JP2018188408A - 制御性ｔ細胞増強剤並びにそれを含む医薬及び食品組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】効率よく制御性Ｔ細胞を増強でき、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防や治療に有効かつ安全性の高い、医薬又は食品の有効成分となりうる物質を提供すること。【解決手段】生体への安全性の高いトレハロースを有効成分とする制御性Ｔ細胞増強剤を１型糖尿病などの自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤として使用する。【選択図】図４

Description

本発明は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）増強剤並びにそれを含む医薬及び食品組成物に関する。

制御性Ｔ細胞は過剰な免疫応答を抑制する機能を持ち、免疫寛容を担うとされている。制御性Ｔ細胞の減少や機能異常は、自己免疫疾患やアレルギーの発症原因となると考えられている。したがって、制御性Ｔ細胞の量的又は質的なコントロールは、自己免疫疾患やアレルギーの予防や治療に有用であると考えられる。

一方、トレハロースの様々な生理活性が報告されている。
例えば、特許文献１には「トレハロースを含有する腸管粘膜免疫調節剤」が開示されており、トレハロースを経口投与することにより、粘膜に存在する免疫担当細胞による免疫グロブリンＡ及びインターフェロン−γなどのサイトカインの産生を増強できることが開示されている。
また、特許文献２には「トレハロース等のコスモトロープを含む医薬組成物を経口送達で投与し、糖尿病等の疾患を治療する方法」が開示されており、トレハロース等のコスモトロープが血漿中の酸素の拡散を促進することが示されているが、具体的な治療データは開示されておらず、糖尿病等の治療効果は不明である。
また、トレハロースには、生活習慣病予防効果（非特許文献１）や膵臓ランゲルハンス島保護作用（非特許文献２）があることが知られているが、制御性Ｔ細胞に対する効果は知られていない。

WO2002/038146 特開2016-026156

Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 62(6), 380-387, 2016 日本栄養・食糧学会誌 第６６巻 第１号 １７−２４ ２０１３

本発明は効率よく制御性Ｔ細胞を増強でき、自己免疫疾患や炎症性疾患の予防や治療に有効な医薬又は食品の有効成分となりうる物質を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、トレハロースが腸内細菌叢におけるフィルミクテス門（以下、Firmicutesという。）の増加を介して制御性Ｔ細胞を増殖させ、その結果、１型糖尿病などの自己免疫疾患や炎症性疾患を効率よく予防又は治療できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下を提供する。
[１]トレハロースを有効成分とする制御性Ｔ細胞増強剤。
[２] 制御性Ｔ細胞がＣＤ８陽性制御性Ｔ細胞である、[１]に記載の制御性Ｔ細胞増強剤
。
[３] [１]または[２]に記載の制御性Ｔ細胞増強剤を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患
の予防又は治療剤。
[４]自己免疫疾患が１型糖尿病である、[３]に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
[５]医薬である、[３]または[４]に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
[６]食品組成物である、[３]または[４]に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
[７]トレハロースを有効成分とする腸内細菌叢改善剤。
[８]Firmicutesに属する細菌を増加させる、[７]に記載の腸内細菌叢改善剤。
[９]Firmicutesに属する細菌がルミノコッカス属細菌である、[８]に記載の腸内細菌叢改善剤。

トレハロースを投与することで制御性Ｔ細胞を増加させ、異常な免疫応答を抑えることができるので、１型糖尿病などの自己免疫疾患や炎症性疾患予防や治療に有用である。また、トレハロースは食品にも使用されるため、特定保健用食品や機能性表示食品の有効成分としても有用である。

Heligmosomoides polygyrus感染群（Hp）、対照群（DW）、トレハロース投与群（ＴＨ）及びマルトース投与群（MT）における腸内細菌叢の解析結果を示す図。 Heligmosomoides polygyrus感染群（Hp）、対照群（DW）、トレハロース投与群（ＴＨ）及びマルトース投与群（MT）の腸内細菌叢におけるルミノコッカスの割合を示す図。＊はＰ＜０．０５を示す。 ＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞の量とルミノコッカスの割合（縦軸）の関係を示す図。 Heligmosomoides polygyrus感染群（Hp）、対照群（DW）、トレハロース投与群（ＴＨ）及びマルトース投与群（MT）におけるＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞の量を示す図。＊はＰ＜０．０５を示す。 Heligmosomoides polygyrus感染群（Hp）、対照群（DW）、トレハロース投与群（ＴＨ）及びマルトース投与群（MT）における血糖値の経時変化を示す図。＊はＰ＜０．０５を示す。

本発明の制御性Ｔ細胞増強剤はトレハロースを有効成分とする。

トレハロースは２分子のグルコースが還元性基同士で結合してなる二糖類である。α，α−トレハロース、α、β−トレハロース（ネオトレハロース）、β，β−トレハロース（イソトレハロース）の３種の異性体が存在するが、これら３種類の１種又は２種以上を用いることができる。この中では天然に存在するα，α−トレハロースが好ましい。トレハロースは制御性Ｔ細胞増強効果を発揮するものである限り、その純度や調製方法は特に限定されない。

制御性Ｔ細胞は他のＴ細胞の増殖抑制を介して免疫を抑制するＴ細胞を意味し、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０などの免疫抑制性サイトカインを分泌する細胞を含むが、これらに限定されない。制御性Ｔ細胞は例えばＣＤ８陽性でＣＤ１２２マーカーによって特定されることが好ましい。
制御性Ｔ細胞を増強するとは、制御性Ｔ細胞の量を増加させること、及び／又は制御性Ｔ
細胞の機能、例えば、他のＴ細胞の増殖抑制や免疫抑制性サイトカインの分泌亢進という機能を増強させることを含む。

トレハロースの制御性Ｔ細胞増強効果は投与された対象の腸内細菌叢におけるFirmicutesに属する細菌、例えばルミノコッカス属細菌の増加を介することが本発明者らの検討で明らかとなった。したがって、本発明はトレハロースを有効成分とする腸内細菌叢改善剤を提供する。

トレハロースを有効成分とする制御性Ｔ細胞増強剤は、自己免疫疾患や炎症性疾患の予防剤や治療剤として使用することができる。
自己免疫疾患としては、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、及び多発性硬化症などが挙げられ、広義には移植片対宿主病も含まれる。炎症性疾患としてはアレルギー性疾患や炎症性腸疾患が挙げられる。

自己免疫疾患や炎症性疾患の予防剤や治療剤は自己免疫疾患や炎症性疾患の予防や治療のための医薬として使用できる。
このような医薬はトレハロースを含有する限り、任意の剤形で製剤化されていてよいが、例えば、液剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、散剤、注射剤等が挙げられる。トレハロースを含む医薬は必要に応じ、例えば、希釈剤、安定化剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。

また、トレハロースを有効成分とする医薬はトレハロースのみを有効成分とする医薬でもよいし、トレハロースとともに、自己免疫疾患や炎症性疾患に対する他の有効成分を含む医薬でもよい。

本発明の医薬における有効成分としてのトレハロースの濃度は特に制限されないが、例えば、０．１〜１００％（ｗ／ｗ）、０．５〜５０％（ｗ／ｗ）、又は１〜２５％（ｗ／ｗ）であってよい。

投与態様としては、特に制限されないが、腸内細菌叢を改善するためには経口投与が好ましい。

本発明の医薬の投与量は自己免疫疾患や炎症性疾患を治療できる限り特に制限されず、患者の年齢、性別、体重、重篤度等の諸条件に応じて適宜設定することができるが、トレハロースの１回あたりの投与量として約０．５ｇ〜１００ｇ／成人／日が例示され、約１ｇ〜５０ｇ／成人／日が好ましい。本発明の医薬は、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。また、本発明の医薬は、数日又は数週間に１回の投与としてもよい。各回の投与時の投与量は、有効成分の投与量に換算して一定でもよく、差があってもよい。

本発明の制御性Ｔ細胞増強剤は生体に安全なトレハロースを有効成分とするため、自己免疫疾患や炎症性疾患の予防や治療のための食品組成物として使用することもできる。このような食品組成物としては、特定保健用食品や機能性表示食品が挙げられる。本発明の食品組成物は、例えば、「血糖上昇抑制効果を有する食品」、「アレルギー予防効果を有する成分を含有する食品」等の表示を付して販売することもできる。

本発明のトレハロースを有効成分とする自己免疫疾患や炎症性疾患の予防や治療のための食品組成物は、トレハロースを、食品として一般に用いられる原料、例えば、蛋白質、脂質、炭水化物、ビタミン類などに配合することにより製造することもできる。本発明の食品組成物の形状は例えば、錠剤、液剤、カプセル（軟カプセル、硬カプセル）、粉末、顆粒、ゼリーが挙げられる。また、本発明の食品組成物の例としては乳製品、調味料、菓子
類、麺類、スープ類、飲料等が挙げられる。

本発明の食品組成物中に含まれるトレハロースの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、０．１〜１００％（ｗ／ｗ）、０．５〜５０％（ｗ／ｗ）、又は１〜２５％（ｗ／ｗ）であってよい。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の態様は以下には限定されない。

＜１型糖尿病モデルの作製＞
ストレプトゾトシン(STZ)を生理食塩水に溶解させ、８週齢の雄性C57BL/6 マウスに50mg/kgBWを５日間連日腹腔投与した。

＜１型糖尿病抑制への介入操作＞
STZ投与の２週前にHeligmosomoides polygyrus（Hp）の感染幼虫200隻を、ゾンデを用い
てマウスに経口感染させた(Hp群)。トレハロースは蒸留水に３％となるよう溶解しSTZ投
与１週前より自由引水により投与した（TH群）。二糖類の対照として３％マルトース（MT群）、対照群として蒸留水のみ（DW群）も投与した。

＜腸内細菌叢の解析＞
以下の手順で腸内細菌叢の解析を行った。
STZ投与直前の各群のマウスの糞便を採取し、DNAを抽出する。全ての細菌の16S rRNAを増幅するプライマーを用いて、PCRを行う。増幅された16S rRNAを次世代シークエンサーに
より、網羅的に配列を決定する。読まれた配列に基づき、菌種を半定量的に同定する。
ルミノコッカスは、ルミノコッカスの16S rRNAに特異的なプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行うことで定量する。

＜CD8Tregの解析＞
以下の手順でCD8Tregの解析を行った。
STZ投与直前の各群のマウスから、腸間膜リンパ節および脾臓を採取する。細胞懸濁液を
調製し、蛍光標識した抗CD8抗体、抗CD122抗体を作用させ、フローサイトメーターを用いてCD8陽性、CD122陽性のCD8Tregを検出する。リンパ球画分におけるCD8Tregを算出する。

＜１型糖尿病の病態の解析＞
以下の手順で１型糖尿病の病態の解析を行った。
STZ投与後経時的に血液を採取し、グルコース濃度をラボグルコ（ForaCare社）とグルコ
ース測定カートリッジを用いて測定する。

＜結果＞
図１に腸内細菌叢の解析結果を示す。
ＴＨ投与によりFirmicutesが増加しており、腸内細菌叢のパターンはＨｐ群と類似していた。しかし、マルトース投与ではFirmicutesの増加は見られなかった。Firmicutesのうち、ルミノコッカスに着目して調べたところ、ＴＨ投与によりルミノコッカスが顕著に増加していることが分かった（図２）。これはＨｐも同様であったが、マルトースではルミノコッカスは増加しなかった。

発明者らの研究により、Ｈｐはトレハロースを分泌することが確認されており、Ｈｐの免疫抑制作用はトレハロースによるものと考えられる。

ＨｐはＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞を増加させることが発明者らの研究で分かっているが、ＨｐのＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞増強作用はルミノコッカスの増加によるのではないかという考えのもと、腸内細菌叢におけるルミノコッカスの割合とＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞の量の関係を調べた。その結果、図３に示すように、腸内細菌叢におけるルミノコッカスの割合とＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞の量の間には相関性があることが分かった。
実際に、ルミノコッカスを増加させるＴＨはＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞を増加させることが示された（図４）。

ＣＤ８^＋Ｔｒｅｇ細胞は異常な免疫反応を抑制するので、ＴＨ投与により自己免疫疾患である１型糖尿病の治療効果が期待できる。図５に示すとおり、１型糖尿病モデルマウスにおいて、ＴＨ投与により血糖値の上昇を抑えることができることが示された。

Claims (9)

1. トレハロースを有効成分とする制御性Ｔ細胞増強剤。
2. 制御性Ｔ細胞がＣＤ８陽性制御性Ｔ細胞である、請求項１に記載の制御性Ｔ細胞増強剤。
3. 請求項１または２に記載の制御性Ｔ細胞増強剤を含む、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
4. 自己免疫疾患が１型糖尿病である、請求項３に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
5. 医薬である、請求項３または４に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
6. 食品組成物である、請求項３または４に記載の自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
7. トレハロースを有効成分とする腸内細菌叢改善剤。
8. フィルミクテス門に属する細菌を増加させる、請求項７に記載の腸内細菌叢改善剤。
9. フィルミクテス門に属する細菌がルミノコッカス属細菌である、請求項８に記載の腸内細菌叢改善剤。

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