整した。この溶液に水溶性
カルボジイミド20mgを加え、PH6.0に調節しつ
つ1時間保持して反応させた。この反応液をPH
7.0の20mMリン酸緩衝液生理食塩溶液で平衡
化しておいたセフアデツクスG−25を用いてゲ
ル過し、素通り分画を分取した。この素通り
分画を凍結乾燥して目的のテオフイリン−デキ
ストラン結合物を得た。
しておいたアミノ化デキストラン100mgを水に
溶かし、PH6.0に調整した。この溶液に水溶性
カルボジイミド20mgを加え、PH6.0に調節しつ
つ1時間保持して反応させた。この反応液をPH
7.0の20mMリン酸緩衝液生理食塩溶液で平衡
化しておいたセフアデツクスG−25を用いてゲ
ル過し、素通り分画を分取した。この素通り
分画を凍結乾燥して目的のテオフイリン−デキ
ストラン結合物を得た。
(vi) テオフイリンの測定
テオフイリン−デキストラン結合物30μg及
び前記の抗体100μgを含む溶液50μに各種濃
度のテオフイリン溶液を加え、37℃で30分間加
温後、グルコース−6−リン酸脱水素酵素
(G6PDH)1μgを含有する溶液50μを加え
た。30分後に0.5mMグルコース−6−リン酸、
0.5mM NADP及び20mM MgCl2を含む
0.1Mグリシルグリシン緩衝液(PH8.5)1.0mlを
加えて30℃における波長340nmの吸光度の増
加速度を求めたところ下表に示す結果が得られ
た。テオフイリン量 ΔA340on/min 0μg 0.080 2.0 0.075 5.0 0.064 10.0 0.045 20.0 0.030 30.0 0.020 40.0 0.018 実施例 3 (i) 抗β−ガラクトシダーゼマウスIgGの作製 抗原として大腸菌由来のβ−ガラストシダー
ゼ(ワイルドタイプ)を用いたほかは実施例1
(i)項と同様にして、β−ガラクトシターゼの異
なる抗原決定基を認識していると思われる3つ
の細胞株を得た。この細胞の産生する抗体は活
性化抗体であつた。
び前記の抗体100μgを含む溶液50μに各種濃
度のテオフイリン溶液を加え、37℃で30分間加
温後、グルコース−6−リン酸脱水素酵素
(G6PDH)1μgを含有する溶液50μを加え
た。30分後に0.5mMグルコース−6−リン酸、
0.5mM NADP及び20mM MgCl2を含む
0.1Mグリシルグリシン緩衝液(PH8.5)1.0mlを
加えて30℃における波長340nmの吸光度の増
加速度を求めたところ下表に示す結果が得られ
た。テオフイリン量 ΔA340on/min 0μg 0.080 2.0 0.075 5.0 0.064 10.0 0.045 20.0 0.030 30.0 0.020 40.0 0.018 実施例 3 (i) 抗β−ガラクトシダーゼマウスIgGの作製 抗原として大腸菌由来のβ−ガラストシダー
ゼ(ワイルドタイプ)を用いたほかは実施例1
(i)項と同様にして、β−ガラクトシターゼの異
なる抗原決定基を認識していると思われる3つ
の細胞株を得た。この細胞の産生する抗体は活
性化抗体であつた。
(ii) ヒトα−フエトプロテイン及びβ−ガラクト
シダーゼの両方に結合性を有する抗体の作製 抗6PDHマウスモノクローン細胞のかわりに
前項で得られた細胞を用い、そして1mg/mlの
ヒトIgG PBS溶液のかわりに1mg/mlのヒト
α−フエトプロテイン(AFP)溶液を用いた
ほかは実施例1(ii)項と同様に行ない、IgG分画
を得た。
シダーゼの両方に結合性を有する抗体の作製 抗6PDHマウスモノクローン細胞のかわりに
前項で得られた細胞を用い、そして1mg/mlの
ヒトIgG PBS溶液のかわりに1mg/mlのヒト
α−フエトプロテイン(AFP)溶液を用いた
ほかは実施例1(ii)項と同様に行ない、IgG分画
を得た。
(iii) AFP測定
前項で得られた抗AFP抗β−ガラクトシダ
ーゼ抗体1μg/50μに各種濃度のAFP溶液
50μ及び第(i)項の別の細胞株から得られた異
なる抗原決定基を認識する抗AFPマウスIgG1μ
g/50μを加え、37℃で20分間加温した。こ
れにβ−ガラクトシダーゼ50μを加えてさら
に37℃で20分間加温した。
ーゼ抗体1μg/50μに各種濃度のAFP溶液
50μ及び第(i)項の別の細胞株から得られた異
なる抗原決定基を認識する抗AFPマウスIgG1μ
g/50μを加え、37℃で20分間加温した。こ
れにβ−ガラクトシダーゼ50μを加えてさら
に37℃で20分間加温した。
基質液(3×10-3M 0−ニトロフエニル−
β−1−ガラクトピラノシド、0.01Mトリス、
0.1M NaCl、0.05M2−メルカプトエタノール、
PH7.0)1.0mlを加えて37℃で30分間加温して酵
素反応させ、0.5mlの0.5M炭酸溶液を加えて反
応を停止させた。この反応液の420nmにおけ
る吸光度を測定した結果を第2図に示す。図
中、黒丸は他の異なぬ抗体を加えた場合を表わ
し、白丸は加えなかつた場合を表わしている。
β−1−ガラクトピラノシド、0.01Mトリス、
0.1M NaCl、0.05M2−メルカプトエタノール、
PH7.0)1.0mlを加えて37℃で30分間加温して酵
素反応させ、0.5mlの0.5M炭酸溶液を加えて反
応を停止させた。この反応液の420nmにおけ
る吸光度を測定した結果を第2図に示す。図
中、黒丸は他の異なぬ抗体を加えた場合を表わ
し、白丸は加えなかつた場合を表わしている。
(発明の効果)
本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極
めて高感度で測定できる。また操作が簡単であ
り、安価かつ容易にリガンドを定量することが可
能である。本発明の方法に用いる抗体は容易に大
量生産できるという大きな利点を有する。
めて高感度で測定できる。また操作が簡単であ
り、安価かつ容易にリガンドを定量することが可
能である。本発明の方法に用いる抗体は容易に大
量生産できるという大きな利点を有する。
図面はいずれも本発明の実施例で得られたもの
であり、第1図はヒトIgG濃度と吸光度の関係
を、そして第2図はヒトα−フエトプロテイン濃
度と吸光度の関係を示している。
であり、第1図はヒトIgG濃度と吸光度の関係
を、そして第2図はヒトα−フエトプロテイン濃
度と吸光度の関係を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 測定対象の抗原決定基具有物質と、酵素又は
酵素と高分子化合物との結合物とを、溶液中で該
抗原決定基具有物質及び該酵素の両者に結合性を
有する抗体又はこの抗体と高分子化合物との結合
物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測定す
ることを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方
法。 2 酵素の活性を測定するときより前に測定対象
の抗原決定基具有物質と同じ抗原決定基具有物質
と高分子化合物との結合物又は該抗原決定基具有
物質の重合物を前記抗体又はこの抗体と高分子化
合物との結合物に接触せしめる特許請求の範囲第
1項記載の抗原決定基具有物質の測定方法。 3 酵素の活性を測定するときより前に測定対象
の抗原決定基具有物質をこの抗原決定基具有物質
に対して結合性を有しかつ前記酵素に対して結合
性を有しない抗体もしくはこの抗体と高分子化合
物との結合物に接触せしめるか、又は、前記酵素
をこの酵素に対して結合性を有しかつ測定対象の
抗原決定基具有物質に対して結合性を有しない抗
体もしくはこの抗体と高分子化合物との結合物に
接触せしめる特許請求の範囲第1項記載の抗原決
定基具有物質の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18446784A JPH0246899B2 (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | Kotaioryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18446784A JPH0246899B2 (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | Kotaioryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6162863A JPS6162863A (ja) | 1986-03-31 |
JPH0246899B2 true JPH0246899B2 (ja) | 1990-10-17 |
Family
ID=16153662
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18446784A Expired - Lifetime JPH0246899B2 (ja) | 1984-09-05 | 1984-09-05 | Kotaioryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0246899B2 (ja) |
-
1984
- 1984-09-05 JP JP18446784A patent/JPH0246899B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6162863A (ja) | 1986-03-31 |
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