JPS59109862A - 凍結乾燥感作血球の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、凍結乾燥感作血球の製造法に関する。

近年、インスリン、甲状腺ホルモン、α−フェトプロテ
ィン（以下ＡＦＰと略称する）５人胎盤性性腺刺激ホル
モン（以下ｈＣＧと略称する）。

ＨＢ抗原及び抗体など尿及び体液中に分泌される微量の
生体成分を測定してその結果を臨床診断あるいは病気の
予後判定Ｃ二利用することが広く行なわれている。しか
し、これらの生体成分はいずれも微量であるため、通常
の化学分析では測定が困難であり、一般的には免疫化学
的方法、特に測定１へ度の非常に高い放射免疫測定法（
以下ＲＩＡ法と略称する）及び酵素免疫測定法（以下１
’、　Ｉ　Ａ法と略称する）によらなければならない。

しかし、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法とも操作が複雑で簡便性、
迅速性が欠けるほか、ＲＩＡ法ではアイソトープの入手
、管理および測定のための高価な設備が必要である。こ
の点、血球を担体として利用した受身血球凝集反応（以
下Ｉ）ＨＡと略称する）は特別の測定設備も必要とせず
、その上操作の簡便性、迅速性、経済性の面からも優れ
ている。しかも近年、血球の処理法、感作方法、抗原及
び抗体の精製法の改善等によ（ハＰＨＡ法の感度は著し
く向上し、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法の感度と匹敵するように
なった。

一般にＰＨＡ法で使用する感作血球は咄乳動物や鳥類か
ら採取した血球を天然のまま、あるいはゲルタールアル
デヒド、ピルビンアルデヒド、ホルムアルデヒドなど適
当な固定剤で処理した後さらにタンニン酸、ビス−ジア
ゾベンジジンなどの結合剤で処理した上、対応する抗原
又は抗体を感作して調整することが出来る。

しかしながら、液状の感作血球は冷所に置いても保存性
が悪いという欠点を有する。

感作血球は保存性を良くするために、凍結乾燥法が用い
られる。しかじ感作血球は凍結乾燥したものでもなお、
感度低下や、血球凝集像の乱れが認められ、その上凍結
乾燥感作血球量の外観ならびに溶解性にψ１ト点があっ
た。

本発明者らはかかる技術的背景の下に、鋭怠検討したと
ころ、凍結乾燥時に二ａ類、血／δアルブミンおよびア
ミノ酸、さらに糖アルコールを共存させることにより、
長期間安定で凝集像も鮮明でしかも外観ならび（二用時
の分散性の優れた凍結乾燥感作血球が得られることを見
い出し、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を
完成した。

本発明は、■二糖類、■血清アルブミンおよび■アミノ
酸を溶存させた感作血球浮遊液を凍結乾燥すること？特
徴とする凍結乾燥感作血球の製造法である。また、上記
の製造法における感作血球浮遊液にさらに拮１４アルコ
ール乞帛（］′させてもよい。

本発明方法に用いられる三糖類としては、たとえはンヨ
糖、ラクト〜ス、トレハロース、ゲンチオビオース、セ
ロビオース、マルトースなどが挙けられる。なかでも、
ヅヨ糖、ラクトースが好ましい。

本発明方法で用いられる血清アルブミンとしては、たと
えば哺乳動物に山来し、常套手段で得られた血清アルブ
ミンが使用出来る。その例としては、たとえはヒト血清
アルブミン、ウマ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン
、ヒツジ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ
血清アルブミンなどが挙けられる。なかでも、ウシ血清
アルブミンが好ましい。

本発明で用いられるアミノ酸としては、脂肪族のもの、
芳香族のもの、複素環式のもののいずれでもよい。その
例としては、たとえば脂肪族酸性アミノ酸（例、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸）。

脂肪族中性アミノ酸（例、グリンン、アラニン。

バリン、ロイヅン、イソロイシン、セリン、スレオニン
、グルタミン、アスパラギン）　、　脂肪族塩基性アミ
ノ酸Ｃ例、リジン、アルギニン）、脂肪族含硫アミノ酸
（例、ンステイン、シスチン、メチオニン）、芳香族ア
ミノ酸（例、フェニルアラニン、チロシン）、複素環式
アミノ酸（プロリン。

ヒスチジン）などが挙げられる。なかでも、グルタミン
酸、グリシンが好ましい。

これらのアミノ酸は、塩を形成したものでもよい。原塩
としてはたとえば、ナトリウム珈、カリウム塩などが挙
げられる。特に、グルタミン酸。

アスパラギン酸などの酸性アミノ酸はナトリウム又はカ
リウム塩として用いることが好ましい。またリジンなど
の塩基性アミノ酸は適当な酸で中和したのち使用するこ
とが好ましい。

本発明方法においては、感作血球浮遊液にさらに糖アル
コールを溶存させることが好ましい。該糖アルコールと
しては、たとえばヘキシット（例、マンニット、ソルビ
ット）、ペンチット（例、アラビット、キシリット）、
テトリット（例、エリトリット）などが挙げられる。な
かでも、マンニットが好ましい。

本発明の溶存させる化合物の使用量は、凍結乾燥に付さ
れる感作血球浮遊液全量ＣＩＥ作血球濃度を約４ｖ／ｖ
％とした場合〕に対し、三糖類の濃度が約１〜１５Ｚ％
、さらに好ましくは約２〜１０Ｗ／Ｖ係となる鼠、ｆｆ
ｕ渭アルブミンの濃度が約０．１〜３Ｓ％、さらに好ま
しくは約０．３〜２　Ｗ／Ｖ％となる量、アミノ酸のＣ
度が約０．１〜５　′Ｎ／Ｖ係、さらに好ましくは約０
．３〜２Ｗ／／ｖ％となる量、糖アルコールの濃度が約
１〜３０　ｖ７Ｖ％、さらに好ましくは約３〜１５　”
／ｖ％となる沿がそれぞ３几１いらＪする。上記感作血
球０度が約４Ｖ／ｖ係以外の場合ＩＡＺ、」二記の２存
させる化合物の使用量は」二記濃度と比例下る量ン用い
ることが出来る。

凍結乾燥処理は、感作血球の凍結乾燥に適している方法
１条件が採用される。該処理は、感作血球浮遊液を、た
とえば温度としては約−４０〜＋４０°Ｃで、圧力とし
ては約０．５−１０５−１ＯＸ１０で、時間としては約
２４〜７２時間で行なわれる。

かくして得られる凍結乾燥感作血球はきわめて安定で長
時間室温以」二で保存しても実質的に抗原抗体反応の作
用能は低生が認められず、カリ特異性も保たれており凝
集反応像も鮮明でありその」二美麗な粉末で外観にも優
れており、しかも用時蒸留水、生理食塩水及び各種緩衝
液に対しての分散性も優れているので用時に容易に感作
血球浮遊液を調製することが出来る。

このように、本発明の方法で得られた凍結乾燥感作血球
は、感作血球に要求される条件すなわち（１）保存安定
性、（２）凝集像の鮮明性（陰性像、陽性像）、＋３＋
凍結乾燥品の外観および（４）分散性のすべてを満足す
る優２ｔだものである。

本発明方法に用いられる感作血球浮遊液は、通常、固定
化処理しだ哺乳動物赤血球又は鳥類赤血球を血清学的活
性物質で感作した後、適当な緩衝液に浮遊させたもので
ある。

該赤血球としては、たとえばヒト、ウマ、ラン。

ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの哺乳動物赤血球やニワトリ
、ガチョウ、七面鳥などの鳥類赤血球が使用出来る。

該固定化処理は、一般に赤血球の固定に利用される固定
剤のいずれを用いてもよく、たとえばホルマリン、ピル
ビンアルデヒド、ゲルタールアルデヒドなどが用いられ
る。上記のようにして固定処理した赤血球をさらにタン
ニン酸処理して感作してもよい。このタンニン酸処理は
、自体公知の方法に準じて行なうことができ、たとえば
、固定赤血球浮遊液にタンニン酸含を液（通常的０００
１〜０．０４　Ｗ／Ｖ％程度が好ましい）を振盪下に小
量ずつ添加したのち、室温下に約０．５〜３時間時間数
置または振のすることにより、血清学的活性物質に対す
る吸着能が増強さり、た赤血球を得ることができる。

このようにして得られた赤血球に感作させる血清学的活
性物質としては、抗原、ハプテンおよび抗体などのいず
れであってもよい。たとえば免疫グロブリン、アルブミ
ン、フィブリノーゲン（フィブリンおよびそれらの分解
産物）、Ａ、ＦＰ、Ｃ反応性タンパク、β２−ミクログ
ロプリンベオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウィルス
抗原、ｈＣＧ、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンナ
トのタンパク、ホルモン、投与薬剤など、またそれらの
抗体などが挙げられる。かがる血清学的活性物質で前記
した赤血球を感作するに際しては、自体公知の感作処理
を採用することができ、赤血球と血清学的活性物質とを
水性溶媒（たとえば水。

生理食塩水、各種緩衝液など）中で接触させるのがよく
、一般に血清学的活性物質含有液と赤血球の水性溶媒浮
遊液とを混合し、静置することにより行なわれるが、所
望により攪拌もしくは振盪して接触時間を短縮するよう
にしてもよい。血清学的活性物質含有液としては、該活
性物質を含有する一血清、血漿もしくは精製活性物質含
有液などが挙げられる。とりわけ舅製した血清学的活性
物質の溶液を用いて感作処理を行なうのが好ましく、こ
の場合通常的０．００１〜１０η／ｍｌとりわけ約００
１〜２　Ｗ／ｙｎｌ稈度の活性物質を含有する溶液を、
約１〜２０％（Ｖ／Ｖ）とりわけ３−１０　％（ｖ／／
ｖ）程度の上記赤血球浮遊液に等容量添加するのがよい
。本感作処理は、一般にｐＨ約５〜８で約２０〜６０′
Ｃの温度で行なうのが好ましい。本感作処理後、所望に
より感作赤血球を水性溶媒で洗浄してもよい。かくして
得られたＩ□ｇ作赤作法血球水性溶媒たとえばｐＨ７，
４のリン酸食塩Ｍ衝液やｐＨ７のヘペス食塩緩衝液に約
２〜２０％（Ｖ／′ｖ）になるように浮遊させる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１ （１）抗ｈＣＧ免疫グロブリンの調製 精製ｈ　ＣＧ　（単位１０．０００１影輪）を完全フロ
インドアジュバントと混合し、ウサギに免疫して得た抗
ｈＣＧ血清（ウサギ）を飽和硫酸アンモニウムを添加し
塩析を行なった。８０００ｒｐｍ８０分間遠心分離し、
生じた沈殿を生理食塩水に溶解し、−晩生理食塩水で透
析して抗ｈＣＧ免疫グロブリン液を得た。

（２）抗ｈＣＧ感作血球浮遊液の調製 羊血球を常法に従ってピルビンアルデヒドで固定化し、
さらに公知の方法（ジャーナル・オブ・エギスベリメン
タル・メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第９３巻（１９５１
年）第１０７頁）でタンニン酸処理して得たタンニン酸
処理固定化羊血球乞すン酸緩４Ｎ’ｒ　液に浮遊させた
。こ八と上記抗ｈＣＧ免疫グロブリン液をリン酸緩衝液
に濃度約０．１３訪へｔ（二希釈溶解したものとを等量
混合し、５６°Ｃ２時間反応させて抗ｈＣＧを血球に感
作した。

次いで得られた抗ｈｃｏ惑作血球を生理食塩水で洗浄後
、正常ウサギ血清０．５％を含むヘベス緩衝食塩水中に
１晩放置した後、生理食塩水で洗浄し、表１記載の添加
剤含有〜ベス緩衝食塩水を用い４％（ｖ／／Ｖ）抗ｈＣ
Ｇ感作皿球浮遊敵を調製した。

（３）凍結乾燥抗ｈＣｑ感作血球の調製上記抗ｈｃＧｇ
作血球浮遊液を０．２５　ｍｌずつバイアル瓶（２ｍｌ
容量）に分注し約−３０〜−４０°Ｃで予備凍結したの
ち、真空凍結乾燥機に入れ排気して真空（ニし温度を３
０°Ｃまで徐々に上げながら、約４０時間乾燥した。つ
いで窒素ガスを充填したのち、バイアルを封栓して、凍
結乾燥抗ｈＣＧ感作血球を得た。

（４）凍結乾燥感作血球の試験 実施例１（３）で調製した各凍結乾燥品にっき３７°Ｃ
に於ける外観、ヘペス緩衝食塩水に対する分散性、感度
の安定性、血球凝集像の鮮明さを調べた。

結果は表１に示すとおりである。なお、感度の測定法は
下記の通りである。すなわち、上記凍結乾燥抗ｈＣＧ感
作血球１バイアルに対しヘペス綴衝食塩水１ｍｌを添加
し、１％抗ｈｃＧｇ作血球浮遊液を調製した。各感作血
球浮遊液０．２　ｍｌずつを半球形の底部を有する内径
約１０馴の小試験管にとり、これにｈＣＧ標準液０．１
　ｖｔｌを加え振とう混合し２時間静置後、試験管底部
に生ずる沈降像から沈降環が生ずる場合を陰性、生じな
い場合を陽性として結果を判定した。結果を第１表に示
す。

注１．外観 Ａ：美麗な粉末。

Ｂｏややあらい粉末。

Ｃｏあらい粉末。

Ｄ　かなりあらい粉末。

注２９分散性 Ａ、直ちに分散する。

Ｂ：分散しやすい。

Ｃ分散するのに時間がかかる。

Ｄ゛完全は分散しない。

注３．感度 Ａ：凍結乾燥前と比べ感度不変。

Ｂ′凍結乾燥前と比べやや感度が低下する。

Ｃ凍結乾燥前と比べかなり感度が低下する。

Ｄ、凍結乾燥前と比べ著しく感度が低下する。

注４　陰性像 Ａ：＃結乾燥前と比べ沈降環の直径不変。

Ｂ′凍結乾燥前と比べ沈降環の直径やや大。

Ｃ１凍結乾燥前と比べ沈降環の直径かなり大。

Ｄ：凍結乾燥前と比べ沈降環の直径著しく大。

上記の結果から明らかなよう（二、本発明の二糖類、血
清アルブミンおよびアミノ酸さらに糖アルコールを溶存
し凍結乾燥する方が、個々の成分の一種のみを溶存し凍
結乾燥した場合、該成分のうちの二種（すなわち、（ａ
ｌ二糖類および血清アルブミン、（ｂ）三糖類およびア
ミノ酸、（Ｃ）血清アルブミンおよびアミノ酸）を溶存
し凍結乾燥した場合および該成分のうち糖アルコールと
他の一種または二種（すなわち、（ｄ）糖アルコールお
よび三糖類。

ｔｅｌ糖アルコール、三糖類および血清アルブミン。

（ｆ）ｍアルコール、三糖類およびアミノ酸）を溶存し
凍結乾燥した場合よりも、抗ｈｃｏｇ度血球の外観、溶
解性、感度、陰性像の面で優れた安定性効果を示してい
る。

実施例２ 実施例１と同様にして得た抗ｈｃＯ感作血球浮遊液に対
して、次に示す安定剤全添加して行った安定性試験の結
果を第２表に示す。なお、試験方法は実施例１と同じで
ある。各感作血球の感度は、実施例１（二足した試験法
において、陽性反応を示す最小ｈＣＧ）５度で表わした
。

表２から明らかなごとく、苛酷安定性試験（３７°Ｃ４
週間保存）及びｌＯｏｃ、１２力月保存で、安定剤とし
てマンニット、シヨ糖、牛血清アルブミン及びグルタミ
ン酸ナトリウム（又はグリシン）を添加した場合、感度
、外観、溶解性、陰性像ともに艮好な成績であった。

（ンス下令白ｐ （１）抗ＡＦＰ免疫グロブリンの調製 ？ｆ帯血から通常の方法により得られたＡＦＰ　１６ツ
を０．５　ＭＮａ　Ｃ＋を含む０．　Ｉ　ＭＮａ　ＨＣ
Ｏ３８ｍｌに溶解し、予めＮ／１０００　ＨＣＩで洗浄
したプロムヅアン化セファａ−ス４Ｂ（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社（スエーデン）ＷＪ３ｙに加え
、５°Ｃで一夜攪拌した。反応終了後０．５ＭＮａＣ１
を含む０．１　ＭＮａＨＣＯ３テ十分洗浄し、次いでＨ
ＣＩでｐＨ８に調整した０、５Ｍエタノールアミン１０
ｍ１を添加して室温で１時間反応させた後、（１１１Ｍ
Ｎａ　ＣＩを含むｏＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）ｆ２
）　ｌ　ＭＮａ　Ｃｌを含む０．１　Ｍホウ酸Ｍ＃Ｈ（
ｐＨｓ、ｏ）および（８１０，１５ＭＮａ　Ｃｌを含む
００２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で順次洗浄しカラ
ムに充填した（　２．．２　’　Ｘ　２．５　ｃｍ　）
。３５ｍ１のヤギ抗Ａ−Ｆ　Ｐ血清を飽和硫酸アンモニ
ウム法で塩析沈殿させ、得られたγ−グロブリン画分を
上記のＡＦＰ結合セファロース４Ｂカラムに付した。０
，１５　ＭＮａ　ＣＩを含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＩ（８，０）でカラムを洗浄し、次いで０．１７Ｍグ
リンンー塩酸緩衝液（ｐＨ２，２）で溶出することによ
って抗ＡＦＰ抗体を得た。

（２）抗ＡＦＰ感作血球浮遊液の調製 ヤギ赤血球を常法に従ってゲルタールアルデヒドで固定
化し、さらにタンニン酸処理して得たタンニン酸処理固
定化ヤギ血球を３０％（Ｖ／Ｖ　）の濃度にリン酸緩衝
液中に浮遊させ、これに実施例３（１）で調製した抗Ａ
ＦＰ抗体のリン酸緩衝液溶液（０，７Ｍｆ／ｍｌ）を等
容量混合し、５６°Ｃで３時間反応させてＡＦＰをヤギ
血球に感作した。次いで得られた感作血球を生理食塩水
で洗浄し、正常ウサギ血清０．５％を含むリン酸食塩緩
衝液中で放置した後、生理食塩水で洗浄し、５％マンニ
ット。

２．５％シヨ糖、０．５％グルタミン酸ナトリウム。

０．５％牛血清アルブミンおよび０１％ＮａＮ３を含む
水溶液に１．８％（Ｖ／／Ｖ）になるように抗ＡＦＰ感
作血球を浮遊させた。

（３）凍結乾燥抗ＡＦＰ感作血球の調製実施例３（２）
で調製した抗ＡＰ’Ｐ感作血球浮遊液を０．５　ｙｒｔ
ずつバイアル瓶に分注し、実施例１（３）と同様の方法
で凍結乾燥抗Ａ　Ｆ　Ｐ感作血球を調製した。このよう
にして得た抗Ａ、ＦＰｉ作血球について、実施例１（４
）と同様の試験をＡＦＰ標準液について実施したところ
、表３に示すように、感度、外観、溶解性、陰性像とも
に良好な結果を与えた。

表３ り 実施例４ ＋１１　　抗ヒ）Ｉ’ｇＥ感作血球浮遊液の調製羊血球
を用い、常法に従って、ゲルタールアルデヒド固定乞し
、さらにタンニン酸処理して得たタンニン酸処理固定化
羊血球を１０％（Ｖ／Ｖ　）の濃度になるよう（ニリン
酸緩衝液中に浮遊させ、これに濃度０．１　”／Ｉ／ｍ
ｌの抗ヒ）ｉｇＥヤギ血清ガンマグロブリンのリン酸緩
衝液を等容量混合し、５６’０２時間反応させて抗ヒ）
ＩｇＥガンマグロブリンを羊血球に感作した。次いで得
られた感作血球を生理食塩水で洗浄し、正常ウサギ血清
０５％を含むリン酸素塩Ｍ衝液中Ｃ−放置した後生理食
塩水で洗浄し、１０％マンニット、５％ンヨ糖、１％牛
血清アルブミン、１％グルタミン酸ナトリウム及び０．
１％Ｎ　ａ　Ｎ　３を含む水溶液に４％（Ｖ／ｖ）　　
＋　’ニーなるように抗ヒ）ＩｇＥ！作血球全血球させ
た。

（２）凍結乾燥抗ヒ）ＩｇＥ［作血球 実施例４（１）で調製した抗ヒ）ＩｇＥ感作血球浮遊液
を０．５　ｍｔずつバイアル瓶（容量２ｓ＋ｔ）に分注
し、実施例１（３）と同様な方法で凍結乾燥抗ヒ１−Ｉ
（３）感度の測定 このようにして得た凍結乾燥抗ヒトＩｇＥ［作血球（二
ついてＶプレートを使用するマイクロタイター法を用い
て、ヒ）ＩｇＥの測定を行なった。

すなわち、凍結乾燥感作血球ｌバイアルに対しヘベス緩
衝食塩水１ｍｌを添加して、感作血球浮遊液を調製した
。一方ヒトＩｇＥ標準希釈液をＶプレー）ウェルに０．
０５ｉｔ分取し、リン酸緩衝液食塩水を用いて、２倍段
階希釈系列を作り、これに前記の感作血球浮遊液０゜０
５ｍ１を加えて混合、振とうし、室温で１時間静置後、
各ウェル底部の凝集像より、凝集の起っているものを陽
性とし、そうでないものを陰性として結果を判定した。

感作血球の感度は陽性反応を示す最小ヒトＩｇＥ濃度で
表わした。結果は第４表に示されたごとく、外観、溶解
性は熱論のこと、感度、陰性像とも艮好な成績を示した
。

表４

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）、■三糖類、■血清アルブミンおよび■アミノ酸
   を溶存させた感作血球浮遊液を凍結乾燥することを特徴
   とする凍結乾燥感作血球の製造法。
2. （２）、感作血球浮遊液にさらに糖アルコールを溶存さ
   せる特許請求の範囲第１項記載の製造法。