JP2000309539A - 血漿から血清を得る方法 - Google Patents
血漿から血清を得る方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】血漿から血清を迅速に得る方法を提供する。
【解決手段】高分子繊維集合体または高分子多孔質体に
血漿を接触させて血清を得ることを特徴とする血漿から
血清を得る方法。
血漿を接触させて血清を得ることを特徴とする血漿から
血清を得る方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フィブリノーゲン
を含んだ血漿中から、血清を回収できる方法に関する。
さらに詳しくは抗凝固剤を含んだ血漿から短時間に血清
を得る方法に関する。
を含んだ血漿中から、血清を回収できる方法に関する。
さらに詳しくは抗凝固剤を含んだ血漿から短時間に血清
を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】透析患者の血液を検査する場合、透析中
にヘパリンなどの抗凝固剤を投与しながら治療を行うた
め、血液検体中に抗凝固剤が混入するのは避けられな
い。抗凝固剤が混入すると、当然のことながら凝固しな
いために、一度凝固させてから遠心分離して血清を得る
方法は困難となる。そのため、凝固剤を添加する必要が
あることと、凝固にかかる時間が長いため、サンプルを
得るまでに多大な時間が必要であった。凝固させずに遠
心分離すると、フィブリノーゲンはフィブリンとなって
いないために、上澄みはフィブリノーゲンを含んだ血漿
となる。しかし、血漿ではフィブリノーゲンが存在する
ために検査値に影響を与えてしまい、正確な値が得られ
ない。
にヘパリンなどの抗凝固剤を投与しながら治療を行うた
め、血液検体中に抗凝固剤が混入するのは避けられな
い。抗凝固剤が混入すると、当然のことながら凝固しな
いために、一度凝固させてから遠心分離して血清を得る
方法は困難となる。そのため、凝固剤を添加する必要が
あることと、凝固にかかる時間が長いため、サンプルを
得るまでに多大な時間が必要であった。凝固させずに遠
心分離すると、フィブリノーゲンはフィブリンとなって
いないために、上澄みはフィブリノーゲンを含んだ血漿
となる。しかし、血漿ではフィブリノーゲンが存在する
ために検査値に影響を与えてしまい、正確な値が得られ
ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】よって、抗凝固剤を含
んだ血液から血漿を得ることは容易であるが、血漿から
血清を迅速に得る方法は確立されていないのが現状であ
る。また、研究用の血清を多量に採集する方法において
も、動物から得た多量の血液は移送中に凝固してしま
い、血清を採集するには多大な労力を要する。かといっ
て、凝固しないようにＡＣＤ液のような抗凝固剤を加え
ると凝固しないために、遠心分離で血漿が得られ、血清
を得ることはできない。抗凝固剤を加えた血液から遠心
分離によって血漿を得ることは容易であるが、血漿から
血清を得るためには多大な労力がかかっているのが実状
である。
んだ血液から血漿を得ることは容易であるが、血漿から
血清を迅速に得る方法は確立されていないのが現状であ
る。また、研究用の血清を多量に採集する方法において
も、動物から得た多量の血液は移送中に凝固してしま
い、血清を採集するには多大な労力を要する。かといっ
て、凝固しないようにＡＣＤ液のような抗凝固剤を加え
ると凝固しないために、遠心分離で血漿が得られ、血清
を得ることはできない。抗凝固剤を加えた血液から遠心
分離によって血漿を得ることは容易であるが、血漿から
血清を得るためには多大な労力がかかっているのが実状
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は以下のものであ
る。 高分子繊維集合体または高分子多孔質体に血漿を接
触させて血清を得ることを特徴とする血漿から血清を得
る方法。 親水化した高分子繊維集合体または高分子多孔質体
に血漿を接触させて血清を得ることを特徴とする血漿か
ら血清を得る方法。 高分子繊維集合体がポリエステル、ポリプロピレン
およびポリアミドからなる群から選ばれた少なくとも一
種である上記または記載の血漿から血清を得る方
法。 高分子多孔質体がポリエステル、ポリウレタン、ポ
リプロピレン、ポリアミドおよびポリビニルホルマール
からなる群から選ばれた少なくとも一種である上記な
いし記載の血漿から血清を得る方法。 親水化する手段として親水性高分子を高分子繊維集
合体または高分子多孔質体に固定化する上記記載の血
漿から血清を得る方法。 親水性高分子がゼラチン、ポリビニルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンか
らなる群から選ばれた少なくとも一種である上記記載
の血漿から血清を得る方法。 高分子繊維集合体または高分子多孔質体をモジュー
ルに充填し、血漿を内部に通過させ、高分子繊維集合体
または高分子多孔質体と接触させて血清を得ることを特
徴とする血漿から血清を得る方法。
る。 高分子繊維集合体または高分子多孔質体に血漿を接
触させて血清を得ることを特徴とする血漿から血清を得
る方法。 親水化した高分子繊維集合体または高分子多孔質体
に血漿を接触させて血清を得ることを特徴とする血漿か
ら血清を得る方法。 高分子繊維集合体がポリエステル、ポリプロピレン
およびポリアミドからなる群から選ばれた少なくとも一
種である上記または記載の血漿から血清を得る方
法。 高分子多孔質体がポリエステル、ポリウレタン、ポ
リプロピレン、ポリアミドおよびポリビニルホルマール
からなる群から選ばれた少なくとも一種である上記な
いし記載の血漿から血清を得る方法。 親水化する手段として親水性高分子を高分子繊維集
合体または高分子多孔質体に固定化する上記記載の血
漿から血清を得る方法。 親水性高分子がゼラチン、ポリビニルアルコール、
ポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンか
らなる群から選ばれた少なくとも一種である上記記載
の血漿から血清を得る方法。 高分子繊維集合体または高分子多孔質体をモジュー
ルに充填し、血漿を内部に通過させ、高分子繊維集合体
または高分子多孔質体と接触させて血清を得ることを特
徴とする血漿から血清を得る方法。
【０００５】
【発明の実施の形態】高分子にはその表面に蛋白を吸着
するものが多い。蛋白の中でも血漿中のフィブリノーゲ
ンを選択的に吸着する高分子が存在することが発明者ら
のスクリーニングによって明らかとなった。高分子は血
漿との接触面積を大きくとるために高分子繊維集合体ま
たは高分子多孔質体に成形し、血漿と接触させると血漿
中のフィブリノーゲンを吸着除去して検出限界(15mg/d
l) 以下とし、血清とすることができることが鋭意研究
の末、明らかとなった。
するものが多い。蛋白の中でも血漿中のフィブリノーゲ
ンを選択的に吸着する高分子が存在することが発明者ら
のスクリーニングによって明らかとなった。高分子は血
漿との接触面積を大きくとるために高分子繊維集合体ま
たは高分子多孔質体に成形し、血漿と接触させると血漿
中のフィブリノーゲンを吸着除去して検出限界(15mg/d
l) 以下とし、血清とすることができることが鋭意研究
の末、明らかとなった。
【０００６】高分子繊維集合体または高分子多孔質体は
成形してそのままでも、血漿に接触させて血清を得るこ
とができる。しかし、フィブリノーゲンを吸着して除去
するだけでなく、アルブミンやγグロブリンなどの血漿
蛋白も少し吸着してしまう。その結果、得られた血清
は、もとの血漿よりアルブミン濃度がやや低い結果とな
る。
成形してそのままでも、血漿に接触させて血清を得るこ
とができる。しかし、フィブリノーゲンを吸着して除去
するだけでなく、アルブミンやγグロブリンなどの血漿
蛋白も少し吸着してしまう。その結果、得られた血清
は、もとの血漿よりアルブミン濃度がやや低い結果とな
る。
【０００７】もとの血漿と蛋白濃度を同じにする方法と
しては、高分子を親水化する方法が好ましい。親水化す
る方法としてエタノール、グリセリンなどのアルコール
類を通液する方法などが考えられるが、中でも親水性高
分子を高分子繊維集合体または高分子多孔質体に固定化
する方法が非常に効果的である。親水性高分子としてゼ
ラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコー
ルまたはポリビニルピロリドンが挙げられ、固定化する
方法として限定されるものではないが、官能基の共有結
合で固定化する方法、付着させて熱、紫外線、放射線、
架橋剤などで親水性高分子を架橋させて、高分子繊維集
合体または高分子多孔質体に絡ませる方法、またただ単
に付着させる方法でも親水化は可能である。
しては、高分子を親水化する方法が好ましい。親水化す
る方法としてエタノール、グリセリンなどのアルコール
類を通液する方法などが考えられるが、中でも親水性高
分子を高分子繊維集合体または高分子多孔質体に固定化
する方法が非常に効果的である。親水性高分子としてゼ
ラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコー
ルまたはポリビニルピロリドンが挙げられ、固定化する
方法として限定されるものではないが、官能基の共有結
合で固定化する方法、付着させて熱、紫外線、放射線、
架橋剤などで親水性高分子を架橋させて、高分子繊維集
合体または高分子多孔質体に絡ませる方法、またただ単
に付着させる方法でも親水化は可能である。
【０００８】親水性高分子の固定化量には最適量が存在
し、固定化量が少ない場合は、何も固定しない場合の高
分子繊維集合体または高分子多孔質体と同様に、フィブ
リノーゲンを吸着して除去するだけでなく、アルブミン
やγグロブリンなどの血漿蛋白も少し吸着してしまう。
その結果、得られた血清は、もとの血漿よりアルブミン
濃度がやや低い結果となる。逆に固定化量が多い場合は
親水化されすぎたために、フィブリノーゲンを吸着する
能力は失われ、血漿から血清を得ることができなくなっ
てしまう。すなわち、親水性高分子の固定化量には最適
値があるが、その最適値は親水性高分子の種類で異な
る。
し、固定化量が少ない場合は、何も固定しない場合の高
分子繊維集合体または高分子多孔質体と同様に、フィブ
リノーゲンを吸着して除去するだけでなく、アルブミン
やγグロブリンなどの血漿蛋白も少し吸着してしまう。
その結果、得られた血清は、もとの血漿よりアルブミン
濃度がやや低い結果となる。逆に固定化量が多い場合は
親水化されすぎたために、フィブリノーゲンを吸着する
能力は失われ、血漿から血清を得ることができなくなっ
てしまう。すなわち、親水性高分子の固定化量には最適
値があるが、その最適値は親水性高分子の種類で異な
る。
【０００９】高分子繊維集合体または高分子多孔質体の
素材となる高分子は特に限定されるものではないがポリ
エステル、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニルホ
ルマールが、フィブリノーゲンを選択除去する上で好ま
しい。繊維集合体の糸径は１０μm 以下と細い方が、多
孔質の孔径は５０μm 以下と小さい方が高分子の接触面
積を大きくする面で特に好ましい。また当然のことなが
ら、高分子繊維集合体または高分子多孔質体のフィブリ
ノーゲン吸着能力には限界がある。具体的に、血漿から
血清１ｍｌを得るためには０．１ｇ以上の高分子繊維集
合体または高分子多孔質体が必要である。効果的に接触
させる手段をとることで高分子の量を低減することがで
きる。多量に血清が必要な場合、例えば、１００ｍｌの
血清が必要な場合、１０ｇ以上の高分子繊維集合体また
は高分子多孔質体に血漿を効果的に接触させることでフ
ィブリノーゲンを含まない血清を得ることができる。接
触面積を大きくする形態をとることで、フィブリノーゲ
ン除去能力が高まり、より多くの血清が得られる。
素材となる高分子は特に限定されるものではないがポリ
エステル、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニルホ
ルマールが、フィブリノーゲンを選択除去する上で好ま
しい。繊維集合体の糸径は１０μm 以下と細い方が、多
孔質の孔径は５０μm 以下と小さい方が高分子の接触面
積を大きくする面で特に好ましい。また当然のことなが
ら、高分子繊維集合体または高分子多孔質体のフィブリ
ノーゲン吸着能力には限界がある。具体的に、血漿から
血清１ｍｌを得るためには０．１ｇ以上の高分子繊維集
合体または高分子多孔質体が必要である。効果的に接触
させる手段をとることで高分子の量を低減することがで
きる。多量に血清が必要な場合、例えば、１００ｍｌの
血清が必要な場合、１０ｇ以上の高分子繊維集合体また
は高分子多孔質体に血漿を効果的に接触させることでフ
ィブリノーゲンを含まない血清を得ることができる。接
触面積を大きくする形態をとることで、フィブリノーゲ
ン除去能力が高まり、より多くの血清が得られる。
【００１０】高分子繊維集合体または高分子多孔質体と
血漿を接触させる方法は特に限定されるものではなく、
高分子繊維集合体または高分子多孔質体を血漿中に浸漬
させる方法、高分子繊維集合体または高分子多孔質体を
モジュールに充填し血漿を通液する方法、高分子繊維集
合体または高分子多孔質体を膜へと成形し濾過する方
法、高分子繊維集合体または高分子多孔質体に血漿を吸
液させたのち、高分子繊維集合体または高分子多孔質体
から血清を搾り取る方法などが挙げられるが、高分子繊
維集合体または高分子多孔質体をモジュールに充填し血
漿を通液する方法が迅速に血清を得ることのできる面で
最も好ましい。
血漿を接触させる方法は特に限定されるものではなく、
高分子繊維集合体または高分子多孔質体を血漿中に浸漬
させる方法、高分子繊維集合体または高分子多孔質体を
モジュールに充填し血漿を通液する方法、高分子繊維集
合体または高分子多孔質体を膜へと成形し濾過する方
法、高分子繊維集合体または高分子多孔質体に血漿を吸
液させたのち、高分子繊維集合体または高分子多孔質体
から血清を搾り取る方法などが挙げられるが、高分子繊
維集合体または高分子多孔質体をモジュールに充填し血
漿を通液する方法が迅速に血清を得ることのできる面で
最も好ましい。
【００１１】
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらに何等限定されるものではな
い。
明するが、本発明はこれらに何等限定されるものではな
い。
【００１２】〔実施例１〕メルトブロー法によって得ら
れた平均繊維直径１．８μｍのポリエチレンテレフタレ
ート極細繊維不織布を直径２９．０ｍｍの円形に切断
し、４８枚積層してモジュールに充填した。充填した不
織布の重量は１．３１ｇであった。モジュールには図１
の成形体を用いた。すなわち入口としてモジュールの上
面端部に直径１．０ｍｍの穴、出口として底面中央部に
直径１．０ｍｍの穴を有し、モジュール内部の直径３
０．０ｍｍ、厚さ７ｍｍの円盤状モジュールである。
れた平均繊維直径１．８μｍのポリエチレンテレフタレ
ート極細繊維不織布を直径２９．０ｍｍの円形に切断
し、４８枚積層してモジュールに充填した。充填した不
織布の重量は１．３１ｇであった。モジュールには図１
の成形体を用いた。すなわち入口としてモジュールの上
面端部に直径１．０ｍｍの穴、出口として底面中央部に
直径１．０ｍｍの穴を有し、モジュール内部の直径３
０．０ｍｍ、厚さ７ｍｍの円盤状モジュールである。
【００１３】血液には抗凝固剤としてＡＣＤを用いたウ
シの血液を遠心分離して得られた１０ｍｌの牛血漿を使
用した。牛血漿のフィブリノーゲン濃度は２０４ｍｇ／
ｄｌ、アルブミン濃度３．４ｇ／ｄｌであった。容器の
外周部から内側へ送液したところ、フィブリノーゲンは
検出限界以下の１５ｍｇ／ｄｌ以下、アルブミン濃度
２．９ｇ／ｄｌの血清が５．５ｍｌ得られた。
シの血液を遠心分離して得られた１０ｍｌの牛血漿を使
用した。牛血漿のフィブリノーゲン濃度は２０４ｍｇ／
ｄｌ、アルブミン濃度３．４ｇ／ｄｌであった。容器の
外周部から内側へ送液したところ、フィブリノーゲンは
検出限界以下の１５ｍｇ／ｄｌ以下、アルブミン濃度
２．９ｇ／ｄｌの血清が５．５ｍｌ得られた。
【００１４】〔実施例２〕メルトブロー法によって得ら
れた平均繊維直径１．８μｍのポリエチレンテレフタレ
ート極細繊維不織布に親水性ポリマーであるゼラチンを
付着させたものを用いた。ゼラチンを不織布に付着させ
る方法としては、ゼラチン０．０３％水溶液に不織布を
１時間浸漬した後、８００ｒｐｍで５分間余分な水分を
絞り出し、７０℃で２０時間乾燥させた。こうして得ら
れた親水化不織布を直径２９．０ｍｍの円形に切断した
ものを４８枚積層し、モジュールに充填した。充填した
不織布の重量は１．３９ｇであった。モジュールには図
１の成形体を用いた。すなわち入口としてモジュールの
上面端部に直径１．０ｍｍの穴、出口として底面中央部
に直径１．０ｍｍの穴を有し、モジュール内部の直径３
０．０ｍｍ、厚さ７ｍｍの円盤状モジュールである。
れた平均繊維直径１．８μｍのポリエチレンテレフタレ
ート極細繊維不織布に親水性ポリマーであるゼラチンを
付着させたものを用いた。ゼラチンを不織布に付着させ
る方法としては、ゼラチン０．０３％水溶液に不織布を
１時間浸漬した後、８００ｒｐｍで５分間余分な水分を
絞り出し、７０℃で２０時間乾燥させた。こうして得ら
れた親水化不織布を直径２９．０ｍｍの円形に切断した
ものを４８枚積層し、モジュールに充填した。充填した
不織布の重量は１．３９ｇであった。モジュールには図
１の成形体を用いた。すなわち入口としてモジュールの
上面端部に直径１．０ｍｍの穴、出口として底面中央部
に直径１．０ｍｍの穴を有し、モジュール内部の直径３
０．０ｍｍ、厚さ７ｍｍの円盤状モジュールである。
【００１５】血液には抗凝固剤としてＡＣＤを用いたウ
シの血液を遠心分離して得られた１０ｍｌの牛血漿を使
用した。牛血漿のフィブリノーゲン濃度は２０４ｍｇ／
ｄｌ、アルブミン濃度３．４ｇ／ｄｌであった。容器の
外周部から内側へ送液したところ、フィブリノーゲンは
検出限界以下の１５ｍｇ／ｄｌ以下、アルブミン濃度
３．３ｇ／ｄｌの血清が５．５ｍｌ得られた。得られた
血清のアルブミン濃度は血漿のアルブミン濃度と１０％
以内の差であり、アルブミンが不織布内に吸着されず、
フィブリノーゲンのみが吸着されていた。
シの血液を遠心分離して得られた１０ｍｌの牛血漿を使
用した。牛血漿のフィブリノーゲン濃度は２０４ｍｇ／
ｄｌ、アルブミン濃度３．４ｇ／ｄｌであった。容器の
外周部から内側へ送液したところ、フィブリノーゲンは
検出限界以下の１５ｍｇ／ｄｌ以下、アルブミン濃度
３．３ｇ／ｄｌの血清が５．５ｍｌ得られた。得られた
血清のアルブミン濃度は血漿のアルブミン濃度と１０％
以内の差であり、アルブミンが不織布内に吸着されず、
フィブリノーゲンのみが吸着されていた。
【００１６】
【表１】
【図１】本発明において使用するモジュールの一例を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BA08 BA10 BB06 BB12 BB22 BB34 CA26 HA02 HA14 4C038 UA03 UA06 4C077 AA11 BB03 KK25 LL13 MM07 MM08 NN06 PP01 PP08 PP09 PP12 PP13 PP14 PP18 4C087 AA01 AA04 BB35 CA21 DA02 DA03 DA15 ZA51 ZA81 ZC78
Claims (7)
- 【請求項１】 高分子繊維集合体または高分子多孔質体
に血漿を接触させて血清を得ることを特徴とする血漿か
ら血清を得る方法。 - 【請求項２】 親水化した高分子繊維集合体または高分
子多孔質体に血漿を接触させて血清を得ることを特徴と
する血漿から血清を得る方法。 - 【請求項３】 高分子繊維集合体がポリエステル、ポリ
プロピレンおよびポリアミドからなる群から選ばれた少
なくとも一種である請求項１または２記載の血漿から血
清を得る方法。 - 【請求項４】 高分子多孔質体がポリエステル、ポリウ
レタン、ポリプロピレン、ポリアミドおよびポリビニル
ホルマールからなる群から選ばれた少なくとも一種であ
る請求項１ないし３記載の血漿から血清を得る方法。 - 【請求項５】 親水化する手段として親水性高分子を高
分子繊維集合体または高分子多孔質体に固定化する請求
項２記載の血漿から血清を得る方法。 - 【請求項６】 親水性高分子がゼラチン、ポリビニルア
ルコール、ポリエチレングリコールおよびポリビニルピ
ロリドンからなる群から選ばれた少なくとも一種である
請求項５記載の血漿から血清を得る方法。 - 【請求項７】 高分子繊維集合体または高分子多孔質体
をモジュールに充填し、血漿を内部に通過させ、高分子
繊維集合体または高分子多孔質体と接触させて血清を得
ることを特徴とする血漿から血清を得る方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11122745A JP2000309539A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 血漿から血清を得る方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11122745A JP2000309539A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 血漿から血清を得る方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000309539A true JP2000309539A (ja) | 2000-11-07 |
Family
ID=14843563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11122745A Withdrawn JP2000309539A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 血漿から血清を得る方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000309539A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004065958A1 (ja) * | 2003-01-22 | 2004-08-05 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | フィブリノーゲン除去用フィルタ、フィブリノーゲン除去用フィルタデバイス、及び、それらを用いるフィブリノーゲン除去方法 |
| CN100343667C (zh) * | 2003-01-22 | 2007-10-17 | 积水化学工业株式会社 | 用于除去血纤蛋白原的过滤介质,用于除去血纤蛋白原的过滤装置和使用该装置除去血纤蛋白原的方法 |
| CN106726557A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-31 | 杭州聚立医疗用品有限公司 | 一种采血袋及用该采血袋去除纤维蛋白原的方法 |
-
1999
- 1999-04-28 JP JP11122745A patent/JP2000309539A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004065958A1 (ja) * | 2003-01-22 | 2004-08-05 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | フィブリノーゲン除去用フィルタ、フィブリノーゲン除去用フィルタデバイス、及び、それらを用いるフィブリノーゲン除去方法 |
| CN100343667C (zh) * | 2003-01-22 | 2007-10-17 | 积水化学工业株式会社 | 用于除去血纤蛋白原的过滤介质,用于除去血纤蛋白原的过滤装置和使用该装置除去血纤蛋白原的方法 |
| KR100780191B1 (ko) * | 2003-01-22 | 2007-11-28 | 세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤 | 피브리노겐 제거용 필터, 피브리노겐 제거용 필터 장치 및이들을 이용한 피브리노겐 제거 방법 |
| CN106726557A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-31 | 杭州聚立医疗用品有限公司 | 一种采血袋及用该采血袋去除纤维蛋白原的方法 |
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060427 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20091211 |