KR101398768B1 - 세포 흡착 컬럼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 감안하여, 세포와의 접촉에 의한 세포의 변성이나 분화 유도 등의 우려가 적고, 흡착체 표면적을 가지면서 흡착체 충전 용적이 작고, 조작성이나 환자에 대한 부담을 감소시키기 위한 콤팩트성을 갖는 세포 흡착 컬럼을 제공하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유를 포함하고, 표면적이 0.5 m2 이상 10 m2 미만인 흡착체를 충전하여 이루어지는 세포 흡착 컬럼이며, 흡착체 충전 용적이 100 ㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼을 제공한다.
세포 흡착 컬럼, 흡착체, 사이토카인, 섬유

Description

세포 흡착 컬럼{CELL-ADSORBING COLUMN}
본 발명은 신규한 흡착 컬럼, 특히 혈액을 순환시켜 사용하는 혈액 처리 컬럼에 적합한 흡착 컬럼에 관한 것이다. 특정량의 흡착체를 컬럼에 조립하여 충분한 양의 백혈구를 제거할 수 있는, 콤팩트성이 우수한 세포 흡착 컬럼에 관한 것이다.
최근 들어, 다양한 혈액 처리 컬럼이 연구되어, 예를 들면 백혈구 제거나 과립구 제거를 목적으로 한 컬럼(일본 특허 공개 (소)60-193468호 공보, 일본 특허 공개 (평)5-168706호 공보(특허 문헌 1, 2)), 사이토카인 흡착을 목적으로 한 컬럼(일본 특허 공개 (평)10-225515호 공보, 일본 특허 공개 (평)12-237585호 공보, 일본 특허 공개 (평)10-147518호 공보(특허 문헌 3, 4, 7)), 백혈구와 독소를 동시에 흡착시키는 것을 목적으로 한 컬럼(일본 특허 공개 제2002-113097호 공보(특허 문헌 5)) 등이 각각 개발되어 왔다. 이들은 통상적으로 컬럼 내부에 각각 목적으로 하는 물질을 제거·흡착하기 위한 여과재 또는 흡착 담체를 갖고 있다. 이들 여과재 또는 흡착 담체로서는 다양한 물질, 형상의 것이 이용되고 있지만, 각각 일장일단이 있다. 예를 들면, 폴리에스테르 부직포로 이루어지는 백혈구 제거 담체(일본 특허 공개 (소)60-193468호 공보(특허 문헌 1))에서는 복수의 섬유 직경으로 이루어지는 섬유를 혼합한 부직포를 제조하여, 혈구의 눈막힘 해소를 위해 개량이 실시되고 있지만, 부직포 자체의 부피 밀도가 높고, 혈구 제거성을 다 제어할 수 없어 여전히 혈액 순환 중의 압력 손실 상승의 우려가 문제이다.
또한, 직경 2 mm 정도의 아세트산셀룰로오스 비드로 이루어지는 흡착 담체(특허 문헌 2)에 있어서는 압력 손실의 우려는 그다지 없지만, 흡착 표면적을 크게 할 수는 없어, 흡착 담체로서는 비효율적이다. 그렇다고 하여 입경을 작게 하는 것은 압력 손실 증가로 이어지기 때문에 채용하기 어렵다.
흡착 담체의 부피 밀도는 너무 크면 눈막히기 쉽고, 반대로 너무 작으면 형태 유지성이 나빠지기 때문에, 0.05 내지 0.15 g/cm3인 것이 중요하고, 바람직하게는 0.10 내지 0.15 g/cm3인 것을 사용하는 것이 개시되어 있지만(일본 특허 공개 제2002-172163호 공보(특허 문헌 6)), 0.05 내지 0.10 g/cm3의 범위에서는 특히 형태 안정성이 나쁘고, 0.10 내지 0.15 g/cm3의 범위에서도 여전히 실용적이지 않다.
또한, 종래의 세포 흡착 컬럼은 세포 제거 선택성이 높은 것에서는 흡착체 충전 용적이 150 ㎖를 초과하는 큰 것(예를 들면 시판되는 아다컬럼(등록상표))밖에 존재하지 않는다. 세포 제거 선택성이 없는, 주로 여과 기능에 의한 세포 흡착 컬럼에서는 흡착체 충전 용적이 작은 것이 존재하지만(예를 들면, 시판되는 세파셀(등록상표)), 충전된 흡착체의 표면적은 10 m2를 초과하여, 그의 표면과 세포의 접촉에 의한 변성이나 분화 유도 등의 영향이 우려된다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (소)60-193468호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)5-168706호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (평)10-225515호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)12-237585호 공보
특허 문헌 5: 일본 특허 공개 제2002-113097호 공보
특허 문헌 6: 일본 특허 공개 제2002-172163호 공보
특허 문헌 7: 일본 특허 공개 (평)10-147518호 공보
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 감안하여, 세포와의 접촉에 의한 세포의 변성이나 분화 유도 등의 우려가 적고, 흡착체 표면적을 가지면서 흡착체 충전 용적이 작고, 조작성이나 환자에 대한 부담을 감소시키기 위한 콤팩트성을 갖는 세포 흡착 컬럼을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 혈액 내에 존재하는 세포, 특히 과립구나 단구 등의 활성화된 백혈구, 암 세포 등뿐만 아니라, 과잉으로 존재하는 사이토카인도 제거할 수 있는, 압력 손실이 적은 세포 흡착 컬럼을 제공하는 것도 과제로 한다. 또한, 여기서 말하는 혈액이란 세포나 혈액 성분을 포함하는 액체를 의미한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
〔1〕 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유를 포함하고, 표면적이 0.5 m2 이상 10 m2 미만인 흡착체를 충전하여 이루어지는 세포 흡착 컬럼이며, 흡착체 충전 용적이 100 ㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
〔2〕 상기 흡착체 중의 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유로 이루어지는 부분의 부피 밀도가 0.01 g/cm3 이상 0.15 g/cm3 이하인 것을 특징으로 하는, 〔1〕에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔3〕 상기 섬유 직경이 3 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔4〕 상기 흡착체에 아민 잔기를 결합하여 이루어지는 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔5〕 사이토카인을 흡착하는 것을 특징으로 하는 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔6〕 상기 사이토카인은 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 종양괴사인자-α(TNF-α), 전이성장인자(Transforming Growth Factor; TGF-β), 혈관신생증식인자(VEGF) 및 면역억제산성단백(IAP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 〔5〕에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔7〕 혈액을 순환시키는 용도에 이용하는 것을 특징으로 하는 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔8〕 건강인의 혈액을 혈류 속도 30 ㎖/분으로 하여 1시간 동안 컬럼 내를 통과시켰을 때, 이하의 수학식 1 및 2를 만족시키는 것을 특징으로 하는 〔7〕에 기재된 세포 흡착 컬럼.
2c<a
b>106
여기서,
a: 흡착체 단위 중량당의 과립구 흡착수(개/g)
b: 흡착체 단위 중량당의 단구 흡착수(개/g)
c: 흡착체 단위 중량당의 림프구 흡착수(개/g)
〔9〕 건강견을 이용한 체외순환시험에 있어서, 생리식염수를 이용하여 헤마토크리트값을 40％로 조절한 혈액을 30 ㎖/분의 속도로 컬럼 내를 통과시켰을 때, 혈액 처리량 1500 ㎖일 때의 컬럼 전후에서의 압력 손실이 150 mmHg 이하인 것을 특징으로 하는 〔1〕 내지 〔8〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼.
〔10〕 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼을 이용하여 시료 중의 세포를 흡착하는 것을 특징으로 하는, 세포의 흡착 방법.
〔11〕 상기 시료가 혈액인, 〔10〕에 기재된 세포의 흡착 방법.
〔12〕 상기 세포가 백혈구인, 〔10〕 또는 〔11〕에 기재된 세포의 흡착 방법.
〔13〕 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼을 이용하는 것을 특징으로 하는, 백혈구 제거 요법.
〔14〕 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 세포 흡착 컬럼을 이용하는 것을 특징으로 하는, 궤양성 대장염, 클론병, 또는 만성 관절 류마티스의 치료법.
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 세포와의 접촉에 의한 세포의 변성이나 분화 유도 등의 우려가 적고, 흡착체 표면적을 가지면서 흡착체 충전 용적이 작고, 조작성이나 환자에 대한 부담을 감소시키기 위한 콤팩트성을 갖는 세포 흡착 컬럼을 제공하는 것이 가능해졌다. 또한, 혈액 내에 존재하는 세포, 특히 과립구나 단구 등의 활성화된 백혈구, 암 세포 등뿐만 아니라, 과잉으로 존재하는 사이토카인도 제거할 수 있는, 압력 손실이 적은 세포 흡착 컬럼을 제공하는 것이 가능해졌다.
도 1은 본 발명의 세포 흡착 컬럼을 예시하는 종단면도이다.
부호의 설명
1: 용기 본체
2: 유입구
3: 유출구
4: 필터
5: 칸막이판
5a: 칸막이판의 개구
6: 필터
7: 칸막이판
7a: 칸막이판의 지지 돌기
7b: 칸막이판의 투과 구멍
8: 파이프
9: 유로
10: 관통 구멍
11: 흡착체
Q: 혈액 흐름
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명에서의 세포 흡착 컬럼의 세포 흡착이란, 컬럼에 유입된 혈액 등의 안에 있는 세포(과립구, 단구, 림프구, 그 밖의 혈액 세포, 암 세포 등)가 컬럼 안에서 나오지 않는 경우를 의미하며, 본 발명 중에서는 여과 효과에 의한 현상도 포함하기로 한다. 즉, 세포 흡착 용도란, 혈액 등의 체액으로부터 세포를 흡착하여 인체의 치료·예방 등을 행하는 용도를 의미한다.
본 발명에서의 세포 흡착 컬럼은 1시간 동안 건강인 혈액을 컬럼 내를 순환시켰을 때의 혈액으로부터의 백혈구의 흡착수에 대하여 이하의 수학식 1 및 2를 만족시키는 것이 바람직하다.
<수학식 1>
2c<a
<수학식 2>
b>106
상기 수학식 1 및 2에 있어서, a: 흡착체 단위 중량당의 과립구 흡착수(개/g), b: 흡착체 단위 중량당의 단구 흡착수(개/g), c: 흡착체 단위 중량당의 림프구 흡착수(개/g)이다. 이들 혈구 흡착수의 측정에 있어서의 혈구수의 정량, 헤마토크리트값의 측정은 시스멕스사 XT-1800iV 등을 이용하여 행하는 것이 가능하다. 여기서, 과립구수는 호중구수를 가지고 계산하기로 한다. 상기 수학식 1 및 2에 의한 평가를 목적으로 하여 본 발명의 세포 흡착 컬럼을 사용하는 경우, 혈류 속도는 30 ㎖/분으로 한다.
상기 수학식 1 및 2에 의한 평가의 일례를 예를 들면 이하와 같다. 피검체(예를 들면, 건강인)으로부터 직접 혈액을 채취하여 실험을 행하는 경우, 순환 개시시 5분, 15분, 30분, 60분의 4점에서 컬럼 통과 전후에 채혈하여(각 1 ㎖) 각각의 혈구수를 측정한다. 샘플 채취 시간 t(분)에서의 혈액 1 ㎖ 중의 흡착체 단위 중량당의 세포 흡착수를 Dt로 하여 이하의 식에 의해 구한다.
Dt(개/g)=[(컬럼 순환 전의 혈액 1 ㎖ 중의 혈구수)-(컬럼 순환 후의 혈액 1 ㎖ 중의 혈구수)]
흡착체 단위 중량당의 혈구의 흡착수 D는 이하의 식으로 구한다.
D(개/g)=30×(5×D5+10×D15+15×D30+30×D60)/흡착체 중량(g)
또한, 혈구의 흡착수 측정에 있어서, 인간 혈액을 이용한 본 목적의 세포 흡착 컬럼(실제 컬럼) 크기에서의 실험은 윤리상 곤란할 수도 있기 때문에, 미니컬럼법으로 스케일 다운하여 실시하는 것이 바람직한 경우가 있다. 그 경우, 미니컬럼의 흡착체 충전 용적에 대하여 단위 시간당의 혈액과 흡착체와의 접촉 시간이 본 발명의 세포 흡착 컬럼(실제 컬럼)의 경우의 용적에 대한 접촉 시간과 동등해지도록 혈류 속도를 변경하는 것이 적당하다. 상기 수학식 1 및 2에 의한 평가를 미니컬럼법에 의해 행하는 경우의 일례를 예를 들면 이하와 같다. 실제 컬럼(내경 36 mm, 흡착체 충전 용적 70 ㎖ 정도이면서 방사상 플로우 타입의 컬럼)을 스케일 다운하여 혈구의 흡착수를 구한다. 흡착체를 직경 1 cm의 원판형으로 오려내고, 충전 용적 2 ㎖의 원통형 컬럼(내경 1 cm)에 적층하여 충전한다. 이 컬럼을 이용하고, 혈액으로서는 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)한 건강인의 혈액 25 ㎖를 통과시켜 스케일 다운 평가를 행한다. 이 원통형 컬럼의 흡착체 충전 용적에 대한 단위 시간당의 혈액과 흡착체의 접촉 시간이 실제 컬럼과 동등해지도록 혈류 속도를 선정하면, 0.86 ㎖/분이 된다.
흡착체를 직경 1 cm의 원판형으로 오려 내고, 충전 용적 2 ㎖의 원통형 컬럼(내경 1 cm)에 적층하여 충전한다. 이 컬럼을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)한 인간의 혈액 25 ㎖를 0.86 ㎖/분으로 순환시킨 후, 순환 개시시(0분)와 순환 종료시(1시간)에 있어서 각 1 ㎖의 혈액을 채취하고, 혈구의 조성으로부터 혈구수를 측정한다. 샘플 채취 시간 t(분)에서의 혈액 1 ㎖ 중의 흡착체 단위 중량당의 세포 흡착수를 Dt로 하여 흡착체 단위 중량당의 혈구의 흡착수 D'를 이하의 식으로 구한다.
D'(개/g)=25×(D0-D60)/흡착체 중량(g)
본 발명에 있어서는 상기 2 방법으로 a, b, c를 구하는 것이 가능하다. 수학식 1에 대해서는 a/2c가 1을 초과한다(a/2c>1)고 바꿔 말할 수도 있지만, a/2c에 대해서는 소수점 이하 둘째 자리를 사사오입하여 구하기로 한다. 또한, b는 상기 어느 하나의 스케일의 실험에 있어서 수학식 2를 만족시키면 되는 것으로 한다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼에 있어서, 수학식 2의 단구 흡착수 b가 106개를 초과하는 것이 바람직한 이유는 하기와 같다. 즉, 특히 염증성 질환에 있어서는 증가한 단구가 면역 담당 세포의 활성화에 밀접하게 영향을 미치고 있음을 알 수 있기 때문에, 이 단구를 혈액 내로부터 제거하는 것이 바람직한 것에 의한다. 흡착체 단위 중량(g)당 106개 미만밖에 제거할 수 없는 경우에는 잔존하는 단구가 많아, 염증 등을 충분히 억제하는 작용이 저하되기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 림프구 흡착수는 과립구 흡착수보다 적은 것이 요망된다. 이는, 림프구가 항체 생산, 정보 기억이나 정보 전달에 중요한 역할을 갖고 있기 때문이다. 건강인에 있어서는 혈액 내의 과립구와 림프구의 수의 비는 거의 동등한 것부터 과립구가 수배인 것까지 개인차가 있지만, 본 발명의 세포 흡착 컬럼을 이용한 경우의 흡착체 단위 중량당의 과립구 흡착수와 림프구 흡착수는 상기 수학식 1의 관계를 만족시키는 것이 바람직하고, 수학식 1 대신에 4c<a를 만족시키는 것이 보다 바람직하다. 본 발명에서 말하는 림프구란, 이른바 림프구의 총칭이다. 즉, 시스멕 스사 제조의 XT-1800iV를 이용하여 행한 세포 분류에 준하여 B 세포나 T 세포 등을 구별한 것은 아니다.
세포 흡착 컬럼에 있어서는, 흡착체의 충전 용량을 크게 하면, 한번에 취급하는 혈액량이 증가하기 때문에 조작성이 나빠지고, 또한 혈액의 컬럼 내에서의 체류 시간이 증가하기 때문에, 흡착체와의 접촉에 의한 혈액에 대한 변성이나 분화 유도 등의 우려가 생긴다. 본 발명의 세포 흡착 컬럼은 흡착체 충전 용적이 100 ㎖ 이하인 것, 컬럼에 충전하는 흡착체는 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유를 포함하는 것, 및 흡착체의 표면적이 0.5 m2 이상 10 m2 미만인 것을 특징으로 하기 때문에, 이에 따라 상술한 문제점이 해소된다.
흡착체 충전 용적의 하한에 대해서는 흡착체의 충전량에도 의존하지만 2 ㎖ 이상으로 하는 것이 바람직하고, 혈액을 통과시켰을 경우의 눈막힘 방지 측면에서 5 ㎖ 이상이 바람직하다. 또한, 안전을 위해서는 10 ㎖ 이상이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포 흡착 컬럼의 크기는 특별히 제한은 없다. 그러나, 아무리 콤팩트한 세포 흡착 컬럼이더라도 단위 혈액량을 처리할 때의 사용 개수가 증가한다면 효율적이지 않은 경우가 있다. 즉, 본 발명의 세포 흡착 컬럼을 공업적, 산업적으로 이용하는 경우에는 컬럼을 통과시킬 수 있는 혈액량이 일정량 이상 있는 것이 유리하다. 구체적으로는, 어느 컬럼이, 실질적인 압력 손실에서의 컬럼 압력의 상승에 의해 용혈 등의 악영향을 일으키지 않고 세포를 제거하는 처리를 행할 수 있는 혈액의 총량을 혈액 처리량이라 표현했을 경우에, 본 발명의 세포 흡착 컬럼의 혈액 처리량이 1500 ㎖ 이상인 것이 바람직하다. 또한, 효율화를 위해서는 1800 ㎖ 이상, 나아가 2000 ㎖ 이상이 안전을 위해 보다 바람직하다. 혈액 처리량의 판정은 소정의 혈액량을 컬럼에 통과시켰을 때의 컬럼 전후(컬럼의 입구 및 출구)에서의 압력 손실에 의할 수 있다. 예를 들면, 건강견을 이용한 체외순환시험에 있어서, 생리식염수를 이용하여 헤마토크리트값을 40％로 조절한 혈액을 30 ㎖/분의 속도로 혈액 처리량 1500 ㎖를 통과시켰을 때의 압력 손실이 150 mmHg 이하인 것이 바람직하다. 건강견이란 건강한 상태의 개를 의미하며, 건강한 것은 1주일의 사전 사육 기간 후, 체중 감소가 없는 것에 의해 확인할 수 있다. 또한, 개로서는 실시예에서 이용하고 있는 체중 9 내지 12 kg의 수컷을 이용할 수 있고, 견종으로서도 특별하게 한정은 없지만 비글견 등을 사용할 수 있다.
상기에 대하여 보다 상세하게 언급한다. 단구는 이물질 인식능이 강하기 때문에, 컬럼 내에서의 흡착체의 표면적이 큰 것이 그의 제거를 위해서는 유리하게 기능하기 때문에, 표면적을 크게 하는 방법이 단구 제거에는 일견 유효하게 보인다. 그러나, 단순히 흡착체의 충전량을 늘리면, 혈액 순환시의 컬럼 중의 눈막힘의 위험이 증대한다. 또한, 이를 방지하기 위해 컬럼의 충전 용적을 너무 크게 하는 것은 흡착체와 세포의 접촉에 의한 세포의 변성이나 분화 유도 등의 우려가 생기기 때문에 채용하기 어렵다. 이에 반해, 본 발명의 세포 흡착 컬럼에 있어서는, 흡착체에 함유되는 섬유의 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하로 제어되었기 때문에, 단구가 갖는 이물질 인식력을 효과적으로 이용하고, 또한 과립구의 탐식 작용도 유효하게 이용할 수 있다. 이 때문에, 단구의 흡착수와 림프구의 흡착수의 차 이가 큰 컬럼이 되고, 그 결과로서 흡착체 충전 용적이 100 ㎖ 이하인 콤팩트한 컬럼으로 했을 경우에도, 필요한 이물질 인식능을 갖는 세포 흡착 컬럼을 실현하는 것이 가능해진다. 또한, 단구의 이물질 인식력이나 탐식능은 생체 내에서는 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하의 크기의 물질에 대하여 보다 강하게 기능하는 점에서도, 본 발명의 세포 흡착 컬럼의 흡착체를 구성하는 섬유로서는 이물질의 크기를 모방한 이 범위의 섬유 직경을 갖는 섬유를 이용하는 것이 바람직하다. 그러나, 섬유 직경이 가늘면, 섬유 자체의 탄성 부족 때문에, 섬유 자체의 분산이 나빠져, 단구나 과립구가 인식해야 할 물질로서 유효하게 기능할 수 없게 될 우려가 있다. 이 때문에, 흡착 성능 안정화를 위해서는 흡착체의 섬유의 섬유 직경은 3 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 것이 보다 바람직하다. 이것은 림프구의 흡착수와의 차이를 보다 크게 하기 위해서도 바람직하다.
여기서, 본 발명에서의 섬유 직경이란 섬유 단면의 직경을 말한다. 섬유 직경은 흡착체로부터 랜덤하게 소편 샘플 10개를 채취하여, 주사형 전자 현미경(니혼 덴시 가부시끼가이샤 제조, JSM-5400LV 등)으로 1000 내지 3000배의 사진을 촬영하고, 각 샘플로부터 10개씩 총 100개의 섬유의 직경을 측정하고, 이들의 평균치의 소수점 이하 첫째 자리를 사사오입하여 산출한다.
이러한 섬유 직경을 갖는 섬유에 대하여, 이것을 포함하는 것을 흡착체로 하여 컬럼 용기에 충전했을 때의 표면적은 10 m2 미만인 것이 바람직하다. 이는, 상술한 바와 같이 흡착체와 세포의 접촉에 의한 세포의 변성이나 분화 유도 등의 우 려가 생기기 때문이다. 또한, 안전을 위해서는 표면적은 8 m2 미만인 것이 바람직하다. 또한, 충전한 흡착체의 표면적은 0.5 m2 이상인 것이 필요하다. 이 미만이면, 단구의 흡착수를 106개 이상으로 할 수는 없다. 또한, 안정적으로 106개 이상의 단구를 흡착시키기 위해서는 1.0 m2 이상인 것이 바람직하다.
여기서 말하는 표면적의 평가 방법으로서는 수은 포로시메트리(mercury porosimetry)법을 이용하는 것이 간편하다. 본 발명에서는 압력은 0.4 내지 3000 psia의 범위를 측정한다. 그 밖에 BET법을 이용하여도 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 말하는 흡착체 충전 용적이란, 세포 흡착 컬럼 중에서 흡착체를 충전하는 공간 전체의 용적을 말한다. 바꿔 말하면, 혈액 유입, 유출구를 폐쇄한 상태에서의 내용적 전체를 의미하며, 흡착체나 필터 등의 충전물을 제거한 상태에서 세포 흡착 컬럼 내(주로 컬럼 용기 내)에 충전할 수 있었던 비중 기지의 물 등의 양으로부터 구할 수 있다. 또한, 충전물을 제거할 수 없는 경우에는 컬럼 용기의 내강의 형상을 상세하게 측정하여 계산으로 구할 수도 있다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼은 상술한 흡착체를 컬럼 용기에 충전함으로써 제조할 수 있다. 컬럼 용기로서는 공지된 혈액 처리 등에 이용하는 컬럼의 용기를, 흡착체 충전 용적 등에 맞춘 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 컬럼의 구성으로서는, (1) 흡착체를 평판형으로 형성한 것을 중첩하여 충전한 컬럼, (2) 흡착체가 원통 형상으로 감겨져 이루어지는 원통형 필터가 양단부에 혈액 입구와 혈액 출구를 갖는 원통 용기에 수납되어 있는 컬럼, 또한 (3) 흡착체가 중공 원통형으로 감겨져 이루어지는 중공 원통형 필터가 그의 양단부가 밀봉된 상태에서 혈액 입구와 혈액 출구를 갖는 원통형 용기에 수납되고, 또한 용기의 혈액 출구는 상기 중공 원통형 필터의 외주부로 통하는 부위에 설치되고, 용기의 혈액 출구는 상기 중공 원통형 필터의 내주부로 통하는 부위에 설치되어 있는 컬럼이 바람직하다. 그 중에서도, (3) 원통 중공형 필터를 이용하는 컬럼은 혈액 내의 세포의 대부분이, 원통 형상 필터의 외주부가 큰 면적의 부직포에 의해 신속히 제거되고, 제거되지 않고 남은 근소한 세포도 중공 원통형 필터의 내주부에서의 작은 면적의 부직포에 의해 충분히 제거되는 방식으로 효율적인 세포 흡착이 가능하기 때문에 가장 바람직하다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼이 과립구, 단구 등의 세포를 효율적으로 흡착 제거시키기 위해서는 흡착체를 구성하는 중합체는 수불용성 담체인 것이 바람직하다. 이 경우도, 흡착체에 포함되는 섬유나 중공사 섬유의 섬유 직경은 상술한 바와 같이 0.5 ㎛ 이상인 것이 바람직하다. 이보다 직경이 작아지면, 섬유의 강성이 없어져, 섬유끼리로 형성되는 공극을 안정적으로 확보할 수 없게 되고, 그 결과, 림프구의 흡착 제거가 많아지기 때문에, 메모리 셀의 제거로 이어져 바람직하지 않다. 다만, 림프구의 흡착 제거율을 억제하기 위해서는 섬유 직경의 보다 바람직한 범위는 3 ㎛ 이상이고, 더욱 바람직한 범위는 4 ㎛ 이상이다. 또한, 림프구의 제거율을 보다 억제하면서 과립구나 단구의 제거율 저하로 이어지지 않도록 하는 측면에서는 섬유의 직경을 5 ㎛ 이상으로 하는 것이 보다 바람직할 수도 있다. 그러나, 섬유의 직경이 8 ㎛를 초과하는 경우에는 과립구, 단구의 제거율이 저하 경향을 나타내고, 섬유의 직경이 10 ㎛를 초과하면 과립구나 단구의 제거율이 저하되기 때문에 성능 저하가 발생한다. 실용상의 측면에서는 섬유의 직경이 20 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.
수불용성 담체로서 바람직한 소재는 소수성 섬유, 즉 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 폴리올레핀이나, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 폴리에스테르, 폴리테트라플루오로에틸렌을 비롯한 불소화 중합체이다. 또한, 후술하는 바와 같이, 표면 수식에 의해 각종 알킬기나 방향환 등을 부가하여 소수성 부위를 설치한 것을 이용할 수도 있다. 아민 잔기가 고정화되는 중합체로서 바람직한 것의 구체예로서는, 폴리(p-페닐렌에테르술폰): -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-}n-이나 유델 폴리술폰: -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CH3)2-(p-C6H4)-O}n- 외에도 -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-O}n-, -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O}n-, -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CF3)2-(p-C6H4)-O}n- 등으로 대표되는 폴리술폰계 중합체, 폴리에테르이미드, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리페닐렌술피드, 폴리스티렌, 아크릴 중합체 등이고, 또한 후술하는 아민 잔기를 공유 결합으로 고정화시킬 수 있는 반응성 관능기를 갖는 것이 간편하게 사용된다. 그 중에서도, 폴리스티렌이나 폴리술폰계 중합체는 안정성이 높고, 또한 형상 유지성이 좋기 때문에 바람직하게 이용된다.
구체적인 예로서는, 상술한 반응성 관능기를 결합시킨 클로로아세트아미드메 틸화 폴리스티렌, 클로로아세트아미드메틸화한 유델 폴리술폰, 클로로아세트아미드메틸화한 폴리에테르이미드 등이 사용된다. 또한, 이들 중합체는 유기 용매에 대하여 가용인 것이 코팅 공정의 채용이 가능한 등 성형 용이성 면에서 특히 바람직하게 사용된다.
본 발명에서 사용하는 흡착체로서는, 흡착체를 구성하는 중합체(예를 들면 상기 수불용성 담체)에, 관능기로서 아민 잔기가 결합되어 이루어지는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 4급 암모늄기 또는 직쇄상 아미노기 또는 이들 양쪽의 기(이하, 4급 암모늄기 등이라고 함)를 고정화한 것이 바람직하다. 이들 관능기는 흡착체를 구성하는 수불용성 담체에 결합하는 것이 바람직하다. 4급 암모늄기 등을 수불용성 담체에 고정화하기 위한 반응성 관능기로서는, 할로메틸기, 할로아세틸기, 할로아세트아미드메틸기, 할로겐화알킬기 등의 활성 할로겐기, 에폭시드기, 카르복실기, 이소시안산기, 티오이소시안산기, 산 무수물기 등을 들 수 있지만, 특히 활성 할로겐기가 바람직하다. 그 중에서도, 할로아세틸기는 제조가 용이할 뿐만 아니라, 반응성이 적절히 높고, 4급 암모늄기 등의 고정화 반응이 온화한 조건으로 수행할 수 있음과 동시에, 이 때 생기는 공유 결합이 화학적으로 안정하기 때문에 바람직하다.
4급 암모늄기 등이란, 4급 암모늄 및/또는 1 내지 3급 아미노기를 의미한다. 1 내지 3급 아미노기로서는, 탄소수로 말하면, 질소 원자 1개당 탄소수 18 이하인 것이 반응율 향상을 위해 바람직하다. 또한, 1 내지 3급 아미노기 중에서도 질소 원자 1개당 탄소수 3 이상 18 이하, 특히 4 이상 14 이하의 알킬기를 갖는 3급 아 미노기가 중합체에 결합(고정화)되어 이루어지는 흡착체가 사이토카인 흡착성 측면에서 우수하다. 그와 같은 3급 아미노기의 구체예로서는, 트리메틸아민, 트리에틸아민, N,N-디메틸헥실아민, N,N-디메틸옥틸아민, N,N-디메틸라우릴아민, N-메틸-N-에틸-헥실아민 등을 들 수 있다. 또한, 직쇄상 아미노기를 갖는 화합물의 예로서는 테트라에틸렌펜타민 등을 들 수 있다. 이들 아미노기에 대해서는 일부 분지가 있는 구조의 것도 포함한다.
본 발명에서의 4급 암모늄기 등의 흡착재에 대한 결합 밀도는 수불용성 담체 등의 흡착재를 구성하는 중합체의 화학 구조 및 용도에 따라 다르지만, 너무 적으면 그의 기능이 발현되지 않은 경향이 있다. 한편, 너무 많으면, 고정화 후의 담체의 물리적 강도가 나빠지고, 흡착체로서의 기능도 내려가는 경향이 있다. 따라서, 상기 밀도는 수불용성 담체의 반복 단위당 0.01 내지 2.0몰, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0몰이 좋다. 또한, 4급 암모늄기 등을 고정화시키는 (4급화) 방법으로서는 요오드화칼륨을 촉매로 하는 반응이 자주 이용되지만, 여기에 구속되지 않고 공지된 방법에 의한 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상술과 같은 4급 암모늄기 등의 아민 잔기를 수불용성 담체 등에 결합시키는 방법은 특별히 상술한 반응에 한정되지 않는다. 예를 들면, 4급 암모늄기 등의 아민 잔기를 포함하는 중합체를 용매, 예를 들면 염화메틸렌, 테트라히드로푸란, N,N-디메틸포름아미드 등에 녹이고, 이 용액에 수불용성 담체로 이루어지는 부직포를 침지한 후, 이 용매를 증발시킴으로써 용이하게 제조된다.
한편, 본 발명의 흡착체는 수불용성 담체 등의 흡착재를 구성하는 중합체에 대하여, 상술한 바와 같이 관능기를 고정화시킴과 동시에, 또는 이 대신에 소수성 부위를 부여한 것일 수도 있다. 소수성 부위는, 예를 들면 알킬기(에틸기, 옥틸기, 헥실기, 라우릴기 등), 방향환을 포함하는 기 등이고, 중합체에 대하여 유기 반응으로 부여 도입할 수 있다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼은 사이토카인을 흡착할 수 있다. 사이토카인이란, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 종양괴사인자-α(TNF-α), 전이성장인자(TGF-β), 혈관신생증식인자(VEGF) 및 면역억제산성단백(IAP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이토카인이고, 2종 이상의 조합일 수도 있다. 이들은 모두 백혈구 제거 요법 적용이 고려되고 있고, 궤양성 대장염, 클론병, 만성 관절 류마티스 등으로 그 병의 용태로의 관여가 지적되고 있는 사이토카인이다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼에 있어서는 이들 중 흡착해야 할 사이토카인의 종류에 따라, 흡착체에 고정화하는 4급 암모늄기 등의 아민 잔기를 적절히 선택하면 좋다. 예를 들면, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 전이성장인자(TGF-β), 혈관신생증식인자(VEGF), 면역억제산성단백(IAP) 등을 표적으로 하는 경우에는 N,N-디메틸헥실아민, N,N-디메틸옥틸아민, N,N-디메틸라우릴아민 등을 흡착체에 고정화하면, 얻어지는 세포 흡착 컬럼에 흡착성을 부여할 수 있다. 또한, 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 활성형 전이성장인자(TGF-β), 종양괴사인자-α(TNF-α) 등을 표적으로 하는 경우에는 아민 성분으로서 테트라에틸렌펜타민을 흡착체에 고정화함으로써, 얻어지는 세포 흡착 컬럼에 흡착성을 부여할 수 있다. 또한, 복수의 종류의 관능기를 조합하여 고정화할 수도 있고, 예를 들면 4급 암모늄염 및 직쇄상 아미노기의 양쪽을 이용하는 것도 가능하다. 복수의 종류의 관능기를 조합하여 사용함으로써, 흡착되는 사이토카인의 종류에 폭을 갖게 할 수 있기 때문에 바람직하고, 원하는 사이토카인 흡착 특성을 높이는 등의 이점이 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 있어서 흡착체의 형상으로서는 특별히 한정은 없지만, 컬럼으로서 이용하는 경우에는 섬유, 막, 중공사가 바람직하고, 또한 형태로서는 섬유를 편직한 편지, 직물이나 부직포 등의 섬유 구조물이 바람직하다. 흡착체가 그것만으로 형태 유지될 수 있으면 단독으로의 사용도 가능하고, 형태 유지성이 낮으면 적당한 기재에 코팅 등의 방법으로 고정하거나, 다른 흡착체와 혼합하여 하나의 컬럼으로서 이용할 수도 있다. 고정화 또는 혼합 등의 조작은 상기 형상으로 가공하기 전에 행할 수도 있다.
본 발명에 있어서 부직포는 단독 섬유로 제조되는 것일 수도 있지만, 특히 해도형 복합 섬유로 제조되는 것이 바람직하다. 즉, 이러한 복합 섬유를 이용하여 공지된 방법에 의해 부직포로 하고 나서, 이 부직포를 형태 유지성을 향상시키고 부피 밀도를 조정하기 위해 니들 펀칭한 후, 해성분을 용해시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 흡착체의 제조 방법에 대하여, 흡착체의 형태로서 부직포를 예로 취하여 의태적으로 설명한다. 섬유 직경이 다른 복수 종류의 섬유를 재료로서 이용하는 경우에는 목적하는 혼합 비율이 되도록 계량하고, 혼합한 상태에서 카드를 통과시켜 서로 충분히 분산시켜 솜 형상으로 한다.
이 솜 형상물을 목표하는 평량이 되도록 칭량한 후 크로스 래퍼에 통과시켜 니들 펀칭하여 부직포를 제조한다. 또한, 형태 안정화를 위해, 이 부직포와 별도로 제조한 네트를 서멀 본딩법, 캘린더법, 니들 펀칭법 등의 공지된 웹 접착 방법으로 적층 구조로 할 수도 있다. 또한, 적층 구조로 하기 위한 보다 바람직한 방법은, 미리 예비 펀칭을 실시한 솜 형상물을 제조하고, 그 사이에 네트를 끼워 넣고 펀칭하여 부직포-네트-부직포의 층 구조를 갖는 흡착체를 제조하는 방법으로서, 간편하기 때문에 연속 생산에 적합하다. 또한, 예비 펀칭한 면상물의 한쪽 면에 네트 1장을 올려 둔 2층 구조의 것을 적층하여 다층 구조의 흡착체를 제조하는 것도 가능하다. 네트와의 2층 이상의 구조로 함으로써 형태 유지성의 향상이 개선된다. 부직포와 네트의 2층 구조일 수도 있고, 부직포 사이에 네트를 끼워 넣은 형상, 즉 부직포-네트-부직포의 샌드위치 구조를 취하는 것이 보다 바람직하다. 물론, 흡착체의 부피 밀도를 고려하여, 피처리 매체를 통과시켰을 때의 흡착체 전후에서의 압력 손실에 영향이 없는 범위에서 추가로 다층 구조로 하는 것도 가능하다.
본 발명에서의 네트의 소재로서는, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴계 중합체, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌(PP) 등의 공지된 중합체를 사용할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 부직포와 일체화한 후에 관능기 도입을 위한 유기 합성 반응에 제공하는 경우에는, 사용하는 용매의 종류나 반응 온도에 따라 적절히 소재를 선택하면 좋다. 특히, 생체 적합성 면이나 내증기멸균성 면에서는 PP가 특히 바람직하다. 방사선 멸균을 행하는 경우에는 폴리에스테르나 폴리에틸렌이 바 람직하다.
복수의 섬유가 합사된 실이나 방적사에 의해 네트 구조가 형성되어 있으면, 합사된 실 모양 사이 등을 혈액 등의 피처리 매체가 통과함에 따른 압력 손실 상승의 우려가 있기 때문에, 네트는 모노필라멘트로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 모노필라멘트이면 1개당의 기계적인 강력도 유지하기 쉽다.
모노필라멘트의 직경은 바람직하게는 50 ㎛ 이상 1 mm 이하이고, 마찬가지로 네트의 두께는 바람직하게는 50 ㎛ 이상 1.2 mm 이하이다. 이 이상보다 큰 범위에서도 가능하지만, 단위 부피당의 흡착체 그 자체의 분량을 감소시키게 되어 바람직하지는 않다.
네트의 구성으로서는 특별히 한정되지 않고, 결절망, 무결절망, 러셀망 등을 사용할 수 있다. 네트의 망눈의 형상(공극 형상)도 특별히 한정되지 않고, 직사각형, 마름모형, 구갑형 등을 사용할 수 있다. 또한, 네트의 구성재의 부직포에 대한 위치적인 관계를, 예를 들면 네트의 공극 형상이 사각형인 경우, 네트 및 부직포의 주면(主面)에서 봐서 부직포의 장축 또는 단축 방향에 대하여 각도 90도±10도의 방향을 이루도록 네트를 부직포에 적층하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 부직포를 적층했을 때의 강도나 취급 성능이 보다 향상되고, 제조시의 수율(원료에 대한 제품의 비율)도 향상된다.
네트를 이용함으로써, 부직포에 의해 형태 유지성을 부여할 수 있어, 부피 밀도가 작더라도 형태가 안정된 흡착체로 할 수 있다. 또한, 네트 자체가 피처리 매체의 압력 손실에 영향을 주기 때문에, 네트로서는 가능한 한 개공부가 큰 편이 바람직하다. 이를 위해서는 임의의 100 mm2 중에 10 mm2 이상의 공극을 갖는 것인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 3 mm변(角) 정도의 개공부를 갖는 것이면, 형태 유지성도 양호해져 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 흡착재의 형태는 특히 부직포로 하는 것이 바람직하지만, 그 경우, 부직포의 부피 밀도는 너무 크면 눈막히기 쉬워지고, 반대로 너무 작으면 형태 유지성이 나빠지기 때문에, 0.02 내지 0.15 g/cm3인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.15 g/cm3인 것이 사용된다. 흡착체 중 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유 부분의 부피 밀도는 0.01 g/cm3 이상인 것이 바람직하고, 0.03 g/cm3 이상인 것이 보다 바람직하다. 또한, 눈막힘을 방지하기 위해서는 0.15 g/cm3 이하인 것이 바람직하고, 0.13 g/cm3 이하인 것이 보다 바람직하다. 여기서 말하는 부피 밀도란, 펠트형으로 가공한 시트로서, 원하는 관능기 도입 반응 등을 실시하여 얻어지는 시트형 물체 등, 최종 단계에서의 흡착체의 부피 밀도를 가리킨다. 부피 밀도를 크게 하면 백혈구나 세포 등의 큰 물질을 여과하는 능력이 향상되지만, 너무 크면 혈액 순환시에 눈막히기 쉬워지기 때문에, 상기 범위가 바람직하다.
부피 밀도의 측정은 예를 들면 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 흡착체를 3 cm변의 정방형의 소편으로 절단한 후, 5 cm변이고 1 mm 두께의 폴리프로필렌(PP)제 판을 두께 방향으로 중첩하도록 위에서 올려 둔 상태에서 흡착체의 두께를 측정하고, 판을 떼어 다시 올려두고 나서 흡착체의 두께를 측정한다. 이상의 조작을 5회 반복하고, 그의 평균치를 두께로 한다. 이 소편의 무게를 상기 두께로부터 산출한 부피로 나눔으로써 부피 밀도를 구한다. 이상의 부피 밀도 측정을 5 샘플에서 실시하고, 평균치를 부피 밀도로 한다. 네트를 갖는 경우에는 상기 방법으로 네트를 갖는 소편에 대하여 두께를 측정하여 산출한 부피와, 소편의 무게로부터 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유의 중량 및 네트 중량을 뺀 중량으로부터 마찬가지로 부피 밀도를 계산하여 구한다. 또한, 컬럼 용기에 흡착체를 충전할 때에는 부피 밀도가 변화되지 않도록 충전하는 것이 필요하다.
컬럼을 통과시키는 혈액량이 1500 ㎖ 이상까지 눈막힘이 생기지 않는 것이란, 상술한 큰 부피의 제어에 의해 실현할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 흡착 컬럼의 이용에 대하여 일례를 들어 설명한다. 본 발명의 컬럼은 유입구와 유출구를 갖는 용기를 포함하고, 그 용기 내에 세포 흡착용 흡착체가 충전되고, 상기 세포 흡착용 흡착체에 접촉 전 또는 접촉 후의 혈액을 유도하는 유로를 갖도록 구성되어 있다. 유로는 유입구 및 유출구 중 어디에든 연통되어 있고, 유입구로부터 유입된 체액이 유로를 경유하고, 그 전후 중 어느 하나에서 세포 흡착용 흡착체에 접촉하고 유출구로부터 유출되도록 되어 있다.
이들 유입구와 유출구는, 체외 순환하여 이용하는 세포 흡착 컬럼에 체액을 유입·유출시키는 수단으로서, 체외 순환의 치료에 사용할 때 순환계의 회로에 접속되는 부위가 된다. 형상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 체외 순환용 회로를 형성하는 튜브에 접속시킬 수 있는 형태인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 커넥터 형상을 갖고, 회로 튜브와의 착탈이 용이하게 되어 있는 것이 바람직하다.
상기 유로는 혈액을 컬럼의 내부로 유도하거나, 혹은 컬럼에 공급된 혈액을 컬럼 밖으로 도출하는 작용을 갖고, 그의 유도 작용에 의해 혈액을 세포 흡착용 흡착체에 균일하게 공급하여 접촉시키도록 한다. 이 유도용 유로를 갖지 않는 컬럼의 경우에는 세포 흡착용 흡착체의 충전 양태에 따라서는 편류를 발생시키는 경우가 있다. 편류가 발생하면, 정화용 충전재에 체액을 균일하게 접촉시킬 수 없게 되어, 정화 능력을 저하시키는 원인이 된다.
유로의 형상은 체액의 유도 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 단면 형상이 원형, 사각형, 삼각형, 그 밖의 다각형의 단면을 갖는 파이프나 이를 조합한 형상의 파이프, 가는 막대를 우물 정자 형태로 짜서 쌓아 올린 형상체, 중공사를 묶은 집속체, 일단 파이프의 주위에 도포 고화시켜 유로를 형성한 후, 그 파이프를 추출한 후의 공간 등을 들 수 있다. 유로의 길이 방향의 형상으로서는 체액의 체류 등을 일으키지 않도록 하기 위해 직선형으로 똑바른 것이 바람직하다. 또한, 유동 방향을 따라서 완만하게 테이퍼가 붙어 있는 형상이 바람직하다.
본 발명의 세포 흡착 컬럼의 내부의 구성의 일례를 도 1에 따라 설명한다. 도 1에 있어서, 1은 용기 본체이고, 그의 길이 방향의 전단과 후단에 유입구 (2)와 유출구 (3)을 설치하고 있다. 유입구 (2)의 내측에는 필터 (4)와 원판형의 칸막이판 (5)가 설치되고, 또한 유출구 (3)의 내측에는 필터 (6)과 원판형의 칸막이판 (7)이 설치되어 있다.
2장의 칸막이판 (5, 7) 중, 전측(유입구측)의 칸막이판 (5)에는 중심부에 개구 (5a)가 설치되고, 또한 후측의 칸막이판 (7)의 중심부에는 지지 돌기 (7a)가 설치되어 있다. 또한, 칸막이판 (7)의 외주에는 다수의 투과 구멍 (7b)가 둘레 방향으로 간헐적으로 설치되어 있다. 또한, 칸막이판 (5)의 개구 (5a)와 칸막이판 (7)의 지지 돌기 (7a) 사이에 1개의 파이프 (8)이 걸쳐져 있다.
상기 파이프 (8)은 혈액을 유도하는 유로 (9)를 내측에 형성하고, 또한 주벽에 다수의 관통 구멍 (10)을 설치하고 있다. 또한, 파이프 (8)은 전단을 칸막이판 (5)의 개구 (5a)에 연통시킴과 동시에, 후단을 칸막이판 (7)의 지지 돌기 (7a)에 의해 폐지하고 있다. 이 파이프 (8)의 외주에, 흡착체 (11)이 몇겹이나 복수층으로 권취되어 있다.
이 세포 흡착 컬럼을 순환법에 사용할 때에는 유입구 (2)와 유출구 (3)에, 혈액 풀과의 사이에 순환 회로를 형성한 튜브를 연결하고, 그 혈액 풀로부터 취출되는 혈액을 유입구 (2)에 공급하고, 내부의 흡착체 (11)로 유해 물질을 제거하여 유출구 (3)으로부터 유출되고, 다시 혈액 풀로 복귀하도록 순환시킨다.
컬럼 내에서는 유입구 (2)로부터 필터 (4)를 거쳐서 유로 (9)에 침입한 혈액은 유로 (9)를 이동하면서 관통 구멍 (10)으로부터 순차적으로 흡착체 (11)에 침입하고, 반경 방향 중 어느 한쪽으로 이동하면서 세포 등을 흡착한다. 세포 등이 제거된 혈액은 칸막이판 (7)의 외주의 다수의 투과 구멍 (7b)로부터 유출되고, 필터 (6)을 거쳐 유출구 (3)으로부터 유출된다.
상기 예에서는 혈액이 개구 (5a)로부터 파이프 (8) 내의 유로 (9)를 유동하면서 관통 구멍 (10)으로부터 유출되지만, 본 발명의 세포 흡착 컬럼에서의 혈액의 이동 방향은 상기와는 반대로 하여 유출구 (3)으로부터 혈액을 공급하고, 유입구 (2)로부터 유출시키도록 할 수 있다.
이하, 실험예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 발명의 내용이 실시예로 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서의 평가 항목 및 측정·산출 조건에 대하여 먼저 설명한다.
(혈구수의 측정)
혈액 내의 혈구수의 정량, 헤마토크리트값의 측정은 시스멕스사 XT-1800iV를 이용하여 행하였다. 여기서, 과립구수는 호중구수를 가지고 계산하였다.
(사이토카인 흡착 평가)
사이토카인 흡착 평가는 소 태아 혈청에 인간 천연형 IL-1, IL-6을 첨가하여 각각 500 pg/㎖로 제조하였다. 이 혈청에 흡착체를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 진탕하고, 상청을 채취하여 샘플로 하였다. 흡착체:혈청량=30 mg:1 ㎖의 고액비로 통일하고, 진탕 전후의 사이토카인량을 하기 식에 의해 구하여 사이토카인 흡착율(제거율)을 측정하였다. 정량은 EIA법을 이용하고, 시판되는 키트(IL-1: R & D System사 제조의 인간 IL-1β ELISA 키트, IL-6: 가마쿠라 테크노사이언스 제조)를 이용하여 행하였다.
사이토카인 흡착율(％)=[(진탕 전의 혈청 중의 사이토카인 농도)-(진탕 후의 혈청 중의 사이토카인 농도)]/(진탕 전의 혈청 중의 사이토카인 농도)×100
(섬유 직경의 측정)
부직포로부터 랜덤하게 소편 샘플 10개를 채취하고, 주사형 전자 현미경(니혼 덴시 가부시끼가이샤 제조, JSM-5400LV)으로 1000 내지 3000배의 사진을 촬영하였다. 각 샘플로부터 10개씩 총 100개의 섬유를 선택하여 각 섬유의 직경을 사진을 기초로 측정하고, 이들의 평균치를 산출하여 소수점 이하 첫째 자리를 사사오입하여 섬유 직경으로 하였다.
(표면적의 측정)
컬럼 용기에 충전된 흡착체의 표면적의 평가 방법으로서는 수은 포로시메트리법을 이용하였다. 압력 범위는 0.4 내지 3000 psia로 하여 측정하였다. 건조된 흡착체를 칭량하고, 장치는 마이크로메리텍스사 제조의 포어사이저 9320을 이용하였다.
(부피 밀도의 측정)
제조예에서 제조한 흡착체를 임의의 3 cm변의 정방형의 소편으로 절단한 후, 5 cm변이고 1 mm 두께의 PP제 판을 두께 방향으로 중첩하도록 위에서 올려 둔 상태에서 흡착체의 두께를 측정하고, 판을 떼어 다시 올려 두고 나서 흡착체의 두께를 측정하였다. 이렇게 해서 측정을 5회 행하고, 이들의 평균치를 두께로 하였다. 이 소편의 무게를 상기 두께로부터 산출한 부피로 나눔으로써 부피 밀도를 구하였다. 이상의 부피 밀도 측정을 각 흡착체에 대하여 5 샘플에서 실시하고, 그의 평 균치를 부피 밀도로 하였다. 네트를 갖는 경우에는 상기 방법으로 네트를 갖는 소편에 대하여 두께를 측정하여 산출한 부피와, 소편의 무게로부터 네트 중량을 뺀 중량으로부터 마찬가지로 부피 밀도를 계산하여 구하였다.
(흡착체 충전 용적의 측정)
흡착체 충전 용적(표 중에서는 "충전 용적"이라 약기함)이란, 세포 흡착 컬럼 중에서 흡착체를 충전하는 공간 전체의 용적을 말한다. 바꿔 말하면, 혈액 유입, 유출구를 폐쇄한 상태에서의 내용적 전체를 의미하며, 흡착체나 필터 등의 충전물을 제거한 상태에서 충전할 수 있었던 비중 기지의 물의 양으로부터 구하였다.
(흡착체 단위 중량당 혈구의 흡착수의 측정-순환법)
세포 흡착 컬럼을 이용하여, 체중이 약 10 kg(9 내지 12 kg)인 건강한 개(견종: 비글견, 성별: 수컷, 연령: 반년 내지 2살. 또한, 구입 후 1주일 사육하여 체중 감소가 없는 것을 확인하였음)에 대하여, 혈액의 헤마토크리트값을 40％가 되도록 생리식염수를 수액하고, 혈류 속도 30 ㎖/분으로 체외순환시험을 행하였다. 순환 개시시 5분, 15분, 30분, 60분의 4점에서 컬럼 전후에서 채혈하고(각 1 ㎖), (혈구수의 측정)에 기재한 방법으로 혈구수를 측정하였다. 샘플 채취 시간 t(분)에서의 혈액 1 ㎖ 중의 흡착체의 단위 중량당의 세포 흡착수를 Dt로 하여 이하의 식으로 구하였다.
Dt(개/g)=[(컬럼 순환 전의 혈액 1 ㎖ 중의 혈구수)-(컬럼 순환 후의 혈액 1 ㎖ 중의 혈구수)]
흡착체 단위 중량당의 혈구의 흡착수 D는 이하의 식으로 구하였다.
D(개/g)=30×(5×D5+10×D15+15×D30+30×D60)/흡착체 중량(g)
또한, 후술하는 실시예에서는 컬럼 전후의 압력 손실을 혈액 처리량 1500 ㎖, 1750 ㎖의 시점에 측정하였다.
(흡착체 단위 중량당 혈구의 흡착수의 측정-미니컬럼법)
미니컬럼법에 의해 스케일 다운하여 실시하였다. 컬럼 크기에 맞추어 혈류 속도를 실제 컬럼(흡착체 충전 용적 100 ㎖ 상당) 사용시의 30 ㎖/분에 상당하는 0.65 ㎖/분으로 설정하였다.
흡착체의 각각 소정량을 내용적 2 ㎖의 원통형 컬럼(내경 1 cm)에 직경 1 cm의 원판형으로 오려내고, 적층하여 충전하고, 37℃에서 1시간 동안 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)한 건강인 자원봉사자의 혈액 25 ㎖를 0.65 ㎖/분의 혈류 속도로 순환시킨 후, 순환 개시시(0분)와 순환 종료시(1시간)에 있어서 각 1 ㎖의 혈액을 채취하고, 혈구의 조성을 (혈구수의 측정)에서의 방법으로 측정하였다. 샘플 채취 시간 t(분)에서의 혈액 1 ㎖ 중의 세포 흡착수를 Dt로 하여 이하의 식으로 구하고, 흡착체 단위 중량당의 혈구의 흡착수 D'는 이하의 식으로 구하였다.
D'(개/g)=25×(D0-D60)/흡착체 중량(g)
본 시험법은 순환법의 스케일 다운 실험이라 위치 부여하고, 충전 용적 100 ㎖로 했을 경우의 흡착체 표면적을 본 시험에 사용한 흡착체 표면적의 50배로 하여 취급하였다.
상기 2 방법 중 어느 하나로 상기 수학식 1 및 수학식 2에서의 a, b, c를 구하였다. 수학식 1의 a/2c에 대해서는 소수점 이하 둘째 자리를 사사오입하여 구하 는 것으로 하였다.
[제조예 1: 흡착체 1 내지 4의 제조]
(부직포 1, 2)
36섬의 해도 복합 섬유이며, 섬이 추가로 코어쉘 복합에 의해 이루어지는 것을, 다음 성분을 이용하여 방사 속도 850 m/분, 연신 배율 3배의 제사 조건으로 얻었다.
섬의 코어 성분; 폴리프로필렌
섬의 쉘 성분; 폴리스티렌 90 중량％, 폴리프로필렌 10 중량％
해(海)성분; 에틸렌테레프탈레이트 단위를 주요한 반복 단위로 하고, 공중합 성분으로서 5-나트륨술포이소프탈산 3 중량％를 포함하는 공중합 폴리에스테르(PETIFA)
복합 비율(중량 비율); 코어:쉘:해=41:41:18
이 섬유 30 중량％(직경 30 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 70 중량％를 포함하는 시트형 물체를 제조한 후, 니들 펀칭함으로써 부직포를 얻었다(부직포 1). 마찬가지로 이 섬유 68 중량％(직경 30 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 32 중량％를 포함하는 시트형 물체를 제조한 후, 니들 펀칭함으로써 부직포를 얻었다(부직포 2).
(탈해 부직포 1, 2)
다음으로, 이 부직포 1, 2를 각각 90℃ 수산화나트륨 수용액(3 중량％)으로 처리하고, 해성분인 PETIFA를 이 수용액에 용해시켰다. 이에 따라, 부직포 1로부 터 코어쉘 섬유의 직경이 4 ㎛이고 부피 밀도가 0.05 g/cm3(총 평량 250 g/m2)인 탈해 부직포 1을 제조하고, 부직포 2로부터 코어쉘 섬유의 직경이 4 ㎛이고 부피 밀도가 0.05 g/cm3(총 평량 250 g/m2)인 탈해 부직포 2를 제조하였다.
(중간체 1, 2)
다음으로, 니트로벤젠 1200 mL와 황산 780 mL의 혼합액에 파라포름알데히드 6 g을 20℃에서 용해시킨 후, 0℃로 냉각하고, 151.8 g의 N-메틸올-α-클로로아세트아미드를 가하고, 5℃ 이하에서 용해시켰다. 여기에 20 g의 상기 탈해 부직포 1, 2를 침지하고, 실온에서 2시간 정치하였다. 그 후, 섬유를 취출하고, 대과잉의 냉메탄올 중에 넣어 세정하였다. 세정 후의 섬유를 메탄올로 잘 씻은 후, 수세하고, 건조하였다. 이렇게 해서, 탈해 부직포 1로부터 24 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 1)를 제조하고, 탈해 부직포 2로부터 26.8 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 2)를 제조하였다.
(흡착체 1, 2)
N,N-디메틸옥틸아민 100 g과 요오드화칼륨 16 g을 720 mL의 N,N-디메틸포름아미드(이하 DMF라 약칭함)에 녹인 용액에 10 g의 중간체 1, 2를 각각 침지하고, 85℃의 버스 중에서 3시간 가열하였다. 가열 후의 섬유를 메탄올로 세정하고, 1 mol/L 농도의 식염수에 침지한 후, 수세하고, 진공 건조하였다. 이렇게 해서, 중간체 1로부터 13.4 g의 디메틸옥틸암모늄화 섬유(흡착체 1)를, 중간체 2로부터 15.8 g의 디메틸옥틸암모늄화 섬유(흡착체 2)를 얻었다.
(흡착체 3, 4)
또한, 테트라에틸렌펜타민 6.3 g, n-부틸아민 7.2 g을 DMF 500 ㎖에 용해시킨 액에, 10 g의 중간체 1, 2를 각각 침지하고, 반응은 30℃에서 3시간 행하고, DMF로 세정한 후에 수세하고, 진공 건조함으로써, 중간체 1로부터 13.9 g의 테트라에틸렌펜타민화 섬유(흡착체 3)를, 중간체 2로부터 16.6 g의 테트라에틸렌펜타민화 섬유(흡착체 4)를 얻었다.
[제조예 2: 흡착체 5, 6의 제조]
(부직포 3, 4)
36섬의 해도 복합 섬유이며, 섬이 추가로 코어쉘 복합에 의해 이루어지는 것을 다음 성분을 이용하여 방사 속도 850 m/분, 연신 배율 2배의 제사 조건으로 얻었다.
섬의 코어 성분; 폴리프로필렌
섬의 쉘 성분; 폴리스티렌 90 중량％, 폴리프로필렌 10 중량％
해성분; PETIFA
복합 비율(중량 비율); 코어:쉘:해=41:41:18
이 섬유 30 중량％(직경 40 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 70 중량％를 포함하는 시트형 물체를 제조한 후, 니들 펀칭함으로써 부직포를 얻었다(부직포 3). 마찬가지로 이 섬유 68 중량％(직경 40 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 32 중량％를 포함하는 시트형 물체를 제조한 후, 니들 펀칭함으로써 부직포를 얻었다(부직포 4).
(탈해 부직포 3, 4)
다음으로, 이 부직포 3, 4를 각각 90℃ 수산화나트륨 수용액(3 중량％)으로 처리하고, 해성분의 PETIFA를 이 수용액에 용해시켰다. 이에 따라, 부직포 3으로부터 코어쉘 섬유의 직경이 8 ㎛이고 부피 밀도가 0.13 g/cm3(총 평량 250 g/m2)인 탈해 부직포 3을 제조하고, 부직포 4로부터 코어쉘 섬유의 직경이 8 ㎛이고 부피 밀도가 0.13 g/cm3(총 평량 250 g/m2)인 탈해 부직포 4를 제조하였다.
(중간체 3, 4)
다음으로, 니트로벤젠 1200 mL와 황산 780 mL의 혼합액에 파라포름알데히드 6 g을 20℃에서 용해시킨 후, 0℃로 냉각하고, 151.8 g의 N-메틸올-α-클로로아세트아미드를 가하여 5℃ 이하에서 용해시켰다. 여기에 20 g의 상기 탈해 부직포 3, 4를 침지하고, 실온에서 2시간 정치하였다. 그 후, 섬유를 취출하여 대과잉의 냉메탄올 중에 넣고, 세정하였다. 세정 후의 섬유를 메탄올로 잘 씻은 후, 수세하고, 건조하였다. 이렇게 해서, 탈해 부직포 3으로부터 23.7 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 3)를 제조하고, 탈해 부직포 4로부터 27.1 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 4)를 제조하였다.
(흡착체 5, 6)
N,N-디메틸헥실아민 100 g과 요오드화칼륨 16 g을 720 mL의 DMF에 녹인 용액에 10 g의 중간체 3, 4를 각각 침지하고, 85℃의 버스 중에서 3시간 가열하였다. 가열 후의 섬유를 메탄올로 세정하고, 1 mol/L 농도의 식염수에 침지한 후, 수세하 고, 진공 건조하였다. 이렇게 해서, 중간체 3으로부터 12.8 g의 디메틸헥실암모늄화 섬유(흡착체 5)를, 중간체 4로부터 14.3 g의 디메틸헥실암모늄화 섬유(흡착체 6)를 얻었다.
[제조예 3: 흡착체 7, 8의 제조]
(부직포 5, 6)
36섬의 해도 복합 섬유이며, 섬이 추가로 코어쉘 복합에 의해 이루어지는 것을 다음 성분을 이용하여 방사 속도 880 m/분, 연신 배율 3배의 제사 조건으로 얻었다.
섬의 코어 성분; 폴리프로필렌
섬의 쉘 성분; 폴리스티렌 90 중량％, 폴리프로필렌 10 중량％
해성분; PETIFA
복합 비율(중량 비율); 코어:쉘:해=41:41:18
이 해도 복합 섬유 30 중량％(직경 30 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 70 중량％를 태프트 블렌더를 이용하여 충분히 혼합 분산시키고, 카드를 통과시켜 시트형 물체를 제조하였다. 그 후, 개공부가 2 mm변인 폴리에스테르제 네트(두께 0.4 mm, 모노필라멘트의 직경 0.3 mm, 평량 75 g/m2)를, 시트형 물체의 양단 축에 대하여 네트의 섬유 방향이 5도를 이루도록 시트형 물체 사이에 끼우고, 크로스 래퍼에 통과시켜 목표하는 평량이 되도록 칭량한 후, 니들 펀칭하였다. 이렇게 해서 3층 구조로 이루어지는 부직포를 제조하였다(부직포 5). 마찬가지로 이 해도 복합 섬유 68 중량％(직경 30 ㎛)와 직경 22 ㎛의 폴리프로필렌 32 중량％로부터 3층 구조로 이루어지는 부직포를 얻었다(부직포 6).
(탈해 부직포 5, 6)
다음으로, 이 부직포 5, 6을 각각 90℃ 수산화나트륨 수용액(3 중량％)으로 처리하고, 해성분인 PETIFA를 이 수용액에 용해시켰다. 이에 따라, 부직포 5로부터 코어쉘 섬유의 직경이 4 ㎛이고 부피 밀도가 0.01 g/cm3(총 평량 80 g/m2)인 탈해 부직포 5를 제조하고, 부직포 6으로부터 코어쉘 섬유의 직경이 4 ㎛이고 부피 밀도가 0.05 g/cm3(총 평량 80 g/m2)인 탈해 부직포 6을 제조하였다.
(중간체 5, 6)
다음으로, 니트로벤젠 1200 mL과 황산 780 mL의 혼합액에 파라포름알데히드 6 g을 20℃에서 용해시킨 후, 0℃로 냉각하고, 151.8 g의 N-메틸올-α-클로로아세트아미드를 가하여 5℃ 이하에서 용해시켰다. 여기에 20 g의 상기 탈해 부직포 5, 6을 침지하고, 실온에서 2시간 정치하였다. 그 후, 섬유를 취출하여 대과잉의 냉메탄올 중에 넣고, 세정하였다. 세정 후의 섬유를 메탄올로 잘 씻은 후, 수세하고, 건조하였다. 이렇게 해서, 탈해 부직포 5로부터 24 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 5)를 제조하고, 탈해 부직포 6으로부터 26.8 g의 α-클로로아세트아미드메틸화 폴리스티렌 섬유(중간체 6)를 제조하였다.
(흡착체 7, 8)
N,N-디메틸옥틸아민 100 g과 요오드화칼륨 16 g을 720 mL의 DMF에 녹인 용액 에 10 g의 중간체 5를, N,N-디메틸헥실아민 100 g과 요오드화칼륨 16 g을 720 mL의 DMF에 녹인 용액에 10 g의 중간체 6을 각각 침지하고, 85℃의 버스 중에서 3시간 가열하였다. 가열 후의 섬유를 메탄올로 세정하고, 1 mol/L 농도의 식염수에 침지한 후, 수세하고, 진공 건조하였다. 이렇게 해서, 중간체 5로부터 13.4 g의 디메틸옥틸암모늄화 섬유(흡착체 7)를, 중간체 6으로부터 15.8 g의 디메틸헥실아민암모늄화 섬유(흡착체 8)를 얻었다.
[제조예 4: 흡착체 9, 10의 제조]
제조예 2에서, 총 평량이 330 g/m2가 되도록 섬유량을 늘리고, 펀칭 횟수를 배로 함으로써 제조예 2와 마찬가지로 부직포 7, 8, 탈해 부직포 7, 8, 중간체 7, 8, 흡착체 9, 10을 제조하였다.
[제조예 5: 컬럼 1 내지 12의 제조]
상기에서 얻어진 흡착체 1 내지 10을 폭 47 mm, 길이 377 mm로 잘라낸 후, 외경 8 mm의 원통형이고, 또한 개구율 40％의 직경 4 mm의 구멍을 갖는 폴리프로필렌제 코어재에 롤형으로 약 6 회전분 권취하고, 도 1에 나타낸 것과 동일한 형상의 컬럼 케이스에 도입하여, 내경이 36 mm, 충전 용적이 70 ㎖인 컬럼 1 내지 10(각각 흡착체 1 내지 10에 대응)을 제조하였다.
또한, 상기에서 얻어진 흡착체 1 및 2를, 폭 47 mm, 길이 528 mm로 잘라낸 후, 외경 8 mm의 원통형이고, 또한 개구율 40％의 직경 4 mm의 구멍을 갖는 폴리프로필렌제 코어재에 롤형으로 약 6 회전분 권취하고, 도 1에 나타낸 것과 동일한 형 상의 컬럼 케이스에 도입하여, 충전 용적이 95 ㎖인 컬럼 11 내지 12를 제조하였다.
[실시예 1 내지 10]
얻어진 컬럼 1 내지 8과 11, 12의 10개를 이용하여, 개(체중: 9 내지 12 kg, 견종: 비글견, 성별: 수컷, 연령: 반년 내지 2살. 또한, 구입 후 1주일 사육하여 체중 감소가 없는 것을 확인하였음)를 이용한 체외순환시험을 행하였다. 혈액의 흐름은 컬럼의 외측으로부터 내측으로 흐르는 방향에서 통일시켰다. 동물을 펜토바르비탈나트륨(넴부탈: 다이닛본 세이야꾸(주)) 약 25 mg/kg의 복강내 투여에 의해 마취하고, 진정화한 것을 확인한 후, 수술대 상에 등 부위에 고정하였다.
지속적 혈액 여과 투석 장치(TR-520: 도레이 메디칼(주))에 지속 여과용 혈액 회로(U-525MCB: (주)우베 쥰켄)를 부착하였다. 헤파린 주입 라인을 포함한 회로의 동맥측을, 기포가 남지 않도록 생리 식염액(오쓰카 세이쇼꾸 츄: (주)오쯔카 세이야꾸 고죠)으로 채운 후, 컬럼에 기포가 들어가지 않도록 컬럼 입구측에 접속시키고, 추가로 컬럼의 출구측에 정맥측 회로를 접속시켰다. 컬럼 입구측을 밑으로 하여, 혈액 펌프를 이용하여 생리 식염액 2 L를 흘렸다(유량: 100 mL/분). 다음으로, 컬럼을 상하 반대로 하여, 컬럼 입구측을 위로 세팅하고, 500 mL의 생리 식염액에 5000 U의 헤파린(헤파린 나트륨 주사액 "시미즈": 시미즈 세이야꾸(주))을 첨가하여 제조한 헤파린 첨가 생리 식염액을 흘렸다(유량: 50 mL/분). 또한, 200 U/mL 농도의 헤파린 첨가 생리 식염액을 약 30 mL 넣은 50 mL 용량의 주사통을 동맥측 회로의 헤파린 주입 라인에 세팅하였다.
처치 전에 전완정맥으로부터 채취한 혈액을 이용하여 헤마토크리트값(i-STAT: 후소 야꾸힌 고교(주))을 측정하고, 순환 개시 전의 헤마토크리트값이 40％가 되도록 수액량을 산출하여, 생리 식염액을 요측피정맥으로부터 주입하였다. 또한, 순환 중의 수액으로서 40 mL의 생리 식염액을 1시간에 걸쳐 요측피정맥으로부터 주입하였다.
동물의 마취 상태가 안정된 것을 확인한 후, 체중이 10 kg 전후인 개에 대하여 좌측 대퇴부를 절개하여 대퇴동정맥을 노출시키고, 캐뉼러(서플로우 유치침 14G×2" 또는 16G×2": 데루모(주))를 이용하여 대퇴동정맥과 지속 여과용 혈액 회로를 접속시켰다.
혈액 순환 펌프 및 헤파린 함유 시린지 펌프를 스타트시켜 혈액 순환을 개시하였다. 혈액의 순환은 초기값을 20 mL/분으로 설정하고, 5분 후에는 30 mL/분으로 하여 60분간 행하였다. 혈액 회로의 컬럼 입구 직전의 항응고제 주입 라인 앞부위로부터 헤파린 1500 U/body를 단회 투여하고, 그 후 140 U/kg/hr의 헤파린을 헤파린 주입 라인으로부터 지속 투여하였다. 혈액 순환 개시시 및 종료시(개시 1시간 후)에 컬럼 직전 및 직후의 혈액 회로에 있는 채혈 버튼으로부터 1 ㎖씩 채혈하여 혈액 샘플로 하였다. 이상의 조작의 종료 후, 혈관으로부터 캐뉼러를 제거한 후, 이들 혈관을 결찰하고, 절개부에 암피실린나트륨(주사용 빅실린: 메이지 세이카(주))-생리 식염액(주사용 빅실린의 1 바이알(역가: 500 mg)에 생리 식염액 20 mL를 가하여 용해)을 분무 및 황산겐타마이신(겐타신 연고 1 mg 역가: 쉐링 플라우(주))을 도포한 후, 외과적으로 피부를 봉합하였다. 실험 중에는 체온 저하 방 지를 위해 워머((주)나쓰메 세이사꾸쇼)를 이용하여 동물을 보온하였다. 동물이 마취에서 깨어난 것을 확인한 후, 원래의 우리에 복귀시켰다. 상술한 (흡착체 단위 중량당 혈구의 흡착수의 측정-순환법)에 따라, 채취한 혈액 샘플을 이용하여 혈액 흡착수를 평가한 결과는 표 1에 나타내었다. 또한, 표 1에는 각 실시예에서 이용한 컬럼 내의 흡착체의, 표면적, 충전 용적, 섬유 직경, 흡착 관능기, 흡착체 중량, 흡착체 번호, 압력 손실 및 부피 밀도를 아울러 나타내었다.
[비교예 1, 2]
얻어진 컬럼 9, 10의 2개를 이용하여 실시예 1 내지 10과 마찬가지로 개를 이용한 체외순환시험을 행하였다. 결과는 표 1에 나타내었다. 또한, 표 1에는 비교예 1, 2에서 이용한 컬럼 내의 흡착체의, 표면적, 충전 용적, 섬유 직경, 흡착 관능기, 흡착체 중량, 흡착체 번호, 압력 손실 및 부피 밀도를 아울러 나타내었다.
Figure 112009018652106-pct00001
[실시예 11 내지 18]
건강인 자원봉사자의 혈액 50 ㎖를 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)하고, 그 안에 500 pg/㎖이 되도록 인간 천연형 IL-1, IL-6을 용해시키고, 흡착체 1 내지 8을 이용하여 사이토카인 흡착 평가의 검토를 행하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.
Figure 112009018652106-pct00002
[실시예 19 내지 26]
흡착체 1, 2, 5, 6, 7, 8의 각각 소정량을 내용적 2 ㎖의 원통형 컬럼에 충전하였다. 37℃에서 1시간 동안 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)한 건강인 자원봉사자의 혈액 25 ㎖를 0.65 ㎖/분의 혈류 속도로 각 컬럼을 순환시켰다. 상술한 (흡착체 단위 중량당 혈구의 흡착수의 측정-미니컬럼법)에 따라 세포 흡착 컬럼의 혈액 흡착수를 평가하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 또한, 표 3에는 각 실시예에서 이용한 컬럼 내의 흡착체의, 표면적, 충전 용적, 섬유 직경, 흡착 관능기, 흡착체 중량, 및 흡착체 번호를 나타내었다.
Figure 112009018652106-pct00003
[비교예 3,4]
흡착재 2, 5의 각각 소정량을 내용적 2 ㎖의 원통형 컬럼에 충전하였다. 37℃에서 1시간 동안 헤파린 채혈(헤파린 농도: 10 U/㎖)한 건강인 자원봉사자의 혈액 25 ㎖를 0.65 ㎖/분의 혈류 속도로 각 컬럼을 순환시켰다. 상술한 (흡착체 단위 중량당 혈구의 흡착수의 측정-미니컬럼법)에 따라 세포 흡착 컬럼의 혈액 흡착수를 평가하였다. 결과를 실시예 1 내지 10과 동일한 평가 결과와 함께 표 4에 나타내었다. 또한, 표 4에는 비교예 3, 4에서 이용한 컬럼 내의 흡착체의, 표면적, 충전 용적, 섬유 직경, 흡착 관능기, 흡착체 중량, 및 흡착체 번호를 아울러 나타내었다.
Figure 112009018652106-pct00004

Claims (14)

  1. 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유를 포함하고, 표면적이 0.5 m2 이상 10 m2 미만이며, 섬유 직경이 0.5 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 섬유로 이루어지는 부분의 부피 밀도가 0.01 g/cm3 이상 0.15 g/cm3 이하인 흡착체를 충전하여 이루어지는 세포 흡착 컬럼이고, 흡착체 충전 용적이 100 ㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 섬유 직경이 3 ㎛ 이상 10 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는, 세포 흡착 컬럼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 흡착체에 아민 잔기를 결합시켜 이루어지는 세포 흡착 컬럼.
  5. 제1항에 있어서, 사이토카인을 흡착하는 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
  6. 제5항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 종양괴사인자-α(TNF-α), 전이성장인자(TGF-β), 혈관신생증식인자(VEGF) 및 면역억제산성단백(IAP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
  7. 제1항에 있어서, 혈액을 순환시키는 용도에 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
  8. 제7항에 있어서, 건강인의 혈액을 혈류 속도 30 ㎖/분으로 하여 1시간 컬럼 내를 통과시켰을 때, 이하의 수학식 1 및 2를 만족시키는 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
    <수학식 1>
    2c<a
    <수학식 2>
    b>106
    여기서,
    a: 흡착체 단위 중량 당의 과립구 흡착수(개/g)
    b: 흡착체 단위 중량 당의 단구 흡착수(개/g)
    c: 흡착체 단위 중량 당의 림프구 흡착수(개/g)
  9. 제1항에 있어서, 건강견을 이용한 체외순환시험에 있어서, 생리식염수를 이용하여 헤마토크리트값을 40％로 조절한 혈액을, 30 ㎖/분의 속도로 컬럼 내를 통과시켰을 때, 혈액 처리량 1500 ㎖일 때의 컬럼 전후에서의 압력 손실이 150 mmHg 이하인 것을 특징으로 하는 세포 흡착 컬럼.
  10. 제1항에 기재된 세포 흡착 컬럼을 이용하여 시료 중의 세포를 흡착하는 것을 특징으로 하는, 세포의 흡착 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시료가 혈액인 세포의 흡착 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포가 백혈구인 세포의 흡착 방법.
  13. 제1항에 기재된 세포 흡착 컬럼을 이용하는 것을 특징으로 하는, 백혈구 제거 방법.
  14. 삭제
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