JP2568424B2 - 免疫学的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法に
関し、詳しくは、被検液中に含まれる抗原や抗体等のよ
うな同一の微量の被検物質について、ラテツクス凝集反
応と酵素免疫措定とを併せ行なうことができ、かくし
て、被検物質の測定の定量域を拡大し、又は定性的及び
定量的測定の両方の測定を可能とする免疫学的測定法に
関する。

従来の技術 抗原（又はハプテン）抗体反応の高い特異性と検出感
度を利用して、抗原（又はハプテン）又は抗体（以下、
免疫体ということがある。）を同定し、定量する方法と
して、従来より固相イムノアツセイ（免疫測定法）が知
られている。この方法は、抗原（又はハプテン）又は抗
体のいずれかを標識化してなる標準複合体を用いるもの
であつて、特に、標識複合体として放射能を有する物質
を用いる固相ラジオイムノアツセイがよく知られてい
る。この方法は、高感度であつて、広く実用化されてい
るが、反面、放射性同位元素の取扱いに厳重な規制が適
用されるところから、近年においては、標識剤として酵
素を用いる酵素免疫測定法が多く採用されるに至つてい
る。

この酵素免疫測定法は、例えば、石川栄治著「酵素免
疫測定法」（医学書院1987年発行）に記載されているよ
うに、種々の方法が知られているが、一般的には、ポリ
スチレンビーズ表面や試験管内壁面等、水不溶性固相担
体の表面に、例えば抗体を固定し、これに測定すべき被
検物質としての抗原を結合させ、次いで、この抗原に酵
素標識抗体を結合させた後、未反応の酵素標識抗体を洗
浄除去し、かくして、固相担体上に残存する標識酵素の
量から測定すべき抗原の量を求める。上記標識酵素量
は、例えば、酵素に対応する基質を反応させ、生成した
反応生成物を光学的に定量することによつて求めること
ができる。

この酵素免疫測定法は、高感度ではあるが、操作が煩
雑であつて、測定に長時間を要し、また、過剰の被検物
質に適用すれば、酵素標識した免疫体が被検物質によつ
て消費され、見掛け上、反応量の低下、即ち、所謂ゾー
ン現象を生じる。更に、一般に、酵素標識免疫体は、低
温で保存する必要がある等、保存上の問題もある。

他方、免疫学的測定法として、微粒子、特に、合成高
分子ラテツクス粒子を利用するラテツクス凝集反応もよ
く知られている。この方法は、ラテツクス粒子に抗原
（又はハプテン）又は抗体を固定し、これを被検液と混
合し、抗原抗体反応を生ぜしめて、ラテツクス粒子を凝
集させ、これを肉眼にて定性的に検出し、又は光学的に
定量測定するものである。

この方法は、前述した酵素免疫測定法に比較して一般
に、短時間で簡単に測定を行ない得るが、感度が悪く、
高感度に被検物質を検出したい場合には、用いることが
できない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、従来の免疫学的測定法における上記した種
々の問題を解決するためになされたものであつて、同一
の被検物質について、ラテツクス凝集反応と酵素免疫測
定とを併せ行なつて、定量域を拡大し、又は定性測定と
定量測定の両方を可能とする免疫学的測定法を提供する
ことを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明による免疫学的測定法は、水分散型高分子重合
体粒子を担体とし、この担体上に抗原若しくはハプテ
ン、又は抗体と共に、酵素が結合されてなる酵素標識免
疫体結合ラテツクスと被検液を混合して、ラテツクス凝
集反応を行なわせ、次いで、予め抗原若しくはハプテ
ン、又は抗体を結合させた固相担体上で上記酵素標識免
疫体と抗原抗体反応を行なわせることを特徴とする。

本発明の方法において、酵素標識免疫体結合ラテツク
スの調製に用いる水分散型高分子重合体粒子は、例え
ば、特開昭62−231171号公報に記載されているように、
適宜の重合性単量体の乳化（共）重合によつて得ること
ができる。その粒子径は0.01〜３μｍ程度であることが
好ましい。

前記酵素標識免疫体結合ラテツクスとしては、上記水
分散型高分子重合体粒子に酵素及び免疫体の両者を結合
してなるラテツクスや、或いは上記水分散型高分子重合
体粒子に酵素標識した免疫体を結合してなるラテツクス
が好適に用いられる。

酵素及び免疫体の両者を結合してなる前者の酵素標識
免疫体結合ラテツクスは、例えば、前記特開昭62−2311
71号公報に記載されているように、既に知られている。
また、酵素標識免疫体を結合してなる後者の酵素標識免
疫体結合ラテツクスは、予め水分散型高分子重合体粒子
に酵素の結合し得る物質を固定し、次いで、このラテツ
クスに別に調製した酵素標識免疫体を反応させ、酵素標
識免疫体を上記酵素と結合し得る物質によつてラテツク
スに結合することによつて得ることができる。ここに用
いる酵素標識免疫体は、例えば、前記「酵素免疫測定
法」等に記載されている方法に従つて調製することがで
きる。

本発明において、上記酵素と結合し得る物質として
は、レクチンが好適に用いられる。レクチンとしては、
その酵素との結合能力を考慮して、コンカナバリンＡや
レンチルレクチンが特に好適に用いられる。よく知られ
ているように、レクチンは、糖残基と可逆的に結合する
能力を有しているので、酵素としては、糖鎖を含むタン
パク質を用いることができる。従つて、化学的又は生化
学的に糖鎖を修飾した酵素や、その他の酵素、例えば、
酸性フオスフアターゼ等を除外するものではないが、本
発明の方法においては、酵素としては、酵素免疫測定法
において汎用されているペルオキシダーゼやアルカリフ
オスフアターゼが好ましく用いられる。

本発明において、前記水分散型高分子重合体粒子にレ
クチンを結合するには、重合体粒子を構成する単量体組
成や、その表面が有する官能基等に応じて適宜の方法を
採用すればよく、例えば、物理的に吸着させる方法や、
化学的に結合させる方法等によることができる。かかる
方法も、前記した特開昭62−231171号公報や、千畑一郎
著「実験と応用アフイニテイー・クロマトグラフイー」
（講談社1976年発行）等に記載されている。

このようにして、水分散型高分子重合体粒子にレクチ
ンを固定したレクチン結合ラテツクスを調製し、これに
糖の不存在下に過剰量の酵素標識免疫体を混合して、反
応させた後、遠心分離等にて洗浄することによつて、酵
素標識免疫体結合ラテツクスを得ることができる。

本発明の方法においては、かかる酵素標識免疫体結合
ラテツクスを用いることによつて、同一の被検物質につ
いて、ラテツクス凝集反応を行なわせると共に、予め免
疫体を固定させた固相担体を用いて、酵素免疫測定を併
せ行なうことができる。本発明による好ましい態様にお
いては、かかるラテツクス凝集反応と酵素免疫測定とを
単一の試験管内で併せ行なう。

即ち、先ず、例えば、試験管の内面に、例えば、抗体
を結合させ、この試験管内において、被検物質として抗
原を含む被検液と前記酵素標識抗体結合ラテツクスとを
混合し、ラテツクス凝集反応を行なわせて、これを肉眼
又は光学的手段によつて測定し、この後、所定時間、上
記のようにして酵素標識抗体結合ラテツクスに結合した
抗原と前記固相上の抗体とを反応させて、抗原抗体反応
を行なわせ、次いで、未反応の酵素標識免疫体を洗浄、
除去し、更に、上記酵素に対応した基質を用いて酵素反
応を行なわせることによつて、被検液に含まれる抗原を
定量することができる。

尚、本発明においては、用いる上記ラテツクス粒子の
粒子径等にもよるが、上記ラテツクス凝集反応の測定
後、例えば、α−Ｄ−マンノピラノースやα−Ｄ−グル
コピラノース等を用いて、酵素標識抗体結合ラテツクス
におけるレクチンと酵素との結合を解離させ、酵素標識
抗体を生成させるのが有利な場合がある。

本発明においては、必要に応じて、予め抗体を結合し
ていない試験管内で被検液と酵素標識免疫体結合ラテツ
クスとを反応させ、ラテツクス凝集反応を測定した後、
この混合物を酵素標識抗体をを結合した別の試験管に移
し、ここで、前記したようにして、酵素免疫測定を行な
つてもよい。

ラテツクス凝集反応の検出や測定、酵素反応による被
検物質の定量については、前記「酵素免疫測定法」に詳
細に記載されている。

発明の効果 以上のように、本発明の方法によれば、水分散型高分
子重合体粒子からなる担体上に免疫体と酵素とが結合さ
れてなる酵素標識免疫体結合粒子を用いることによつ
て、被検液中に含まれる同一の被検物質について、ラテ
ツクス凝集反応と酵素免疫測定を併せて行なうことがで
き、かくして、被検物質の広い濃度域での定性的及び定
量的測定を行なうことができる。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は
これら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１ （ａ） ラテツクス粒子の調製（１） 2,2,2−トリフルオロエチルメタクリレート100gと、
アクリル酸4g及びスチレンスルホン酸ナトリウム0.5gを
蒸留水10gに溶解させた水溶液とを蒸留水380gに加え、2
80rpmにて攪拌しながら、80℃に昇温させた。これに過
硫酸アンモニウム0.5gを蒸留水10gに溶解した水溶液を
触媒として加え、攪拌下に６時間重合させた。

次いで、アルカリ、酸及び蒸留水の順序にて遠心洗浄
による精製を行なつた後、蒸留水に５重量％となるよう
に再分散させて、カルボキシ化ラテツクスを得た。この
ラテツクス粒子は0.11μｍの粒子径を有していた。

（ｂ） ラテツクス粒子の調製（２） スチレン100gと、アクリル酸4g及びスチレンスルホン
酸ナトリウム0.05gを蒸留水10gに溶解させた水溶液とを
蒸留水380gに加え、280rpmにて攪拌しながら、80℃に昇
温させた。これに過硫酸アンモニウム0.5gを蒸留水10g
に溶解した水溶液を触媒として加え、攪拌下に12時間重
合させた。

次いで、アルカリ、酸及び蒸留水の順序にて遠心洗浄
による精製を行なつた後、蒸留水に５重量％となるよう
に再分散させて、カルボキシル化ラテツクスを得た。こ
のラテツクス粒子は0.32μｍの粒子径を有していた。

（ｃ） コンカナバリンＡ結合ラテツクス粒子の調製 上記（ａ）及び（ｂ）にて得たそれぞれのラテツクス
溶液5ml、ホウ酸緩衝液（pH7.5、0.1mol/）2ml及び蒸
留水11mlを混合し、これに１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（2m
g/ml）2mlを加え、10分後にコンカナバリンＡ（生化学
工業（株）製）水溶液（10mg/ml）5mlを加え、10℃で24
時間反応させた。

次に、それぞれの反応混合物に10重量％アルギニン水
溶液（pH7.5）5mlを加えて、反応混合物中に残存する過
剰の上記カルボジイミドを消費させ、１時間インキユベ
ートした。この後、トリス緩衝液（pH8.2、0.01mol/
）にて遠心洗浄を３回行なつた後、同じ緩衝液に再分
散させ、全量5mlとして、それぞれ前記ラテツクスに対
応して、コンカナバリンＡ結合ラテツクスを得た。

（ｄ） 酵素標識抗体の調製 ペルオキシダーゼ（シグマ社製、タイプVI）40mgを蒸
留水10mlに溶解させ、これにメタ過ヨウ素酸ナトリウム
水溶液（40mg/ml）0.5mlを加え、室温で10分間攪拌し
た。

この溶液をセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−25に展開
し、ペルオキシダーゼ溶液を分画し、水酸化ナトリウム
にてpHを9.5に調整した。これに予め炭酸緩衝液（pH9.
5、0.01mol/）にて透析した抗ヒトIgG抗体（ダコ（Da
ko）社製、ウサギIgG、10mg/ml）10mlを加え、４℃にて
24時間静置した後、水素化ホウ素ナトリウム（5mg/ml）
1mlを加え、４℃で２時間静置した。その後、トリス緩
衝液（pH8.2、0.01mol/）にて透析し、セフアクリル
（Sephacryl）Ｓ−200に展開して、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトIgG抗体を得た。

（ｅ） 酵素標識抗体結合ラテツクスの調製 上で得たペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体溶液10m
lと、前記コンカナバリンＡ結合ラテツクス溶液それぞ
れ2mlを混合し、室温で２時間攪拌、反応させた後、前
記と同じトリス緩衝液を用いて遠心洗浄を２回行なつ
た。この後、同じ緩衝液2mlに分散させて、それぞれペ
ルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体結合ラテツクス１及
び２を得た。

（ｆ） 抗体感作プレートの調製 96穴マイクロプレート（タイターテツク社製、EIA
用）の各ウエルに抗ヒトIgG溶液（0.5mg/ml、pH7.0、0.
1mol/リン酸緩衝液）300μを分注し、４℃にて１日
間静置した。同じ緩衝液にて各ウエルを洗浄した後、ウ
シ血清アルブミン溶液（１％、同緩衝液、アーマー社
製）300μに置換し、37℃で２時間インキユベートし
た。更に、４℃で２日間静置した後、同緩衝液で洗浄
し、抗ヒトIgG感作プレートを得た。

（ｇ） 測定 ヒトIgG標準品（ヘキスト社製）をトリス緩衝液（pH
8.2、0.01mol/、0.9％塩化ナトリウム含有）で希釈し
て、標準ヒトIgG溶液とした。

上記（ｆ）にて調製した抗体感作プレートに上記標準
ヒトIgG溶液100μと、前記（ｅ）にて調製したラテツ
クス溶液１及び２のそれぞれ100μ（トリス緩衝液（p
H8.0、0.01mol/、0.9％塩化ナトリウム含有）にて希
釈した。）とを混合し、室温で反応させ、100秒間にお
ける600nmの吸光度変化をマイクロプレート・リーダー
を用いて測定した。

更に、メチル−α−Ｄ−マンノシド（30mM）100μ
を加え、室温にて２時間静置した。次いで、洗浄液（ト
リス緩衝液、0.9％塩化ナトリウム及び0.2％BSA含有）
で５回洗浄した後、酵素基質溶液（リン酸−クエン酸緩
衝液（pH6.0、0.1mol/、1mM濃度のｏ−フエニレンジ
アミンと0.05％濃度の過酸化水素含有）200μを加
え、室温で１時間反応させた後、硫酸緩衝液（2N）100
μを加えて、反応を停止させ、前記と同じリーダーに
て495nmの吸光度を測定した。

（ｈ） 検量線の作成 上記（ｇ）にて得た吸光度値を各濃度に相当する点で
プロツトし、前記ラテツクス１及び２に対応して、それ
ぞれ第１図及び第２図に示す検量線を作成した。これら
から明らかなように、酵素免疫測定法において、抗原過
剰領域での反応量低下（ゾーン現象）の起こる定量域に
てラテツクス凝集反応を測定しており、広い定量域での
測定を行なうことができる。

実施例２ 実施例１（ａ）にて得たラテツクス溶液5ml、ホウ酸
緩衝液（pH7.5、0.1mol/）2ml及び蒸留水11mlを混合
し、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（2mg/ml）2mlを加
え、10分後にペルオキシダーゼ水溶液（0.5mg/ml）と抗
ヒトIgG（4mg/ml）の等量混合物5mlを加え、10℃で24時
間反応させた。

次に、反応混合物に10重量％アルギニン水溶液（pH7.
5）5mlを加えて、反応混合物中に残存する過剰の上記カ
ルボジイミドを消費させ、１時間インキユベートした。
この後、トリス緩衝液（pH8.2、0.01mol/）にて遠心
洗浄を３回行なつた後、同じ緩衝液に再分散させ、全量
5mlとして、抗ヒトIgG−ペルオキシダーゼ結合ラテツク
ス溶液３を得た。

実施例１（ｆ）の同様にして、ラテツクス凝集反応を
行なつた後、２時間室温で静置し、更に、洗浄した後、
実施例１（ｇ）と同様にして、酵素活性を測定し、第３
図に示す検量線を作成した。

第１図から第３図に明らかなように、酵素免疫測定法
によれば、抗原過剰領域において吸光度の低下が観察さ
れ、みかけ上、実際の値より低い値に読み取られる濃度
域がラテツクス凝集反応によつてカバーされるので、正
確な検体の定量が可能となる。

従来の酵素免疫測定法においては、ある吸光度を越え
る検体については、抗原過剰によるみかけ上の吸光度低
下が起きているかどうかの判断が困難であるため、一般
に吸光度を越えない濃度まで検体を希釈し、定量値に検
体の希釈率を乗じ濃度換算をする方法が採られている。
しかしながら、そのような方法によれば、２度の測定操
作を必要とし、煩雑である。また、本発明によれば、実
用上、ラテツクス凝集反応で定量される濃度域にある検
体では、それに引き続く酵素免疫測定法の測定操作を省
略すればよく、測定操作を極めて簡素化することができ
る。

更に、本発明によれば、第１図から第３図に明らかな
ように、ラテツクスの種類を選択することにより、必要
とされる定量域を適時変更することもできる。

実施例３ 実施例１にて調製した酵素標識抗体結合ラテツクス
と、比較対照として、同じく実施例１にて調製した酵素
標識抗体とをそれぞれ40℃に保持して、酵素活性の経日
変化を調べた。調製直後の酵素活性を100とする相対活
性を第１表に示す。

本発明において用いる酵素標識抗体結合ラテツクスが
保存性にすぐれることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図から第３図は、それぞれ本発明に従つてラテツク
ス凝集反応と酵素免疫測定とを併せ行なつたときの被検
物質の濃度の検量線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉川 浩志 大阪府茨木市下穂積１丁目１番２号 日 東電気工業株式会社内 (72)発明者 木原 康夫 大阪府茨木市下穂積１丁目１番２号 日 東電気工業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−261960（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−231171（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水分散型高分子重合体粒子を担体とし、こ
   の担体上に抗原若しくはハプテン、又は抗体と共に、酵
   素が結合されてなる酵素標識免疫体結合ラテツクスと被
   検液を混合して、ラテツクス凝集反応を行なわせ、次い
   で、予め抗原若しくはハプテン、又は抗体を結合させた
   固相担体上で上記酵素標識免疫体と抗原抗体反応を行な
   わせることを特徴とする免疫学的測定法。
2. 【請求項２】酵素を結合し得る物質を結合させた水分散
   型高分子重合体粒子に酵素を標識した抗原若しくはハプ
   テン、又は抗体を反応させて得られる酵素標識免疫体結
   合ラテツクスを用いることを特徴とする請求項第１項記
   載の免疫学的測定法。
3. 【請求項３】酵素が糖鎖を有するタンパク質であり、酵
   素と結合し得る物質がレクチンであることを特徴とする
   請求項第２項記載の免疫学的測定法。