JPH0260268B2 - - Google Patents

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JPH0260268B2
JPH0260268B2 JP20570484A JP20570484A JPH0260268B2 JP H0260268 B2 JPH0260268 B2 JP H0260268B2 JP 20570484 A JP20570484 A JP 20570484A JP 20570484 A JP20570484 A JP 20570484A JP H0260268 B2 JPH0260268 B2 JP H0260268B2
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JP
Japan
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digoxin
antibody
immunoassay method
solid phase
fragment
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Application number
JP20570484A
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English (en)
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JPS60105965A (ja
Inventor
Uiriamu Furaitaaku Jei
Chan Shannhoo
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EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
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Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of JPS60105965A publication Critical patent/JPS60105965A/ja
Publication of JPH0260268B2 publication Critical patent/JPH0260268B2/ja
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は改善されたゞゎキシン免疫定量法、そ
しお詳现にはむンデむケヌタヌ詊薬ずしお暙識䞀
䟡たたは二䟡抗ゞゎキシン抗䜓および分離を行う
手段ずしお䞍動化りアバむンカラムを甚いる非拮
抗的䞍均質系免疫定量法に関する。 迅速にそしお正確に生物流䜓䞭に存圚するゞゎ
キシンの濃床を枬定しうる臚床怜査宀蚺断テスト
に察する倧きくそしお広い垂堎がある。ゞゎキシ
ンは埀々にしおナノモルたたはそれ以䞋の濃床で
存圚しおいる。 近幎、臚床的に重芁なリガンドの枬定のための
倚くの免疫定量技術が開発された。代衚的には、
拮抗的結合免疫定量法は結合反応に関䞎する結合
成分に結合した暙識物質のコンゞナゲヌトよりな
぀おいお、結合したものおよび遊離したものの二
皮の暙識コンゞナゲヌトを生成させる。結合した
ものおよび遊離したものを䞎える暙識コンゞナゲ
ヌトの盞察量はテスト詊料䞭の怜出させるべきリ
ガンド濃床の凜数である。 結合したものにおける暙識コンゞナゲヌトず遊
離したものの暙識コンゞナゲヌトが暙識物質枬定
に䜿甚される手段によ぀お本質的に識別可胜でな
い堎合には、その結合したものず遊離したものを
物理的に分離させなくおはならない。このタむプ
の怜定は䞍均質系ず呌ばれる。 ぀の最も広く䜿甚されおいる䞍均質系免疫定
量法は攟射免疫定量法RIAおよび酵玠結合免
疫吞着怜定ELISAである。RIAにおいおは
未知量の抗原を含有する詊料を既知量の攟射暙識
抗原および抗䜓ず混合させる。系を平衡に近い点
たで反応せしめ、次いで抗䜓結合抗原を非結合抗
原から分離させる。詊料抗原は限定された数の抗
䜓結合郚䜍に察しお暙識抗原ず拮抗するので、詊
料䞭の抗原が倚くなればなる皋、結合分画䞭の暙
識抗原はたすたす少なくなるたたは非結合分画
䞭ではたすたす倚くなる。この方法は䞀般に時
間がかかり〜時間そしお劎力を芁するも
のである。 極く最近にな぀お、倚孔性担䜓䞊での抗䜓の䞍
動化によ぀おRIAは自動化された。抗原を含有す
るず疑われる詊料を既知量の暙識抗原ず混合させ
た埌、限定された数の䞍動化抗䜓結合郚䜍を有す
るカラムにこの詊料を通す。遊離たたは結合され
た暙識を定量化させるこずができる。迅速ではあ
るけれどもこの怜定法はそれを再珟性のあるもの
ずするためには抗䜓の厳密な枬量を必芁ずする。 RIAは぀の䞻なる䞍利点を有しおいる。第䞀
に䜿甚される暙識物質はその取扱い、保存および
投棄に関しお倚くの問題を有する攟射性同䜍元玠
である。第二にRIAは拮抗様匏で実斜されすな
わちアナラむトず暙識アナラむトは抗䜓䞊の限定
された数の結合郚䜍に察しお拮抗する、埓぀お、
抗䜓芪和性定数が怜定法の感床を代衚的には
10-8M1〜10-11M1の範囲に限定する。 ELISAはその暙識物質が攟射性同䜍元玠より
はむしろ酵玠であるずいう以倖は原則においお
RIAず同様である。それも感床がなお抗䜓芪和性
定数の厳密な凜数であるずいう制限を受ける。 同䜍元玠および酵玠に加えおその他の暙識物質
が蚘茉されおいる。これらずしおは螢光発生団、
補酵玠、生物発光物質、酵玠抑制剀があげられ
る。 䞍均質系免疫定量法における分離段階の皮々の
実斜法が知られおいる。これらずしおは過、遠
心分離、クロマトグラフむヌその他があげられ
る。 分離段階を実斜するためのアフむニテむヌカラ
ムの䜿甚はフランス特蚱出願第79 15992号明现曞
に蚘茉されおいる。それは暙識物質に察しお芪和
性を有し、そしお曎に分子ふるい性を有しおいる
リガンドをそれにカツプリングさせたゲルの䜿甚
を蚘茉しおいる。暙識物質よりはむしろ関心のあ
るリガンドに察しお芪和性を有し、そしお分子ふ
るい性を有するゲルの䜿甚もたた開瀺されおい
る。蚘茉されおいる怜定法は拮抗的たたは非拮抗
的様匏で実斜するこずができる。 米囜特蚱第298687号明现曞は䞍均質系免
疫定量法を開瀺しおいるが、この堎合枬定すべき
物質を暙識䞀次結合察応成分ず反応させ、そしお
未反応結合察応成分の量をその䞀次結合察応成分
に察する特異的結合性を䞎えた固䜓盞䞊ぞの吞収
によ぀お枬定する。この䞀次結合察応成分は限定
された量で存圚させる。 米囜特蚱第654090号明现曞は人絚毛膜ゎ
ナドトロピンHCGに察する非拮抗的䞍均質
系免疫定量法を開瀺しおいるがこれはその分離段
階を実斜するために過剰の酵玠暙識二䟡抗䜓ず䞍
動化HCGカラムを䜿甚しおいる。この怜定法は
モルHCG結合抗䜓ずHCG結合のない抗䜓ずを
区別できないずいう事実によりその感床においお
限定されおいる。䞡皮のものがアフむニテむヌカ
ラムにより保持される。 米囜特蚱第134792号明现曞は関心あるリ
ガンドに察する暙識特異的結合察応成分を過剰に
存圚させる䞍均質系免疫定量法を開瀺しおいる。
暙識特異結合察応成分は二䟡抗䜓であり、そしお
これは前蚘ず同䞀の䞍利点を有しおいる。 「British J. Haematol.」第47巻第269頁
1981は凝固因子に察する二郚䜍免疫攟射胜
枬定怜定法IRMAを開瀺しおいるがここでは
䞀䟡Fab抗䜓フラグメントが䜿甚されおいる。そ
れらの結果は二䟡抗䜓よりはむしろ䞀䟡抗䜓を䜿
甚する堎合に10倍のより高い感床が埗られるこず
を瀺しおいる。 米囜特蚱第200436号明现曞は暙識䞀䟡抗
䜓を䜿甚する免疫定量法を開瀺しおいるが、この
堎合䞍動化抗原枬定すべきものず同䞀の抗原
を䜿甚しお結合分画および遊離分画を分離させ
る。枬定されるのは第䞀矩的には結合分画なので
この怜定は拮抗様匏で通垞実斜される。埓぀お感
床は怜定が奜たしい様匏で実斜される堎合には抗
䜓の芪和性定数によ぀お限定される。 ある堎合には免疫定量におけるアナラむトをア
ナラむト同族䜓に代えるこずができる。䞀般に性
胜はアナラむトの䜿甚ずアナラむト同族䜓の䜿甚
ずの間に差はなく等しいものず予想される。意倖
なこずに本発明のゞゎキシン怜定においおは、䞍
動化抗原ずしおのゞゎキシンをりアバむンに代え
るこずによ぀お怜定の感床および粟床を顕著に改
善するこずが発芋された。本改善をもたらす正確
な機構はわか぀おいないが、それは抗原−抗䜓反
応の性質にあるものず考えられる。 圓該技術においおはその感床および粟床が抗䜓
の芪和性定数によ぀お限定されないゞゎキシンの
䞍均質系免疫定量法に察する芁求がある。 本発明の非拮抗的䞍均質系免疫定量法は次の段
階すなわち、 (a) モル過剰の暙識䞀䟡たたは二䟡抗ゞゎキシン
抗䜓をゞゎキシンを含有する疑いのあるテスト
詊料に接觊させるこずによ぀お反応混合物を生
成させ、それによ぀お前蚘抗䜓の䞀分画がゞゎ
キシンずコンプレツクスを圢成し、そしお䞀分
画が遊離状態に留たり、 (b) この反応混合物を遊離抗䜓の党郚を結合させ
うる量で存圚する、固䜓担䜓䞊で䞍動化させた
りアバむンを有する固䜓盞ず接觊させお遊離抗
䜓をこの反応混合物から分離し、そしお (c) 暙識を枬定するこずによ぀お固䜓盞から溶出
したコンプレツクスの量を枬定するこず、 を包含する。次いで詊料䞭のゞゎキシン量を暙準
曲線を比范するこずにより決定するこずができ
る。 その他の態様においおは、拮抗的䞍均質系免疫
定量法が提䟛されるが、これは次の䞀連の段階、
すなわち (a) ゞゎキシンを含有する疑いのある詊料を固䜓
盞䞊に䞍動化させたモル過剰のりアバむンず接
觊させるこずにより反応混合物を生成させ、 (b) この反応混合物をゞゎキシンに察しおモル過
剰の、䜆しりアバむンに察しおはモル以䞋の暙
識䞀䟡たたは二䟡抗ゞゎキシン抗䜓ず接觊さ
せ、 (c) 反応を行わせ、それによ぀お抗䜓の䞀分画が
ゞゎキシンず第䞀コンプレツクスを圢成しそし
お第二の分画が䞍動化りアバむンずコンプレツ
クスを圢成するようにし、 (d) 第二分画から第䞀分画を分離し、そしお (e) 第䞀分画たたは第二分画のいずれか䞀぀に存
圚する暙識量を枬定するこず を包含しおいる。 䞀般に抗䜓を免疫定量法で䜿甚する前に抗䜓を
免疫孊的に粟補するこずが望たしい。動物血枅、
腹氎たたは組織培逊媒䜓からのIgG単離法および
アフむニテむヌクロマトグラフむヌによるその免
疫孊的粟補法もたた圓該技術では知られおいる。
簡単にIgG分画を硫酞アンモニりム沈殿により調
補する。IgG分画を次いでむオン亀換、ゲル過
たたは蛋癜質クロマトグラフむヌにより調補す
る。アフむニテむヌ粟補は抗原カラムからの溶出
により実斜される。 抗䜓は倚クロヌン性たたは単䞀クロヌン性のい
ずれであ぀おもよい。䞀䟡抗䜓は圓該技術におい
お既知の方法で調補するこずができる。䟋えば
FabフラグメントはIgGのパパむン消化により埗
られ、Fab′フラグメントはIgGのペプシン消化に
より埗られたab′2フラグメントのゞサルフア
むド還元により埗られる。 抗䜓ぞの暙識物質のカツプリングに察しおは任
意の倚数の方法を䜿甚しうる。暙識物質は酵玠、
攟射性同䜍元玠、発色団、螢光発生団、たたは単
独でたたはその他の詊薬ず組合せた堎合に怜出可
胜なシグナルを発生しうる任意のその他の物質で
ありうる。䞀般に各抗䜓に察しお少くずも䞀぀の
暙識を奜たしくは共有結合的に、そしお抗䜓の免
疫反応性および暙識物質の掻性を保存するような
方法でカツプリングさせるべきである。Fab′フ
ラグメント䞭に存圚する遊離のスルフヒドリル基
は暙識の共有結合的結合に察しお特異的な反応性
の基を䞎える。マレむミドたたはチオピリゞル基
を有する耇玠二官胜亀叉結合詊薬がこの目的には
有甚である。䞀般に免疫孊的掻性の保持を確実に
するために、暙識抗䜓の合成の最終段階は免疫孊
的粟補段階であるのが望たしい。 りアバむンたたはそのコンゞナゲヌトは䟋えば
「Biohemistry」第巻第331頁1970による圓
該技術に既知の方法によ぀お適圓な担䜓䞊に䞍動
化させるこずができる。䞀般に、担䜓はその流れ
特性で遞ばれ、そしおその䟋ずしおはビヌズ化ア
ガロヌス、ビヌズ化デキストラン、ポリアクリル
アミドたたはガラスをあげるこずができる。りア
バむンは盎接にたたは蛋癜質、ポリアミノ酞たた
は合成結合成分でありうるスペヌサヌアヌムを介
しおこの担䜓に共有結合的に結合させるこずがで
きる。通垞、アフむニテむヌカラム物質は䞀回䜿
甚するず捚おられるがしかし所望によりそれを再
埪環させるこずはできる。担䜓が分子ふるい特性
を有しおいるこずは䞀般に望たしくない。それは
もし暙識抗䜓が詊料アナラむトから解離した堎
合、分子ふるいはそれらが盞互に再び出䌚う可胜
性を枛じさせる傟向があるからである。 非拮抗性様匏においおは、本発明の怜定は次の
ようにしお実斜するこずができる。未知量のゞゎ
キシンを含有する通垞は5Ό〜500Όの血枅で
ある患者詊料の既知の容量をゞゎキシンに察しお
明らかに過剰な量の暙識付けした䞀䟡たたは二䟡
の抗䜓を含有する溶液ず混合させる。通垞暙識付
けした抗䜓はゞゎキシンに比べお玄10〜100モル
過剰で存圚させる。ゞゎキシンおよび抗䜓を通垞
は少くずも分、そしお30分未満のある特定の時
間の長さの間、℃〜45℃の間の䞀定の枩床、通
垞は37℃で前培逊preincubationさせる。ゞ
ゎキシン結合抗䜓ず非結合抗䜓を含有するこの溶
液の既知の容量通垞5Ό〜500Όを奜たし
くはmm×10mmの寞法を有する、倚孔性担䜓䞊に
䞍動化させたりアバむンよりなるカラムに通過さ
せる。すべおの遊離の暙識付き抗䜓を結合させる
に充分なりアバむン−カツプリング担䜓が䜿甚さ
れる。カラムを0.2〜5.0ml分の流速で、通垞は
〜ml党量の適圓なバツフアヌで溶出させる。
カラムから溶出する分画は患者血枅からのゞゎキ
シンでコンプレツクス化された暙識付き抗䜓を含
有しおいる。この分画䞭の暙識掻性を次いで枬定
する。或いはたたこの分画を捚お、そしおケむオ
トロピツクchaotropic剀たたは極端な倀のPH
によ぀おカラムから保持されおいる抗䜓を溶出さ
せるこずができる。第䞀の堎合には暙識の量は詊
料䞭のゞゎキシン濃床に盎接比䟋する。第二の堎
合はそれは逆比䟋する。 本発明の怜定法は手動的に実斜しうるしたたは
それは皮々の自動匏たたは半自動匏装眮䟋えば
aca 独立臚床アナラむザヌデナポン瀟補に
適応するこずができる。この堎合には患者詊料お
よび過剰の暙識䞀䟡たたは二䟡抗䜓を装眮の倖で
前培逊させる。既知の容量のこの混合物を分析テ
ストパツクここに参考ずしお包含されおいる
Re29725に蚘茉されおいる䞭に、この装眮の充
填ステヌシペンにおいお自動的に泚入し、次いで
最終パツク内容量をmlずするに充分な量のバツ
フアヌを泚入する。この詊料混合物をパツク通氎
管headerに眮いた倚孔性担䜓䞊で䞍動化さ
せたりアバむンのカラムに通しそしお盎接パツク
䞭に溶出させる。この溶出された分画は患者血枅
䞭のアナラむトでコンプレツクス化された暙識抗
䜓を含有しおいる。このパツクは自動的に37℃で
ブレヌカヌミキサヌたたはブレヌカヌミキ
サヌのいずれかでシグナル発生反応に必芁な詊
薬を添加し、そしお、そのシグナルの光床蚈によ
る読出しを行なう。 本発明の怜定法はたた、拮抗様匏でも実斜させ
うるが、これは抗䜓を詊料ゞゎキシンずりアバむ
ンに、連続的ずいうよりはむしろ同時に露出させ
るこずを意味しおいる。 拮抗様匏においおは怜定法は以䞋のように実斜
される。ゞゎキシンを含有する疑いのある詊料の
䞀区分量、通垞は10〜100Όを固䜓盞䞊に䞍動
化させたモル過剰のりアバむンを含有する詊隓管
に加える䞀般にはアフむニテむヌカラム暹脂䟋
えば亀叉結合アガロヌスたたはデキストランの
100〜1000Ό充填容量。次いで䞀䟡たたは二䟡
暙識抗ゞゎキシン抗䜓溶液を詊料䞭に予想される
ゞゎキシンの最倧倀よりモル過剰の、䜆しりアバ
むンに察しおはモル以䞋の量で加える。この抗䜓
溶液の量は䞀般には〜50Όである。このよう
にしお生成された反応混合物を23℃〜45℃、奜た
しくは37℃の枩床で、15〜60分、奜たしくは15分
間、静かに撹拌し぀぀培逊する。抗䜓−ゞゎキシ
ンコンプレツクスを次いで抗䜓䞍動化りアバむ
ンコンプレツクスから分離させる。芪和性暹脂が
䜿甚される堎合には玄分間の2000×の遠心が
奜たしい。次いで䞊柄流䜓を吞匕する。固䜓盞䞊
に吞着された暙識の量たたは䞊柄流䜓䞭の暙識の
量のどちらかを枬定しおテスト詊料䞭に最初に存
圚したゞゎキシンの量を決定するこずができる。
暙識が酵玠である堎合には酵玠をその基質ず反応
させお怜出可胜な生成物を生成させるこずによ぀
お枬定を実斜するこずができる。非酵玠暙識䟋え
ば螢光発生団、発色団、および攟射性同䜍元玠は
圓該技術でよく知られた技術により枬定するこず
ができる。 固䜓盞䞊でゞゎキシンよりはむしろりアバむン
を䜿甚するこずの利点は次の実斜䟋によ぀お説明
されおいる。これら実斜䟋䞭では皮々の実隓条件
䞋にゞゎキシンアナラむトおよびりアバむン
アナラむト同族䜓カラムの䞡方が調補され、
そしおそれらのゞゎキシンアフむニテむヌカラム
を䜿甚する免疫孊的怜定における性胜がバツクグ
ラりンド、感床および粟床に関しお評䟡された。
各暹脂の合成に察する至適条件は異぀おいるけれ
ども、最良のりアバむン暹脂は䞀貫しお最良のゞ
ゎキシン暹脂よりも秀れた性胜を瀺した。 本明现曞䞭ではりアバむンのみが特定的に䟋瀺
されおいるけれども、均等物ずしおゞギトキシ
ン、デスラノシド、ゞゎキシゲニン、およびスト
ロフアンチンが予想される。 䟋   䞀䟡抗䜓−酵玠コンゞナゲヌトの合成 りアバむン−HSA免疫吞着剀を䜿甚しお兎党
血枅から盎接ゞゎキシン特異抗䜓を免疫粟補し
た。 りアバむンは蛋癜質HSA、人血枅アルブミ
ンスペヌサヌアヌムを介しおアガロヌスマトリ
ツクスに結合させた。第䞀の段階はりアバむン−
アルブミンコンゞナゲヌトの合成を包含する。り
アバむン0.56ミリモルを20mlの氎に溶解を暗
所で宀枩で䞀時間、メタ過沃玠酞ナトリりム
1.02ミリモルで酞化した。定量酞化は酢酞゚
チルメタノヌルH2O7525で展開さ
せたシリカゲルプレヌト䞊での薄局クロマトグ
ラフむヌによ぀お蚌明された。ダり゚ツクスAG
−1X8むオン亀換暹脂のmlのカラム䞊にこの氎
性混合物を通すこずによ぀お過剰の過沃玠酞塩を
陀去した。りアバむンの定量的回収は攟射胜暙識
トリチりム化りアバむンを远跡するこずによ
り蚌明された。0.4mlのNa2CO3を添加するこ
ずによ぀お酞化りアバむンの溶液をPH9.5にバツ
フアヌ化させ、そしお20mlのHSA溶液28mg
mlず合した。45分埌、このコンゞナゲヌトを20
mlの氎に新たに溶解させた0.3のナトリりムボ
ロハむドラむドを添加するこずによ぀お還元させ
た。時間埌mlのモル蟻酞を加えおそのPHを
6.5に䞋げた。PH6.5で時間眮いた埌、モル、
NH4OHでそのPHを7.5に䞊昇させた。党反応混
合物を蒞留氎で完党に透析させ次いで最埌に
0.015モル燐酞ナトリりムバツフアヌPH7.8、
0.15モルNaClで透析した。このコンゞナゲヌト
をアミコンPM−30膜で濃瞮させお、4.2mgmlず
した。蛋癜質濃床は圓該技術では既知のロヌリヌ
法により枬定された。 りアバむン−HSAコンゞナゲヌトを「Bio−
Radmanual」に蚘茉の方法を䜿甚しおアフむゲ
ル 10ビオ−ラド・ラボラトリヌズ瀟補䞊で
䞍動化させた。25mlのアフむゲル 10を75mlの氷
冷氎で掗぀た。このゲルを透析りアバむン−
HSAコンゞナゲヌトに加えそしお℃でロツカ
ヌ䞊で䞀晩混合せしめた。過剰の掻性゚ステル基
を0.1mlのモル゚タノヌルアミンPH8.0を宀
枩で䞀時間加えるこずにより急冷させた。最埌
に、このゲルを蒞留氎で完党に、次いで順に500
mlの0.5モルNaCl、400mlの0.1モルグリシンPH
2.5、300mlの2.5モルNH4SCN、1000mlのホスフ
゚ヌトバツフアヌ化塩氎で掗぀た。りアバむン芪
氎性暹脂をmlのベツド容積になるようにカラム
0.7×15cm䞭に充填しお、そしお燐酞バツフア
ヌ化塩氎で平衡化した。抗血枅4.5mgmlモノ
特異性抗䜓のカペル抗ゞゎキシン血枅10mlを
ml分以䞋の流速で適甚した。カラムをその
280nmの吞光床がベヌスラむン0.01に達す
るたで燐酞バツフアヌ化塩氎で掗぀た。次いで60
mlのモルNH4SCNPH7.5でこのカラムから
抗䜓を溶出させ、そしお盎ちに℃で燐酞バ
ツフアヌ化塩氎で回透析した。 アミコン撹拌セル装眮PM−30膜䞊でこの
27mlのアフむニテむ−粟補抗ゞゎキシン抗䜓を
2.7mlに濃瞮した。最終蛋癜質濃床は10mgmlで
あ぀た。詊料を0.1モル酢酞ナトリりムPH4.5
1000mlで℃で時間透析した。透析埌、同䞀酢
酞ナトリりムバツフアヌに溶解させた10mgmlの
ペプシン溶液20Όを加え、そしお枩床を37℃に
加枩しお20時間保぀た。この消化時間の埌、短時
間遠心分離させるこずにより詊料を枅柄化させ、
次いで0.015モル燐酞ナトリりムPH7.4、0.15モ
ルNaCl燐酞バツフアヌ化塩氎䞭で平衡化させ
たセフアデツクス−150カラム1.5×90cm䞊
でクロマトグラフむヌに付した。ゲル電気泳動に
より同定されたFab′2フラグメントを含有する
カラム分画をプヌルし19.2ml、次いで加圧
過PM−30アミコン膜で2.7mlに濃瞮した。濃
瞮埌このFab′2フラグメントを55Όのモル
ゞチオスレむトヌル溶液を加えるこずにより還元
させお盞圓するFab′フラグメントずした。還元
は25℃で90分間実斜された。次いで℃で0.15モ
ルNaCl、0.015モル燐酞ナトリりム、PH5.6×
1000mlで透析を実斜した。 このようにしお調補されたFab′フラグメント
を次いで20倍モル過剰の−マレむミド安息銙酞
−ヒドロキシサクシンむミド゚ステルMBS
ず反応させた。テトラヒドロフラン䞭の79ミリモ
ルのMBS溶液85ΌをmlのFab′フラグメント
の溶液に加え、そしお25℃でアルゎン䞋に時間
反応させた。この混合物を燐酞バツフアヌ化塩氎
䞭でセフアデツクス−25亀叉結合ビヌズデキ
ストラン、5000ドルトンの排陀限界を有するの
カラム1.5×40cm䞊で脱塩させた。ボむド容
量䞭に溶出される誘導䜓化されたFab′フラグメ
ントをプヌルし、そしお℃の燐酞バツフアヌ化
å¡©æ°Žäž­12mgmlのβ−ガラクトシダヌれmlず合
した。16時間埌この溶液をアミコンPM−30加圧
過撹拌セル䞭でmlに濃瞮させ、次いでセフア
ロヌス4B−CL1.5×90cmカラム䞭〜×106ド
ルトン排陀限界を有するビヌズ圢亀叉結合マクロ
现孔性アガロヌスのカラムクロマトグラフむヌ
に付した。Fab′−β−ガラクトシダヌれコンゞ
ナゲヌトは遊離β−ガラクトシダヌれず共に溶出
された。酵玠掻性の党ピヌクをプヌルし、次いで
りアバむンアフむニテむヌカラム䞊で免疫孊的に
粟補させた。免疫孊的粟補法は以䞋の通りであ぀
た。セフアロヌス4B−CLカラムからのプヌルし
たカラム分画をりアバむンアフむニテむヌカラム
1.0×7.0cmを通しお溶出させ、次いで100mlの
燐酞バツフアヌ化塩氎で溶出させた。この
Fab′−β−ガラクトシダヌれコンゞナゲヌトを
次いで燐酞バツフアヌ化塩氎䞭の23ミリモルりア
バむン50mlで溶出させた。この溶出液は最終詊薬
に盞圓し、これを℃のの燐酞バツフアヌ化
塩氎で回透析した。  りアバむンずゞゎキシン暹脂の合成 りアバむンおよびゞゎキシンをそれぞれ別々に
皮々の比率で有機スペヌサヌ成分トリ゚チレンテ
トラアミンTETAを介しおセフアデツクス
−10フアルマシア・フアむン・ケミカルズ瀟
より入手可胜なビヌズ型デキストランにカツプ
リングさせた。 りアバむン20〜325mgを蒞留氎に溶解させ、
そしお倍のモル過剰のメタ過沃玠酞ナトリりム
を添加するこずによ぀お25℃で時間酞化させ
た。この時間の終りに過剰の過沃玠酞塩を陀去さ
せるダり゚ツクス−X8Cl-むオン亀換暹脂
のmlのカラムに各溶液を通すこずによ぀お反応
を停止させた。溶出液を集めそしお濃瞮ストツク
溶液の添加によ぀お0.1モル燐酞ナトリりムPH
7.0の最終濃床ずした。TETA50〜125mgを
各溶液に加え衚1A参照そしお最終溶液のPH
をPH7.0に調敎した。この溶液を25℃で時間培
逊し、この時間の終りに30mgのナトリりムシアノ
ボロハむドラむドを加えた。埗られた溶液を25℃
で48時間撹拌した。 りアバむンに぀いお前蚘した同䞀の方法を、䜆
しゞゎキシンを30゚タノヌルに溶解させおゞゎ
キシンに察しお実斜した。実隓の詳现は衚1Bに
瀺されおいる。 各コンゞナゲヌトりアバむン−TETA9ロツ
トおよびゞゎキシン−TETA9ロツトを次いで
次の方法によ぀おセフアデツクス−10にカツプ
リングさせた。210のセフアデツクス−10を
蒞留氎䞭で膚最させた。暹脂を次いで䞀回
の氎で回掗぀た。最埌に暹脂をのメタ過
沃玠酞ナトリりム10に懞濁させるこず
により酞化させた。時間25℃に眮いた埌、暹脂
を沈降させ、䞊柄流䜓を陀去し、そしお暹脂を玄
の0.25モル燐酞ナトリりムPH7.0を䜿甚
しお焌結ガラスロヌト䞊で掗぀た。埗られた暹脂
を25ml区分に分け、そしお前蚘合成コンゞナゲヌ
ト各ロツトにその䞀区分を混合させた。時間混
合埌、ナトリりムシアノボロハむドラむド30
mgをコンゞナゲヌトを加えた暹脂の各区分量に
加えた。埗られた懞濁液を25℃で64時間混合させ
るがこの時暹脂を沈降させ、䞊柄流䜓を陀去し、
そしお暹脂各区分別々にを300mlの氎、300ml
の0.5モルNaClおよび500mlの0.15モル燐酞ナトリ
りムPH7.1で掗぀た。各暹脂郚分をaca 独立
臚床アナラむザヌ分析カラム0.5×cm、カラ
ム本圓り1.8mlに充填させた。そのカラムを
次いでmgの−ニトロプニル−β−−ガラ
クトピラノシドONPGを含有するaca 独立
臚床アナラむザヌ分析テストパツクの通氎管䞭に
くがみdimpleで䜍眮させた。  りアバむン−TETA−セフアデツクスずゞ
ゎキシン−TETA−セフアデツクスの比范 前蚘(B)で合成された各暹脂ロツトを次のプロト
コヌルに埓぀おaca 独立臚床アナラむザヌで評
䟡した。10ピコモルの前蚘(A)で合成されたβ−ガ
ラクトシダヌれ暙識抗ゞゎキシンFab′を100ÎŒ
のたたは5ngmlのゞゎキシンを含有する人プ
ヌル血枅詊料に加えた。10分間25℃で培逊埌、抗
䜓−詊料混合物を自動的に前蚘のaca 独立臚床
アナラむザヌ分析テストパツク䞭に泚入させそし
おパツク通氎管䞭のカラムを通しお溶出させた。
詊料に続けおmlの0.15モル燐酞ナトリりムPH
7.8を流した。カラム流速は34Ό秒であ぀
た。このパツクに次いで針䜍眮カラムバむパ
スにおいお曎に2.9mlの氎を充填した。ONPG
を玄1/2分埌にブレヌカヌミキサヌから攟
出させた。酵玠掻性は基質添加埌405nmで、29秒
および46秒で枬定された。 衚によりすべおのの暹脂ロツトの性胜を
バツクグラりンド衚および感床衚
に぀いお比范する。バツクグラりンドは詊料
が0ngmlのゞゎキシンを含有する堎合の405nm
の吞収倉化ずしお定矩された。これら条件䞋では
すべおの暙識抗䜓はカラムに結合残存する筈であ
る。感床は分離ずしお、すなわち0ngmlã‚žã‚Žã‚­
シンず5ngmlゞゎキシンずの間における405nm
の吞収における倉化ずしお定矩される。 バツクグラりンドは䞀般にカラムがゞゎキシン
−TETA−セフアデツクスよりな぀おいる堎合
により䜎か぀たが、感床はカラムがりアバむン−
TETA−セフアデツクスよりな぀おいる堎合に
垞により良奜であ぀た。最良のりアバむン暹脂は
0.158吞収単䜍分の感床を有しおおり、䞀方最
良のゞゎキシン暹脂は0.110吞収単䜍分しか瀺
さなか぀た。衚においお星印を付したこれら
の暹脂は以埌の研究甚に遞ばれたものであ぀た。  粟床 衚においお星印を付された暹脂、すなわちり
アバむン−TETA−セフアデツクスよりなる䞀
぀のものずゞゎキシン−TETA−セフアデツク
スよりなるその他のものを曎にゞゎキシンに察す
る怜定粟床に関しお評䟡した。たたは
3.4ngmlゞゎキシンを含有する詊料を䜿甚しお
前蚘ず党く同じようにパツクを操䜜した。少くず
ものパツクが各薬剀濃床においお操䜜され
た。そしお平均倀、暙準偏差S.D.およ
び倉動係数C.V.が決定された。これらは
衚に瀺されおいる。 この薬物に察する医孊的決定濃床である1ng
mlゞゎキシンにおいお枬定の粟床はゞゎキシンカ
ラムに比范しおりアバむンカラムに察しお有意に
改善された。ゞゎキシンカラムを䜿甚する堎合に
は、1ngmlゞゎキシンの血枅濃床を有する人は
誀認され易い。そしお堎合により薬剀の過剰投䞎
たたは䞍充分投䞎を導きうる。ゞゎキシンは
1ngml以䞋の濃床では有効性はなく、そしおそ
れより倧きく䞊回る濃床では有毒なので、そのよ
うな枬定誀差の結果は重倧なものでありうる。こ
の理由からゞゎキシンカラムの代りにりアバむン
カラムを䜿甚するこずが本発明の基本を圢成す
る。
【衚】
【衚】
【衚】
【衚】
【衚】
【衚】 䟋   二䟡ab′2抗䜓酵玠コンゞナゲヌトの
合成 mlのアフむニテむヌ粟補抗ゞゎキシン
ab′2フラグメント䟋に蚘茉のようにしお調
補〔2.85mgmlの蛋癜質−0.015モル燐酞ナトリ
りム、0.15モルNaCl、ミリモルEDTAPH7.0
䞭〕を23〜25℃で9.1Όの、ゞメチルホルムアミ
ド䞭に溶解させた60ミリモルサクシンむミゞル
−−マレむミド−メチルシクロヘキサン−
−カルボキシレヌトSMCC溶液ず混合させ
た。60分埌、同䞀の燐酞ナトリりム−NaCl−
EDTA溶液で平衡化させたセフアデツクス−
25カラム1.5×30cm䞊でこの溶液を脱塩させ
るこずによ぀おこの反応を停止させた。ボむド容
積で溶出した蛋癜質を集め、そしおアミコン撹拌
セル濃瞮装眮PM−30膜を䜿甚しおmlたで
濃瞮した。mlの0.05モルトリスHCl、0.15モル
NaCl、ミリモルMgCl2PH7.5䞭に溶解させ
たβ−ガラクトシダヌれ24mgをこのab′2−
SMCCアダクトに加えそしお℃で20時間反応さ
せた。℃で時間、0.1モルの−メルカプト
゚タノヌル10Όの添加によ぀おこの反応を急冷
させた。ab′2−β−ガラクトシダヌれコンゞ
ナゲヌトを0.05モルトリスHCl、0.15モルNaCl、
ミリモルMgCl2PH7.5で℃で平衡化させた
セフアロヌズ4Bカラム1.5×90cm䞊でのクロ
マトグラフむヌによ぀おこのab′2−β−ガラ
クトシダヌれコンゞナゲヌトを未反応β−ガラク
トシダヌれから分離させた。  りアバむン暹脂ずゞゎキシン暹脂の合成 りアバむンおよびゞゎキシンをそれぞれ牛血枅
アルブミンBSAを介しお至適比率でセフア
デツクス−10に別々にカツプリングさせた。  りアバむン−BSAは500mlの熱蒞留氎70
℃にのりアバむン氎和物を溶解させる
こずにより調補された。溶液を25℃たで冷华さ
せた埌、7.3のメタ過沃玠酞ナトリりムを加
え、次いで暗所で25℃で時間連続混合させ
た。次いでこの混合物を250mlのダり゚ツクス
−X8陰むオン亀換暹脂床に通すこずによ
぀お酞化を停止させた。溶出液を集め、そしお
モル燐酞ナトリりムバツフアヌPH7.0に
溶解させた牛血枅アルブミン溶液10500
mlず合した。25℃で時間眮いた埌、0.64
のナトリりムシアノボロハむドラむドを撹拌し
぀぀加えそしおこの混合物を25℃で72時間培逊
させた。カツプリングしなか぀たりアバむン
を、りアバむン−BSAコンゞナゲヌト溶液を
24時間蒞留氎流氎で次いで20容量の0.015モル
燐酞ナトリりムバツフアヌPH7.0で℃で
透析させるこずによ぀おこの混合物から陀去し
た。セフアデツクス暹脂にカツプリングする前
にNaCl14.6を加えるこずによ぀お、このコ
ンゞナゲヌト溶液の最終むオン匷床を0.25モル
に調敎した。  りアバむン−BSAのセフアデツクス−10
ぞのカツプリング セフアデツクス−10420フアルマシ
ア・フアむン・ケミカルズ瀟補を時間以
䞊、2000mlの蒞留氎䞭で膚最させた。暹脂埮粒
子をデカントおよび×2000mlの氎による再懞
濁により陀去させた。次いで暹脂を20の溶解
メタ過沃玠酞ナトリりムを含有する氎1000mlに
再懞濁させるこずにより酞化させた。10分埌、
暹脂を×2000mlの氎、次いで4000mlの0.25モ
ル燐酞ナトリりムバツフアヌPH7.0で掗぀
た。デカントさせた暹脂を1000mlのりアバむン
−BSA溶液前蚘よりのものに再懞濁させ、
25℃で時間混合させ、次いで0.66のナトリ
りムシアノボロハむドラむドず混合させた。72
時間埌、氎䞭の0.1ナトリりムドデシルサル
プヌト4000ml、12の蒞留氎、次いで4000ml
の0.15モル燐酞ナトリりムバツフアヌPH7.1
で完党に掗぀た。最終暹脂をデナポンaca 独
立臚床アナラむザヌ䞭での自動分析に䜿甚する
ための小圢カラム0.5cm×cm䞭にスラリ
ヌ状態で充填させた。  ゞゎキシン−BSAは75mlの゚タノヌルに1.25
のゞゎキシンを溶解させ、぀いでこの溶液を
1.83のメタ過沃玠酞ナトリりムを含有する氎
150mlず合するこずにより調補された。25℃で
時間撹拌した埌、この混合物をダり゚ツクス
−X8陰むオン亀換暹脂床100mlに通
すこずによ぀お酞化を停止させた。溶出液を
0.1モル燐酞ナトリりムPH8.5に溶解させた
牛血枅アルブミン2.5の溶液ず合した。
ナトリりムシアノボロハむドラむド0.24
を次いで加え、そしおこの混合物を25℃で48時
間混合させた。遊離のコンゞナゲヌトしおいな
いゞゎキシンを日間蒞留氎流氎で、次いで20
容量の0.015モル燐酞ナトリりムバツフアヌ
PH7.0で℃で透析させるこずによ぀お陀去
した。  ゞゎキシン−BSAのセフアデツクス−10
ぞのカツプリング セフアデツクス−1050を時間以䞊、
250mlの蒞留氎䞭で膚最させた。暹脂埮粒子を
デカントおよび再懞濁により陀去させた。次い
で暹脂をの溶解メタ過沃玠酞ナトリりムを
含有する氎250mlに再懞濁させるこずにより酞
化させた。10分埌暹脂を×250mlの氎、次い
で0.1モル燐酞ナトリりムバツフアヌPH8.5
1000mlで掗぀た。デカントさせた暹脂〜250
mlの沈降床容積を次いで125mgのナトリりム
シアノボロハむドラむドを含有する125mlの0.1
モル燐酞ナトリりムバツフアヌPH8.5でス
ラリヌ化させた。24時間絶えず混合した埌暹脂
を×500mlの氎、500mlの0.15モル燐酞ナトリ
りムPH7.8で掗い、そしお125mlの0.15モル
燐酞ナトリりムPH8.5に℃で再懞濁させ
た。無氎酢酞1.25mlをスラリヌに加えそし
お30分間混合し぀぀℃で反応させた。暹脂を
の0.5モルNaCl、の蒞留氎および
の0.15モル燐酞ナトリりムPH7.1で完党に
掗぀た。最終暹脂をaca 独立臚床アナラむザ
ヌテストパツクの通氎管䞭に䜍眮させるように
蚭蚈されおいる小圢カラム0.5cm×cm䞭
にスラリヌ状で充填させた。  二䟡抗䜓酵玠コンゞナゲヌトを䜿甚するゞゎ
キシン−BSA−セフアデツクス暹脂ずりアバ
むン−BSA−セフアデツクス暹脂の比范 同䞀条件䞋に䞡暹脂ロツトを比范した。前蚘(A)
で合成されたab′2−β−ガラクトシダヌれ
200Όのバツフアヌ䞭2.6ピコモルを皮々の量
のゞゎキシン0.51.53.5および5.0ng
mlを含有する正垞人血枅暙準液200Όに加え
た。10分間の25℃における培逊時間の埌、党抗䜓
−詊料混合物を自動的にaca 独立臚床アナラむ
ザヌテストパツクに泚入し、そしおパツク通氎管
䞭のカラムを通しお溶出させた。詊料に぀づいお
mlの0.15モル燐酞ナトリりムPH7.8を流した。
カラム流速は34Ό秒であ぀た。次いで針䜍眮
カラムバむパスにおいおパツクに曎に2.6
mlの氎を充填した。ONPGは玄3.5分埌にブレヌ
カヌミキサヌから攟出された。酵玠掻性は
405nmで、基質添加埌29および46秒で枬定され
た。 第図および衚によりバツクグラりンドおよ
び傟斜感床第図および粟床衚に関し
お぀の至適化させたゞゎキシン−BSA−セフ
アデツクスおよびりアバむン−BSA−セフアデ
ツクス暹脂の性胜を比范する。 䞡暹脂ロツトはab′2−β−ガラクトシダヌ
れコンゞナゲヌトに関しお盎線状薬量感応を可胜
にするが、りアバむン−暹脂はより䜎いバツクグ
ラりンド32䜎いおよびより倧きな傟斜感床
47倧きいの䞡方を瀺した。より䜎いバツク
グラりンドおよびより高い傟斜感床はより良奜な
怜定性胜および粟床にず぀お奜たしいものであ
る。曎に怜定粟床はゞゎキシン暹脂に察するより
もりアバむン暹脂に察しお顕著でより良奜であ぀
た衚。個々のパツク怜定は前蚘ず党く同様
にしお぀のゞゎキシン濃床、0.5ngmlおよび
1.5ngmlで実斜された。各薬剀濃床に察しお少
くずも12のパツクが操䜜された。そしお平均倀
、暙準偏差S.D.および倉動係数
C.V.が枬定された。
【衚】 ラム ラム

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  (a) モル過剰の暙識䞀䟡たたは二䟡抗ゞゎキ
    シン抗䜓をテスト詊料に接觊させるこずによ぀
    お反応混合物を生成させ、それによ぀お前蚘抗
    䜓の䞀分画がゞゎキシンずコンプレツクスを圢
    成しそしお䞀分画が遊離状態に留たり、 (b) この反応混合物を遊離抗䜓の党郚を結合しう
    る量で存圚する、その䞊で䞍動化させたりアバ
    むンを有する固䜓盞ず接觊させ、それにより遊
    離抗䜓をこの固䜓盞䞊に結合させ、そしお (c) 暙識掻性を枬定するこずによ぀お固䜓盞から
    溶出したコンプレツクスの量を枬定する こずからなるテスト詊料䞭のゞゎキシンを枬定す
    るための非拮抗的免疫定量法。  暙識が酵玠、攟射性同䜍元玠、発色団たたは
    螢光発生団である前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の免疫定量法。  䞀䟡抗䜓がFabフラグメントたたはFab′フラ
    グメントである前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    免疫定量法。  二䟡抗䜓がab′2フラグメントである前蚘
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞がビヌズ化アガロヌス、ビヌズ化デキ
    ストラン、ポリアクリルアミドたたはガラスであ
    る前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞をカラム䞭に充填させる、前蚘特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞がビヌズ化デキストランであり、䞀䟡
    抗䜓がFab′フラグメントであり、そしお暙識が
    β−ガラクトシダヌれである前蚘特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞がビヌズ化デキストランであり、二䟡
    抗䜓がab′2フラグメントでありそしお暙識が
    β−ガラクトシダヌれである前蚘特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の免疫定量法。  (c)の枬定段階が溶出β−ガラクトシダヌれ暙
    識Fab′抗ゞゎキシン抗䜓ゞゎキシンコンプレ
    ツクスを−ニトロプニル−β−−ガラクト
    ピラノシドず接觊させるこずにより実斜される、
    前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量法。  (c)の枬定段階が溶出β−ガラクトシダヌれ
    暙識ab′2抗ゞゎキシン抗䜓ゞゎキシンコン
    プレツクスを−ニトロプニル−β−−ガラ
    クトピラノシドず接觊させるこずにより実斜され
    る、前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量
    法。  (a) ゞゎキシンを含有する疑いのある詊料
    を固䜓盞䞊に䞍動化させたモル過剰のりアバむ
    ンず接觊させるこずにより反応混合物を生成さ
    せ、 (b) この反応混合物をゞゎキシンに察しお免疫化
    孊的に過剰の、䜆しりアバむンに察しおは免疫
    化孊的に䞍足の暙識䞀䟡たたは二䟡抗ゞゎキシ
    ン抗䜓ず接觊させ、 (c) 反応を行わせお抗䜓の䞀分画がゞゎキシンず
    第䞀コンプレツクスを圢成し、そしお第二の分
    画が䞍動化りアバむンずコンプレツクスを圢成
    するようにするこず、 (d) 第二分画から第䞀分画を分離し、そしお (e) 第䞀分画たたは第二分画のいずれか䞀぀に存
    圚する暙識量を枬定する こずからなる䞀連の段階を包含するテスト詊料䞭
    のゞゎキシンを枬定するための、拮抗的免疫定量
    法。  暙識が酵玠、攟射性同䜍元玠、発色団たた
    は螢光発生団である前蚘特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の免疫定量法。  䞀䟡抗䜓がFabフラグメントたたはFab′フ
    ラグメントである前蚘特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の免疫定量法。  二䟡抗䜓がab′2フラグメントである前
    蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞がビヌズ化アガロヌス、ビヌズ化デ
    キストラン、ポリアクリルアミドたたはガラスで
    ある前蚘特蚱請求の範囲第項蚘茉の免疫定量
    法。  固䜓盞がビヌズ化デキストランであり、䞀
    䟡抗䜓がFab′フラグメントであり、そしお暙識
    がβ−ガラクトシダヌれである前蚘特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の免疫定量法。  固䜓盞がビヌズ化デキストランであり、䞀
    䟡抗䜓がab′2フラグメントでありそしお暙識
    がβ−ガラクトシダヌれである前蚘特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の免疫定量法。  (e)の枬定段階が枬定すべき分画を−ニト
    ロプニル−β−−ガラクトピラノシドず接觊
    させるこずにより実斜される、前蚘特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の免疫定量法。  (e)の枬定段階が枬定すべき分画を−ニト
    ロプニル−β−−ガラクトピラノシドず接觊
    させるこずにより実斜される、前蚘特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の免疫定量法。
JP20570484A 1983-10-03 1984-10-02 䞍均質系ゞゎキシン免疫定量法 Granted JPS60105965A (ja)

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