CN110283282B - 一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，以聚合物为核，在核表面的光引发剂的引发作用下，引发功能性反应单体聚合，在微球表面接枝毛刷状聚合物链，然后，将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附，后化学偶联进行固定化。与现有技术相比，本发明将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附，后化学偶联进行固定化，吸附过程操作简单，仅通过加入单一偶联剂即可获得微球表面含大量功能基团的高亮度毛刷状荧光微球，同时获得的荧光微球粒径可控，粒度分布均一，荧光亮度高，官能团含量高。

Description

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子纳米复合材料领域，具体涉及一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法。

背景技术

荧光微球是指一种载有荧光分子的功能性微球，是内部包覆或表面负载有荧光物质，并且在外界能量的刺激下激发出荧光的微球，微球尺寸一般在纳米级至微米级的范围内。由于荧光微球表面含有特殊基团，而且具有稳定的形态结构、良好的荧光特性以及较高的荧光灵敏度，借助荧光微球表面的活性官能团能与抗体进行结合可实现对待测抗原的检测，因此其在生物医学领域具有非常广泛的应用。

荧光微球的制备一般包括两大类，一是荧光物质包含在微球内部，另一种是荧光分子处于载体微球表面。其制备方法包括物理法和化学法。物理法是指载体和荧光物质仅通过简单的物理作用相结合，包括有吸附法、包埋法和自组装法三种，其中吸附法虽然制备简单，但是荧光物质的吸附量受限，而且容易渗漏不利于检测；包埋法虽然解决了物理吸附产生的部分缺点，但是也在一定范围内局限了微球的荧光强度。化学法则包括化学键合法和共聚法两种，共聚法对染料和单体都有特定的要求。目前，大多数技术获得的荧光微球都存在粒径分布较宽，荧光性能不稳定，荧光亮度不够高等缺陷。

表面带有羧基、氨基等功能基团的荧光微球具有比表面积大、表面吸附性强、反应能力强等优点，容易与蛋白质，核酸，酶等生物活性物质反应，从而可以标记生物分子进行检测。如微球表面的羧基基团可以结合生物分子中的氨基基团，从而实现快速高效的生物检测，而且微球表面羧基密度越高越利于生物检测与分析。微球表面功能基团的方法目前一般有后修饰法和一步法，后修饰法是在制备成微球后再进行官能团的修饰，该法基团修饰量可调但操作复杂，一步法是在制备微球的过程中引进官能团，该法操作简单但基团含量可调性不足。

目前，关于荧光微球亮度可控，性能稳定，粒径均一且表面官能团含量高的荧光微球制备文献报道不多，现有制备方法无法得到表面官能团含量高，粒径可控且粒度均一，荧光强度可控的荧光微球。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，表面官能团含量超高，粒径可控且粒度均一，荧光强度可控。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，以聚合物为核，在核表面的光引发剂的引发作用下，引发功能性反应单体聚合，在微球表面接枝毛刷状聚合物链，然后，将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附，后化学偶联进行固定化。

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备表面具有光引发剂的核；

(2)制备功能性毛刷状微球；

(3)将功能性毛刷状微球和荧光分子在缓冲液中均匀混合，进行物理吸附；

(4)在吸附完全的体系中加入偶联剂，完成化学偶联反应。

制得的荧光微球粒径为100nm～1000nm，且多分散指数小于0.3。

步骤(1)具体方法为：将引发剂、表面活性剂以及反应单体混合溶于水中，搅拌混合均匀并预乳化，在惰性气体氛围下，于70-90℃反应2-3小时，之后加入光引发剂，再反应1.5-2.5小时，透析纯化处理，即得表面具有光引发剂的核。

所述引发剂选自过硫酸钾、过硫酸胺、偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰或过氧化十二酰中的一种；

所述的表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、月硅酸钾、丁二酸二辛醋磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十二烷基氯化铵中的一种；

所述的反应单体选自苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯。

所述的光引发剂选自2-[对-(2-羟基-2-甲基苯丙酮)]-乙二醇-甲基丙烯酸酯(光引发剂I)、异丙基苯甲酮甲基丙烯酸酯(光引发剂II)、4-乙烯基苄基N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯(光引发剂III)，光引发剂的化学结构如下：

步骤(2)具体方法为：将表面具有光引发剂的核移入光反应器，加入功能性反应单体和纯水，在惰性气体氛围下，打开紫外灯反应1.5-2.5小时，反应结束后透析纯化，即得到功能性毛刷状微球。

所述功能性反应单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、丁烯酸、甲基丙烯酸-2-氨基乙酯盐酸盐或N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺盐酸盐的一种。

步骤(3)物理吸附具体方法为：配置缓冲液，将功能性毛刷状微球分散于缓冲液中，再加入荧光分子，室温下置于摇床上进行物理吸附2～10小时。

所述缓冲液选自2-吗啉乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种；

所述荧光分子选自萘酰亚胺类染料、荧光素类染料、氟化硼二吡咯类染料、萘类染料、香豆素类染料、蒽醌类染料或荧烷类染料中的一种。

步骤(4)化学偶联反应时间为2～20小时，所述偶联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、戊二醛或高碘酸钠溶液的一种。

本发明具体机理为，首先合成功能性毛刷状微球，以聚合物为核，在核表面的光引发剂的引发作用下，引发功能性反应单体聚合，在微球表面接枝毛刷状聚合物链，毛刷状聚合物的厚度可以由光引发剂的表面密度及功能性单体的加入量来控制；然后，将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附后化学偶联进行固定化，因为微球表面接枝的毛刷状聚合物链在溶剂中会发生电离，使高分子链上带上大量电荷，吸引带相反电荷的荧光分子进入毛刷状微球内部。吸附过程操作简单，且仅通过加入单一偶联剂即可获得微球表面含大量功能基团的高亮度毛刷状荧光微球，同时获得的荧光微球粒径可控，粒度分布均一，荧光亮度高，官能团含量高，在生物医学检测(如免疫侧向层析)等领域具有广泛的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：相比后修饰法在制备成微球后再进行官能团的修饰的复杂操作，一步法基团含量可调性不足，采用本发明制备方法，通过提供表面具有引发剂的核、功能性反应单体，混合均匀后，通过光乳液聚合法获得功能性毛刷状微球，将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附，后化学偶联进行固定化，吸附过程操作简单，仅通过加入单一偶联剂即可获得微球表面含大量功能基团的高亮度毛刷状荧光微球，同时获得的荧光微球粒径可控，粒度分布均一，荧光亮度高，官能团含量高。

附图说明

图1为具有不同链长的毛刷状微球加入相同含量的的5-氨基荧光素后荧光强度变化图；

图2为表面带有大量羧基的毛刷状微球的SEM图；

图3为功能性毛刷状荧光微球的SEM图；

图4为毛刷状荧光微球的Zeta电位图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，具体包括以下步骤：

一、表面带有光引发剂的核的制备，包括以下步骤：

(1)核的制备：引发剂过硫酸钾溶于40mL水中，表面活性剂十二烷基硫酸钠溶于40mL水中，称取8g苯乙烯，均将其转移至500mL的三口烧瓶中，加入120mL纯水，充分搅拌混合均匀并预乳化30分钟，在氮气保护下升温至80℃，在300转/分钟的搅拌速度下反应2.5小时。

(2)表面带有光引发剂的核的制备：称取4g溶于丙酮溶液的光引发剂I，缓慢加入反应瓶中，在300转/分钟的速度下反应2小时，透析进行纯化处理。

采用激光粒度仪测定不同十二烷基硫酸钠添加量制备的核粒径及其粒径分布，结果如下：添加0.18％十二烷基硫酸钠时，制备的核粒径为515nm，多分散指数为0.067；添加1.75％十二烷基硫酸钠时，制备的核粒径为95nm，多分散指数为0.044；添加1.9％十二烷基硫酸钠时，制备的核粒径为77nm，多分散指数为0.052。

二、表面带大量羧基基团的毛刷状微球的制备包括以下步骤：

毛刷状微球的制备：称取步骤(2)制备的表面带有光引发剂I的苯乙烯核乳液20g，移入光反应器中，再加入适量的反应单体丙烯酸和100mL纯水，在氮气保护下，打开紫外灯反应2小时，反应结束后透析纯化。

采用激光粒度仪测定不同功能性反应单体添加量制备的球刷粒径及其粒径分布，选用粒径为77nm的核来制备功能性毛刷状微球，结果如下：添加200％丙烯酸时制备的毛刷状微球粒径为356nm，多分散指数为0.169；添加150％丙烯酸时制备的毛刷状微球粒径为302nm，多分散指数为0.118；添加125％丙烯酸时制备的毛刷状微球粒径为267nm，多分散指数为0.109；添加100％丙烯酸时制备的毛刷状微球粒径为242nm，多分散指数为0.127；添加50％丙烯酸时制备的毛刷状微球粒径为144nm，多分散指数为0.057。

三、具有高亮度的功能性毛刷状荧光微球的制备，包括以下步骤：

(1)配置200mL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，缓冲液的pH＝5.5；

(2)取2g表面带有大量羧基基团的毛刷状微球乳液，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液至10mL，功能性毛刷状微球充分分散于缓冲液中，再加入适量5-氨基荧光素；将上述溶液混合均匀，室温下置于摇床上进行物理吸附2小时；

(3)加入偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声20秒，室温下置于摇床上反应10小时，透析纯化处理，得到羧基功能化的高亮度毛刷状荧光微球。

采用激光粒度仪测定不同厚度的毛刷状微球在均添加4％的5-氨基荧光素后制备的荧光微球的粒径及其粒径分布，结果如下：初始粒径为144nm的毛刷状微球制备的荧光微球粒径为220nm，多分散指数为0.300；初始粒径为242nm的毛刷状微球制备的荧光微球粒径为333nm，多分散指数为0.196；初始粒径为268nm的毛刷状微球制备的荧光微球粒径为414nm，多分散指数为0.178；初始粒径为303nm的毛刷状微球制备的荧光微球粒径为459nm，多分散指数为0.169；初始粒径为355nm的球刷制备的荧光微球粒径为682nm，多分散指数为0.200。

采用激光粒度仪测定球刷在添加不同含量的5-氨基荧光素后制备的球刷粒径及其粒径分布，结果如下：选用初始毛刷状微球粒径为355nm，加入0.5％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为799nm，多分散指数为0.215；加入1％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为839nm，多分散指数为0.204；加入2％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为883nm，多分散指数为0.190；加入4％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为980nm，多分散指数为0.245；加入8％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为927nm，多分散指数为0.291；加入16％的5-氨基荧光素时制备的荧光微球粒径为421nm，多分散指数为0.159。

对制得的产品进行检测，具体为：

1.采用激光粒度仪对微球粒径进行分析测试，结果表明：功能性毛刷状荧光微球的分散性好，粒径均一，且大小可控。

2.采用同步荧光法对加入相同含量5-氨基荧光素的不同接枝链长功能性毛刷状荧光微球进行荧光光谱扫描，如图1所示。结果表明：随着毛状微球接枝链长的增加，功能性毛刷状荧光微球的荧光强度增加。

3.利用扫描电子显微镜对功能性毛刷状微球的表面形貌进行了表征。结果如图2、3所示，功能性毛刷状微球的球形度良好，粒径均一。

4.采用激光粒度仪对毛刷状微球与毛刷状荧光微球的Zeta电位进行测试，结果表明：毛刷状微球与毛刷状荧光微球带负电荷，如图4所示功能性毛刷状荧光微球的Zeta电位在-50.1mv左右，表明带有羧基功能基团且具有十分良好的稳定性。

实施例2

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备表面具有光引发剂的核；

将引发剂、表面活性剂以及反应单体混合溶于水中，搅拌混合均匀并预乳化，在惰性气体氛围下，于70℃反应3小时，之后加入光引发剂，再反应2.5小时，透析纯化处理，即得表面具有光引发剂的核。

引发剂采用过硫酸胺；表面活性剂采用十二烷基硫酸钠；反应单体采用苯乙烯；光引发剂采用异丙基苯甲酮甲基丙烯酸酯。

(2)制备功能性毛刷状微球；

将表面具有光引发剂的核移入光反应器，加入功能性反应单体和纯水，在惰性气体氛围下，打开紫外灯反应1.5小时，反应结束后透析纯化，即得到功能性毛刷状微球。

功能性反应单体采用甲基丙烯酸。

(3)将功能性毛刷状微球和荧光分子在缓冲液中均匀混合，进行物理吸附；

配置缓冲液，将功能性毛刷状微球分散于缓冲液中，再加入荧光分子，室温下置于摇床上进行物理吸附4小时。

缓冲液采用2-吗啉乙磺酸缓冲液；荧光分子采用荧光素类染料。

(4)在吸附完全的体系中加入偶联剂，完成化学偶联反应。

化学偶联反应时间为2小时，偶联剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

实施例3

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备表面具有光引发剂的核；

将引发剂、表面活性剂以及反应单体混合溶于水中，搅拌混合均匀并预乳化，在惰性气体氛围下，于65℃反应2小时，之后加入光引发剂，再反应1.5小时，透析纯化处理，即得表面具有光引发剂的核。

引发剂采用偶氮二异丁脒盐酸盐；表面活性剂采用十六烷基三甲基溴化铵；反应单体采用苯乙烯；光引发剂采用4-乙烯基苄基N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯。

(2)制备功能性毛刷状微球；

将表面具有光引发剂的核移入光反应器，加入功能性反应单体和纯水，在惰性气体氛围下，打开紫外灯反应2.5小时，反应结束后透析纯化，即得到功能性毛刷状微球。

功能性反应单体采用甲基丙烯酸-2-氨基乙酯盐酸盐。

(3)将功能性毛刷状微球和荧光分子在缓冲液中均匀混合，进行物理吸附；

配置缓冲液，将功能性毛刷状微球分散于缓冲液中，再加入荧光分子，室温下置于摇床上进行物理吸附10小时。

缓冲液采用磷酸盐缓冲液；荧光分子采用萘类染料。

(4)在吸附完全的体系中加入偶联剂，完成化学偶联反应。

化学偶联反应时间为20小时，偶联剂采用戊二醛。

实施例4

一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备表面具有光引发剂的核；

将引发剂、表面活性剂以及反应单体混合溶于水中，搅拌混合均匀并预乳化，在惰性气体氛围下，于80℃反应3小时，之后加入光引发剂，再反应2小时，透析纯化处理，即得表面具有光引发剂的核。

引发剂采用过硫酸胺；表面活性剂采用十二烷基硫酸钠；反应单体采用苯乙烯；光引发剂采用异丙基苯甲酮甲基丙烯酸酯。

(2)制备功能性毛刷状微球；

将表面具有光引发剂的核移入光反应器，加入功能性反应单体和纯水，在惰性气体氛围下，打开紫外灯反应2小时，反应结束后透析纯化，即得到功能性毛刷状微球。

功能性反应单体采用丁烯酸。

(3)将功能性毛刷状微球和荧光分子在缓冲液中均匀混合，进行物理吸附；

配置缓冲液，将功能性毛刷状微球分散于缓冲液中，再加入荧光分子，室温下置于摇床上进行物理吸附8小时。

缓冲液采用2-吗啉乙磺酸缓冲液；荧光分子采用萘酰亚胺类染料。

(4)在吸附完全的体系中加入偶联剂，完成化学偶联反应。

化学偶联反应时间为10小时，偶联剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

实施例2-4制得的荧光微球也都具有分散性好，粒径均一，且大小可控的特点。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，以聚合物为核，在核表面的光引发剂的引发作用下，引发功能性反应单体聚合，在微球表面接枝毛刷状聚合物链，然后，将制备的功能性毛刷状微球与荧光分子先物理吸附，后化学偶联进行固定化；

具体包括如下步骤：

（1）制备表面具有光引发剂的核；

（2）制备功能性毛刷状微球；

（3）将功能性毛刷状微球和荧光分子在缓冲液中均匀混合，进行物理吸附；

（4）在吸附完全的体系中加入偶联剂，完成化学偶联反应；

步骤（1）具体方法为：将引发剂、表面活性剂以及反应单体混合溶于水中，搅拌混合均匀并预乳化，在惰性气体氛围下，于60-90℃反应2-3小时，之后加入光引发剂，再反应1.5-2.5小时，透析纯化处理，即得表面具有光引发剂的核；

步骤（3）物理吸附具体方法为：配置缓冲液，将功能性毛刷状微球分散于缓冲液中，再加入荧光分子，室温下置于摇床上进行物理吸附2～10小时；

步骤（4）化学偶联反应时间为2～20小时，所述偶联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、戊二醛或高碘酸钠溶液的一种。

2.根据权利要求1所述的一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自过硫酸钾、过硫酸铵、偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰、过氧化十二酰或偶氮二异丁脒盐酸盐中的一种；

所述的表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、月桂酸钾、丁二酸二辛酯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或十二烷基氯化铵中的一种；

所述的反应单体选自苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯。

3.根据权利要求1所述的一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，所述的光引发剂选自2-[对-(2-羟基-2-甲基苯丙酮)]-乙二醇-甲基丙烯酸酯、异丙基苯甲酮甲基丙烯酸酯或4-乙烯基苄基N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体方法为：将表面具有光引发剂的核移入光反应器，加入功能性反应单体和纯水，在惰性气体氛围下，打开紫外灯反应1.5-2.5小时，反应结束后透析纯化，即得到功能性毛刷状微球。

5.根据权利要求4所述的一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，所述功能性反应单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、丁烯酸中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种功能性毛刷状荧光微球的制备方法，其特征在于，所述缓冲液选自2-吗啉乙磺酸缓冲液、取代磺酸哌嗪缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸或磷酸盐缓冲液中的一种；

所述荧光分子选自萘酰亚胺类染料、荧光素类染料、氟化硼二吡咯类染料、萘类染料、香豆素类染料、蒽醌类染料或荧烷类染料中的一种。

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