JPH11276200A - ウイルス凝集検査薬およびウイルス検査用キット - Google Patents
ウイルス凝集検査薬およびウイルス検査用キットInfo
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Abstract
感度良く検出することのできるウイルス凝集検査薬を提
供する。 【解決手段】 微小固体担体の表面に、ウイルス表層の
蛋白質に親和性のある分子を固定させたウイルス凝集検
査薬である。本発明の検査薬は、特にエイズウイルスま
たはC型肝炎ウイルスの検出に好適に用いられる。
Description
液中に形成された抗ウイルス抗体を介さずに血液中のウ
イルスを直接、感度良く検出することのできるウイルス
凝集検査薬および該検査薬を含むウイルス検査用キット
に関するものである。本発明のウイルス凝集検査薬は、
特に非A非B型肝炎の主な原因となるC型肝炎ウイルス
(HCV)や、後天性免疫不全症候群(エイズ)ウイル
ス(HIV)の検出に有用である。
の治療法が問題となっている上記C型肝炎やエイズは、
ウイルスそのものの変異が激しく、長年の間その実体が
不明であったこともあり、二次感染が多発し感染者の増
加を有効に防止することができていなかった。しかしな
がら近年における遺伝子解析技術の著しい発展により、
これらウイルスの一次構造が次々と解明されるに至っ
て、その検出法がようやく確立され、二次感染の増大に
も歯止めがかかる様になった。即ち、上述したいずれの
ウイルスにおいても、変異の激しい表層の蛋白質に比べ
て核蛋白質は一次構造をよく保っていることが分かり、
更に遺伝子工学技術の発展によってこれら蛋白質の大量
生産が可能になったことから、表層の蛋白質に加えて核
蛋白質を抗原として用い、患者の血清中に形成された抗
ウイルス抗体を検出する方法が開発され、現在、日常検
査法として普及している。
ス感染者の体内に、ウイルスが感染してから抗体ができ
るまでの期間、少なくとも2〜3カ月間は、感染の有無
を判定することができず、二次感染を有効に防ぐことが
できないという問題を持つだけでなく、膠原病などの自
己免疫疾患の場合、偽陽性が現れやすく診断がつきにく
いのが現状である。また、特にHIVにおいては、母子
感染の場合、子供は親から受け継いだ抗体を持っている
ために、このような抗体検査だけでは、感染しているか
どうかの正確な判断が得られないという問題も残る。そ
こで、従来の患者血清中の抗ウイルス抗体を検出する診
断法に代わって、ウイルスそのものを直接検出できる新
規な方法を提供することが切望されている。
目してなされたものであって、その目的は、患者血清中
に生成される抗ウイルス抗体を検出する従来の抗体検査
法に代わって、抗体を介さずに直接、短時間で感度良く
血清中のウイルスを検出することのできる新規なウイル
ス凝集検査薬を提供することにある。
のできた本発明のウイルス凝集検査薬とは、微小固体担
体の表面に、ウイルス表層の蛋白質に親和性のある分子
を固定させたものであるところに要旨を有するものであ
る。
ことのできる好ましいウイルスは、エイズウイルスおよ
びC型肝炎ウイルスである。本発明に用いられるウイル
スの外套蛋白質に親和性のある分子としては、抗体等の
蛋白質、またはペプチドが推奨される。
上述したウイルス凝集検査薬および陽性対照試薬を含ん
でなるところに要旨を有するものである。このキットに
は、更に陰性対照試薬を含むことが好ましい。
は、微小固体担体の表面に、ウイルス表層の蛋白質の一
部または全部を固定させたものであり、一方、陰性対照
試薬として好ましいのは、ウイルス表層の蛋白質の一部
または全部を含有するものである。
に代わって、血清中のウイルスを直接検出することので
きる新規な検査薬について鋭意検討したところ、感染者
の血液中に存在するウイルス表層の蛋白質を介して、こ
の領域に親和性のある分子で標識された担体が凝集する
ことによって、該ウイルスを直接、短時間で感度良く検
出することができることを見出し、本発明を完成したの
である。従って、本発明においては、表層の蛋白質を有
するウイルスであって、その表層の蛋白質に親和性を有
する分子が存在し、且つ該分子が固定される担体が存在
するものであれば全て本発明の範囲内に包含される。上
述した様に本発明のウイルス凝集検査薬は、微小固体担
体の表面に、ウイルスの外套蛋白質に親和性のある分子
を固定させた点に特徴を有するものである。尚、以下の
記載では便宜上、上述した親和性のある分子を固定して
いない微小固体担体を未標識担体と呼び、これに対して
ウイルス表層の蛋白質に親和性分子を固定した担体(本
発明担体)を分子標識担体と呼ぶ場合がある。
ある分子とは、表層の蛋白質を認識して電気化学的また
は化学的に結合することのできる分子を意味し、その様
な分子としては、例えばポリクローナル/モノクローナ
ル抗体、CD4(HIVにおいては、リンパ球のバイン
ディングサイトとして知られている)等の可溶性蛋白
質、ポリペプチド等が挙げられる。尚、本発明で対象と
なるウイルスの様に変異が激しく抗体の作製が困難であ
ったものについては、特定領域のペプチドのみを抗原に
用いて抗体を効率よく作製する方法がTamらによって提
案されており、本発明においてもその適用が可能である
(James P. Tam. In Synthetic Peptide:Approaches to
Biological Problems, ed. J. P. Tam and E. T. Kais
er, Multiple antigen peptide systems: A model desi
gn for synthetic peptide vaccine and immunoassay,
pages 3-18, 1989, Alan R. Liss, Inc.)。
ては、ラテックス、ゼラチン、ポリスチレン、金コロイ
ド等、通常の凝集法に用いられる球状担体であれば特に
限定されない。これら担体のサイズは、0.3nm〜2
0μmの範囲内であれば任意のサイズを使用することが
可能であり、凝集判定方法によって好適なサイズを適宜
選択し得る。例えば凝集の有無を肉眼で判定する場合に
は、肉眼で容易に観察することのできる0.2〜3μm
のサイズを用いることが好ましく、一方、分光学的手法
を用いて凝集の有無を判定する場合には0.2μm以下
でも構わない。また、これらの担体は何色に着色されて
いても良く、どの判定方法を選択するかによって適宜決
定されることが好ましい。
血清等の溶液中に予め分散させておいても良いし、ある
いは凍結乾燥品を、用時、適当な溶媒(例えば精製水や
緩衝液等)を加えて溶解しても良い。
薬を含有するキットを用いて、ウイルスを検出する方法
について説明する。本発明のウイルス検査用キットに
は、上記ウイルス凝集検査薬の他に、陽性対照試薬、お
よび必要に応じて陰性対照試薬が含まれる。
体検査法の場合と同様、標的ウイルスを有する患者血清
に加熱処理や化学処理等を施して非感染性状態とし、し
かも判定可能な状態にしたものを用いることもできる
が、本発明者らの研究によれば、未標識担体の表面に、
ウイルス表層の蛋白質の一部または全部を固定した、い
わゆる偽ウイルスモデルの使用が、より効果的であるこ
とが分かった。即ち、検査時における取扱い上の安全性
や陽性対照としての品質確保等を考慮すれば、後者の偽
ウイルスモデルを使用することが推奨される。
しては、標的ウイルスを含まない健常者の血清、緩衝
液、塩類含有水溶液、ウイルスの外套蛋白質を含有する
もの等が挙げられる。これらのうち、本発明キットにお
ける陰性対照としての品質確保といった観点からすれ
ば、表層の蛋白質の一部または全部を含有するものを使
用することが同様の趣旨で推奨され、具体的には、精製
水や緩衝液、血清等の溶液中に予め分散させておいても
良いし、あるいは凍結乾燥品を、用時、適当な溶媒(例
えば精製水や緩衝液等)を加えて溶解しても良い。
して、HIV検査用キットの一例を挙げ、その使用方法
を説明する。 [HIV検査用キット] 構成品目: 抗gp120−分子標識Latex試薬、2ml 陽性対象[偽HIV;gp120標識−金コロイ
ド]、500μl 陰性対象[gp120]、500μl 凝集板、20枚 検体希釈液、50ml
してから使用する。また添加前には、泡立てない様に混
和し、均一な懸濁状態にしておく。 2.凝集板のサークル内に、上記分子標識Latex試
薬を20μl加える。 3.その上に、検体あるいは陽性対照/陰性対照をそれ
ぞれ20μlずつ加え、マイクロピペットの先端で均一
に混和する。 4.凝集板を手に持って、1〜2分間ローリング混和す
る。 5.陽性対照試薬については、凝集像がはっきりと認め
られると共に、陰性対照については凝集像が認められな
いことを確認する。
を更に詳細に説明するが、下記実施例及び試験例は本発
明を制限するものではなく、前・後記の趣旨を逸脱しな
い範囲で変更実施することは全て本発明の技術的範囲に
包含される。
0.7μm)懸濁液に、抗gp120モノクローナル抗
体(1mg/mlのほう酸緩衝液、pH8.3)を等量
混和し、37℃で1時間反応させた。反応終了後、更に
ウシ血清アルブミン(10mg/ml)を加えてその濃
度が0.1%になる様に調整し、未反応活性基のブロッ
キング化を室温で30分間行った。その後、遠心操作を
繰り返して未反応物を除去すると共に、リン酸緩衝液
(pH7.4)に置換してHIV検査薬を得た。
ド(NanoProbe 社製)に、バキュロバイラスで発現させ
たリコンビナントgp120を反応させて標識したもの
を調製し、陰性対照としては、該リコンビナントgp1
20をリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解したものを調
製した。
製)懸濁液に、ビオチニル化した抗NS(HCV)モノ
クローナル抗体を等量混和し、37℃で1時間反応させ
ることによりHCV検査薬を調製した。陽性対照として
はリコンビナントNSを、陰性対象としてはヒトアルブ
ミンを夫々金コロイドに標識して用いた。尚、NSとは
non structure protein の略称である。
namics社製,粒径0.2μm)懸濁液と抗gp120モ
ノクローナル抗体(1mg/ml精製水)を等量混和
し、更にトリエチルアミン(10mg/ml精製水)
を、その濃度が0.1%になる様に加え、室温で1時間
反応させることによりHIV検査薬を調製した。陽性対
照/陰性対照の調製は、製剤例1に準じて行った。
3nm)に、抗NS(HCV)モノクローナル抗体を用
いて調製したSH基導入Fab’抗体を反応させること
によりHCV検査薬を調製した。陽性/陰性対照の調製
は、製剤例2に準じて行った。
社製,粒径0.2μm)をグルタールアルデヒドで処理
した後、抗gp120モノクローナル抗体(1mg/m
lのほう酸緩衝液、pH8.3)を等量混和し、反応さ
せた。反応終了後、トリエチルアミンで未反応活性基を
ブロックしてHIV検査薬を得た。陽性対照/陰性対照
の調製は、製剤例1に準じて行った。
7μm)懸濁液に、バキュロバイラスで発現したリコン
ビナントCD4(100μg/mlのほう酸緩衝液,p
H8.3)を等量混和し、37℃で1時間反応させるこ
とによりHIV検査薬を調製した。陽性/陰性対照の調
製は、製剤例1に準じて行った。
μm)懸濁液に、抗gp120ポリペプチド溶液を等量
混和した後、37℃で1時間反応させることによりHI
V検査薬を調製した。陽性/陰性対照の調製は、製剤例
1に準じて行った。
7μm)懸濁液に、抗NS(HCV)モノクローナル抗
体液を等量混和した後、37℃で1時間反応させること
によりHCV検査薬を調製した。陽性/陰性対照の調製
は、製剤例2に準じて行った。
て、製剤例7に準じて作製したHIV検査薬の感度試験
を行った。尚、この保存株の培養上清は、既知のHIV
抗体検査薬(セロディアHIV、富士レビオ社製)では
陰性を示す。試験を実施するに当たっては、製剤例7に
記載の陽性対照では陽性を示し、陰性対照では陰性を示
すことを確認すると共に、HIV−2型であるLAV−
2には全く反応しないことを確認したうえで、この保存
株の培養上清を種々の希釈倍率で希釈し、製剤例7の検
査薬と反応させた。その結果を表1に示す。
薬を用いれば、105 の希釈倍率下においても感度良く
検出することができた。尚、HTLV−III B保存ウイ
ルス(104-5 個/ml)の希釈限界倍率は105 倍で
あり、この希釈倍率は、ウイルスが存在すると考えられ
る限界値であった。
株の培養上清(104- 5 個/ml)を、非働化したヒト
血清で10倍ずつ順次希釈した場合の感度を調べた。そ
の結果を表2に示す。
査薬を用いれば、HIVをヒト血清のみで10,000
倍希釈してもその感度に影響を及ぼすことがなく検出可
能であることが分かった。
由来の血清を用いて感度試験を行った。その結果を表3
に示す。
用いれば、C型肝炎のみを特異的に検出することができ
ることが分かった。
従来の抗体検査法に比べて、以下の様な優れた利点を有
するものである。 本発明では抗体を介さずに直接ウイルスを検出するも
のであるから、従来の抗体検査法の様に、患者の血清中
に抗体が形成されるまで(約2〜3カ月)のタイムラグ
を埋めることができ、感染後、速やかに標的ウイルスを
検出することが可能になる。 母子感染経路によって感染した子供や膠原病などの自
己免疫疾患患者等の様に、従来の抗体検査法ではウイル
スの検出が困難であった場合においても、感度良く検出
することができる。 従来の抗体検査法では検出不可能であった微量のウイ
ルスでも、感度良く検出することができる。 従来の抗体検査法では、陽性対照として標的ウイルス
を有する患者血清を用いなければならなかったのに対
し、本発明によれば、微小固体担体の表面に、ウイルス
表層の蛋白質を固定させたものを使用することができる
ので、検査側の安全性を確保するといった観点からも非
常に推奨される。
Claims (7)
- 【請求項1】 微小固体担体の表面に、ウイルス表層の
蛋白質に親和性のある分子を固定させたものであること
を特徴とするウイルス凝集検査薬。 - 【請求項2】 前記ウイルスが、エイズウイルスまたは
C型肝炎ウイルスである請求項1に記載のウイルス凝集
検査薬。 - 【請求項3】 前記親和性のある分子が、蛋白質または
ペプチドである請求項1または2に記載のウイルス凝集
検査薬。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれかに記載のウイル
ス凝集検査薬、および陽性対照試薬を含んでなることを
特徴とするウイルス検査用キット。 - 【請求項5】 更に、陰性対照試薬を含んでなる請求項
4に記載のウイルス検査用キット。 - 【請求項6】 前記陽性対照試薬が、微小固体担体の表
面に、ウイルス表層の蛋白質の一部または全部を固定さ
せたものである請求項4または5に記載のウイルス検査
用キット。 - 【請求項7】 前記陰性対照試薬が、ウイルス表層の蛋
白質の一部または全部を含有するものである請求項5ま
たは6に記載のウイルス検査用キット。
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