JPH0374207B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、リンパ球の亜分画であるＴ細胞とＢ
細胞の分離材および分離装置ならびに分離方法に
関するもので、更に詳しくは、リン脂質またはリ
ボソームの親水性基部分に対する粘着性の差を利
用してＴ細胞とＢ細胞を分離するためのＴ細胞と
Ｂ細胞の分離材および分離装置ならびに分離方法
に関するものである。 本発明は、リンパ球の亜分画であるＴ細胞とＢ
細胞の分離に関するが、血液成分、腹水成分など
の他の体液成分の分離についても、本発明は応用
可能である。 従来技術とその問題点 リンパ球は、免疫監視機構で主役を演じている
細胞でありながら、グツド症候群のような疾病の
発生に関与するという複雑な機能を持つ細胞であ
る。したがつて、生体防御機構の解明や免疫疾患
の臨床検査、細胞間相互作用を調べる上で、リン
パ球のＴ細胞、Ｂ細胞両群や、特定機能の局在し
たリンパ球サブセツトを分離することは、重要な
課題である。 リンパ球とよばれる細胞集団の中には、種々の
点で性質の異なる、少なくとも２種類の細胞集団
の存在することがわかつている。代表的細胞集団
には、胸腺由来細胞（thymus−derived
lymphocyte）であるＴ細胞と、骨髄由来細胞
（bone marrow−derived lymphocyte）である
Ｂ細胞とがある。 このようなＴ細胞とＢ細胞の分離は、従来の方
法では、一つの方法で両細胞を完全に分離するこ
とは困難であつた。従来の末梢血からのＢ細胞、
Ｔ細胞の分離方法は、いずれもまず、Ficoll−
Paqueなどの高密度等張液を用いた比重遠心法に
より、白血球のうち70〜90％のリンパ球を含む白
血球浮遊液を獲得し、次いで、これを分離処理し
ていた。この後続する分離処理の主なものとし
て、次の六つの方法が知られている。 (1) ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を用
いたロゼツト形成法 (2) ナイロン繊維を用いたカラム法 (3) 多孔性表面を有する水不溶性かつ疏水性の固
体あるいは酸性官能基を含有する粒状疏水性固
体物質を用いた分離法 (4) フルオレツセンス・セルソーターによる分離
法 (5) 無支持担体連続電気泳動法 (6) アフイニテイクロマトグラフイー しかしながら、上記従来法には、下記のような
欠点がある。 第１の方法は、ヒツジ赤血球とリンパ球を共存
させるので、リンパ球を刺激してしまう。 第２の方法は、分離が十分にされず、また、Ｔ
細胞の回収率は必ずしもよくない。さらに、ナイ
ロンウールに粘着したＢ細胞を活きの良い状態で
溶離する適切な方法がない。 第３の方法は、Ｔ細胞の分離、回収率は良い
が、Ｂ細胞の回収率は低い。 第４の方法は、蛍光標識に抗血清を用いるため
に、細胞に刺激や損傷を与えてしまい、また、
10⁷〜10⁸個程度のリンパ球の大量取得が困難であ
る。 第５の方法は、Ｔ細胞とＢ細胞を簡便に大量分
離できる利点を有しているが、細胞の成熟度によ
つて易動度が異なり、また、細胞の機能に与える
電場の影響が解明されていない。 第６の方法は、細胞の機能変化に関して、未知
の危険性が含まれている。 さらに、第５の方法を除いた第１〜第６の方法
に共通して、処理操作が簡便でないか、あるい
は、処理時間が長いという欠点がある。 具体的公知例として、特開昭56−140886号、同
58−74611号などがあるが、いずれも上記方法の
内の一つであり、同様の問題点がある。 発明の目的 本発明は、上述した実情に鑑みてなされたもの
で、その目的とするところは、リンパ球のＴ細胞
とＢ細胞を効率よく分離でき、機能を損なうこと
なく細胞を回収でき、操作が簡便で特殊な装置を
必要とせず、さらに、臨床検査だけでなく、免疫
疾患治療、細胞培養にも適用可能な、広い応用性
を有するＴ細胞とＢ細胞の分離材および分離装置
ならびに分離方法を提供しようとするにある。 発明の具体的構成 本発明の第１の態様によれば、Ｔ細胞とＢ細胞
を分離する方法であつて、体液流路を経て互いに
連通する体液流出入口を備えた本体と、該体液流
路内に備えられた、親油性基および親水性基を有
する脂質の該親水性基部分が露出する形で支持体
に固定された分離材を有する分離装置に、Ｔ細胞
とＢ細胞を含有する体液を流し、流出するＴ細胞
を回収し、続いて溶離液を流すことにより、脂質
に粘着したＢ細胞を回収することを特徴とするＴ
細胞とＢ細胞の分離方法が提供される。 本発明の第２の態様によれば、Ｔ細胞とＢ細胞
を分離するに際して用いる分離材であつて、支持
体に、親油性基および親水性基を有する脂質が、
固定剤を介して、親水性基部分が露出する形で固
定されていることを特徴とするＴ細胞とＢ細胞の
分離材が提供される。 本発明の第３の態様によれば、Ｔ細胞とＢ細胞
を分離するに際して用いる分離装置であつて、体
液流路を経て互いに連通する体液流出入口を備え
た本体と、該体液流路内に備えられた前記の分離
材とを有することを特徴とするＴ細胞とＢ細胞の
分離装置が提供される。 以下、本発明の内容を更に詳細に説明する。 本発明は、リンパ球の亜分画であるＴ細胞とＢ
細胞を含有する体液から、Ｔ細胞とＢ細胞を分
離、回収する方法および分離材ならびに分離装置
に関するが、例えば血小板や血球等の細胞の分離
にも応用可能である。 本発明の基本的思想は、脂質の親水性基部分に
対するリンパ球の亜分画であるＴ細胞およびＢ細
胞の粘着性（度）の差を利用し、両者を分離、回
収し、診断、治療に役立てようとするものであ
る。従来より、特定の物質に対するＴ細胞とＢ細
胞の粘着性の差を利用し、両者を分離、回収する
方法は行われているが、満足いく状態でなかつた
ことは前述の通りである。 本発明においては、Ｔ細胞とＢ細胞を分離する
に際し、Ｂ細胞の粘着材として、親油性基および
親水性基を有する両親媒性の脂質を用いるのであ
るが、分離しようとする細胞が親油性基部分に接
触すると、その粘着力が強すぎ、親油性基部分か
らの細胞の剥離（溶離）が困難となり、また、剥
離したとしてもその機能を損い、後の検査等に問
題を残す。しかし、分離しようとする細胞が、上
記脂質の親水性基部分に接触するようにすれば、
Ｔ細胞は粘着しないがＢ細胞は適度な粘着力で粘
着するので、Ｔ細胞およびＢ細胞の分離がそれら
の細胞機能を損なうことなく容易に行えることを
本発明者らは見い出し、本発明に至つたものであ
る。 Ｂ細胞の粘着剤としては、脂質に限られず、脂
質を構成成分とするリポソームも利用できる。こ
れら脂質等の親水性基部分と細胞とが接触するよ
う構成した本発明の分離材または装置は、生体膜
に近似し、生体適合性に優れているため、細胞を
刺激したり、損傷したりしない上、Ｔ細胞とＢ細
胞の分離が適度な粘着力の差により十分に行な
え、さらに、粘着したＢ細胞の剥離も円滑に行わ
れる。 なお、Ｔ細胞およびＢ細胞の前記脂質に対する
粘着力には、電気的引力や物理的な結合等種々の
要因があり、これらの要因を包括して、本発明に
おいては粘着力と表現した。 はじめに、本発明の分離材および分離装置につ
いて説明する。 本発明の分離材は、脂質またはリポソームが、
その親水性基部分がＴ細胞とＢ細胞を含有する体
液と接触するように、その親水性基部分が露出す
る形で支持体または基体上に固定されたものであ
る。この分離材を適当な装置に組み込んだものが
分離装置である。 脂質またはリポソームの固定方法および固定剤
との組合せにつき、詳細に説明する。 まず第１に、リポソームをハイドロゲルにより
固定した分離材について一例を述べるが、これに
限定されることはない。 (1) リポソームをハイドロゲルにより固定した分
離材 (1‐1) リポソームの調製 ホスフアチジルコリン、ホスフアチジルエ
タノールアミン、ホスフアチジン酸、ホスフ
アチジルセリン、ホスフアチジルイノシトー
ル、ホスフアチジルグリセロール、スフイン
ゴミエリン、カルジオリピン等のリン脂質よ
り、少なくとも１種の適当なリン脂質を10〜
100mol％、リン脂質を強化する場合には、
例えばコレステロールを20〜50mol％、酸化
防止のためには、α−トコフエロール、アス
コルビルパルミテートあるいはアスコルビル
ステアレート等を0.1〜3mol％、さらに、電
荷を付与する場合には、ジセチルリン酸、ジ
アセチルリン酸あるいはステアリルリン酸等
を０〜15mol％混合し、従来既知の方法でリ
ポソームを調製する。そして、遊離の脂質を
除くために、超遠心分離を行い、沈降リポソ
ームのみを捕集する。必要ならば、ニユクリ
ボア・メンブレン等により、サイジングを行
う。リポソームの最終脂質濃度は５〜
20μmol／mlとするのがよい。 なお、リポソーム調製の際には、緩衝液と
して、PH7.2〜7.4のTyrode′s bufferあるいは
Hank′s balanced salt solutionを使用する
（以降、単にバツフアという）。 (1‐2) リポソーム／ハイドロゲルの調製 リポソームを支持体に固定するために、ハ
イドロゲルを用いる。ハイドロゲル原液の一
例を挙げると、22.5w／ｖ％アクリルアミ
ド、あるいは、7.5w／ｖ％ポリビニルアル
コール、15w／ｖ％ゼラチン、20w／ｖ％ポ
リビニルピロリドンに、必要に応じ、架橋剤
である１〜５％のメチレンビスアクリルアミ
ドを加えた溶液である。 なお、上記ハイドロゲル原液の作製にあた
り、モノマーあるいはポリマーを溶解する液
には、上記バツフアを用いるのが良い。 ハイドロゲル原液に使用しうる他のものと
して、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリ
レート）、ポリメタクリル酸、ポリ（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、
ポリエチレンオキサイド、多糖類、アルギン
酸ナトリウム、コラーゲン、フイブリンなど
がある。 リポソームとハイドロゲル原液は、１容：
２容の割合で混合するのが好ましい。 (1‐3) 支持体 リポソームをハイドロゲルで固定する支持
体としては、多孔壁を有するホローフアイバ
ーで、ポリプロピレン製、再生セルロース
製、ポリメタクリル酸メチル製、エチレン−
酢酸ビニル共重合体製などがよいが、多孔性
でないホローフアイバーでも、ハイドロゲル
の固定が適切になされる処理をすれば用いる
ことができる。また、多孔性シートなど、そ
の形態は問わない。 (1‐4) 分離材、分離装置の作製例 孔径20Å〜0.4μｍ、長さ１〜30ｍ、
porosity30〜70％の多孔性ホローフアイバー
１〜100本をコイル状に束ね、アクリル管あ
るいはガラス管に収納し、両端をエポキシ樹
脂あるいはポリウレタン樹脂で固定する。 ホローフアイバーの中空部分に、前記リポ
ソーム／ハイドロゲルを流し、10〜60分間静
置後、バツフアで洗浄し、両端をパラフイル
ム等でおおい、γ線を約3Mrad照射する。 次いで、バツフアで残存モノマーあるいは
ポリマーを洗浄すると、分離材および離装置
が得られる。 なお、架橋材としてＮ，Ｎ−メチレンビス
アクリルアミドを用いる場合は、γ線照射の
代りに、５％テトラエチルメチレンジアミン
および2.5％過硫酸カリウムを添加した後、
10〜30分間放置して重合させても良い。 次に、脂質をシランカツプリング剤により
固定した分離剤について述べるが、これに限
定されることはない。 (2) 脂質をシランカツプリング剤により固定した
分離材 (2‐1) シランカツプリング剤およびその支持体へ
の結合 シランカツプリング剤としては、オクチル
トリメトキシシラン、オクタデシルトリメト
キシシラン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタ
デシル−３−アミノプロピルトリメトキシシ
リルクロライドなどを用いることができる。 シランカツプリング剤の支持体への結合
は、例えば以下のように行う。 PH4.0に調整した１％Ｎ，Ｎ−ジメチル−
Ｎ−オクタデシル−３−アミノプロピルトリ
メトキシシリルクロライド溶液を、ガラスキ
ヤピラリー（支持体）の中空部分に入れる。
あるいは、プラスチツクカツプにガラスビー
ズ（支持体）を入れ、ここに添加する。10分
間放置後、液を捨て暫く風乾する。次に、
110℃で１時間キユアリングする。 (2‐2) 脂質およびその吸着 脂質としては、ホスフアチジルコリン、ホ
スフアチジルエタノールアミン、ホスフアチ
ジン酸、ホスフアチジルセリン、ホスフアチ
ジルイノシトール、ホスフアチジルグリセロ
ール、スフインゴミエリン、カルジオリピン
などのリン脂質を、少なくとも１種用いるの
が好適である。 例えば、ホスフアチジルコリンを35〜
100mol％、電荷を付与する場合には、ジセ
チルリン酸、ジアセチルリン酸あるいはステ
アリルアミン等を０〜15mol％混合し、クロ
ロホルム溶液とする。最終脂質濃度は、５〜
20μmol／mlとするのが良い。 この液を、上記処理を施したガラスキヤピ
ラリーの中空部分あるいはガラスビーズの入
つたプラスチツクカツプに添加する。60分間
放置後、液を捨て、蒸留水で軽く洗浄する。
次いで、12時間以上減圧乾燥し、これを分離
材として使用する。 (2‐3) 分離装置の作製例 上記処理を施した長さ１〜30ｍのガラスキ
ヤピラリー１〜100本をコイル状に束ね、両
端をエポキシ樹脂あるいはウレタン樹脂で固
定して、アクリル管またはガラス管に収納す
る。あるいは、上記処理を施したガラスビー
ズを、底面にナイロンネツトあるいはステン
レスメツシユを取り付けたアクリル製カラム
またはガラス製カラムに充填する。 発明の具体的作用 本発明の分離方法を、第１図を参照しつつ、好
適実施例に基づいて説明する。 ヘパリン加ヒト末梢血から、ソジウムメトリゾ
エート−フイコール混液（20℃で比重1.077）を
使つて比重遠心法により分離し、バツフアで洗浄
した白血球分画を、10⁶〜10⁷個／mlの濃度でバツ
フアに懸濁させる。 これを、細胞分離装置１の細胞貯溜容器２に入
れ、コツク４を調節して静かにリンパ球分離器５
に流した後、あらかじめ容離液貯溜容器３に入れ
ておいたバツフアを連続的に流す。分離器５内の
分離材６は、先に説明した分離材のいずれでも良
い。この時、流出液の濁度を、フローセルを使用
した検出装置７で測定する。 流出液分画を捕集装置９に一定量づつ捕集し、
記録装置８の記録紙上に描かれるピークから、必
要な分画（細胞）を回収する。 次に、本発明のＴ細胞とＢ細胞との分離の原理
を、分離材として、多孔性ホローフアイバー製の
支持体上にリポソームをハイドロゲルで固定した
例について説明する。 この分離材の一構成例を第２ａ図に示す。第２
ａ図に見えるように、ホローフアイバー１０の中
空部には、その多孔１４によりハイドロゲル１１
が固定され、このハイドロゲルにより○印で示す
リポソーム１２が固定されている。この時、多数
の脂質で構成されるリポソームは、脂質の親油性
基部分が内側となり、親水性基部分が外側表面に
並ぶ構造となつていて、親水性基部分がホローフ
アイバーの中空部分、すなわちＴ細胞とＢ細胞を
含有する体液の流路に露出している形となつてお
り、これを誇張して、第２ａ図には、○印で１２
とした示している。前述した分離、回収操作のよ
うにして、ホローフアイバーに前記体液を流す
と、第２ｂ図に示されるように、リンパ球の亜分
画の内のＢ細胞１３が、リポソーム１２に粘着す
る。一方、Ｔ細胞は、Ｂ細胞に比べてリポソーム
の親水性基部分への粘着力が小さいので、そのま
まホローフアイバーの中空部を流出していく。し
たがつて、検出装置７においては、最初に実質的
にＴ細胞のみが検出され、捕集される。その後、
リポソームにより粘着されたＢ細胞を、例えばバ
ツフアのような容離液を用いてリポソームより分
離すれば、実質的にＢ細胞のみが回収される。 続いて、分離材として、ガラスキヤピラリー製
の支持体上に脂質をシランカツプリング剤で固定
した例について説明する。 この例では、第２ａ図および第２ｂ図におい
て、１０を多孔１４のないガラスキヤピラリーと
し、１１をシランカツプリング剤、１２を脂質、
１３をＢ細胞と考えれば、リンパ球の亜分画であ
るＢ細胞の脂質への粘着を、前記と全く同じ説明
でカバーすることができるのは明白である。 リンパ球の亜分画の内、Ｂ細胞が、上述したよ
うに脂質またはリポソームの親水性基部分に粘着
し、捕捉される理由については、複合的であると
考えられている。電子顕微鏡観察によると、Ｂ細
胞はＴ細胞に比べて凹凸が激しく、表面はなめら
かではない。このため、脂質やリポソームの親油
性基部分あるいはナイロン繊維などにからまれる
と、その粘着力が強すぎて、容離が困難になると
思われる。これに対し、脂質やリポソームの親水
性基部分に対するＢ細胞の粘着力は、Ｔ細胞の粘
着力よりは十分に大きく、かつ容離も簡単な程度
である。 また、Ｂ細胞の脂質またはリポソームの親水性
基部分に対する粘着力は、電気的な引力によつて
も発現されていると考えられている。 このように、Ｂ細胞の粘着は、物理的あるいは
電気的な結合力に基いた複合的なものと考えられ
る。 発明の具体的効果 本発明においては、支持体、細胞分離作用を有
する物質、および支持体に細胞分離作用を有する
物質を固定する物質を適当に選択して組み合わせ
ることにより、優れた分離材、分離装置および分
離方法が得られる。 多孔性ホローフアイバー、ハイドロゲル、リポ
ソームの組合せ、およびガラスキヤピラリー（ガ
ラスビーズ）、シランカツプリング剤、脂質の組
合せは、特に優れたもので、支持体へのリポソー
ムまたは脂質の固定は、確実で簡単に行うことが
でき、脂質またはリポソームの親水性基部分は、
体液流路に露出する形で整然と並べられ、親油性
基部分が体液流路に露出する形で並べられるよう
なことはなく、優れた分離能が付与される。 脂質またはリポソームのＢ、Ｔ細胞の分離能
は、その親水性基部分に対する粘着力がＢ細胞で
は大きく、Ｔ細胞では小さく、その差は適度なも
のであることに基づく。従つて、Ｂ、Ｔ細胞は確
実に分離され、回収される。また、脂質またはリ
ポソームの親水性基部分に粘着されたＢ細胞の剥
離（溶離）も、例えばバツフアを流すなどの極め
て簡単な操作で行うことができ、細胞機能を損な
うことなく、細胞を回収することができる。 本発明の上述した組合せで得られる分離材を用
いた分離装置の操作（分離方法）は、Ｔ細胞とＢ
細胞を含有する体液を流し、次いでバツフアを流
すといつた簡単な操作のみでよく、従来のよう
に、他に特殊な装置を必要としない。 本発明によれば、細胞機能を損なうことなく、
Ｂ細胞およびＴ細胞を分離、回収することができ
るので、臨床検査だけでなく、免疫疾患治療、細
胞培養に利用できる。 実施例 次に、本発明を、実施例に基づき具体的に説明
する。 実施例 １ 下記組成(a)、(b)のリポソームを（１−１）で述
べたようにして調製した。

【表】 このリポソームを、7.5w／ｖ％ポリビニルア
ルコール（重合度約2000）及び1.5w／ｖ％Ｎ，
Ｎ−メチレンビスアクリルアミドを含むバツフア
よりなる組成をハイドロゲル原液に混合した。 孔径0.55μｍ、porosity45％のポリプロピレン
製ホローフアイバーの中空部をエタノールで濡ら
した後、上記のようにして得られたリポソーム／
ハイドロゲル液で、ホローフアイバーの中空部を
コーテイングし、3Mradのγ線を照射して重合、
架橋し、分離材を得た。 これを第１図に示すようにセツトし、以下に述
べるようにしてＴ細胞とＢ細胞の分離、回収操作
を行つた。リポソームが、上記組成(b)の場合の分
離結果を第３図に示す。 なお、組成(a)でも、(b)とほぼ同等の結果であつ
た。 正常人末梢血より採取したリンパ球の懸濁液
（５×10⁶cells／ml）をカラムに流し、続いてバツ
フアを流した。そして、カラムからの流出液の濁
度（波長400nｍ）を連続的に測定、記録し、フ
ラクシヨンコレクター（東洋製作所製、角型重量
式フラクシヨンコレクター、型式：SF−160Z）
で2.5mlずつ分画採取し、細胞を回収した。 実施例 ２ 下記組成の脂質を、内径0.25mm、長さ25ｍのガ
ラスキヤピラリー内面に、１％Ｎ，Ｎ−ジメチル
−Ｎ−オクタデシル−３−アミノプロピルトリメ
トキシシリルクロライドを用いて（２−２）で述
べたようにして固定し、分離材を得た。 これを、第１図に示すような装置にセツトし、
実施例１と同様にして細胞分離を行つた。

【表】 脂質組成が(d)の場合の分離結果を第４図に示
す。なお、(c)でも、ほぼ同等の結果であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の分離装置の一構成例を示す
線図、第２ａ図は、多孔性ホローフアイバーにリ
ポソームをハイドロゲルで固定した分離材の線図
的断面図、第２ｂ図は、第２ａ図の分離材にリン
パ球を通した時、リンパ球のうちのＢ細胞が粘着
された状態を示す図、第３図は、リポソーム／ハ
イドロゲル液をホローフアイバーの中空部内面に
コーテイングして得た分離材を用いてリンパ球を
分離した時のクロマトグラム、第４図は、シラン
カツプリング剤を介してガラスキヤピラリーの中
空部内面に脂質を固定して得た分離材を用いてリ
ンパ球を分離した時のクロマトグラムである。 符号の説明、１……細胞分離装置、２……細胞
貯溜容器、３……溶離液貯溜容器、４……コツ
ク、５……リンパ球分離器、６……分離材、７…
…検出装置、８……記録装置、９……流出液分画
捕集装置、１０……ホローフアイバー、１１……
ハイドロゲル、１２……リポソーム、１３……リ
ンパ球（Ｂ細胞）、１４……多孔。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｔ細胞とＢ細胞を分離する方法であつて、体
   液流路を経て互いに連通する体液流出入口を備え
   た本体と、該体液流路内に備えられた、親油性基
   および親水性基を有する脂質の該親水性基部分が
   露出する形で支持体に固定された分離材を有する
   分離装置に、Ｔ細胞とＢ細胞を含有する体液を流
   し、流出するＴ細胞を回収し、続いて溶離液を流
   すことにより、脂質に粘着したＢ細胞を回収する
   ことを特徴とするＴ細胞とＢ細胞の分離方法。 ２ Ｔ細胞とＢ細胞を分離するに際して用いる分
   離材であつて、 支持体に、親油性基および親水性基を有する脂
   質が、固定剤を介して、親水性基部分が露出する
   形で固定されていることを特徴とするＴ細胞とＢ
   細胞の分離材。 ３ Ｔ細胞とＢ細胞を分離するに際して用いる分
   離装置であつて、 体液流路を経て互いに連通する体液流出入口を
   備えた本体と、該体液流路内に備えられた、親油
   性基および親水性基を有する脂質が、固定剤を介
   して、親水性基部分が露出する形で支持体に固定
   されている分離材とを有することを特徴とするＴ
   細胞とＢ細胞の分離装置。