PT2021025T - Método e meios para tratar doença intestinal inflamatória - Google Patents

Description

MÉTODO E MEIOS PARA TRATAR DOENÇA INTESTINAL INFLAMATÓRIA

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um método de tratamento de doença intestinal inflamatória (IBD), em particular, colite ulcerativa e doença de Crohn e meios para uso no tratamento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A colite ulcerativa e a doença de Crohn são manifestações de doença intestinal inflamatória (IBD). Outras formas de IBD incluem colite linfocítica e colite colagenosa. Os pacientes com colite ulcerativa fulminante são atualmente tratados com altas doses de esteroides. As experiências de fase clínica-III com anti-TNFa estão em andamento. Ambos os fármacos são, em geral, inibidores de inflamação. Os mesmos são eficazes em cerca de 50% dos casos, mas produzem sérios efeitos adversos.

Frequentemente, os pacientes também podem ter episódios recorrentes de colite fulminante. Em pacientes com colite fulminante que não respondem ao tratamento médico, a intervenção cirúrgica imediata é mandatória. A colite ulcerativa está sempre restrita ao intestino grosso (cólon). Em colite fulminante, o cólon é ressecado e uma ileostomia externa é construída. Após a recuperação e, possivelmente, o tratamento médico adicional de inflamação de coto retal, anastomose ileorretal ou cirurgia reconstrutiva com a bolsa pélvica é realizado na maioria dos pacientes para restaurar a continuidade intestinal. Ambos os procedimentos operatórios incluem fezes moles cerca de seis vezes por dia e perturbações nos equilíbrios minerais e de água.

Os pacientes com doença de Crohn têm normalmente sua inflamação na parte mais distal do intestino delgado e na primeira parte do intestino grosso (região ileocecal), mas a inflamação pode estar localizada em qualquer parte do trato gastrointestinal. 0 tratamento médico não pode curar a doença, embora alívio temporário possa ser fornecido por fármacos anti-inflamatórios tais como esteroides e azatioprina. A cirurgia com resseção de segmentos intestinais de fistulação e estenoicos é indicada em cerca de 50% dos pacientes; metade dos mesmos terá recorrências e precisará de cirurgia adicional. Portanto, um método que pode, especificamente, interromper a inflamação em IBD e prevenir a doença recorrente no paciente é fortemente garantido. 0 documento N° W02005113037 revela um filtro e um método para remover materiais selecionados de uma amostra de fluido biológico. 0 filtro compreende um alojamento externo, entrada e saída. Uma pluralidade de superfícies de filtro é fornecida dentro do alojamento externo e pelo menos um revestimento é aplicado às superfícies de filtro. 0 pelo menos um revestimento compreende pelo menos dois módulos de ligação que são, por sua vez, ligados de modo seletivo um ao outro. Um módulo de ligação é ligado de modo seletivo às superfícies de filtro e um outro módulo de ligação é configurado para se ligar de modo seletivo aos materiais selecionados que devem ser removidos da amostra fluida. Ã medida que se permite que a amostra fluida passe através da entrada, do alojamento externo e da saída, os materiais selecionados são ligados de modo seletivo às superfícies de filtro através do revestimento. A amostra fluida é uma amostra de sangue. Um componente de fluido selecionado é um componente de sangue escolhido a partir de, i.a., leucócitos, granulócitos e linfócitos.

Os meios de filtro e aparelho para a separação de leucócitos do sangue são revelados nos documentos, i.a.: JP2003265596 ; US5885457; JP04187206; US4936993; JP03000074; JP0216 7071; JP02 00 982 3;JP100574 77 . 0 documento Ν° WO 02/24307 revela um dispositivo adsorvente para a redução do conteúdo de células circulantes e/ou plaquetas numa amostra biológica, tal como sangue, em que o dispositivo adsorvente compreende um suporte e um agente de afinidade imobilizado no suporte. 0 agente de afinidade pode ser um anticorpo que se liga a uma molécula expressada na superfície das células circulantes e/ou plaquetas.

Lampinen M et al. (Eosinophil granulocytes are activated during the remission phase of ulcerative colitis, 2005, GUT volume 54; 12; 1.714 a 1.720) revela um estudo projetado para investigar eosinófila intestinal e granulócitos neutrofílicos por citometria de fluxo. O papel demonstra um aumento na expressão de CD66b em neutrófilos obtidos a partir de cólon e amostras de biopsia de íleo de pacientes com colite ulcerativa.

Sandborn W.J e Targan S.R (Biologic therapy of inflammatory bowel disease, 2001, Gastroenterology vol. 122; 6; 1.592 a 1.608) revisam as terapias biológicas que são desenvolvidas para o tratamento de doença intestinal inflamatória. Essas terapias incluem anticorpos para integrinas α4β7, que foram desenvolvidas numa tentativa de inibir o leucócito que se direciona para a mucosa intestinal. Z Lui et al (IL-15 is highly expressed in inflammatory bowel disease and regulates local T cell-dependent cytokine production, The Journal of Immunology, volume 164; 7; 3.608 a 3.615) descreve o efeito da citocina IL-15 na produção de citocina pró-inflamatória por células T ativadas e sugere um papel para IL-15 em doença intestinal inflamatória.

Sandborn (Preliminary data on the use of aférese in inflammatory bowel disease, Inflamm Bowel Dis, vol.12; S15-21) descreve a terapia de aférese para IBD, notavelmente, os sistemas de aférese Adacolumn e Cellsorba. 0 Adacolumn é um dispositivo de filtração embalado com esferas de acetato de celulose enquanto a coluna Cellsorba consiste em fibras não tecidas de poliéster.

Kanai et al. (The logics of leukocytapheresis as a natural biological therapy for inflammatory bowel disease, Expert Opin. Biol Ther. Volume 6(5); 453 a 466) é uma análise que descreve os resultados de estudos clínicos que testam a leucacitaf erese para o tratamento de IBD. Os estudos descritos têm como base o uso de sistemas de aférese de Adacolumn e Cellsorba descritos acima.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Um método para tratar IBD, em particular, colite ulcerativa e doença de Crohn é descrito no presente documento. É um objetivo da invenção fornecer meios para uso no método.

Os objetivos adicionais da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da breve descrição a seguir da invenção, das modalidades preferenciais da mesma ilustradas num desenho e das reivindicações anexas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece uma coluna de leucaférese carregada com um suporte no qual os anticorpos contra os marcadores de superfície de célula de leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T e granulõcitos neutrofílicos são imobilizados, em que os ditos anticorpos contra os linfócitos T ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD6 9 e integrina α4β7 e/ou em que os ditos anticorpos contra granulócitos neutrofílicos ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD66b, A presente invenção também fornece um suporte para leucaférese que compreende, imobilizados no mesmo, um ou mais anticorpos aumentados contra os leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T e granulócitos neutrofílicos e em que os ditos anticorpos contra linfócitos T ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD69 e integrina α4β7 e/ou em que os ditos anticorpos contra granulócitos neutrofílicos ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD66b.

No processo inflamatório de IBD, as células T interagem com os leucócitos. Os agentes nocivos são liberados dos leucócitos mediante o estímulo por parte de certos cofatores. Esses agentes nocivos danificam as células intestinais. Através da citometria de fluxo de material obtido a partir de biópsias intestinais de pacientes com IBD ativo, identificaram-se marcadores de superfície de célula de leucócito de linfócitos T ativados e de granulócitos de eosinófila e neutrófilos ativados, em que as células são enriquecidas no local inflamatório, mas também estão presentes na circulação de sangue periférico. A presente invenção tem como base a hipótese de que essas células ativadas são responsáveis pela iniciação e manutenção de inflamação em IBD e que sua remoção da circulação pode reduzir e, até mesmo, eliminar tal inflamação. 0 conceito compreende a perceção de que o estado inflamatório de cada paciente é único em termos do grau de ativação de leucócito e do tipo e proporções relativas de células T invasoras, parâmetros que variam de paciente para paciente e com a gravidade da doença e são influenciados por medicações administradas para o paciente. A presente invenção não recorre ao uso de adsorventes de leucócito não específicos conhecidos na técnica, tais como algodão e outras fibras de polímero. No contexto da invenção, IBD compreende, principalmente, doença de Crohn e colite ulcerativa, mas também colite colagenosa distinguida por diarreia aquosa, endoscopia normal, mas acúmulo histopatológico de colágeno na submucosa intestinal, e colite linfocítica distinguida pela presença de grandes quantidades de linfócitos na mucosa intestinal acompanhada por diarreia.

Conforme descrito no presente documento, um paciente com IBD é submetido a colonoscopia. Uma ou mais biópsias de tecido intestinal doente são tomadas. A partir do material de biopsia combinado ou único, uma suspensão de célula única é preparada. A presença de linfócitos T, linfócitos B, granulócitos neutrofílicos e granulócitos eosinófilos na suspensão de célula única é determinada por citometria de fluxo com o uso de anticorpos contra CD4, CD8, CD3, CD15, CD19. Além disso, o estado de ativação da mucosa que invade as células imunitárias é investigado pelo uso de anticorpos contra marcadores de ativação tais como CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 e CD66b. Em princípio, o estado inflamatório de cada paciente é único em termos de grau de ativação e tipo de invasão da célula, e parâmetros que variam de acordo com a gravidade da doença e sob determinas medicações. Com base no resultado dessa investigação, uma coluna de leucaférese é usada para a eliminação focalizada da população de células causadoras de inflamação dominante. Para eliminar os linfócitos B e T ativados, os anticorpos que reconhecem o marcador de ativação CD69 acoplado a um suporte sólido são usados. Para eliminar os granulócitos neutrofílicos ativados, os anticorpos contra a molécula de migração intestinal ou contra CD66b são usados; uma coluna carregada com um suporte no qual um anticorpo de integrina α4 β7 é imobilizado, eliminará os leucócitos desse tipo. Desse modo, as células sanguíneas na circulação periférica ativada em nódulos linfáticos que drenam o local intestinal inflamatório de passagem para a mucosa intestinal para fornecer inflamação local adicional serão eliminadas por tal leucaférese de sangue periférico à base de anticorpo. Isso atenuará ou, até mesmo, inibirá recrutamento adicional de células T autorreativas gastrointestinais.

De acordo com a presente invenção, revela-se uma coluna de leucaférese, de acordo com as presentes reivindicações, carregada com um suporte sólido adequado de uma razão entre grande superfície e volume, a superfície da qual transporta os anticorpos com capacidade para se ligar aos leucócitos ativados que circulam no sangue periférico, em que os leucócitos ativados são selecionados a partir de linfócitos T e granulócitos neutrofílicos. 0 sangue periférico de passagem de um paciente que sofre de inflamação de IBD através da coluna fará com que os leucócitos ativados se acoplem aos anticorpos e, desse modo, eliminem os mesmos da circulação. Através de mecanismos homeostáticos, a depleção de leucócitos ativados na circulação de sangue periférico resulta num número decrescente de leucócitos ativados que se dirigem para o intestino e, então, numa redução do número de leucócitos ativados no intestino. Neste pedido, o termo "anticorpo" compreende anticorpos, em particular, anticorpos monoclonais e fragmentos ou modificações dos mesmos que retêm a capacidade de ligação de antígeno/anticorpo do anticorpo correspondente, que incluem anticorpos alterados recombinantes e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.

Esse tipo de leucaférese "personalizada" tem capacidade para classificar os leucócitos ativados especificamente ativados para as células da mucosa intestinal, o que elimina, então, um importante fator no processo inflamatório e reverte a colite fulminante. Em pacientes com doença de Crohn, o mesmo princípio se aplica, com exceção dos leucócitos; nesse caso, os leucócitos são ativados para o antígeno (ou os antígenos) localizado mais no fundo na parede intestinal. Pela identificação dos antígenos que causam a inflamação do mesmo, é possível selecionar os antígenos para apresentar os mesmos num estado imobilizado num suporte sólido para os leucócitos que passam através da coluna e ligar os leucócitos ativados dessa maneira.

Com base no tipo intestinal e grau de ativação inflamatória, a coluna de leucaférese é usada para a eliminação alvejada da população de células causadoras de inflamação dominante, A depleção de linfócitos T ativados no sangue periférico é, em particular, preferencial. A eliminação de linfócitos T ativados do sangue periférico de um paciente IBD pelo contacto dos mesmos com os anticorpos contra CD69 ou anticorpo integrina α4β7 é preferencial; esses anticorpos podem ser usados sozinhos ou em combinação. Os granulócitos neutrofílicos ativados podem ser eliminados de uma maneira correspondente pelo contacto dos mesmos com os anticorpos contra CD66b.

Os granulócitos neutrofílicos ativados e granulócitos eosinófilos também podem ser identificados no sangue periférico de um paciente IBD. A eliminação de leucócitos T ativados e/ou granulócitos neutrofílicos ativados pode ser alcançada pelo uso de coluna que compreende mais dois ou mais tipos de anticorpo no suporte sólido. De preferência, um suporte separado é usado para cada anticorpo.

Os suportes separados, cada um com um diferente anticorpo ou diferentes anticorpos, podem estar dispostos num número correspondente de colunas separadas. É preferencial que as colunas sejam acopladas em linha.

Conforme descrito no presente documento, diversas biópsias obtidas a partir de um paciente com IBD por colonoscopia podem ser combinadas, mecanicamente tratadas para formar uma suspensão de célula única e analisadas por citometria de fluxo para identificar a presença de leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T, granulócitos neutrofílicos e granulócitos eosinófilos, linfócitos B opcionalmente ativados, pela exposição dos mesmos para anticorpos específicos, em particular, anticorpos contra CD4, CDS, CD3, CD 15, e CD19.

Conforme descrito no presente documento, o estado de ativação das células imunitárias invasoras de mucosa obtidas a partir de um paciente com IBD por colonoscopia pode ser determinado pela exposição das células imunitárias invasoras para anticorpos contra marcadores de ativação tais como CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLADR, CD44 e CD66b.

Os linfócitos T propensos a migrar para o interior da mucosa da parede intestinal expressam o recetor de integrina α4β7 que se liga a MAdCAM-1 (Molécula de Adesão Celular da Mucosa-1) expressa no endotélio. De acordo com a presente invenção, tais células T invasoras podem ser removidas da circulação periférica por leucaférese com o uso de uma coluna que compreende um suporte no qual um anticorpo para o recetor de integrina α4β7 é imobilizado.

Desse modo, um paciente com IBD em que as biópsias investigadas por citometria de fluxo indicam inflamação ativa pode ser submetido à leucaférese à base de anticorpo projetada para eliminar populações celulares específicas responsáveis pela inflamação intestinal local. Um acesso intravenoso é introduzido e, por exemplo, veias antecubitais acopladas aos tubos heparinizados que se ligam a uma bomba peristáltica que bombeia aproximadamente 30 ml de sangue por minuto. 0 sangue passa através da coluna de leucaférese de anticorpo projetado e a tubagem é reintroduzida, por exemplo, na veia antecubital contralateral. Por exemplo, o paciente é submetido a 60 minutos de leucaférese que eliminará as células ativadas de aproximadamente metade ou um pouco menos da metade do volume sanguíneo (60 x 20 ml = 1.800 ml) . Independente do volume sanguíneo eliminado numa leucaférese, o tratamento é repetido por 3 a 5 vezes dentro de 1 a 3 semanas a fim de remover as células imunitárias sanguíneas ativadas de modo intestinal recentemente exibidas. O resultado pode, então, ser seguido por investigação adicional de células únicas a partir das biópsias intestinais por citometria de fluxo conforme indicado acima.

Descreve-se no presente documento um método de tratamento de doença intestinal inflamatória (IBD) que compreende: (a) fornecer uma amostra de biopsia intestinal obtida a partir de tecido inflamado de um paciente; (b) tratar mecanicamente a amostra para obter uma suspensão celular; (c) identificar os marcadores de superfície de célula de leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T, granulócitos neutrofílicos e granulócitos eosinófilos na suspensão; (d) aumentar os anticorpos contra os leucócitos ativados; (e) imobilizar os anticorpos contra os leucócitos ativados num suporte comum ou em suportes separados; (f) fornecer uma coluna carregada com o (s) suporte(s); (g) desviar uma porção do sangue periférico do paciente para fazer com que a mesma passe através da coluna antes de reinfundir a mesma no paciente para fazer com que os ditos leucócitos ativados se acoplem aos anticorpos no (s) suporte (s), eliminando, através disso, os mesmos da corrente sanguínea. É preferencial que os suportes que carregam os anticorpos contra leucócitos T ativados e contra granulócitos neutrofílicos ativados e/ou granulócitos eosinófilos ativados sej am fornecidos em colunas separadas, que podem ser acopladas em linha ou em paralelo. Também é preferencial para o método recorrer a uma única coluna carregada com suportes separados em que os anticorpos contra dois ou mais dentre linfócitos T ativados, granulócitos neutrofílicos ativados e granulócitos eosinófilos ativados, linfócitos B opcionalmente ativados, respetivamente, são imobilizados. De preferência, a coluna da invenção tem um volume morto de 20 a 100 ml, em particular, de 30 a 50 ml, mas outro volume maior tal como até 500 ml também são viáveis. Quando as colunas de um volume maior são usadas, é importante esvaziar as mesmas do sangue no final do tratamento para manter a perda sanguínea num mínimo. Isso pode ser feito pela lavagem dos mesmos como, por exemplo, solução salina até o meio de lavagem ter deslocado a maioria do ou essencialmente todo o sangue na coluna. As superfícies da coluna e da tubagem que estão em contacto com o sangue devem ser de um tipo de modo a impedir a coagulação; é, portanto, preferencial usar colunas e tubagem com superfícies heparinizadas. Os métodos para fornecer ou modificar superfícies que não ativam o sistema de coagulação são bem conhecidos na técnica. Normalmente, um terço a dois terços do volume sanguíneo do paciente, de preferência, cerca de metade de seu volume sanguíneo ou um pouco menos, é feito para passar a coluna num único tratamento. Normalmente, um único tratamento não será suficiente para obter remissão ou liberdade a longo prazo ou supressão substancial de sintomas. Portanto, o tratamento é, de preferência, repetido de duas ou três a cinco vezes e mais dentro de uma a três semanas do tratamento inicial. A amostra de biopsia intestinal é uma das diversas tais amostras obtidas a partir do paciente e em que as amostras são combinadas antes do tratamento mecânico para fornecer uma suspensão celular. Os anticorpos contra CD69 ou integrina α4β7 anticorpo em relação aos linfócitos T ativados na circulação periférica são particularmente úteis no método da invenção, cujos anticorpos também são preferenciais para a imobilização do suporte da invenção. A presença de linfócitos T ativados na mucosa intestinal é vantajosamente detetada pela exposição da suspensão celular ou células isoladas a partir da suspensão para anticorpos específicos contra um ou mais dentre os marcadores de ativação CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44, CD6 6b.

Os "anticorpos de aumento" incluem o fornecimento de tais anticorpos a partir de fontes comerciais ou outras fontes. A invenção será agora descrita em mais detalhes com referência às modalidades preferenciais da mesma ilustradas num desenho.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1 a 4 mostram a expressão de marcadores de atividade em células T CD4+ e granulócitos neutrofílicos a partir do sangue periférico e mucosa intestinal;

As Figuras 5 a 9 mostram os efeitos de separação de células T CD4+ de sangue periférico ativadas e granulócitos neutrofílicos em colunas MACS (Separação de Células Magneticamente Ativadas); A Figura 10 mostra uma coluna da invenção acoplada à circulação de um paciente. DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS Materiais e métodos

Recolha e preparação de amostras. Durante a colonoscopia de um paciente IBD com colite ulcerativa fulminante, as amostras de biopsia foram recolhidas, imediatamente transferidas em tubos preenchidos com solução salina fisiológica e adicionalmente processadas dentro de uma hora. As suspensões de célula única de células de biopsia foram obtidas com o uso de um homogeneizador de vidro encaixado com folga. As células foram, então, lavadas duas vezes com um tampão para separação de células ativadas de fluorescência (FACS) que contém NaN3 a 0,05%, albumina sérica bovina (BSA) a 0,1% e di-hidrato de citrato trissódico a 0,4% em PBS. O sangue periférico heparinizado do mesmo indivíduo foi hemolizado com um cloreto de amónio aquoso de 0,83% em peso e lavado duas vezes no tampão FACS para obter uma suspensão de leucócitos.

As suspensões de célula foram separadamente incubadas com anticorpos monoclonais conjugados por fluorocromo por 30 minutos a temperatura ambiente no escuro. Após uma lavagem final, as células foram suspensas em 500 μΐ do tampão FACS e analisadas.

Anticorpos. mAbs de anti-humano de murganho conjugados ao isotiocianato de fluoresceina (FITC), ficoeritrina (PE) ou proteína de clorofila de peridinina (PerCP) foi usado para todos os antígenos (CD4, CD69, CD66b). A marcação de controlo correspondida ao isótopo também foi realizada, com o uso de IgM κ e IgG2bK de anti-humano de murganho conjugado ao fluorocromo como controlos para coloração não específica. Todos os anticorpos usados para citometria de fluxo foram adquiridos junto a Becton Dickinson (BD) Biosciences/Pharmingen, San Diego, EUA. As microesferas conjugadas com anti-FITC (partículas supramagnéticas nano-dimensionadas acopladas aos anticorpos específicos) foram adquiridas junto a Miltenyi Biotech, GmbH, Alemanha.

Ensaio de citometria de fluxo. 0 ensaio de citometria de fluxo foi realizado num cirtómetro de FACS Calibur com dois laseres (BD Immunocytometry systems, San José, CA, EUA) . Dez mil células foram contadas e analisadas em cada amostra. Para a análise de dados, o software CellQuest Pro a partir de Becton Dickinson foi usado.

Coluna de leucaférese. Um acesso intravenoso na forma de uma primeira cânula 1 é introduzido na veia antecubital 8. A primeira cânula 1 é acoplada a um primeiro tubo heparinizado 2 no qual uma bomba peristáltica 3 funciona, bombeando aproximadamente 30 ml de sangue por minuto. Em sua outra extremidade, o primeiro tubo heparinizado 2 é ligado a uma extremidade de uma coluna de leucaférese 4 que tem um volume de 50 ml preenchido com um suporte sólido granular 5, tal como Sepharose®, em que um anticorpo aumentado contra leucócitos T ativados coletados a partir de um paciente é imobilizado. 0 suporte sólido 5 com o anticorpo imobilizado é mantido no lugar pelo primeiro e pelo segundo corpos de filtro 10, 11. A outra extremidade da coluna de leucaférese 4 é ligada a um segundo tubo heparinizado 6 que é acoplado a uma segunda cânula 7 em sua outra extremidade. A segunda cânula 7 é introduzida na veia antecubital contralateral 9. 0 sangue venoso feito para fluir da veia antecubital 8 para a veia antecubital contralateral 9 é, então, passado através da coluna 4 em que os linfócitos T ativados se acoplam ao anticorpo no suporte 5 e são, assim, retidos na coluna. Uma sessão de leucaférese é tipicamente uma de 60 minutos, que eliminará as células ativadas de aproximadamente metade ou um pouco mais do que a metade do volume sanguíneo (que depende do peso corporal da pessoa; 60 x 20 ml 1.800 ml) . 0 tratamento é repetido, por exemplo, por 3 a 5 vezes dentro de 1 a 3 semanas para remover células imunitárias sanguíneas ativadas de modo intestinal recentemente exibidas. 0 resultado pode, então, ser seguido pela investigação adicional de células únicas a partir de biópsias intestinais por citometria de fluxo conforme descrito acima. De maneira correspondente, a aférese de neutrófilos ativados e/ou eosinófilos ativados é realizada. Os métodos adicionais para fixação de anticorpo aos suportes sólidos em cromatografia de afinidade úteis na invenção são descritos em Nisevitch M e Firer, MA, J Biochem Biophys Methods 49 (2001) 467 a 480. EXEMPLO 1

Separação de MACS. Dois ml de sangue periférico heparinizado de um dador saudável forem estimulados com SEB (4 mg/ml) e anticorpo monoclonal anti-CD2S (10 mg/ml) por 2 horas em 37 °C para obter células T ativadas e granulócitos neutrofílicos. A fim de obter uma população misturada de ativados e células em repouso, 2 ml de sangue não estimulado foram subsequentemente adicionados. Os leucócitos foram fixados e eritrócitos foram removidos por lise hipotónica. Os leucócitos foram lavados e incubados com anti-CD69 ou CD66b conjugado com FITO. Após 10 minutos de incubação em 4 °C no escuro, as células foram lavadas e incubadas por 15 minutos com microesferas anti-FITC. As células foram separadas numa coluna de MACS; tanto as frações negativas quanto as frações positivas foram recolhidas em diferentes tubos. Finalmente, as células foram lavadas e analisadas por FACS. EXEMPLO 2

Pacientes IBD têm células T CD4+ ativadas em sangue periférico e no intestino. Investigaram-se suspensões de célula única do sangue e biópsias de cólon intestinal de 10 pacientes com Mb Crohn e 12 pacientes com colite ulcerativa. Os pacientes com IBD exigem células T CD4 + em sangue periférico com um fenótipo ativado, visto que as células T auxiliares que expressam o marcador de ativação muito precoce foram encontradas (Figura 1) . Em biópsias de cólon de pacientes IBD, a maioria das células T CD4 + expressa o marcador de ativação CD69 como um sinal de resposta de célula T inflamatória acumulada na parede intestinal do cólon responsável pela destruição autoimune do cólon (Figura 2) . As células T ativadas encontradas no sangue periférico são como células T que foram ativadas num nódulo linfático intestinal que drena o segmento de cólon inflamatório e essas células estão na via para a inflamação, uma população de células que seriam eliminadas. EXEMPLO 3

Pacientes IBD têm granulócitos neutrofílicos ativados em sangue periférico e no intestino. Os granulócitos neutrofílicos são uma parte do sistema imunitário inato e participam da ativação e manutenção da inflamação local. No sangue periférico dos pacientes com IBD, a maioria dos granulócitos neutrofílicos expressam baixas quantidades de CD66b, no entanto, uma fração dos granulócitos neutrofílicos expressa altas quantidades de CD66b que indicam um fenótipo ativado (Figura 3) . Uma porção substancial dos granulócitos neutrofílicos das biópsias de cólon dos pacientes com IBD ativo é CD66bHi (Figura 4), que demonstra uma ativação do sistema imunitário inato provavelmente envolvido no acionamento da inflamação intestinal. EXEMPLO 4

Linfôcitos T CD4+ ativados podem ser eliminados do sangue periférico. A eliminação de linfôcitos T ativados que expressam o marcador de ativação CD69 a partir do sangue periférico (Figura 5), células que estão de passagem para a mucosa de cólon inflamado, pode ser alcançada pelo uso de anticorpos específicos e uma coluna. Uma suspensão de linfôcitos T aquosa marcada com o marcador de ativação CD69 foi feita para passar através de uma coluna carregada com um anticorpo secundário conjugado com leito magnético anti-FITC. Os linfôcitos T não ativados foram separados com sucesso e enriquecidos no eluato de coluna, que mostra que a maioria das células CD69+ pode ser eliminada do sangue periférico (Figura 6). EXEMPLO 5

Eliminação de granulócitos neutrofílicos ativados do sangue periférico. Os granulócitos neutrofílicos ativados identificados pela sua expressão de altos níveis do marcador de superfície celular CD66b (Figura 7) foram incubados com um anticorpo secundário conjugado com leito magnético anti-FITC e submetidos à purificação de coluna. A maioria dos neutrófilos ativados que expressam quantidades intermediárias a altas do marcador de ativação CD66b foi aprisionada na coluna e, então, eliminada do sangue periférico (Figura 8). EXEMPLO 6

Tratamento exemplificativo de um paciente com IBD. Um paciente com IBD é submetido à colonoscopia. Diversas biópsias são tomadas. Uma suspensão de célula única preparada a partir de biópsias combinadas. Os leucócitos ativados, ou seja, linfôcitos T, linfôcitos B, granulócitos neutrofílicos e granulócitos eosinófilos, na suspensão de célula única são identificados por citometria de fluxo com o uso de anticorpos contra, por exemplo, CD4, CD8, CD3, CD15, CD19. Além disso, o estado de ativação das células imunitárias invasoras de mucosa é determinado pelo uso de anticorpos contra marcadores de ativação, tais como, por exemplo, CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 e CD66b.

Uma coluna de leucaférese que compreende anticorpos contra os leucócitos e as células imunitárias invasoras de mucosa encontradas para serem ativadas é preparada. 0 volume da coluna pode ser variado dentro de amplos limites, mas por razões de economia, e mantendo a perda de sangue num mínimo, um volume de aproximadamente 30 a 50 ml é preferencial. Os anticorpos são imobilizados num suporte adequado, tal como Sepharose®, por qualquer técnica para acoplar de como covalente os anticorpos a um suporte sólido. Por exemplo, os anticorpos contra o marcador de ativação CD69 para eliminar as células T ativadas e anticorpos contra a molécula de migração intestinal ou contra CD66b para eliminar granulócitos neutrofílicos ativados ou contra o anticorpo contra CD9 para eliminar granulócitos eosinófilos ativados são usados num paciente particular. A coluna pode ser fornecida de modo pré-carregado com um suporte no qual um ou mais anticorpos são imobilizados ou é individualmente preparada, tal como por uma estratégia de imobilização não covalente com o uso de, por exemplo, uma proteína A ou estreptavidina que contém suporte que ligará o domínio Fc do anticorpo ou um anticorpo biotinilado, respetivamente. A coluna de leucaférese individualmente preparada ou já feita é acoplada à circulação periférica do paciente similar a de um rim artificial por um período de tempo suficiente para deixar que diversos volumes de sangue, de preferência, de cerca de três a cerca de cinco volumes de sangue, passem através do mesmo. EXEMPLO 7

Colunas de leucaférese para captura de uma população de célula específica ou uma combinação de populações celulares específicas. Uma coluna que compreende um suporte carregado com um anticorpo de integrina α4β7 elimina as células T que expressam a molécula de migração intestinal (Figura 9), então, as células de sangue periférico ativadas em nódulos linfáticos que drenam o local intestinal inflamatório de passagem para a mucosa intestinal que faz com que a inflamação local adicional seja eliminada no procedimento de leucaférese à base de anticorpo. 0 carregamento da coluna com um suporte que transporta um anticorpo contra CD69 eliminará os ativados T e linfõcitos B da corrente sanguínea, inibindo, desse modo, o recrutamento adicional de células T autorreat ivas intestinais. De uma maneira similar, uma coluna carregada com um suporte que transporta um anticorpo contra CD66b eliminará os granulócitos neutrofílicos ativados; para a eliminação correspondente de granulócitos eosinófilos ativados, o anticorpo CD9 é preferencial. Esses suportes podem ser usados um a um ou em combinação, tal como em colunas consecutivamente acopladas ou em paralelo, em que cada uma contém um tipo de suporte ou uma única coluna que contém diversos tipos de suporte tal como, por exemplo, um CD69 de transporte e um outro CD66b de transporte. Para otimizar a eliminação de célula T numa coluna de determinado tamanho e suporte sólido, a densidade de anticorpo no suporte superfície, afinidade de anticorpo, a taxa de fluxo de sangue que passa através da coluna, etc., pode ser variada.

Desse modo, um paciente com IBD em que as biópsias investigadas por citometria de fluxo indicam inflamação ativa, é submetido a leucaférese à base de anticorpo projetado para eliminar populações celulares específicas responsáveis pela inflamação intestinal local. Um acesso intravenoso é introduzido em, por exemplo, veias antecubitais acopladas aos tubos heparinizados afetados por uma bomba peristáltica que bombeia aproximadamente 30 ml de sangue por minuto. 0 sangue é feito para passar através da coluna de leucaférese da invenção e o tubo é reintroduzido, por exemplo, na veia antecubital contralateral. 0 paciente é submetido a 60 minutos de leucaférese que eliminará as células ativadas de aproximadamente metade do volume sanguíneo (60 x 20 ml = 1.800 ml) . O tratamento é repetido por 3 a 5 times dentro de 1 a 3 semanas a fim de remover células imunitárias sanguíneas ativadas de modo intestinal recentemente exibidas. O resultado pode, então, ser seguido por investigação adicional de células únicas a partir das biópsias intestinais por citometria de fluxo conforme indicado acima.

LEGENDAS PARA AS FIGURAS

Figura 1 A expressão do marcador de atividade CD69 é relativamente baixa em linfócitos T CD4+ de sangue periférico (expressos por 3,8% das células T CD4+, com intensidade de fluorescência média (MFI) 20,0) .

Figura 2 Linfócitos T CD4+ da mucosa do cólon têm uma expressão de CD69 aumentada (72,8%, MFI 3.3.5). Figura 3 A maioria dos granulócitos neutrofílicos do sangue periférico expressam baixas quantidades de CD66b; mas 11,5% têm uma expressão aumentada que indica a ativação de célula. A MFI das células na porta Ml é 104,3.

Figura 4 Os granulócitos neutrofílicos da mucosa do cólon têm MFI de CD66b maior (629,7 na porta Ml) e uma proporção aumentada de granulócitos neutrofílicos ativados.

Figura 5 Linfócitos T CD4+ antes da separação de células positivas CD69: 5,9% das células expressam CD6 9 .

Figura 6 Linfócitos T CD4+ após a separação de células positivas CD69. A fração positiva consiste em 61,6% de células positivas CD69 T CD4+.

Figura 7 Granulócitos neutrofílicos antes da separação de células positivas CD66b: 42,7% das células têm expressão de CD66b intermediária a alta.

Figura 8 Granulõcitos neutrofílicos após a separação de células positivas CD66b: 86,6% dos neutrofilos na fração positiva têm expressão de CD66b intermediária a alta.

Figura 9 Linfócitos T CD4+ antes e após a separação de células positivas de integrina α4β7: 37,4% de células têm expressão de integrina α:4β7 intermediária a alta antes de MACS e 92,9% após MACS.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2005113037 A [0004] • JP 2003265596 B [0005] • US 5885457 A [0005] • JP 04187206 B [0005] • US 4936993 A [0005] • JP 03000074 B [0005] • JP 02167071 A [0005] • JP 02009823 A [0005] • JP 10057477 B [0005] • WO 0224307 A [0006]

Documentos de não patente citados na descrição • LAMPINEN M et al. Eosinophil granulocytes are activated during the remission phase of ulcerative colitis. GUT, 2005, vol. 54 (12) , 1714-1720 [0007] • SANDBORN W.J ; TARGAN S.R. Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterology, 2001, vol. 122 (6), 1592-1608 [0008] • Z LUI et al. IL-15 is highly expressed in inflammatory bowel disease and regulates local T cell-dependent cytokine production. The Journal of Immunology, vol. 164 (7), 3608-3615 [0009] • SANDBORN. Preliminary data on the use of apheresis in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis, vol. 12, 15-21 [0010] • KANAI et al. The logics of leukocytapheresis as a natural biological therapy for inflammatory bowel disease. Expert Opin. Biol Ther., vol. 6 (5), 453-466 [0011] • NISEVITCH M ; FIRER, MA. J Biochem Biophys Methods, 2001, vol. 49, 467-480 [0037]

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Coluna de leucaférese carregada com um suporte no qual os anticorpos contra marcadores de superfície de célula de leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T e granulócitos neutrofílicos sâo imobilizados, em que os ditos anticorpos contra linfócitos T ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD69 e integrina α4β7, e/ou em que os ditos anticorpos contra granulócitos neutrofílicos ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD66b.
2. 2. Coluna, de acordo com a reivindicação 1, que tem um volume morto de 20 ccm a 100 ccm.
3. 3. Coluna, de acordo com a reivindicação 1, que tem um volume morto de 30 ccm a 50 ccm.
4. 4. Combinação de duas ou mais colunas de leucaférese, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, acopladas em paralelo ou em linha.
5. 5. Aparelho para leucaférese que compreende a coluna, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, uma bomba sanguínea acoplada em linha à coluna e meios para acoplar a bomba e a coluna ao sistema venoso de um paciente.
6. 6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 5, em que os meios de acoplamento da bomba e da coluna ao sistema venoso de um paciente compreendem duas cânulas.
7. 7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a bomba é uma bomba peristãltica que funciona num tubo flexível ligado à coluna.
8. 8. Suporte para leucaférese que compreende, imobilizados no mesmo, um ou mais anticorpos aumentados contra leucócitos ativados selecionados a partir de linfócitos T e granulócitos neutrofílicos e em que os ditos anticorpos contra linfócitos T ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD69 e integrina α4β7 e/ou em que os ditos anticorpos contra granulócitos neutrofílicos ativados são selecionados a partir de anticorpos contra CD66b.
9. 9. Suporte, de acordo com a reivindicação 8, em que os leucócitos ativados foram isolados de uma ou mais amostras de biopsia tomadas a partir do tecido intestinal inflamado.