EA015989B1 - Лечение воспалительного заболевания кишечника - Google Patents
Лечение воспалительного заболевания кишечника Download PDFInfo
- Publication number
- EA015989B1 EA015989B1 EA200800662A EA200800662A EA015989B1 EA 015989 B1 EA015989 B1 EA 015989B1 EA 200800662 A EA200800662 A EA 200800662A EA 200800662 A EA200800662 A EA 200800662A EA 015989 B1 EA015989 B1 EA 015989B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- regulatory
- ιβό
- patient
- activated
- Prior art date
Links
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 23
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000005005 sentinel lymph node Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 45
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 24
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 23
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 16
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 11
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 8
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 3
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 claims 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 102400000884 Cholecystokinin-5 Human genes 0.000 description 4
- 101800001545 Cholecystokinin-5 Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000019908 regulation of T cell activation Effects 0.000 description 2
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101100042271 Mus musculus Sema3b gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000003903 intestinal lesions Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003797 telogen phase Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Percussion Or Vibration Massage (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Способ лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD) включает сбор регуляторных Т-клеток в активированном или неактивированном состоянии из сигнальных лимфатических узлов пациента, дренирующих сегменты кишечника с IBD или без него, возможно, активирование клеток посредством их контактирования с цитокином и антигенным экстрактом, полученным из воспаленного сегмента кишечника, размножение Т-клеток in vitro и реинфузию размноженных Т-клеток пациенту. Также раскрыты способы получения сигнальных узлов, размножения Т-клеток, восстановления T1/T2-баланса у пациента, страдающего от болезни Крона, и соответствующие применения размноженных Т-клеток, цитокинов и антигенного экстракта, а также соответствующих активированных и размноженных Т-клеток.
Description
Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания кишечника и средству осуществления этого способа.
Предшествующий уровень техники
Стойкие выздоровления от воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΟ), такого как болезнь Крона (СО) и неспецифический язвенный колит (ИС), редки. В Швеции ΙΒΩ ежегодно диагностируют у 1400 новых пациентов с пиком заболеваемости в возрасте 20 лет, что приводит к пожизненному лечению кортизоном и/или иммунодепрессивными лекарственными средствами с тяжелыми побочными эффектами. Более того, ΙΒΏ часто приводит к хирургической резекции кишки и постоянной стоме, которая представляет собой значительный дефект. Неспецифический язвенный колит также увеличивает риск рака толстой кишки.
Считают, что ΙΒΩ представляет собой аутоиммунное заболевание из-за аномалий иммунного ответа на обычно безвредные антигены слизистой. На основании вовлеченных цитокинов, воспаление при СО характеризуют как иммунный ответ, опосредованный Тн1-клетками. Предполагают, что ИС имеет иммунный ответ, опосредованный Тн2-клетками, хотя это не было четко показано [Ри88 Ι.Ι. с1 а1., 1996. 1. 1ттипо1. 157:1261-70; МиШи О.Е. е1 а1., 1996. 1иДатш. Во\гс1 ϋίδ. 2:16-26].
Цитокины действуют как регуляторы иммунологических ответов, поскольку они стимулируют дифференцировку и пролиферацию вовлеченных клеточных элементов. СО4+ хелперные Т-клетки могут дифференцироваться в две главные субпопуляции клеток-эффекторов, в Тн1 -клетки, при стимуляции 1Ь12 (интерлейкином-12), и в ТН2-клетки, при стимуляции 1Ь-4. Тн1-клетки секретируют ΙΡΝ-γ (γинтерферон), который стимулирует фагоцитарные и цитолитические Т-клеточно-зависимые реакции против внутриклеточных микробов, таких как вирусы или внутриклеточные бактерии. Тн2-клетки секретируют 1Ь-4 и 1Ь-5, которые стимулируют продукцию 1дЕ и опосредованную эозинофилами/тучными клетками защиту против паразитов. Тн2 также функционирует для понижающей регуляции Тн1-ответов.
Задача изобретения
Задачей изобретения является предложение способа, который лечит воспалительное заболевание кишечника или, по меньшей мере, сдерживает его на протяжении длительных периодов времени.
Также в задачу изобретения входит предложение средства для применения в способе.
Другие аспекты задачи станут очевидны из следующего краткого изложения сущности изобретения, нескольких графических материалов, иллюстрирующих его, описания его предпочтительных воплощений, а также из приложенной формулы изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на представлении, что воспалительное заболевание кишечника, в частности болезнь Крона и/или неспецифический язвенный колит, могут быть навсегда вылечены или, по меньшей мере, удержаны в дремлющем или неактивном состоянии посредством введения регуляторных Т-клеток (Тгед), собранных из сигнальных узлов пациента и размноженных ίη νίΐτο. Таким образом уменьшают воспаление кишечника и могут даже полностью его подавить без необходимости прибегать к медикаментозному лечению, такому как кортикостероиды.
Отсутствие ответа иммунной системы на вводимые перорально антигены определяют как пероральную толерантность. Вероятно, этот механизм предотвращает неверную иммунную реакцию против кишечного содержимого, и считают, что он опосредован по меньшей мере двумя процессами: во-первых, активацией регуляторных Т-клеток (Тгед, СО4+ СО25+), которые являются членами семейства клеток Тхелперов (СО4+), и, во-вторых, индукцией делеции клона или анергии Т-клеток. Первый процесс, ответственный за толерантность к экспозиции низким дозам антигенов, предположительно, имеет место в локальной лимфоидной системе кишечника и зависит от продукции цитокина ТОР-β. Второй (делеционный) процесс, предположительно, имеет место в системной лимфоидной ткани, стимулированной профильтрованными антигенами, и похож на толерантность, вызванную предшествующим механизмом, к вводимым внутривенно антигенам в отсутствие иммунологического адъюванта. По-видимому, этот последний толерогенный механизм более выражен после экспозиции высоким дозам антигена.
Активация Т-клеток находится под строгой регуляцией с целью поддержания баланса в иммунной системе посредством избегания чрезмерного и неверно направленного иммунного ответа, как наблюдают при аутоиммунитете. У пациентов с болезнью Крона мезентериальные лимфатические узлы сильно увеличены, как признак неконтролируемой регуляции активации Т-клеток.
Поскольку ΙΒΟ представляет собой воспаление, мезентериальные лимфатические узлы, соседние по отношению к воспалительному очагу, в первую очередь, ответственны за дренирование этого очага. Первые узлы, расположенные по прямому пути от воспаленной области, называют сигнальными узлами.
По первому предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов пациента (сигнальных узлов), дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΟ, размножают ίη νίΐτο и вводят обратно пациенту.
По второму предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в неактивированном состоянии собирают из лимфатических узлов пациента, дренирующих здоровые сегменты кишечника, то
- 1 015989 есть сегменты кишечника, не пораженные ΙΒΌ, размножают ίη νίίτο и вводят обратно пациенту. Активированные, а также неактивированные регуляторные Т-клетки, собранные таким образом, могут (дополнительно) быть активированы ίη νίίτο посредством подходящих агентов, таких как цитокины.
По третьему предпочтительному аспекту изобретения регуляторные Т-клетки в активированном состоянии или неактивированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, соответственно, и размножают ίη νίίτο. Размножение может быть непрерывным или с интервалами, такое как с фазами, разделенными фазой (фазами) покоя. Размножаемые регуляторные Т-клетки активируют (стимулируют) цитокином (цитокинами) в комбинации с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника. Альтернативно, регуляторные Т-клетки, собранные из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, активируют (стимулируют) таким образом перед размножением или между фазами размножения. Один цитокин, предпочтительно два или более цитокинов, выбранных из 1Ь-2, 1Ь-7, 1Ь-10, ΤΟΡ-β, Т8ЬР, такие как цитокиновый коктейль, включающий ^-2. ГЬ-7, ГЬ-10, ΤΟΡ-β, в особенности Τ0Ρ-β1, Т8ЬР, применяют в комбинации с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника для получения активации Тгед. Также предпочтительно предусмотреть дополнительную активацию Тгед посредством применения анти-СО3, анти-СО28 и рапамицина. После размножения размноженные и активированные регуляторные Т-клетки вводят обратно пациенту.
Лечение аутологическими регуляторными Т-клетками имеет преимущество уменьшения или даже отсутствия побочных эффектов и высокой эффективности.
По первому варианту третьего предпочтительного аспекта регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, от пациента с болезнью Крона, активируют антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с низкой дозой цитокина 1Ь-2 для размножения, предпочтительно в дополнительной комбинации с антителами против ΙΡΝ-γ и/или ΤΝΡ-α для подавления ТН1 -отклонения и Тн2-размножения. Также предпочтительно регулировать культуральную среду с интервалами, такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в особенности каждый день в течение периода времени от одной недели и более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель. Таким образом, получают популяцию ТН2-клеток, которые используют в аутотрансфузии для восстановления ТН1/ТН2-баланса у пациента. Размножение может быть поддержано посредством дополнительной активации СЭ3 -антителом. Для улучшения Тн2-отклонения при размножении может дополнительно быть использовано антитело против СЭ28 в комбинации с антителом против ΙΕ-12.
По второму варианту третьего предпочтительного аспекта регуляторные Т-клетки в активированном состоянии собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, от пациента с неспецифическим язвенным колитом, активируют антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с одним или более из цитокинов ΙΕ-2, ГЬ-12 и ΙΡΝ-α для размножения, предпочтительно в дополнительной комбинации с антителами против ГЬ-4 и/или против ГЬ-10. Также предпочтительно регулировать культуральную среду с интервалами, такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в особенности каждый день в течение периода времени от одной недели и более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель. Могут быть предложены дополнительные стимулы, такие как СЭ3 и СЭ28, в особенности к концу периода размножения.
По четвертому предпочтительному аспекту изобретения предложены один или более цитокинов в фармацевтически приемлемом носителе для ίη-νίίτο активации регуляторных Т-клеток, собранных от пациента с ΙΒΌ, в особенности из сигнальных узлов, пораженных ΙΒΌ.
По пятому предпочтительному аспекту изобретения предложен способ получения сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ, включающий введение окрашивающего лимфу агента, такого как патентованный синий, в пораженные области кишечника пациента, страдающего от ΙΒΌ, идентификацию лимфатической ткани, окрашенной агентом, возможно, мечение окрашенной ткани швами и резекцию окрашенной ткани. Резецированную ткань тщательно исследуют (производят осмотр, такой как посредством микроскопии), после чего из ткани иссекают сигнальные лимфатические узлы, дренирующие сегменты кишечника с ΙΒΌ.
По шестому предпочтительному аспекту изобретения предложен способ выделения регуляторных Т-клеток из сигнального лимфатического узла, дренирующего сегмент кишечника с ΙΒΌ, включающий оказание давления на лимфатический узел, сбор суспензии клеток, удаленных таким образом из узла, и выделение регуляторных Т-клеток из суспензии.
По седьмому предпочтительному аспекту изобретения предложены регуляторные Т-клетки, выделенные из сигнального лимфатического узла, дренирующего сегмент кишечника с ΙΒΌ.
Другие предпочтительные аспекты изобретения включены в приложенную формулу изобретения.
Сейчас изобретение будет объяснено более подробно посредством ссылки на предпочтительные, но неограничивающие воплощения изобретения, проиллюстрированные несколькими графическими материалами.
- 2 015989
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена диаграмма, показывающая активированные Тгед в образце Тгед, идентифицированные по экспрессии двух поверхностных маркеров;
на фиг. 2 - диаграмма, показывающая функциональный анализ Тгед;
на фиг. 3 показан РТ-РСВ(полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией)-анализ мРНК, экстрагированной от размноженных Тгед;
на фиг. 4 представлена диаграмма, показывающая регулирующую способность Тгед-популяции до и после размножения;
на фиг. 5 - диаграмма, показывающая активацию иммунокомпетентных клеток человека эндогенным экстрактом из воспаленного отдела кишечника;
на фиг. 6 - диаграмма, показывающая зависимость доза-ответ аналогично активированных Тгед, полученных из сигнальных узлов;
на фиг. 7 показана экспрессия ССК5 как маркера для Тн2; на фиг. 8 показана секреция 1Ь-4 в Тгед от пациентов с ИС; на фиг. 9 показана секреция ΙΡΝ-γ в Тгед от пациентов с СО.
Описание предпочтительных воплощений
Пример 1. Идентификация сигнальных узлов, дренирующих воспаленные сегменты кишечника.
Методику сигнальных узлов использовали в течение десяти лет для установления стадий злокачественных опухолей, главным образом злокачественной меланомы и рака молочной железы. Сигнальный узел идентифицируют во время хирургического вмешательства посредством выделения лимфатического дренажа от рака с применением окрашивающего лимфу агента, такого как патентованный синий (СА8 129-17-9) и патентованный синий V (СА8 3536-49-0; часто поставляемый как кальций-хелатированный димер), который вводят в пораженные области кишечника. Идентифицированные таким образом сигнальные узлы метят швами или другими средствами. Затем кишечные поражения совместно с непораженными краевыми зонами и брыжейкой, включая сосуды и регионарные лимфатические узлы, резецируют общепринятым способом. Резецированную ткань тщательно исследуют и сигнальные узлы идентифицируют и удаляют. Этот способ применяют к сигнальным узлам, дренирующим и воспаленный, и непораженный кишечник, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом или болезнью Крона. В дополнение от пациента собирают образец венозной крови. Образец периферической крови и узлов совместно с препаратами из воспалительных очагов, а также сегментов кишечника, не пораженных заболеванием, затем обрабатывают в лаборатории для иммунологического анализа и размножения Т-клеток. Лейкоциты периферической крови (РВЬ) очищают посредством Р1со11-Нурадие (Рйагтас1а, Атегкйат). Получают одноклеточные суспензии клеток лимфатического узла посредством мягкого давления с применением стеклянного гомогенизатора со свободной посадкой. Приготавливают антигенные экстракты из образцов кишечника посредством гомогенизации фрагментов ткани в гомогенизаторе Даунса с последующей денатурацией в течение 5 мин при 97°С. Клетки затем подвергают функциональному анализу.
Пример 2. Выделение популяций Т-клеток.
Лимфоциты и моноциты очищают из образцов крови или лейкоцитарных пленок с применением Ρίсо11-Нурадие Р1ик (Атегкйат Вюкшеисек, иррка1а, 8^ейеи). Рассматриваемую лейкоцитарную пленку или образец крови разбавляли забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8) и тщательно наслаивали на раствор Р1со11-натрия диатризоата, после чего двухфазную систему центрифугировали при 400 д в течение 30 мин. Лимфоциты и моноциты собирали в интерфазе между раствором Р1со11 и плазмой, в то время как эритроциты и гранулоциты собирали на дне пробирок. Слой лимфоцитов удаляли с применением пипетки Пастера и клетки отмывали НВ88 для удаления избытка Р1со11-Нурадие Р1ик, плазмы и тромбоцитов. Когда клетки не использовали немедленно, их хранили при 37°С в среде КРМ1, содержащей 10% Ни8, 1% Ре81 и 1% глутамин. Обыкновенные СЭ4' Тй-клетки и СЭ4+СЭ25+ клетки очищали с применением аи!оМЛС8 8ерага1ог (Мй1еиу1 Вю1ес. Вегдйсй С1айЬасй, Сегтаиу). Клетки подсчитывали, центрифугировали при 300 д в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли пипеткой и клетки растворяли в 90 мкл буфера МЛС8 (0,5% В8Л, 2 мМ ЭДТА, 0,01% азида натрия в РВ8) и 10 мкл Вюйи-АийЬойу Соск!ай на 107 клеток. Это помечало популяции всех не-СЭ4+ клеток. Через 10 мин инкубации при 4°С добавляли 20 мкл Аий-Вюйи МкгоВеайк на 107 клеток и инкубировали в течение дополнительных 15 мин при 4°С. Клетки отмывали приблизительно 20 объемами буфера МАС8, центрифугировали при 300 д в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли и клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера МАС8 на 108 клеток. Проводили магнитное разделение в аи!оМАС8 8ерага1ог для очистки образца от Не-СЭ4+ клеток. Для выделения СЭ4+/СЭ25+ клеток из СЭ4+ популяции СЭ4+ клетки подсчитывали, центрифугировали при 300 д в течение 10 мин, надосадочную жидкость полностью удаляли и осадок растворяли в 90 мкл буфера МАС8 и в 10 мкл СЭ25 МкгоВеайк на 107 клеток. Через 15 мин инкубации при 4°С клетки отмывали, как описано выше, и СЭ25+ клетки выделяли положительной селекцией в аи1оМАС8 8ерага1ог. Аликвоты от всех популяций анализировали проточной цитометрией.
Пример 3. Характеристика клеток посредством проточной цитометрии.
Проточную цитометрию (РАС8) использовали для исследования экспрессии различных поверхно
- 3 015989 стных маркеров на выделенных популяциях клеток. Клетки помещали в 4 мл ЕАС8-пробирки, промывали 2 мл буфера РАС8 (2% РС8 (фетальная телячья сыворотка), 0,05% азида натрия в РВ8), центрифугировали при 300 д в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливали и осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера РАС8. Добавляли 7 мкл каждого антитела, подлежащего применению, и инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при 4°С, после чего клетки промывали еще раз буфером РАС8, центрифугировали, как ранее, и ресуспендировали в 1 мл РАС8 лизирующего раствора для фиксации клеток и лизиса эритроцитов, перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при 4°С перед тем, как их промыть и центрифугировать еще раз, как описано выше. Надосадочную жидкость сливали и клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера РАС8 на пробирку, после чего проводили анализ с применением аппарата Вес1оп 1)1ски15оп ЕАС8СаЕЬиг (ЕгапкЕп Ьаке§, N1, ϋ8Ά).
Пример 4. Анализы пролиферации.
Исследовали супрессивную способность очищенных СТ)4ТТ)25· клеток. 96-Луночные круглодонные планшеты инкубировали с 25 мкл 5 мкг/мл анти-СТ)3 1дО в РВ8 при 37°С в течение 90 мин. Лунки промывали три раза 200 мкл РВ8, после чего добавляли три различные популяции клеток. 100 мкл 500000 клеток/мл С^4-клеток, облученных 25 д, добавляли в каждую лунку совместно с 30000 СТ)4ТТ)25- клеток-респондеров и 1 мкг/мл растворимого СТ) 28 (конечная концентрация). 04+025· клетки добавляли в лунки в различных количествах для создания нескольких различных клеточных отношений С^4+С^257С^4+С^25+. В качестве контроля равные количества С^4+С^25-клеток добавляли к клеткам-респондерам в дополнительном наборе лунок.
Планшеты содержали при 37°С в течение четырех или пяти дней перед тем, как в каждую лунку добавляли 1 мкКи [3Н]-тимидина и планшеты инкубировали в течение 18 ч, после чего их замораживали при -20°С. Клетки размораживали и содержимое лунки перемещали на стекловолоконный фильтр (Та11ас, Тигки, Ып1апИ) коллектором клеток (ТОМТЕС, Натбеп, СТ, И8А). Пластинки сцинтилляционного счетчика МеШЬех А - Ме11-оп (Та11ас, Тигки, Е1'п1апб) помещали на верхнюю часть фильтров и плавили при 85°С. Радиоактивность измеряли с применением сцинтилляционного счетчика 1205 Ве1ар1а1е I чсцчс! (АС'аПас, Тигки, Еш1апб).
Пример 5. ТОР-β 1-индукция ЕохР3.
СТ0 025- клетки приготавливали из лейкоцитарной пленки, как описано выше. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от другого донора и облучали (25 Гр). 3х106 СЭ4 + клеток затем аллоактивировали посредством 1,25х106 РВМС в объеме 2 мл/лунка на б-луночных планшетах с или без 1 нг/мл ТОР-31. Планшеты содержали при 37°С. На 2, 5 и 7 дни брали образцы клеток для анализа проточной цитометрией и экстракции РНК.
Пример 6. Экстракция РНК и синтез кДНК (комплементарной ДНК).
Экстракцию РНК от различных популяций клеток для дальнейшего применения в ПЦР(полимеразная цепная реакция)-анализах проводили следующим образом. Клетки лизировали в 1 мл 'Юо1 (1п\ч1годеп, Саг1§Ьаб, СА, И8А) на 5-6х106 клеток, после чего образец или немедленно замораживали при -70°С для хранения, или инкубировали 5 мин при комнатной температуре перед тем, как добавляли 0,2 мл хлороформа на мл реагента ТК1го1, и пробирки энергично встряхивали. Через 2-3 мин пробирки центрифугировали при 12000 д в течение 15 мин при 4°С. Прозрачную водную фазу перемещали в чистую пробирку, РНК осаждали 0,5 мл изопропанола на мл ТИ1/о1, использованного на первой стадии, и инкубировали 10 мин при комнатной температуре перед центрифугированием при 12000 д в течение 10 мин при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 1 мл 75% этанола на мл ТКкю1, использованного на первой стадии. Пробирки встряхивали и центрифугировали при 7500 д в течение 5 мин при 4°С, после чего осадок кратко высушивали на воздухе (5-10 мин), растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКазы, и инкубировали при 55°С в течение 10 мин. Синтез кДНК проводили посредством 18сг1'р1 сЭМА 8уп111е515 Κΐί (Вю-Каб, Негси1е§, СА, И8А) в соответствии с протоколом изготовителя.
Пример 7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР в реальном времени.
Синтезированную кДНК от различных популяций клеток использовали в ПЦР. Целью ПЦР было выявление экспрессии РохР3, ОАРЭН и РНК-полимеразы II (КРИ). Праймеры получали от СуЬегдепе АВ, Ниббшде, 8^ебеп.
Последовательности:
ЕохРЗ, прямая - САОСАСАТТСССАОАОТТССТС, обратная - 6ССТСТ6ААССАСТССТА6АТС; САРОН, прямая СААССТСААОСТСОСАСТС, обратная - СААСАТССТСАТСССАТТТС; ПРИ, прямая - С С АС С АС С ТС С ААТС АС АТ, обратная - СТСССССТОСТТССАТАА.
Для обычной ПЦР использовали ТЕегшоРо1 Кеасйоп Вийег и ДНК-полимеразу Тац (А’е\х Епд1апб Вю1аЬ§, Егапк£иг1 ат Мат, Оегтапу), в то время как в количественной ПЦР в реальном времени использовали ^^8ΥВΒ Огееп 8ирепшх (Вю-Каб, Негси1е§, СА, И8А). Реакции проводили в термоблоке МуСус1ег или системе детекции 1Сус1ег ίθ Кеа1-Тте РСК (Вю-Каб, Негси1е§, СА, И8А), соответственно, по протоколу: 30 с при 95°С, 30 с при 48-65°С и 30 с при 72°С в течение по меньшей мере 40 повторяющих
- 4 015989 ся циклов. Для реакций количественной ПЦР в реальном времени применяли способ относительного количественного определения, как рассмотрено Сшхшдег Ό О, Ехр. Нета1о1. 2002 30:503-12. ПЦРпродукты разделяли на 2% агарозном геле и бэнды выявляли по УФ-излучению инкорпорированного бромида этидия.
Пример 8. Исследование Тгед, полученных из сигнальных узлов пациентов с ΙΒΌ.
Сигнальные узлы от всего 20 пациентов с ШИ были получены хирургическим вмешательством и исследованы. Полученные из сигнальных узлов лимфоциты (8ЕЛЬ) были охарактеризованы в отношении экспрессии поверхностных маркеров СЭ4, СЭ8. СИЗ, Т-клеточного рецептора (ТСК), СЭ25, СИ69, СЭ45КЛ, СИ45КО и СИ14. Исследовали количество СО4+СЭ25Ь1 Тгед-популяции (фиг. 1). Было обнаружено, что число Тгед-клеток в сигнальных узлах, дренировавших воспаленный сегмент кишечника, было нормальным по сравнению с числом Тгед в сигнальных узлах, дренировавших непораженные области кишечника.
Тгед (СО4+СО25Ь1), очищенные из сигнальных узлов, дренировавших воспаленный сегмент, и Тгед (СО4+СО25Ь1), очищенные из сегмента кишечника, не вовлеченного в воспаление, тем не менее, существенно отличались по их регуляторной активации Т-клеток: Тгед из сигнальных узлов, дренировавших воспалительный очаг, были неудовлетворительны в регуляции активации Т-клеток (фиг. 2). Другими словами, способность регулировать Т-клеточный ответ у Тгед из сигнальных узлов, дренирующих пораженные области, отчетливо нарушена.
Пример 9. Размножение регуляторных Т-клеток.
Для индукции и размножения Тгед СЭ4'СЭ25- Т-клетки периферической крови стимулировали 1Ь2, СО28, аллогенными питающими клетками и ТСЕ-β. После размножения более 85% СИ4+ Т-клетки экспрессировали высокие уровни СО25, указывающие на Тгед-фенотип, как исследовано посредством ЕЛС8 (не показано). КТ-РСК продемонстрировала, что размноженная популяция содержала специфичный для Тгед транскрипт ЕохРЗ, который не присутствовал в СЭ4'СЭ25- популяции перед размножением (фиг. 3).
Индуцированную и размноженную Тгед-популяцию подвергали функциональному тестированию для демонстрации ее способности ингибировать активацию Т-клеток. Размноженная СЭ4'СЭ25' ЕохР3+ популяция (фиг. 3) показывала Тгед-регуляторные свойства, как продемонстрировано ее ингибированием пролиферации Т-хелперных клеток уже в соотношении 1:10 (фиг. 4). По-видимому, число Тгед в сигнальных узлах, дренировавших воспаленные сегменты кишечника у пациентов с ΙΒΌ, было нормальным; по-видимому, их недостаточно для ингибирования ответа стимулированных Т-клеток. Посредством стимулирования и размножения наивных Т-клеток эффективные Т-регуляторные свойства могут быть урегулированы.
Пример 10. Распознавание антигенов, имеющих происхождение из воспалительного очага, регуляторными Т-клетками, полученных из сигнальных узлов.
Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, негативных узлов, кишечного эпителия и лейкоцитов периферической крови, инкубировали в различных концентрациях гомогенатов кишечных клеток в течение от пяти до семи дней. Для Тгед из сигнальных узлов, стимулированных антигенным экстрактом из воспаленной области, наблюдали пролиферацию (фиг. 5).
Тем не менее, когда регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, стимулировали антигенными экстрактами, полученными из невоспаленных участков, наблюдали очень слабые ответы или их отсутствие (не показано). Данные от пациентов с болезнью Крона были сходны с таковыми от пациентов с неспецифическим язвенным колитом.
Сигнальные узлы, дренирующие пораженные области в слепой кишке и в сигмовидной ободочной кишке, и распознают, и пролиферируют против одного и того же антигенного экстракта, полученного из воспалительного очага (фиг. 6). Данные указывают на то, что существует общий антиген, ответственный за размножение клона Т-клеток. Наблюдаемая высокая спонтанная пролиферация существует благодаря размножению клона Т-клеток ίη νίνο в сигнальном узле. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнального узла, отвечают пропорционально дозе антигенного экстракта.
Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов, показывают повышенную экспрессию цитокинов. СЭ4' Т-клетки из сигнальных узлов являются СО45КО+/ССК5+ у пациентов с ИС, что наводит на мысль о состоянии увеличенного ТН2-воспалительного ответа против воспаленной слизистой (фиг. 7).
Сигнальные узлы от пациентов с ИС секретируют увеличенные количества 1Ь-4, ТН2-цитокина, при активации антигенным экстрактом из воспалительного очага (фиг. 8).
Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона, отвечают на антиген-специфическую активацию повышенной продукцией ТН1-цитокина ΙΝΡ-γ (фиг. 9).
Данные указывают, что Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациентов с ИС, имеют увеличенный пролиферативный ответ против антигенов из воспалительного очага и что регуляторные Тклетки, полученные из сигнальных узлов, реагируют ТН2-ответом, как подсказывает увеличенная экспрессия ССК5 (фиг. 7) и увеличенная продукция ТН2-цитокинов, таких как 1Ь-2 (фиг. 8). Т-клетки, полу
- 5 015989 ченные из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона, показывают противоположный тип активации с преимущественной продукцией Тн1-цитокинов, таких как ΙΝΡ-γ.
Эндотелиальные клетки из язвы при ИС или воспалительного очага в кишечнике пациентов с ИС или болезнью Крона проходят апоптоз или некроз и затем подвергаются эндоцитозу профессиональными антиген-представляющими клетками (АРС). АРС подвергают эндоцитозу дезинтегрированные эндотелиальные клетки и мигрируют через лимфатические сосуды в дренирующий лимфатический узел, сигнальный узел, где АРС процессирует и представляет белки (антигены), имеющие происхождение из эндотелиальных клеток, Т-клеткам. Т-клетки становятся активированными, претерпевают клональное размножение и покидают лимфатический узел в поисках областей воспаления, где они становятся клеткамиэффекторами и вносят вклад в воспаление.
Пример 11. Лечение ΙΒΌ.
ΙΒΌ, в частности болезнь Крона и/или неспецифический язвенный колит, можно лечить посредством сбора регуляторных Т-клеток из сигнальных узлов пациента, дренирующих воспаленную область, их размножения и их активации ίη νίΐτο и введения их обратно пациенту посредством инфузии. В частности, размножение регуляторных Т-клеток ίη νίΐτο антиген-специфичным способом имеет преимущество клонально размноженных Тгед, накопленных в сигнальных узлах. Тгед из сигнальных узлов от пациентов с ΙΒΌ размножают в условиях СМР и активируют с применением цитокинового коктейля, содержащего 1Ь-2, 1Ь-7, 1Ь-10, ТСР-3 совместно с антигенным экстрактом из воспаленного сегмента кишечника для достижения антиген-специфичного размножения Тгед.
Эффективность активации оценивают посредством РТ-РСК. РАС8 и анализов ингибирования ίη νί1го, как описано (фиг. 4). Дополнительная активация анти-СБЗ, анти-СБ28 и рапамицином может быть использована для получения оптимального размножения и функциональности ΙΒΌ Тгед. Альтернативно, если Тгед из сигнальных узлов, дренирующих воспаленный сегмент кишечника, не удовлетворительны в отношении их числа и/или функции, рассматривают размножение Тгед из сигнальных узлов, дренирующих невоспаленные сегменты, с применением тех же протоколов. Разумное объяснение этому альтернативному подходу состоит в том, что невоспаленный сегмент можно рассматривать как подходяще регулируемый, таким образом Тгед функциональны, хотя их слишком мало в количестве, чтобы поддерживать регуляцию в соседних сегментах кишечника. Размноженные Тгед любого типа вводят обратно как аутотрансфузию для восстановления правильной иммунорегуляции.
Подписи к графическим материалам.
Фиг. 1. Тгед, идентифицированные по экспрессии поверхностных маркеров СБ4+ и высокому уровню СБ25, СБ4+СБ25Ь1 ΙΕ-2-рецептора.
Фиг. 2. Функциональный анализ Тгед. Очищенные Тгед из сигнальных узлов, дренирующих воспаленный сегмент кишечника, (незакрашенные круги) и невоспаленный сегмент (закрашенные круги), инкубировали с СБ4+СБ25- Т-хелперными клетками, очищенными из периферической крови и активированными анти-СБЗ и анти-СО28. ЗН-тимидин добавляли в культуры в течение последних 16 ч.
Фиг 3. Размножение Тгед-клеток. СБ4+СБ25- клетки активировали Ш-2, ТСР-β, анти-СБ28 и питающими клетками с целью стимулировать размножение Тгед-клеток. Из размноженных СБ4+СБ25Тгед экстрагировали мРНК и демонстрировали транскрипт РохРЗ посредством КТ-РСК, идентифицируя размноженную популяцию как Тгед.
Фиг. 4. Регуляция стимулированных Т-хелперных клеток-респондеров. Популяция перед размножением, содержащая СБ4+СБ25- клетки, неспособна регулировать (закрашенные круги), в то время как адекватную регуляцию получают с использованием размноженных СБ4+СБ25+ клеток (незакрашенные круги).
Фиг. 5. Активация иммунокомпетентных клеток человека. Клетки, полученные из сигнальных лимфатических узлов, несигнальных лимфатических узлов, кишечника, а также лимфоциты периферической крови активировали эндогенным антигенным экстрактом, полученным из воспаленного отдела кишечника пациента с неспецифическим язвенным колитом.
Фиг. 6. Диаграмма доза-ответ. Показана зависимость доза-ответ регуляторных Т-клеток, полученных из сигнальных узлов, дренирующих слепую кишку и сигмовидную ободочную кишку, активированных эндогенным антигенным экстрактом, полученным из того же воспаленного отдела кишечника.
Фиг. 7. Экспрессия ССК5 как маркера Тн2. Регуляторные Т-клетки, полученные из сигнальных узлов от пациента с ИС, имеют повышенную экспрессию ССК5 на СБ4+СБ45КО+ клетках памяти, как признак активации ТН2.
Фиг. 8. Секреция ТН2-цитокина Ш-4 в регуляторных Т-клетках от пациентов с ИС. Клетки из несигнальных узлов (ηδΕΝ) и из сигнальных узлов (8ΕΝ) стимулировали в течение 48 ч воспалительными антигенными экстрактами. Секретируемый Ш-4 измеряли в культивируемых надосадочных жидкостях с применением сэндвич-твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).
Фиг. 9. Секреция Тн1-цитокина ΙΝΡ-γ регуляторными Т-клетками, полученными из сигнальных узлов от пациентов с болезнью Крона. Клетки из несигнальных узлов (ηδΕΝ) и из сигнальных узлов (8ΕΝ1 и 8ΕΝ2) стимулировали в течение 48 ч воспалительным антигенным экстрактом. Секретируемый ΙΝΡ-γ
- 6 015989 измеряли в культивируемых надосадочных жидкостях с применением сэндвич-твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8Л).
Claims (32)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий (а) сбор регуляторных Тклеток в активированном или неактивированном состоянии из сигнальных лимфатических узлов пациента, дренирующих сегменты кишечника с воспалительным заболеванием кишечника (ΙΒΌ) или без него, (б) размножение собранных Т-клеток ίη νίίτο и (в) реинфузию размноженных Т-клеток пациенту.
- 2. Способ по п.1, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона.
- 3. Способ по п.2, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где указанные регуляторные Т-клетки собирают в активированном состоянии.
- 5. Способ по любому из пп.1-3, где указанные регуляторные Т-клетки собирают в неактивированном состоянии.
- 6. Способ по п.4 или 5, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника без ΙΒΌ.
- 7. Способ по п.5 или 6, где собранные Т-клетки активируют одним или более цитокинами в комбинации с антигенным экстрактом, полученным из воспаленного сегмента кишечника.
- 8. Способ по п.7, где активация предшествует размножению.
- 9. Способ по п.7, где активация сопутствует размножению.
- 10. Способ по п.7, где за размножением следует активация.
- 11. Способ по п.7, где один или более цитокинов выбраны из 1Ь-2, 1Ь-7, ΙΕ-10,ΤΟΡ-β1,Τ8ΕΡ.
- 12. Способ по пп.7-11, включающий дополнительную активацию собранных Т-клеток анти-СЭЗ. анти-СО28 и/или рапамицином.
- 13. Способ по п.2, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, и активируют посредством их контактирования с антигенным экстрактом, полученным из воспалительного очага, в комбинации с низкой дозой цитокина 1Ь-2 и размножают.
- 14. Способ по п.13, дополнительно включающий активацию посредством контактирования указанных регуляторных Т-клеток с антителом против ΙΡΝ-γ (ΙΡΝ - интерферон) и/или ΤΝΡ-α (ΤΝΡ - фактор некроза опухоли) для подавления Τн1-отклонения и Τн2-размножения.
- 15. Способ по п.13 или 14, включающий кондиционирование культуральной среды с интервалами, такими как от каждого дня до каждого пятого дня, в частности каждый день в течение периода времени от одной недели или более, в особенности в течение периода времени от трех до четырех недель.
- 16. Способ по любому из пп.13-15, включающий активацию антителом против СО28 в комбинации с антителом против ΙΕ-12 для улучшения Τн2-отклонения.
- 17. Способ по п.3, где регуляторные Т-клетки собирают из лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ или без него, и активируют посредством их контактирования с антигенным экстрактом, полученным из воспалительного очага, в комбинации с одним или более из цитокинов ΙΕ-2, ΙΕ-12 и ΙΡΝ-α и размножают.
- 18. Способ по п.17, где дополнительную активацию обеспечивают посредством контактирования регуляторных Т-клеток с СЭ3 и/или СО28.
- 19. Применение одного или более цитокинов в фармацевтически приемлемом носителе для ίη νίίτο активации регуляторных Т-клеток, собранных из сигнального лимфатического узла пациента с ΙΒΌ.
- 20. Применение по п.19, где ΙΒΌ представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
- 21. Способ получения сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника, пораженные воспалительным заболеванием кишечника (ΙΒΌ), включающий: (а) введение окрашивающего лимфу агента в пораженную область кишечника пациента, страдающего от ΙΒΌ, (б) идентификацию лимфатической ткани, окрашенной агентом, (в) возможно, мечение окрашенной ткани, такое как посредством шва (швов), (г) резекцию окрашенной ткани, (д) исследование окрашенной ткани для идентификации сигнальных лимфатических узлов, дренирующих сегменты кишечника с ΙΒΌ, иссечение идентифицированных сигнальных лимфатических узлов из ткани.
- 22. Способ по п.14, где ΙΒΌ представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
- 23. Способ выделения регуляторных Т-клеток из иссеченного сигнального лимфатического узла, дренирующего сегмент кишечника с ΙΒΌ, включающий: (а) оказание давления на сигнальный лимфатический узел, (б) сбор суспензии клеток, удаленной из узла, (в) выделение регуляторных Т-клеток из суспензии клеток.
- 24. Способ размножения регуляторных Т-клеток, полезных в лечении ΙΒΌ, включающий: (а) обес- 7 015989 печение в подходящей культуральной среде регуляторных Т-клеток, собранных из сигнального узла пациента с ΙΒΌ, (б) активирование клеток посредством их контактирования с цитокином, (в) размножение активированных клеток.
- 25. Способ по п.24, где часть или всю активацию проводят во время размножения.
- 26. Способ восстановления Тн1/Тн2-баланса у пациента, страдающего от болезни Крона, включающий: (а) сбор регуляторных Т-клеток в активированном состоянии из лимфатических узлов пациента, дренирующих сегменты кишечника с болезнью Крона или без нее; (б) активирование собранных таким образом Т-клеток антигенным экстрактом из воспалительного очага в комбинации с низкой дозой цитокина 1Ь-2; (в) размножение клеток; (г) возможно, контактирование клеток во время размножения с антителом против ΙΓΝ-γ и/или ΤΝΡ-α для подавления Тн1-отклонения и Тн2-размножения.
- 27. Способ по п.26, сочетающий кондиционирование культуральной среды с интервалами.
- 28. Способ по п.27, где кондиционирование представляет собой кондиционирование от каждого дня до каждого пятого дня.
- 29. Способ по п.28, включающий стимуляцию размножения посредством контактирования указанных клеток с СРЗ-антителом.
- 30. Применение цитокина, выбранного из 1Ь-2, 1Ь-7, 1Ь-10, ΤΟΡ-β1, Т8ЬР, для активации регуляторных Т-клеток, полученных из сигнального узла пациента, страдающего от ΙΌΒ.
- 31. Применение антигенного экстракта, полученного из воспаленного сегмента кишечника пациента, страдающего от ΙΒΌ, в комбинации с цитокином для активации регуляторных Т-клеток, полученных из сигнального узла пациента.
- 32. Применение по п.31, где цитокин выбран из 1Ь-2, 1Ь-7, 1Ь-10, ТОР-в1, Т8ЬР.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0501916 | 2005-08-31 | ||
| PCT/SE2006/000959 WO2007027132A1 (en) | 2005-08-31 | 2006-08-22 | Treatment of inflammatory bowel disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200800662A1 EA200800662A1 (ru) | 2008-08-29 |
| EA015989B1 true EA015989B1 (ru) | 2012-01-30 |
Family
ID=37809140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200800662A EA015989B1 (ru) | 2005-08-31 | 2006-08-22 | Лечение воспалительного заболевания кишечника |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8852581B2 (ru) |
| EP (1) | EP1933854B1 (ru) |
| JP (1) | JP5492414B2 (ru) |
| KR (1) | KR101475800B1 (ru) |
| CN (1) | CN101252941A (ru) |
| AU (1) | AU2006285446B2 (ru) |
| CA (1) | CA2619735C (ru) |
| EA (1) | EA015989B1 (ru) |
| IL (1) | IL189611A (ru) |
| NO (1) | NO341189B1 (ru) |
| SG (1) | SG165328A1 (ru) |
| WO (1) | WO2007027132A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200801678B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2728696C2 (ru) * | 2018-12-28 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Моноклональное антитело к интерферону бета-1а человека |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG165328A1 (en) | 2005-08-31 | 2010-10-28 | Ith Immune Therapy Holdings Ab | Treatment of inflammatory bowel disease |
| EP2062970A1 (en) | 2007-11-26 | 2009-05-27 | Txcell | Compositions for treating an intestinal inflammatory condition |
| CN102732480A (zh) * | 2012-06-11 | 2012-10-17 | 中山大学 | N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性t细胞的绝对数量在体外扩增上的应用 |
| JP6450594B2 (ja) * | 2012-12-28 | 2019-01-09 | 持田製薬株式会社 | プレセプシン測定による炎症性腸疾患の診断 |
| WO2015075175A1 (en) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Cellectis | Method for generating batches of allogeneic t-cells with averaged potency |
| CN103911341B (zh) * | 2014-01-26 | 2016-04-13 | 山东迪博生物科技股份有限公司 | Th1细胞亚群的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用 |
| JP2018188408A (ja) * | 2017-05-11 | 2018-11-29 | 国立大学法人群馬大学 | 制御性ｔ細胞増強剤並びにそれを含む医薬及び食品組成物 |
| GB201714777D0 (en) * | 2017-09-14 | 2017-11-01 | Univ London Queen Mary | Agent |
| CN110051698A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-07-26 | 天津大学 | 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 |
| CN111374989B (zh) * | 2020-03-16 | 2022-04-19 | 中山大学附属第五医院 | 用于治疗炎症性肠病的药物 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020034500A1 (en) * | 2000-08-15 | 2002-03-21 | Levings Megan K. | Regulatory T cells; methods |
| WO2003059264A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | University Of Southern California | Methods for the induction of professional and cytokine-producing regulatory cells |
| EP1408106A1 (en) * | 2002-10-11 | 2004-04-14 | Sahltech I Göteborg AB | Cancer immuno-therapy |
| WO2004050706A2 (en) * | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Medical Research Council | Regulatory t-cells |
| US20040191235A1 (en) * | 2001-05-11 | 2004-09-30 | Herve Groux | Method for obtaining antigen-specific tr1 regulatory lymphocytes |
| WO2005070090A2 (en) * | 2004-01-08 | 2005-08-04 | Regents Of The University Of California | Regulatory t cells suppress autoimmunity |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6670146B2 (en) | 2000-10-04 | 2003-12-30 | Schering Corporation | Regulatory T cells; methods |
| JP4395070B2 (ja) | 2002-06-25 | 2010-01-06 | インデックス・ダイアグノスティックス・アクチエボラーグ | 潰瘍性大腸炎を診断するための方法およびキット |
| WO2005009339A2 (en) | 2003-05-30 | 2005-02-03 | Pathway Diagnostics Corporation, Inc. (a Delaware Corporation) | Inflammatory bowel diseases |
| PT1739166E (pt) | 2005-07-01 | 2011-09-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Obtenção de células tr1 específicas para um auto-antigénio ou antigénio de alimentos a partir de uma população de pbmc ou de leucócito |
| SG165328A1 (en) | 2005-08-31 | 2010-10-28 | Ith Immune Therapy Holdings Ab | Treatment of inflammatory bowel disease |
| US8449489B2 (en) | 2006-05-12 | 2013-05-28 | Ith Immune Therapy Holdings Ab | Method and means for treating inflammatory bowel disease |
| AU2008283077A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Ith Immune Therapy Holdings Ab | Diagnosis, staging and monitoring of inflammatory bowel disease |
-
2006
- 2006-08-22 SG SG201006316-2A patent/SG165328A1/en unknown
- 2006-08-22 CA CA2619735A patent/CA2619735C/en active Active
- 2006-08-22 JP JP2008528982A patent/JP5492414B2/ja active Active
- 2006-08-22 US US12/065,047 patent/US8852581B2/en active Active
- 2006-08-22 EA EA200800662A patent/EA015989B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-08-22 AU AU2006285446A patent/AU2006285446B2/en active Active
- 2006-08-22 WO PCT/SE2006/000959 patent/WO2007027132A1/en active Application Filing
- 2006-08-22 CN CNA2006800313067A patent/CN101252941A/zh active Pending
- 2006-08-22 EP EP06769624.5A patent/EP1933854B1/en active Active
-
2008
- 2008-02-19 IL IL189611A patent/IL189611A/en active IP Right Grant
- 2008-02-20 ZA ZA200801678A patent/ZA200801678B/xx unknown
- 2008-03-28 KR KR1020087007512A patent/KR101475800B1/ko active IP Right Grant
- 2008-03-28 NO NO20081539A patent/NO341189B1/no unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020034500A1 (en) * | 2000-08-15 | 2002-03-21 | Levings Megan K. | Regulatory T cells; methods |
| US20040191235A1 (en) * | 2001-05-11 | 2004-09-30 | Herve Groux | Method for obtaining antigen-specific tr1 regulatory lymphocytes |
| WO2003059264A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-24 | University Of Southern California | Methods for the induction of professional and cytokine-producing regulatory cells |
| EP1408106A1 (en) * | 2002-10-11 | 2004-04-14 | Sahltech I Göteborg AB | Cancer immuno-therapy |
| WO2004050706A2 (en) * | 2002-12-03 | 2004-06-17 | Medical Research Council | Regulatory t-cells |
| WO2005070090A2 (en) * | 2004-01-08 | 2005-08-04 | Regents Of The University Of California | Regulatory t cells suppress autoimmunity |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| ALLEZ, MATTHIEU ET AL., "Regulatory T Cells: Peace Keepers in the Gut", Inflammatory bowels diseases, September 2004, Vol. 10, no. 5, page 666-page 676, page 672, column 2, line 8-line 37, abstract * |
| BATTAGLIA, MANUELA ET AL., "Rapamycin selectively expands CD4+ CD25+ FoxP3+ regulatory T cells", BLOOD, 15 June 2005, Vol. 105, no. 12, page 4743-page 4748, abstract * |
| FOUSSAT, ARNAUD ET AL., "A Comparative Study between T Regulatory Type 1 and CD4+ CD25+ T Cells in the Control of Inflammation1", The Journal of Immunology, 2003, Vol. 171, page 5018-page 5026 * |
| GROUX, HERVE ET AL., "Regulatory T cells and inflammatory bowel disease", Viewpoint, Immunology Today, October 1999, Vol. 20, no. 10, page 442-page 445, page 442, column 1, line 44-line 45 * |
| HORI, SHOHEI ET AL., "Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3", Science, 14 Februari 2003, Vol. 299, page 1057-page 1061, abstract * |
| KONSTANTINOS A. PAPADAKIS et al., "Expression and Regulation of the Chemokine Receptor CXCR3 on Lymphocytes from Normal and Inflammatory Bowel Disease Mucosa", Inflammatory bowel diseases, 2004, vol. 10, no. 6, pages 778-788, page 779, column 2, lines 11-17; page 783, column 1, lines 3-26; page 783, column 2, lines 1-18 * |
| MASAYUKI SARUTA et al., "Characterization of Foxp3+ Cd4+ Cd25+ Regulatory T Cells from Mesenteric Lymph Nodes in Human Ulcerative Colitis (UC), Gastroenterology, April 2006, vol. 130, no. 2, column 599 * |
| OLSON, TIMOTHY S. ET AL., "Expanded V cell population blocks regulatory T cells and exacerbates ileitis in a murine model of Crohn disease", The Journal of Clinical Investigation, August 2004, Vol. 114, no. 3, page 389-page 398, abstract * |
| VAN DEVENTER, S.J.H., "New biological therapies in inflammatory bowel disease", Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2003, Vol. 17, no. 1, page 119-page 130, abstract * |
| WATANABE, NORIHIKO ET AL., "Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+ CD25+ regulatory T cells in human thymus", Nature, August 2005, Vol. 436, page 1181-page 1185, abstract * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2728696C2 (ru) * | 2018-12-28 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Моноклональное антитело к интерферону бета-1а человека |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SG165328A1 (en) | 2010-10-28 |
| EP1933854B1 (en) | 2014-06-25 |
| KR101475800B1 (ko) | 2014-12-23 |
| IL189611A0 (en) | 2008-06-05 |
| NO341189B1 (no) | 2017-09-04 |
| AU2006285446A1 (en) | 2007-03-08 |
| EP1933854A1 (en) | 2008-06-25 |
| NO20081539L (no) | 2008-05-29 |
| CA2619735C (en) | 2014-05-27 |
| CN101252941A (zh) | 2008-08-27 |
| KR20080047579A (ko) | 2008-05-29 |
| IL189611A (en) | 2011-10-31 |
| WO2007027132A1 (en) | 2007-03-08 |
| CA2619735A1 (en) | 2007-03-08 |
| JP5492414B2 (ja) | 2014-05-14 |
| JP2009506109A (ja) | 2009-02-12 |
| EP1933854A4 (en) | 2012-07-25 |
| ZA200801678B (en) | 2008-12-31 |
| US8852581B2 (en) | 2014-10-07 |
| EA200800662A1 (ru) | 2008-08-29 |
| US20090311228A1 (en) | 2009-12-17 |
| AU2006285446B2 (en) | 2013-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA015989B1 (ru) | Лечение воспалительного заболевания кишечника | |
| Uchiyama et al. | Effect of adult T-cell leukemia cells on pokeweed mitogen-induced normal B-cell differentiation | |
| Pope et al. | Suppressor cells in the spleens of tumor-bearing mice: enrichment by centrifugation on hypaque-ficoll and characterization of the suppressor population | |
| JP5205275B2 (ja) | 散在性ガンの治療法 | |
| Pettit et al. | Differentiated dendritic cells expressing nuclear RelB are predominantly located in rheumatoid synovial tissue perivascular mononuclear cell aggregates | |
| KR20080091772A (ko) | 암환자의 면역치료를 위한 종양 반응성 ｔ－림프구의개선된 증식방법 | |
| ES2633102T3 (es) | El uso de células apoptóticas ex vivo para generar linfocitos T reguladores | |
| WO2004059319A1 (fr) | Procedes individuels de mesure d'une fonction lymphocytaire specifique | |
| US8709404B2 (en) | Immunotherapy in cancer treatment | |
| Bobrove et al. | Depressed in Vitro B—Lymphocyte Differentiation in Systemic Lupus Erythematosus | |
| Tomizawa et al. | Studies of T lymphocyte function and inhibitory factors in minimal change nephrotic syndrome | |
| Xia et al. | Tricyclic antidepressants induce apoptosis in human T lymphocytes | |
| US7749495B2 (en) | Method for inducing an anti-tumor and anti-cachexia immune response in mammals | |
| DeLustro et al. | Mechanism of mastocytoma-mediated suppression of lymphocyte reactivity | |
| US7871606B2 (en) | Use of stimulated peripheral-blood mononuclear cells for the treatment of cancerous diseases | |
| Sieber et al. | Abnormalities of B-cell activation and immunoregulation in patients with Crohn's disease. | |
| Aseffa et al. | Effect of thalidomide on apoptosis of lymphocytes and neutrophils | |
| Pritchard et al. | Immunologic aspects of human sarcomas | |
| Renk et al. | Inhibition of normal allogeneic lymphocyte mitogenesis by a factor released from human tumor cells in culture | |
| Cole et al. | Defective T-lymphocyte chemotactic factor production in patients with established malignancy | |
| Jones et al. | A role for B cells in facilitating defense against an NK cell-sensitive lung metastatic tumor is revealed by stress | |
| JPH10306029A (ja) | 細菌の菌体成分を有効成分とする癌免疫療法剤 | |
| Huynh-Russo | Improving Treatments for Peritoneal Metastasis Originating from Colorectal Cancer | |
| Martin et al. | Immunological Aspects of Malignant Glial Tumors | |
| Kubota | Clinical Evaluation of Immune Response in Patients with Lung Cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment |