JPS59192960A - 免疫学的診断試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は診断に肩用な試薬およびその製造方法に関する
。　　′ 人間および動物の病理状態あるいは他の状態の診断は、
しばしば免疫学的原理の適用によシ達成される。これら
の原理は被検者の体液中の抗体または抗原の存在を決定
するのに用いられる。抗原は、それが被検者に導入され
たとき、抗体と称されるある種の可溶性物質を生成させ
る異種物質である。被検者中シて普通存在しない何らか
の異種物質、例えば蛋白質は適当な条件下でそれが被検
者中に導入されると抗体が生成されうる。

抗体は、その産生の後、抗原と反応し、それＶＣよって
微生物性またけウィルス性の侵入物の場合には感染から
保護する。

免疫学的試験方法は通常不溶化あるいは凝集により顕現
される抗原−抗体反応に基づくものである。

一般に、抗原またけ抗体の存在は、対応する抗体または
抗原を被検者の体液、通常は尿、血清あるいは特別に処
理した１（ｎ液抽出物〔勿論、他の体液も寸だ使用可能
である〕と接触させることにょシ確認しまだは診断され
る。被検者中の抗体寸だは抗原の存在は、不溶性の抗原
−抗体複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ　）が生成すれば認めら
れる。

いくつかの複合体は非常にゆっくり生成し、そして非常
に小さな粒径を翁するから、視覚的にそれらを識別する
ことができるようにするために担体を用いることが必を
である。従来使用されていた担体には、ヒツジおよびヒ
トの赤血球、細菌の細胞、ベントナイＩ・、ラテックス
粒子、例えば示すスチレン、アニオン性フェノール樹脂
および粉砕されたジアゾ化アミノセルロースがある。

血清学的に決定可能な物質を物理的に結合する公知の担
体は、それらが多数の欠点を治しているために、それら
の名月性および免Ｉ）″学的診はブ１法における有用性
が制限されている。重要な欠点の甲には、多くの例にお
ける感度の不足と多くの場合の安定性の乏しさとがある
。これらの欠点は主としてラテックス粒子が血清学的に
反応性の物質で物理的に被覆されている場合に、遊離の
物質と会合した物質との間に乎衡が存在するという事実
によるものである。この結果対応する抗／ｉｉ′１．ま
た（ｄ抗体に対して、遊六１１の抗体または抗原とラテ
ックスに結合した抗体捷だは抗原との間に競争的な抑制
が起こる。さらに、多くの負に帯電した蛋白質を、加水
分解すたけ酵素分解することなく不活性なラテックス粒
子に物理的に被覆することはできない。

この処理の結果反応の％異性に不利益になり得る構造の
立体配置」二の変化が起りうる。小さなペプチドはそれ
自体これらの条件下でさえも不活性ポリマーへの物理的
被覆に役に立たず、このことは多くの免疫学的診断試験
へのこの方法の適用性を制限している。

従って、血清学的に不活性であり、広範囲の血清学的に
決定可能な物質と共に安定で、特異で且つ感度のよい診
断に有用な試薬を形成し、そして最小の時間で容易に確
かめうる視覚的な評価を乃える担体に対する要求がある
。

本発明は、公知の血清学的に決定可能な物質とアミド結
合を介して縮合（〜だｓｆｎ清学的に不活性なラテック
スポリマーの個々に分離した粒子から成る、水とはソ同
じ比重を有する水−不溶性の免疫学的診断剤に関する。

本発明はさらに、そのような試薬の製造方法に関し、そ
の方法は血清学的に　　・決定可能な物質を水溶性カル
ボソイミドの存在下に約５℃乃至約４０°Ｃの縣度でア
ミド結合を形成しうる反応基を含む血清学的に不活性な
ラテックスポリマーと反応させることを特徴とする。

かかる本発明によれば、以前にはポリマーラテックス担
体に充分に物理的に付着させることができなかった多く
の血清学的に決定可能な物質、例えば、多糖類、完全な
蛋白質分子およびにプチドは、化学的方法により血清学
的に不活性なラテックスポリマー担体のある棟の基にア
ミド結合を生成して共有結合されることができるという
ことが、見出された。

本明細書において用いる「血清学的に決定可能な物質」
なる用語は、免疫学的原理の利用によりヒトおよび動物
の体液中で測定されうるような物質を諷°い、その範囲
内に、カルボソイミド縮合剤を用いてアミド結合を生成
させることにより血清学的に不活性なラテックス担体粒
子に化学的に結合させることのでさる血清学的に決定可
能な物質のすべてが包含される。

代表内口つ適当な血清学的に決定可能な物質は、単離さ
れたヒトおまひ動物の抗体、血清成分、毒、　　　　　
素、微生物性およびウィルス性成分、ホルモン、酵累、
アルカロイド、却１１１１ｉ、　ｋよひ組織抽出物、小
さな分子１．の物質例えばインツユリン、アンジオテン
シンおよびウロキナーゼ４ｑであるが、本発明において
使用するのに特に剥している特建の仕材的な物質は、ヒ
ト絨毛膜ゴナドトロピン（７勧ｍσｎｃｈｏｒｉｏ？？
、ｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　）、ヒ）・ガンマ
グロブリンおよびヒト血清アルブミンである。

血清学的に不活性なラテックスポリマー担体し′ζ結合
される上記の血清学的に決定可能な物（改の」ｉ”は通
常約０．０１重量％乃至１　！’＋、　０重搦゛９６で
ある。

しかし、なから、各々の特定のπ■消序的に決定−＋コ
Ｊ化な物質は診断試験において蝦も成功裡に用いられ。

る量で用いられ、従って各々の物′凶、（１そのｔｊ、
υ〕ｊミの要請に適している割合で担体と結合される１
、従って本発明は、診断に有効な試桑を提供するの（ｈ
ニー’１分な句の血清学的に決定［ｌｌ能な物ｙｅｔ全
１ｉｎ　ｉｌ＾学的ｌ′（不活性なラテックスポリマー
担体とポ目台わせて便用することをその１絶囲内（で包
含するものである。

本明細書において用いるｌ−■／＋ｒ学的に不活性なラ
テックスポリマー」寸たは「血清学的に不活性なラテッ
クスポリマー担体粒子」には、水−不活性であり、そし
て約０．０１ミクロン乃至約０９ミクロンの範囲の粒径
および７１（の比重に近い比重を有し、かくして血清学
的に決定可能な物質とのカンシリングの後に、粒子の比
重は約１．０であシ、それらを永久的に水性懸濁液の状
態に保っておくことができるラテックスポリマーが含ま
れる；粒子は免疫学的診断試験に関して不活性でなけれ
ばならず、それらはまた十分な表面電荷密度を持たなけ
ればならず、従って血清学的に決定可能な物質とカップ
リングしたとき、それらの反撥力は醗集を妨げるのに十
分でなければならず、そして粒子は第−Ｍ／、−ｔたは
第二級アミン基およびカルボキシル基との縮合により血
清学的に決定可能な物質とアミド結合を生成することの
できる活性な基を持たなければならない。しかして、ポ
リマー担体はカルがキシル基、アミン基もしくはそれら
に変り得る基またはこれらの基の任意の組合わせのいず
れかを持つことができる。ポリーマー担体上の代表的な
適当な基は活性水素を含む基、例えば、−ＣＯＯＥ、−
ＣＯＮｌｌｌ、ニトリル基、第二級アミン基、第一級ア
ミン基またはそれらの任意の組合わせである。

アミド結合を形成する化学反応は、本発明に従えば、水
溶性のカルボソイミド縮合剤の存在下に実施される。カ
ルボジイミドによる血清学的に法定可能な物質とのカッ
プリングの程度はポリマー中の反応性基の密度に依存す
る。反応性基の密度は、診断試験において有用である十
分な童の血ｔｎ学的に決定可能な物質のカップリングを
提供するのに十分な量の反応性基が存在する限り本発明
の操作可能性には臨界的ではない。

代表的な適当な担体粒子は、通常約４０％乃至約６０％
の固体濃度の水性ラテックス懸濁液として市販されてり
るものである。多くの型のラテックスポリマーは、それ
らが上述の基準に合致していれば、本発明において使用
するのに適している。

代表的な適当なラテックスポリマーはカルボキシル化ア
クリロニトリル系ポリマー、カルボキシル化ポリスチレ
ン、アミノ基をもつカルボキシル化ポリスチレン、アク
リル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニト
リル−ブタツエン−スチレン、ポリ酢酸ビニルアクリレ
ート、ポリビニルピリソン、塩化ビニル−アクリレート
等である。本発明において使用するのに適しているいく
つかの市販のラテックスは、アムスコ・レス（Ａｒｎ、
ｓｃｏ　Ｒｅｓ　）　　４１５０　、　　アムスコ・レ
ス３０１１（アメリカン・ミネラル・スピリツノ・カン
ノソニイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｉｎｅｒａｌ　５ｐｉ
ｒｉｔｓｃｏ、）］；ダウ・ラテックス（１）ｏｗ　Ｌ
ａｔｅｘ　）８１５゜ダウ・ラテックス６２０．ダウ・
ラテックスｇｓ９［ザ・ダウ・ケミカル械カン／々ニー
（ｔｈｅ　Ｄｏｗ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　：
］　Ｈノーイカ−（Ｈｙｃａｒ）　１５１２　＋　”イ
カ−１３７７Ｘ８゜ハイカー２．６００Ｘ１２０（グツ
ドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ　
ＣｈｅｍｉｃａＬ　Ｃｏ、）〕；グルグア（Ｇｅｌｖａ
）　９００　、ライトｏ　／（Ｌｙｔｒｏｎ）６１２、
ライトロン６２４〔モノサンド（Ａイｏｎｓａ−ｎｔｏ
）〕；ｏグレツク、ｔ、　（Ｒｈｏｐｌｅｘ　）　Ｌ　
Ｃ４０３２１６、アンバーライト・ウルトラファイン（
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　Ｕｌｔｒｃｔｆｉｎｅ　）　（Ｏ
−＃Ａ　−７７トーハース（Ｒｏｈｒｎ　ａｎｄ　ｌ１
ａａｓ　）　）がある。

本発明に従えば、血清学的に決定可能な物質は、縮合剤
として水浴性の式 ％式％ 〔式中、Ｒは環中に５乃至６個の炭素原子をもつシクロ
アルキル；２乃至１２個の炭素原子をもつアルキル、例
えばエチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル
、５ｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ア
ミル、ヘキシノペへブチル、オクチノヘ　ノニル、デシ
ル、ウンデシルおよびドデシル；モノアリール置換低級
アルキル基、例えばベンジル、α−およびβ−フェニル
エチル；モノアリール基、例えばフェニル；モルホリノ
；ピペリツル；低級アルキル埴侠モルホリニル基、例え
はエナルモルホリニル；低級アルキル置換ビｄ　ＩＪジ
ル基、例えばエチルピペリツル；ジー低級アルキルアミ
ノ低級アルキル基；低級アルキル償換ヒリソル基、例え
ばα、βおよびγメチルまたはエチルビリツルでめるＪ によシ表わされるモノカルｙｌ？ソイミド、それらの酸
付加塩及び第四級アミンを用いることにより担体の個々
に分離した粒子に共有結合的にカンプリングされる。

カルボソイミドはＥ、　Ｓｃｈ、ｍ１ａｔ、　Ｆ、　ｌ
１ｉｔｚｌｅｒおよびＥ、　Ｌａｈｄｅ、　ＢＣｒ、、
　７１　＋　　１９３３（１９３８）の一般的方法に従
って、対応するチオ尿素からアセトン中での酸化水銀（
ＩＩ）での酸化により製造される。チオ尿素は対応する
アミンから、対称チオ尿素の場合には二睨化炭素との反
応により製造される。非対称チオ尿素はアミンとインチ
オシアネートにより製造することができる。

カルボソイミドはまた対応する尿素から製造し？ける。

上述のように、水溶性カルボソイミドＩｔ：　、□Ｅ　
％明において使用するのに最も適している。カルボソイ
ミドが末端アミン基ヲ何する場合、ハロケ゛ン化水素酸
、例えばｔｉｃ　ｌ　、　ＩＨＪｒ　ｉたはＩｌｌ、硫
酸、スルホン酸、硝酸、リン酸およびホスホン酸トの酸
付加塩を生成させることにより水溶性にすることができ
る：まだ第四級アミン基は一適当な第四級化剤、例えは
メブールＩンレート、臭化メチル、ヨウ化メチル、臭化
ベンツル、ヨウ化エチル、臭化エチル、ヨウ化ベンツル
、エチルトシレー）、ｉ酸メチル、硫酸エチル等で第四
級化することにより水浴性にすることができる。

前記のすべては本発明の実流に有用な縮合剤として適当
である化合物の例である。

血ｍ学的に決定可能な物質および担体け、本発明に従え
ば、好捷しくは室温（約２０°Ｃ乃至約２５°Ｃ）にて
水性媒質中で反応せしめられる。しかしながら、反応に
は約ｃ、　＋１．’：乃至約４０°Ｃの湿度が通してい
る。」ｍ清学的に決定ｂ］能な物質の担体への化学的カ
ップリングを確実にするために、十分なｈｌの縮合剤を
用いて、第１」用ｏＪ貨なアミド結合のすべてが形成さ
れるのを保証する。一般ＩＣ１拉子の重量を基準にして
約０．０５重量％乃至約２０重量％の水溶性カルボソイ
ミドが適当であるが、通常は約１重量％が用いられる。

ｐＨが蛋白質反応成分を変性させるようなものであって
はならないから反応のｐＢは重要である。

通常５乃至７．５のｐＨが適当である。このｐＨは、リ
ン酸緩衝液等のような適当な常用の無機緩衝系の使用に
より維持される。

反応は約５分乃至約２４時間内に完了する。一般に約４
乃至５時間で十分である 生じる生成物は　用いる判定の系および血清学的に決定
可能な物−質の安定性の要求に依存して、約５０乃至８
５のｐ　ＨＶＣ緩衝された水性媒質中に懸濁された水−
不溶性の物質である１、生成物の比重は水とはソ同じで
・あり、その結果生成物の懸濁液は安定となるという結
果をもつ。生成物に例えば遠心分離により単離すること
ができ、そして白色の幾分チキントロピー性の粘稠な粘
土様物質である。化学的には、生成物はアミド結合によ
り血清学的に不活性な担体の側々の分離した粒子に縮合
した単層の血清学的に決定可能な物質からなる。

生成物中の血清学的に決定可能が物質は単一の活性な成
分であるか、あるいは不純物が存在しても、それらは反
応の特異性に干渉しない。

上述の基準に適合しておシそしてそれら自身が上述の基
準に適合している反応成分から生じるすべてのそのよう
な生成物は本発明により包含される。

本発明の範囲内の特定の生成物の例として、約１重量％
乃至約５重量％、通常約３重量％のカルボキシル基の密
度を有するカルボキシル化アクリロニトリル系ポリマー
にアミド結合を介して結合したヒｌ［生膜ゴナドトロピ
ン；約１重量％乃至約５重量％、通常約３亀量％のカル
ボキシル基の密度を鳴するカルボキシル化アクリロニト
リル系ポリマーにアミド結合を介して結合しているヒト
血清アルブミンが挙けられる。

一旦生成物が生じれば、それは免疫学的原理を用いる特
定の診断試験に利用することができる。

それは特定の試験に依存して任意の便利な濃度で用いる
ことができるが、約ｔ、ｏ重ｔａ％乃至約２．５重量％
の濃度が適当であり、１３重量％が好適である。し２か
して、例えば、ヒト絨毛膜ゴナドトロピンを担体わ２子
Ｗカツプリングするとき生じる生成物は、女性が妊娠し
ているかどうかを決定する診断試薬として用いることが
できる。このことは、例えば、渭浄なスライド上に１商
の試験尿ｆ：際き、ｌ簡の抗ヒト絨毛膜ゴナドトロピン
血清を混合し、次いで水性懸１−ＩＥ中に１　ｆ（４ｉ
のＩＩ　ＣＵ−相体生成物を加えることにより達成され
る。２分以内に試１験の結果が観察され、約９０〜９８
％の精度である。

そのような試験の利点はその簡モさ、迅速さ、重苦性、
正確さ」♂よび偽陽性のないことである。

これは非特異性層形成（１ａｙｅｒ♂ｎｇ）によシ生ず
る他の蛋白質による干渉が何らないからである。

もう１つの例として、ガンマグロブリンをＭ体粒子にカ
ッブリングさせたときンこ生じる生成物は、患者が変形
関節炎をもつかどうかを決定する診断試薬として用いる
ことができる。これは例えば、スライド−ヒに緩衝され
た試駆■ｌ清を置きそして１、箇のガンマグロブリン−
担体試薬を水性＠濁液中に混合することにより達成する
ことができる。１分り内て試験結果が観察されそして約
８０″Ａの精凰である。

免疫学的試験方法に・１月な試薬物質は商業的目的のた
めに包装するのが伊オリであり、例えば、−万の容Ｊ＞
ｊ　ＩＣは適当な抗廂７かを含み、能力の容器Ｊ／（１
はゴ１１濱学的Ｖ・−４・７占性な担本（て−ｆｉ　ド
、１，１・せケ介し、−Ｃ結合している血清学的に決定
可能な物質を水性懸濁液中に含む２個の別々の容器を含
む診断試薬キットにすることができる。アミド結合を介
して血清学的に不活性な担体に結合（〜でいる血清学的
に決定可能な物質の水性！靴濁液の濃度は任意の適当な
濃度とすることができる。しかしながら、約１．０重量
％乃至約２５重量％が好：！である、。

次の実施例は本発明をさらに説明するものである。

実施例１ コーン・フラクション（Ｃｏｈｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　
）　Ｉｔを蒸留水で１％溶液になるまで希釈することに
より変性したガンマグロブリンを製造する。得られる懸
濁液を室温で一晩放傷゛シ１．り′いて１　Ｆｌ、　０
００γｐＷで３０分間遠心分子、する。上市液を汗き゛
出し、ワット−ｙ　７　（Ｗｈ、ａ　ｔｒｎａ、＝＋、
　）　１Ｖｉ０．１の詭鍛全通してｒボする。

カルボキシル化アクリロニトリル系ポリマーラテックス
であるハイカー・ラテックス１５７１の１：１０水懸濁
液２０ｙｄを上記の如くして製造した変性した１％のガ
ンマグロブリン２０−と混合スル。１−シクロへキシル
−５−（２−モルホリニル−（４）−エチルクーカルボ
ソイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートの１％水裕液
１０　ｖ、Ｉ；　ｋ　次イで加える１反応混合物を５６
°Ｃの水浴中で１０分間熱する。生じる懸濁液を１５，
０００　ｒｐｔｎ、で１時間遠心分離する。上澄液を注
ぎ出し、残渣をｐ　１１８．２の０．１　Ｍグリ７ンー
食塩緩衝液５０ｍｆ！中に再び懸濁させる。懸濁液を再
び遠心分離し、残渣すなわち０．０１〜１九のガンマグ
ロブリンヲ含み且つ約０．０９μの平均粒径および１．
０１の比重をもつ白い粘土様の物質の粒子を回収する。

ガンマグロブリン−担体粒子をｐ　Ｅ　８．２の０．１
Ｍグリシン−食塩水緩衝液中に懸濁し、次のようにして
変形関節炎の免疫学的診断試験に用いる：５０ラムダ（
Ｌαｍｂｄα）の試験血清を清浄なスライド上に移す。

ｐＨ８，２の０．１Ｍグリシン−食塩水緩衝液１尚を加
え、木製の塗布棒で混合する。

製造した試薬２滴を加え、次いで試薬を再ひ混合する。

スライドを前後に静かに１分間傾むける。

試験の結果を次いで観察する。スライド上の凝集反応は
りウマトイド因子を含む血清の存在を示し、非凝集反応
は血清がリウマトイド因子を含１ないことを示す。

ヤフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　約０．０１〜約０．９ミクロンの粒径を有し且つ
   カルボキシル化アクリロニトリル系ポリマー、カルボキ
   シル化ポリスチレン、アミン基をもつカルボキシル化ポ
   リスチレン、アクリル酸ポリマー及びメタクリル酸ポリ
   マーよりなる群から選ばれ、そしてヒト絨毛膜ゴナドト
   ロピン、ヒト血清アルブミン及び変性ガンマグロブリン
   がら選ばれる血清学的に決定可能な物質がアミド結合を
   介して縮合している血清学的に不活性なラテックスポリ
   マーの個々に分離した粒子から成ることを特徴とする、
   人体の外部で用いるだめの水とほぼ同じ比重を有する水
   −不溶性の免疫学的診断試薬。 λ　ヒト絨毛）臭ゴナドトロピン、ヒト血清アルブミン
   及び変性ガンマグロブリンから選ばれる血清学的に決定
   可能な物質を、水溶性カルボソイミドの存在下に、約５
   ℃乃至約４０℃の温度において、約０，０１〜約０．９
   ミクロンの粒径を有しかつカルボキシル化アクリロニト
   リル系ポリマー、カルがキシル化ポリスチレン、アミノ
   基をもつカルがキシル化ポリスチレン、アクリル酸ポリ
   マー及びメタクリル酸ポリマーよりなる群から選ばれ、
   そしてアミド結合を形成し得る反応性基を含有する血清
   学的に不活性なラテックスポリマーと反応させることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の水−不溶性の免
   疫学的診断試薬の製造方法。