JPH01311275A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １束よ■程朋分界 本発明は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、特
に、酵素免疫測定法に関し、詳しくは、容易に調製し得
て、且つ、安定性にすくれる水不溶性酵素標識免疫体を
用いる筒便な免疫学的測定法に関する。

従来の技術 抗原（又はハプテン）抗体反応の高い特異性と検出感度
を利用して、抗原（又はハプテン）又は抗体を同定し、
定量する方法として、従来より同相イムノアッセイ　（
免疫測定法）が知られている。

この方法は、抗原（又はハプテン）又は抗体のいずれか
を標識化してなる標識複合体を用いるものであって、特
に、標識複合体として放射能を有する物質を用いる同相
ラジオイムノアッセイがよく知られている。この方法は
、高感度であって、広く実用化されているが、反面、放
射性同位元素の取扱いに厳重な規制が適用されるところ
から、近年においては、標識剤として酵素を用いる酵素
免疫測定法が多く採用されるに至っている。

この酵素免疫測定法は、例えば、石川栄治著「酵素免疫
測定法」　（医学書院１９８７年発行）に記載されてい
るように、種々の方法が知られているが、−ａ的には、
ポリスチレンビーズ表面や試験管内壁面等、水不溶性の
固相担体の表面に、例えば抗体を固定し、これに測定す
べき被検物質としての抗原を結合させ、次いで、この抗
原に酵素標識抗体を結合させた後、未反応の酵素標識抗
体を洗浄除去し、かくして、固相担体上に残存する標識
酵素の量から測定すべき抗原の量を求める。

上記標識酵素量は、例えば、酵素に対応する基質を反応
させ、生成した反応生成物を光学的に定量することによ
って求めることができる。

この酵素免疫測定法は、高感度ではあるが、上述したよ
うに、固相担体上での抗原抗体反応、この後の酵素標識
免疫体の添加、洗浄、酵素基質の添加、反応停止、光学
的測定等、煩雑な多段の反応や操作を必要とし、測定に
長時間を要する。更に、常温では酵素標識免疫体や酵素
試剤が容易に変質劣化するので、２〜１０’Ｃでの保存
を必要とし、しかも、特に、酵素標識免疫体については
、低温保存しても、腐敗や酵素の失活、抗体活性の低下
等が生じる。

そこで、試剤の保存性を高めるために、試剤の構成品、
例えば、不溶化免疫体や酵素基質を凍結乾燥化する方法
も提案されている。しかし、酵素標識免疫体の凍結乾燥
品は、再溶解時に不溶物を生じる場合があり、濃度を被
検物質ごとに一定にすることが回能であるので、測定の
定量の再現性に乏しい。また、凍結乾燥時に酵素や免疫
体の活性が低下することも多く、従来、満足すべき性能
を備えた凍結乾燥した酵素標識免疫体は知られていない
。

日が解ン　しようとする課・ 本発明は、従来の酵素免疫測定法における上記した種々
の問題を解決するためになされたものであって、容易に
調製し得て、且つ、安定性にすぐれる水不）容性酵素標
識免疫体を用いる簡便な酵素免疫測定法を提供すること
を目的とする。

課題光鮮犬ナエ友汝久王役 本発明による免疫学的測定法は、酵素を結合し得る物質
を結合させた水不溶性担体に酵素標識した抗原若しくは
ハプテン、又は抗体を結合させてなる水不溶性酵素標識
免疫体と、被検物質としての対応する抗体、又は抗原若
しくはハプテンとを反応させる際に、上記酵素標識免疫
体を上記担体から解離させることを特徴とする。

上記酵素標識免疫体、即ち、酵素標識した抗原若しくは
ハプテン、又は抗体免疫体は、例えば、前記「酵素免疫
測定法」等に記載されている方法に従って得ることがで
きる。

水不溶性酵素標識免疫体は、予め酵素と結合し得る物質
を結合した適宜の水不溶性担体に上記酵素標識免疫体を
結合させることによって得ることができ、本発明の方法
においては、かくして得られる水不溶性酵素標識免疫体
を試剤として用いる。

後述するように、本発明の方法においては、抗原抗体反
応に際して、被検液と上記水不溶性酵素標識免疫体との
混合物に解離剤を加え、上記担体から酵素標識免疫体を
解離させて、抗原抗体反応を上記解離剤の存在下に行な
う。従って、酵素と上記酵素を結合し得る物質との結合
が余りに強固にすぎるときは、目的とする抗原抗体反応
が阻害されるので、上記酵素と結合し得る物質としては
、レクチンが好適に用いられる。レクチンとしては、そ
の酵素との結合能力を考慮して、コンカナバリンＡやレ
ンチルレクチンが特に好適に用いられる。

よく知られているように、レクチンは、糖残基と可逆的
に結合する能力を有しているので、酵素としては、糖鎖
を含むタンパク質を用いることができる。従って、化学
的又は生化学的に糖鎖を修飾した酵素や、その他の酵素
、例えば、酸性フォスファターゼ等を除外するものでは
ないが、本発明の方法においては、酵素としては、酵素
免疫測定法において汎用されているペルオキシダーゼや
アルカリフォスファターゼが好ましく用いられる。

本発明において、水不溶性酵素標識免疫体のための水不
溶性担体は、酵素免疫測定の態様に応して、適宜に選ば
れる。例えば、前記固相担体としてポリスチレンビーズ
を用いる場合は、前記水不溶性担体としては、試験管の
内面、適宜のディスクの小片、ラテックス粒子等の固相
を担体として用いることができる。また、前記固相担体
として試験管の内面を用いるときは、ラテックス粒子や
多孔質材料等を担体として用いることができる。

水不溶性担体にレクチンを結合するには、担体を構成す
る単量体組成や、その表面が有する官能基等に応じて適
宜の方法を採用すればよく、例えば、物理的に吸着させ
る方法や、化学的に結合させる方法等によることができ
る。かかる方法も、前記した特開昭６２−２３１１７１
号公報や、千畑一部著「実験と応用アフィニティー・ク
ロマトグラフィー」　（講談社１９７６年発行）等に記
載されている。

本発明の方法において、前記水不溶性酵素標識免疫体に
おけるレクチンと酵素との間の結合を解離させるには、
レクチンに対して、酵素の有する糖残基よりも強い結合
性をもつ糖を加えればよく、かかる糖としては、α−Ｄ
−マンノピラノースやα−Ｄ−グルコビラノースが好適
に用いられる。

本発明の方法を実施するに際して、酵素標識免疫体を予
め調製するときは、水不溶性酵素標識免疫体の免疫体の
担体としては、ラテックス粒子を用いることが好ましい
。即ち、酵素又は免疫体を化学的に修飾し、これらを混
合し、反応させた後、得られた酵素標識免疫体を未反応
の酵素や免疫体から分離し、精製する。この精製段階に
おいて、酵素標識免疫体を例えばレクチンを結合したラ
テックス粒子と混合し、遠心洗浄等によってラテックス
を取り出せば、酵素標識免疫体結合ラテックスを得るこ
とができる。酵素標識免疫体とレクチン結合ラテックス
との反応は、室温にて１〜３時間程度で十分である。

光肌■苅果 以上のように、本発明の方法によれば、水不溶性担体に
可逆的に酵素を結合し得る物質を結合させ、これとは別
に酵素標識免疫体を調製し、次いで、これらを反応させ
て、上記酵素標識免疫体を上記酵素を結合し得る物質を
介して上記水不溶性担体に結合し、かくして得られる水
不溶性酵素標識免疫体を試剤として用いる。即ち、例え
ば試験管内において、上記試剤に被検液を作用させて、
所定の抗原抗体反応を行なわせる際に、解離剤によって
上記酵素標識免疫体を水不溶性担体から解離させるので
、前述した従来の酵素免疫測定法に比べて、例えば、酵
素標識免疫体の添加や酵素基質の添加等の操作を要せず
、簡便に酵素免疫測定法を実施することができる。

更に、本発明において用いる試剤は、酵素標識免疫体が
担体上に固定されているために、安定であって、保存安
定性にすぐれ、凍結乾燥品も、高精度の測定を可能とす
る。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１ （ａ）　　ラテックス粒子の調製＋１１２．２．２−１
−リフルオロエチルメタクリレート１００ｇと、アクリ
ル酸４ｇ及びスチレンスルホン酸ナトリウム０．５ｇを
蒸留水１０ｇに溶解させた水溶液とを蒸留水３８０ｇに
加え、２８Ｏｒｐｍにて撹拌しながら、８０℃に昇温さ
せた。これに過硫酸アンモニウム０．５ｇを蒸留水１０
ｇに溶解した水溶液を触媒として加え、撹拌下に６時間
重合させた。

次いで、アルカリ、酸及び蒸留水の順序にて遠心洗浄に
よる精製を行なった後、蒸留水に５重量％となるように
再分散させて、カルボキシル化ラテックスを得た。この
ラテックス粒子は０．１１μｍの粒子径を有していた。

（ｂｌ　　コンカナバリンＡ結合ラテックス粒子の調製
上記（ａ）にて得たラテックス溶液５ｍｌ、ホウ酸緩衝
液（ｐＨ７，５，０，１ｍｏｌ／７り　　２ｍｌ及び茎
留水１１ｍ１を７昆合し、これに１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶
液（２■／ｍｌ）　　２ｍｌを加え、１０分後にコンカ
ナバリンＡ（生化学工業（株製）水溶液（１０ｍｇ／　
ｍｌ）５ｍｌを加え、１０℃で２４時間反応させた。

次に、それぞれの反応混合物に１０重量％アルギニン水
ｌ容液（ｐＨ７，５）　５ｍｌを加えて、反応混合物中
に残存する過剰の上記カルボジイミドを消費させ、１時
間インキュベートした。この後、トリス緩衝液（ｐＨ８
，２，０，０１ｍｏｌ／６）にて遠心洗浄を３回行なっ
た後、同じ緩衝液に再分散させ、全１５ｍ１として、コ
ンカナバリンＡ結合ラテックスを得た。

ｆｃｌ　　酵素標識抗体の調製 ペルオキシダーゼ（シグマ社製、タイプＶｌ）　４０■
を蒸留水１０ｍ１に溶解させ、これにメタ過ヨウ素酸ナ
トリウム水溶液（４０■／ｎ＋１）０．５ｍｌを加え、
室温で１０分間撹拌した。

この溶液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　
−２５に展開し、ペルオキシダーゼ溶液を分画し、水酸
化ナトリウムにてｐＨを９．５に調整した。これに予め
炭酸緩衝液（ｐｔｌ　９．５．０．０１ｍｏｌ／ｆｆ）
にて透析した抗ヒトＩｇＧ抗体（ダコ（Ｄａｋｏ）社製
、ウサギＩｇＧ、１０ｎ＋ｇ／ｍ＋）　　１０ｍｌを加
え、４°Ｃにて２４時間静置した後、水素化ホウ素ナト
リウム（５ｕ／ｍｌ）　　１ｍｌを加え、４℃で２時間
静置した。その後、トリス緩衝液（ｐＨ８，２，０，０
１ｍｏｌ／ｊｌりにて透析し、セファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）　Ｓ−２００に展開して、第１ピークを分
取して、酵素標識抗体分画を得た。上記第１ピーク中に
は、ペルオキシダーゼと未反応の抗体とが残存するため
、従来、行われている方法（対照）及び本発明による方
法（ｄｌによって、それぞれ、未反応抗体の除去を行っ
た。

対照として用いる酵素標識抗体を調製するために、コン
カナバリンＡ結合セファローズ（ファーマシア社製）を
用いた。即ち、上で得たペルオキシダーゼ標識抗ヒ）Ｉ
ｇＧ抗体溶液（未反応抗体を含む。）５ｍｌをコンカナ
バリンＡ結合セファローズ（ベツドボリューム５ｍ１）
に展開し、未反応抗体を除去した後、結合した酵素標識
抗体を１０ｍＭα−Ｄ−マンノピラノースで解離し、４
０３ｎｍの吸光度により、酵素標識抗体含有分画を集め
た。

（ｄｌ　　酵素標識抗体結合ラテックスの調製上で得た
ペルオキシダーゼ標識抗ヒ）ＩｇＧ抗体溶液（未反応抗
体を含む。）１０ｍｌと、前記コンカナバリンＡ結合ラ
テックス溶液２ｍｌを混合し、室温で２時間撹拌、反応
させた後、前記と同じトリス緩衝液を用いて遠心洗浄を
２回行なった。この後、同じ緩衝液２ｍｌに分散させて
、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体結合ラテック
スを得た。

ｔｅｌ　　抗体感作プレートの調製 ９６六マイクロプレート　（タイターチック社製、ＥＩ
Ａ用）の各ウェルに抗ヒトＩｇＧ溶液（０，５ｍｇ／ｍ
ＬｐＨ７，ｏ、０．１　ｍｏｌ／　ｌリン酸緩衝液＞３
００μ２を分注し、４℃にて１日間静置した。同し緩衝
液にて各ウェルを洗浄した後、ウシ血清アルブミン溶液
（１％、同緩衝液、アーマ−社製）３００μｌに置換し
、３７°Ｃで２時間インキュベートした。更に、４°Ｃ
で２日間静置した後、同緩衝液で洗浄し、抗ヒトＩｇ０
９作プレートを得た。

（「）　　酵素標識抗体の凍結乾燥 上記（ｅ）にて得た抗体感作プレートに前記（ｄ）で得
たラテックス溶液を各ウェルに１０μｅ、対照として前
記（Ｃ）で調製した酵素標識抗体を別のウェルに１０μ
βずつ分注し、−７０°Ｃに凍結した後、減圧乾燥した
。

（ｇ）　　ばらつきの測定 上記（ｆ）で調製したプレート（１０穴）にヒ目ｇＧ溶
液（１００ｎｇ／ｍｌ）　　１００　ｐ　ｌ、　１１衝
液（トリス緩衝液、ｐＨ７，０，０，１ｍｏｌ／　Ｅ、
１５　ｍ　Ｍ　？Ｍ度のメチル−α−Ｄ−マンノシド、
０．９％濃度の塩化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡ含有
）２００μｌを加え、室温にて２時間インキュベートし
た後、同じ緩衝液で５回洗浄し、次いで、酵素基質溶液
（リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６，０，０，１ｍｏｌ
／　ｌ、１ｍＭ？ｆｆｉ度の０−フェニレンジアミンと
０．０５％ン震度の過酸化水素含有）２００μｐを加え
、室温で１時間反応させた後、硫酸緩衝液（２Ｎ）１０
０μβを加えて、反応を停止させ、マイクロプレート・
リーダーを用いて４９５ｎｍの吸光度を測定した。

対照のプレート（１０穴）についても、同様にして、両
者のばらつきを比較した。結果を第１表に示す。本発明
によれば、ばらつきの少ない凍結乾燥試剤を得ることが
できることが明らかである。

第　　１　　表 実施例２ 実施例１（ｄ）にて調製した酵素標識抗体及び対照とし
て実施例１　（Ｃ１にて調製した酵素標識抗体をそれぞ
れ４０℃にて溶液状態にて静置し、８屑製直後の活性を
１００とする酵素の相対活性の経口変化を調べた。結果
を第２表に示す。

第　　２　　表 実施例３ ｆａｔ　　コンカナバリンＡ結合ディスクの調製ペーパ
ー・ディスク（８１層径、東洋濾紙（株製）を過ヨウ素
酸ナトリウム溶液（０，３ｍｏｌ／７りに浸漬し、室温
にて２時間反応させた。ディスクを取出し、蒸留水にて
洗浄した後、室温にて一夜乾燥させた。このディスクを
コンカナバリンＡ熔液（０，１％）に浸漬し、更に、−
夜装置した。蒸留水にて洗浄した後、水素化ホウ素ナト
リウム溶液（１％）に浸漬し、未反応のアルデヒド基を
還元した後、ディスクを取り出し、蒸留水にて洗浄した
。更に、室温にて乾燥させて、コンカナバリンＡ結合デ
ィスクを作製した。

（ｂ）　　酵素標識抗体結合ディスクの作製上で得たデ
ィスクを実施例１（Ｃ）にて調製した酵素標識抗体結合
溶液に浸漬し、室温にて２時間反応させた後、トリス緩
衝液にて洗浄した。

（Ｃ）　　抗体感作ビーズの作製 ６．５鶴径ポリスチレンビーズを抗ヒトＩｇＧ溶液（０
，５ｔｔｅ　／ｍｌ、ｐ＋Ｉ　７．０　、　０．１　ｍ
ｏｌ／　ｌリン酸緩衝液）に浸漬し、４℃の温度にて一
夜、放置した後、１％ウシ血清アルブミン溶液（同緩衝
液）に置換し、更に、二晩放置した。０．１％ウシ血清
アルブミン溶液（同緩衝液）にて十分に洗浄して、抗ヒ
ＨｇＧ感作ビーズを得た。

（ｄ＋　　測定 ヒ）ＩｇＧ標準品（ヘキスト社製）をリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０，０，１ｍｏｌ／　ｌ、０．９％濃度の塩化ナ
トリウム及び１０ｍＭ？ｍ”度のメチル−α−Ｄ−マン
ノシド含有）にて希釈し、予め試験管に入れておいた抗
体感作ビーズと酵素標識抗体結合ディスクの中へ入れた
。

室温にて２時間反応させた後、リン酸緩衝液（ｐＨ７，
０，０゜１ｍｏ１／ｌ、０．１％ＢＳＡ及び０．９％塩
化ナトリウム含有）で洗浄し、別の試験管に用意した酵
素基質溶液０．５ｍｌ中にビーズのみを移した。室温で
３０分間反応させた後、ＩＮＮ硫酸溶液２ｍ合加え、反
応を停止させた。吸光度値を第３表に示す。

第３表に示す結果から明らかなように、本発明の方法に
よれば、従来の方法に比べて何ら遜色ない測定結果を得
ることができ、他方、酵素標識抗体の添加の手間を要せ
ず、簡便に測定することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素を結合し得る物質を結合させた水不溶性担体
   に酵素標識した抗原若しくはハプテン、又は抗体を結合
   させてなる水不溶性酵素標識免疫体と、被検物質として
   の対応する抗体、又は抗原若しくはハプテンとを反応さ
   せる際に、上記酵素標識免疫体を上記担体から解離させ
   ることを特徴とする免疫学的測定法。
2. （２）酵素が糖鎖を有するタンパク質であり、酵素と結
   合し得る物質がレクチンであることを特徴とする請求項
   第２項記載の免疫学的測定法。