NO341189B1

NO341189B1 - Middel for behandling av betennelsestarmsykdom

Info

Publication number: NO341189B1
Application number: NO20081539A
Authority: NO
Inventors: Ole Winqvist; Magnus Thörn
Original assignee: Tla Targeted Immunotherapies Ab
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2017-09-04
Also published as: US8852581B2; CA2619735C; KR101475800B1; EP1933854A1; EA200800662A1; SG165328A1; JP2009506109A; CN101252941A; EP1933854A4; ZA200801678B; WO2007027132A1; IL189611A0; KR20080047579A; EA015989B1; CA2619735A1; NO20081539L; EP1933854B1; AU2006285446A1; IL189611A; AU2006285446B2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder et middel for utførelse av en fremgangsmåte for behandling av inflammatorisk tarmsykdom.

Oppfinnelsens bakgrunn

Det er mangel på permanente kurer for inflammatorisk tarmsykdom (IBD), f.eks. Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). I Sverige diagnostiseres 1400 nye pasienter med IBD hvert år, med den høyeste forekomst ved en alder på 20 år, noe som fører til livsvarig behandling med kortison og/eller immunundertrykkende medikamenter med alvorlige bivirkninger. Videre fører IBD ofte til kirurgisk tarmreseksjon og permanent stoma, noe som er et større handikap. Ulcerøs kolitt forhøyer også risikoen for kreft i tykktarmen.

IBD antas å være en autoimmun sykdom som skyldes unormaliteter i den immunologiske respons på normalt sett harmløse slimhinneantigener. Basert på cytokinene som deltar karakteriseres betennelsen ved CD som en THl-celleformidlet immunrespons. UC foreslås å ha en TH2-celleformidlet respons, selv om dette ikke klart har blitt vist (Fuss I J et al., 1996. J. Immunol. 157:1261-70, Mullin G E et al., 1996. Inflamm. Bowel Dis. 2:16-26).

Cytokiner virker som regulatorer av immunresponser ved at de stimulerer differensiering og proliferasjon av de cellulære elementer som inngår. CD4+-hjelper-T-celler kan differensiere til to hovedunderpopulasjoner av effektorceller, ThI-celler når de stimuleres med IL-12 og TH2-celler når de stimuleres med IL-4. ThI-celler utskiller IFN-y, som stimulerer fagocytt- og cytolytisk T-celleavhengige reaksjoner mot intracellulære mikrober som virus eller intracellulære bakterier. TH2-celler utskiller IL-4 og IL-5, som stimulerer dannelsen av IgE og eosinofil/mastcelleformidlet forsvar mot parasitter. Th2 bidrar også til å nedregulere ThI-responser.

WO 2005070090 A2 beskriver en metode for å isolere regulatoriske T-celler fra en IBD pasient, men ikke fra portvaktslymfeknute.

EP 1408106 Al beskriver en fremgangsmåte for å isolere celler fra portvaktslymfeknute relatert til behandling av kreft.

Foussat et al., 2003. J. Imm., 171(10):5018-5026 sammenlikner regulatoriske T-celler og CD4<+>CD25<+>T-celler for inflammasjonskontroll i relasjon til IBD.

Oppfinnelsens formål

Det er et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et middel for anvendelse i en fremgangsmåte som kurerer inflammatorisk tarmsykdom, eller som i det minste holder sykdommen i sjakk over lengre tidsrom.

Videre formål vil bli åpenbare ut fra den påfølgende oppsummering av oppfinnelsen, et antall figurer som illustrerer den, beskrivelsen av foretrukne utførelser av den, samt fra de vedlagte krav.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse bygger på den oppdagelse at inflammatorisk tarmsykdom, nærmere bestemt Crohns sykdom og/eller ulcerøs kolitt, kan kureres permanent, eller i det minste holdes i en hvilende eller inaktiv tilstand, ved tilførsel av regulatoriske T-celler (Treg) oppsamlet fra portvaktslymfeknuter ("sentinel lymph node") hos pasienten og ekspandert in vitro. Derved reduseres betennelsen i tarmen, og kan til og med fullt ut undertrykkes uten at man må ty til medikamenter som kortikosteroider.

Immunsystemets manglende responsivitet på oralt tilførte antigener er definert som oral toleranse. Tilsynelatende forhindrer denne mekanismen ukorrekt immunreaksjon mot tarminnhold og antas å formidles av minst to prosesser: for det første, aktiveringen av regulatoriske T-celler (Treg, CD4<+>CD25<+>), som er medlemmer av T-hjelpercellefamilien (CD4<+>), og for det andre, induksjon av klonal delesjon eller anergi av T-celler. Den første prosessen, som er ansvarlig for toleranse overfor antigeneksponering i lave doser, finner formodentlig sted i det lokale intestinale lymfesystem og avhenger av dannelsen av cytokinet TGF-fJ. Den andre prosessen (delesjonsprosessen) finner formodentlig sted i systemisk lymfevev, utløses av filtrerte antigener og ligner på mekanismen bak indusert toleranse overfor intravenøst tilførte antigener i fravær av immunologisk adjuvans. Denne siste, tolerogene mekanismen ser ut til å være mer fremtredende etter eksponering overfor antigen i høye doser.

Aktiveringen av T-celler reguleres nøye for opprettholdelse av balansen i immunsystemet ved at det unngås overdreven og feilrettet immunrespons, noe som observeres ved autoimmunitet. I pasienter med Crohns sykdom er mesenteriale lymfeknuter svært forstørret, som et tegn på ukontrollert regulering av T-celleaktiveringen.

Siden IBD er en betennelse er de mesenteriale lymfeknutene som ligger nærmest betennelsessetet hovedsakelig ansvarlige for drenering av setet. De første knutene som foreligger langs en direkte vei fra det betente området kalles portvaktslymfeknuter.

Regulatoriske T-celler i aktivert tilstand oppsamles fra en pasients lymfeknuter (portvaktslymfeknuter) som drenerer tarmsekvenser med IBD, ekspanderes in vitro og reinfunderes i pasienten.

Regulatoriske T-celler i ikke-aktivert tilstand oppsamles fra en pasients lymfeknuter som drenerer friske tarmsegmenter, dvs. tarmsegmenter som ikke er rammet av IBD, ekspanderes in vitro og reinfunderes i pasienten. De aktiverte så vel som de ikke-aktiverte regulatoriske T-cellene som oppsamles på denne måten kan (videre) aktiveres in vitro med egnede midler, f.eks. cytokiner.

Regulatoriske T-celler i aktivert tilstand eller ikke-aktivert tilstand oppsamles fra lymfeknuter som drenerer tarmsegmenter med henholdsvis uten IBD og ekspanderes in vitro. Ekspansjonen kan være kontinuerlig eller i intervaller, f.eks. i faser som avbrytes av én eller flere hvilefaser. De ekspanderte regulatoriske T-cellene aktiveres (stimuleres) med ett eller flere cytokiner i kombinasjon med et antigenekstrakt fra et betent tarmsegment. Alternativt aktiveres (stimuleres) de regulatoriske T-cellene som er oppsamlet fra lymfeknuter som drenerer tarmsegmenter med eller uten IBD på en slik måte før ekspansjonen eller mellom ekspansjonsfasene. Et cytokin, fortrinnsvis to eller flere cytokiner utvalgt blant IL-2, IL-7, IL-10, TGF-p, TSLP, f.eks. en cytokinblanding som omfatter IL-2, IL-7, IL-10, TGF-P henholdsvis TGF-pi, og TSLP anvendes i kombinasjon med antigenekstraktet fra det betente tarmsegment for å oppnå Treg-aktivering. Det foretrekkes også å sørge for ytterligere Treg-aktivering ved anvendelse av anti-CD3, anti-CD28 og rapamycin. Etter ekspansjonen reinfunderes de ekspanderte og aktiverte regulatoriske T-cellene tilbake til pasienten.

Behandling med autologe regulatoriske T-celler har den fordel at bivirkningene reduseres eller til og med forsvinner, og at behandlingen har høy effektivitet.

Regulatoriske T-celler i aktivert tilstand, oppsamlet fra lymfeknuter som drenerer tarmsegmenter med eller uten IBD fra en pasient med Crohns sykdom og aktivert med et antigenekstrakt fra det betente setet i kombinasjon med en lav dose av cytokinet IL-2 for ekspansjon, benyttes fortrinnsvis i videre kombinasjon med antistoffer mot IFN-y og/eller TNF-a for undertrykkelse av ThI-forfordeling og TH2-ekspansjon. Det foretrekkes også å kondisjonere dyrkningsmediet med mellomrom, f.eks. fra hver dag til hver femte dag, fortrinnsvis hver dag, over et tidsrom på 1 uke eller mer, fortrinnsvis for et tidsrom på fra 3-4 uker. Derved erholdes en populasjon av TH2-celler, som anvendes i autotransfusjon for reetablering av ThI/ TH2-balansen i en pasient. Ekspansjonen kan understøttes av ytterligere aktivering med et CD3-antistoff. For å forbedre TH2-forfordelingen kan et anti-CD28-antistoff i tillegg anvendes ved ekspansjonen i kombinasjon med et anti-IL-12-antistoff.

Regulatoriske T-celler i aktivert tilstand, oppsamlet fra lymfeknuter som drenerer tarmsegmenter med eller uten IBD fra en pasient med ulcerøs kolitt, aktiveres med et antigenekstrakt fra det betente setet i kombinasjon med ett eller flere av cytokinene IL-2, IL-12 og IFN-a for ekspansjon, fortrinnsvis i videre kombinasjon med anti-IL4-antistoff og/eller anti-IL-10-antistoff. Det foretrekkes også å kondisjonere dyrkningsmediet med mellomrom, f.eks. fra hver dag til hver femte dag, fortrinnsvis hver dag, over et tidsrom på 1 uke eller mer, fortrinnsvis over et tidsrom på fra 3-4 uker. Ytterligere stimuli som CD3 og CD28 kan tilføres, fortrinnsvis mot slutten av ekspansjonsperioden.

Ifølge et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes anvendelse av ett eller flere cytokiner i et farmasøytisk aksepterbart bærestoff for in v/fro-aktivering av regulatoriske T-celler oppsamlet fra en pasient med IBD, fortrinnsvis fra portvaktslymfeknuter som er påvirket av IBD.

En fremgangsmåte tilveiebringes for erholdelse av portvaktslymfeknuter som drenerer tarmsegmenter med IBD som omfatter injeksjon av et lymfatisk fargingsmiddel, f.eks. patent blue, i områder med lesjoner i tarmen hos en pasient som lider av IBD, påvisning av lymfevev som farges av midlet, om ønskelig markering av det fargede vev med suturer og reseksjon av det fargede vev. Det resekterte vev undersøkes nøye (undersøkes, f.eks. ved mikroskopi), hvoretter portvaktslymfeknutene som drenerer tarmsegmenter med IBD kuttes ut fra vevet.

Ifølge et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for isolering av regulatoriske T-celler fra en utskåret portvaktslymfeknute som drenerer et tarmsegment med IBD, som omfatter å utøve et trykk på lymfeknuten, oppsamle cellesuspensjonen som derved utsendes fra knuten og isolering av regulatoriske T-celler fra suspensjonen.

Ifølge et aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes regulatoriske T-celler isolert fra en portvaktslymfeknute som drenerer et tarmsegment med IBD.

Videre foretrukne aspekter av oppfinnelsen inngår i de vedlagte krav.

Oppfinnelsen vil nå forklares i mer detalj med henvisning til foretrukne, men ikke begrensende utførelser av oppfinnelsen, illustrert ved et antall figurer.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et diagram som viser aktiverte Treg i en Treg-prøve, identifisert ved ekspresjon av to overflatemarkører,

Fig. 2 er et diagram som viser en funksjonell Treg-analyse,

Fig. 3 viser en RT-PCR-analyse av mRNA ekstrahert fra ekspanderte Treg,

Fig. 4 er et diagram som viser den regulerende evne til en Treg-populasjon før og etter ekspansjon, Fig. 5 er et diagram som viser aktivering av humane immunologiske celler med et endogent ekstrakt fra en betent tarmseksjon, Fig. 6 er et diagram som viser doseresponsen av likt aktiverte Treg avledet fra portvaktslymfeknuter,

Fig. 7 viser ekspresjonen av CCR5 som en markør for Th2,

Fig. 8 viser sekresjonen av IL-4 fra Treg fra UC-pasienter,

Fig. 9 viser sekresjonen av IFN-y fra Treg fra CD-pasienter.

Beskrivelse av foretrukne utførelser

EKSEMPEL 1. Identifisering av portvaktslymfeknuter som drenerer betente tarmsegmenter

Portvaktslymfeknuteteknikken har blitt anvendt i et tiår for å bestemme stadiet for ondartede tumorer, hovedsakelig ondartet melanom og brystkreft. Portvaktslymfeknuten identifiseres under kirurgiske inngrep ved å synliggjøre lymfedrenasjen fra kreften ved anvendelse av et lymfatisk fargingsmiddel, f.eks. patent blue (CAS 129-17-9 og patent blue V (CAS 3536-49-0, ofte levert som en kalsiumchelatert dimer), som injiseres i områder med lesjoner i tarmen. De således påviste portvaktslymfeknutene merkes med én eller flere suturer eller ved andre midler. Så resekteres tarmlesjonene sammen med ikke-rammede, marginale soner og vesenterium, innbefattet kar og regionale lymfeknuter, på konvensjonell måte. Det resekterte vev undersøkes nøye, og portvaktslymfeknutene påvises og fjernes. Denne fremgangsmåten benyttes på portvaktslymfeknuter som drenerer både betent og ikke rammet tarm i pasienter med ulcerøs kolitt eller Crohns sykdom. I tillegg oppsamles en veneblodprøve fra pasienten. Prøven av perifert blod og knutene prosesseres så sammen med prøver fra de betente lesjonene så vel som tarmsegmenter som ikke er rammet av sykdommen i laboratoriet for immunologisk analyse og T-celleekspansjon. Leukocytter fra perifert blod (PBL) renses med Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Amersham). Encellesuspensjoner av lymfeknuteceller erholdes ved forsiktig trykk og anvendelse av en glasshomogenisator med løs tilpasning. Antigenekstrakter fra tarmprøver fremstilles ved homogenisering av vevsfragmentene i en Dounce homogenisator, fulgt av 5 min. denaturering ved 97°C. Cellene behandles så ved funksjonelle analyser.

EKSEMPEL 2. Isolering av T-cellepopulasjoner

Lymfocytter og monocytter renses fra blodprøver eller buffy coat ved anvendelse av Ficoll-Hypaque Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Buffy coat eller blodprøven det gjalt ble fortynnet med PBS og forsiktig lagt over en Ficoll-natriumdiatrizoatløsning, hvoretter tofasesystemet ble sentrifugert ved 400 x g i 30 min. Lymfocyttene og monocyttene oppsamlet på grenseflaten mellom Ficoll-løsningen og plasma, mens erytrocytter og granulocytter ble oppsamlet i bunnen av rørene. Lymfocyttlaget ble fjernet ved anvendelse av en pasteurpipette, og cellene ble vasket med HB SS for fjerning av overskudd av Ficoll-Hypaque Plus, plasma og blodplater. Dersom cellene ikke ble anvendes umiddelbart ble de lagret ved 37°C i RPMI-medium tilsatt 10 % HuS, 1 % PeSt og 1 % glutamin. Konvensjonelle CD4<+->Th-celler og CD4<+>CD25<+->celler ble renset ved anvendelse av en autoMACS separator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). Cellene ble talt og sentrifugert ved 300 x g i 10 min., supernatanten fullstendig avpipetert og cellene løst i 90 ul MACS-buffer (0,5 % BSA, 2 mM EDTA, 0,01 % natriumazid i PBS) og 10 ul Biotin-antistoffblanding pr. IO<7>celler. Denne behandlingen merket alle ikke- CD4<+->cellepopulasjoner. Etter 10 min. inkubering ved 4°C ble 20 ul anti-biotin-mikrokuler tilsatt pr. IO<7>celler, og blandingen ble inkubert i ytterligere 15 min. ved 4°C. Cellene ble vasket med~20 volumer MACS-buffer og sentrifugert ved 300 x g i 10 min., supernatanten ble fullstendig fjernet og cellene ble resuspendert i 500 MACS-buffer pr. 10<8>celler. Magnetisk separasjon ble utført i en autoMACS-separator for fjerning av ikke-CD4<+->celler fra prøven. Ved isolering av CD4<+>/CD25<+->cellene fra CD4<+->populasjonen ble CD4<+->cellene talt og sentrifugert ved 300 x g i 10 min., supernatanten ble fullstendig fjernet og de nedsentrifugerte cellene suspendert i 90 ul MACS-buffer og 10 ul CD25 MicroBeads pr. IO<7>celler. Etter 15 min. inkubering ved 4°B ble cellene vasket som beskrevet ovenfor, og CD25<+->cellene ble isolert ved positiv seleksjon i autoMACS-separatoren. Uttak fra alle populasjoner ble analysert ved væskestrømscytometri.

EKSEMPEL 3. Karakterisering av celler ved væskestrømscytometri Væskestrømscytometri (FACS) ble anvendt for undersøkelse av ekspresjonen av forskjellige overflatemarkører på de isolerte cellepopulasjonene. Cellene ble fordelt i 4 ml FACS-rør, vasket med 2 ml FACS-buffer (2 % FCS, 0,05 % natriumazid i PBS) og sentrifugert ved 300 x t i 10 min., supernatanten ble avhelt og de nedsentrifugerte cellene resuspendert i 100 ul FACS-buffer. 7 ul av hvert av antistoffene som skulle anvendes ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i minst 30 min. ved 4°C, hvoretter cellene ble vasket nok en gang med FACS-buffer, sentrifugert som tidligere og resuspendert i 1 ml FACS-lyseringsløsning for cellefiksering og erytrocyttlysering, blandet og inkubert i 10 min. ved 4°C før vask og sentrifugering igjen som beskrevet ovenfor. Supernatanten ble avhelt og cellene resuspendert i 500 ul FACS-buffer pr. rør, hvoretter analysen ble utført ved anvendelse av et Becton Dickinson FACSCalubur-instrument (Franklin Lakes, NJ,

USA).

EKSEMPEL 4. Proliferasjonsanalyser

Den supremerende evnen til de rensede CD4<+>CD25<+->cellene ble undersøkt. 96-brønners plater med rund bunn ble inkubert med 25 (xl av 5 ug/ml anti-CD3-IgG i PBS ved 37°C i 90 min. Brønnene ble vasket tre ganger med 200 (xl PBS, hvoretter tre forskjellige cellepopulasj oner ble tilsatt. 100 ul med 500000 celler/ml av CD4-celler bestrålt med 25 Gy ble tilsatt til hver brønn, sammen med 30000 CD4+CD25-responderceller og 1 [ ig/ ml løselig CD28 (sluttkonsentrasjon). CD4<+>CD25<+->celler ble tilsatt til brønnene i forskjellige mengder for å gi et antall forskjellige forhold mellom CD4<+>CD25" og CD4<+>CD25<+>. Som kontroll ble det samme antall CD4<+>CD25"-celler tilsatt til respondercellene i et ekstra sett av brønner.

Platene ble inkubert ved 37°C i 4 eller 5 dager før 1 nCi [3H]tymidin ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 18 timer, hvoretter de ble nedfrosset ved

-20°C. Cellene ble opptint og innholdet i brønnen overført til et glassfiberfilter

(Wallac, Turku, Finland) med en cellehøster (TOMTEC, Hamden, CT, USA). MeltiLex A - Melt-on-scintillatorark (Wallac, Turku, Finland) ble plassert på toppen av filtrene og smeltet ved 85°C. Radioaktiviteten ble målt ved anvendelse av en 1205 betaplate væskescintillasjonsteller (Wallac, Turku, Finland).

EKSEMPEL 5. TGF-pl-induksjon av FoxP3

CD4<+>CD25"-celler ble fremstilt fra buffy coat som beskrevet ovenfor. PBMC ble fremstilt fra en annen donor og bestrålt (25 Gy). 3 x IO<6>CD4<+->celler ble så alloaktivert med 1,25 x IO<6>PBMC i et volum på 2 ml/brønn i 6-brønners plater med eller uten 1 ng/ml TGF-pl. Platene ble inkubert ved 37°C. Celleprøver ble uttatt for væskestrømcytometrisk analyse og RNA-ekstraksjon på dag 2, 5 og 7.

EKSEMPEL 6. RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese

RNA-ekstraksjon fra forskjellige cellepopulasj oner for senere anvendelse i PCR-analyser ble utført som følger. Cellene ble lysert i 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pr. 5-6 x IO<6>celler, hvoretter prøven enten ble umiddelbart nedfrosset ved -70°C for lagring eller inkubert i 5 min. ved romtemperatur før tilsetning av 0,2 ml kloroform pr. ml TRIzol-reagens, hvoretter prøvene ble rystet kraftig. Etter 2-3 min. ble rørene sentrifugert ved 12000 x g i 15 min. ved 4°C. Den gjennomsiktige, vandige fasen ble overført til et nytt rør, og RNA ble utfelt med 0,5 ml isopropanol pr. ml TRIzol som ble anvendt i det første trinn og inkubert i 10 min. ved romtemperatur før sentrifugering ved 12000 x g i 10 min. ved 4°C. Supernatanten ble fjernet og nedsentrifugert materiale vasket med 1 ml 75 % etanol pr. ml TRIzol anvendt i det første trinn. Rørene ble vorteksbehandlet og sentrifugert ved 7500 x g i 5 min. ved 4°C, hvoretter det nedsentrifugerte materialet ble lufttørket i kort tid (5-10 min.), løst i 10 ul RNAse-fritt vann og inkubert ved 55°C i 10 min. cDNA-syntese ble utført med iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ifølge produsentens fremgangsmåte.

EKSEMPEL 7. Polymerase-kjedereaksjon (PCR) og sanntids kvantitativ PCR

Syntetisert cDNA fra de forskjellige cellepopulasj onene ble anvendt i PCR. Målet med PCR var å påvise ekspresjon av FoxP3, GAPDH og RNA-polymerase II (RPII). Primere ble erholdt fra Cybergene AB, Huddinge, Sverige. Sekvensene var: FoxP2, forover - CAGCACTTCCCAGAGTTCCTC, revers -

GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC, GAPDH, forover -

GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, revers - GAAGATGGTGATGGGATTTC, RPII,

forover - GCACCACGTCCAATGACAT, revers - GTGCGGCTGCTTCCATAA. For vanlig PCR ble det anvendt ThermoPol reaksjonsbuffer og Taq DNA-polymerase (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Tyskland), mens iQSYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ble anvendt i kvantitativ sanntids PCR. Reaksjonene ble utført i en MyCyeler programmerbar varmeblokk henholdsvis et iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules,

CA, USA) ifølge fremgangsmåten: 30 sek. ved 95°C, 30 sek. ved 48-65°C og 30 sek. ved 72°C over minst 40 gjentatte sykluser. For de kvantitative sanntids-PCR-reaksjonene ble det benyttet en relativ kvantifiseringsfremgangsmåte, se oversikt av Ginzinger D G, Exp. Hematol. 2002 30:503-12. PCR-produktene ble fraksjonert i en 2 % agarosegel og båndene påvist ved UV-eksitasjon av inkorporert etidiumbromid.

EKSEMPEL 8. Undersøkelse av Treg erholdt fra portvaktslymfeknuter fra IBD-pasienter

Portvaktslymfeknuter fra i alt 20 pasienter med IBD ble høstet kirurgisk og undersøkt. Portvaktslymfeknuteerholdte lymfocytter (SEAL) blekarakterisertmed hensyn til ekspresjonen av overflatemarkørene CD4, CD8, CD3, T-cellereseptoren (TCR), CD25, CD69, CD45RA, CD45RO og CD 14. Antall celler i CD4<+>CD25<hi->Treg-populasjonen ble undersøkt (fig. 1). Antallet av Treg-celler ble funnet å være normalt i portvaktslymfeknuter som drenerer et betent tarmsegment, sammenlignet med antall Treg-celler i portvaktslymfeknuter som drenerer ikke-påvirkede områder i tarmen.

Treg (CD4<+>CD25<hl>) renset fra portvaktslymfeknuter som drenerte et betent segment og Treg (CD4<+>CD25<hl>) renset fra et tarmsegment som ikke deltok i betennelsen var imidlertid vesentlig forskjellige når det gjaldt deres regulatoriske aktivering av T-celler: Treg fra portvaktslymfeknuter som drenerte det betente setet hadde en utilfredsstillende yteevne når det gjelder regulering av aktiveringen av T-celler (fig. 2). Med andre ord er den T-celleresponsregulerende evnen til Treg fra portvaktslymfeknuter som drenerer rammede områder klart svekket.

EKSEMPEL 9. Ekspansjon av regulatoriske T-celler

For Treg-induksjon og -ekspansjon ble CD4<+>CD25"-T-celler fra perifert blod stimulert med IL-2, CD28, allogeneiske mateceller og TGF-p. Etter ekspansjonen uttrykte > 85 % av CD4<+->T-cellene CD25 i høyt nivå, undersøkt ved FACS (ikke vist), noe som indikerer en Treg-fenotype. RT-PCR viste at den ekspanderte populasjonen inneholdt Treg-kjennetegntranskriptet FoxP3, som ikke forelå i CD4<+>CD25"-populasjonen før ekspansjonen (fig. 3).

Den induserte og ekspanderte Treg-populasjonen ble analysert funksjonelt for å vise evnen til å inhibere T-celleaktivering. Den ekspanderte CD4<+>CD25<+>FoxP3<+->populasjonen (fig. 3) viste Treg-regulatoriske egenskaper, vist ved inhiberingen av T-hjelpercelleproliferasjonen allerede i et forhold på 1:10 (fig. 4). Antall Treg-celler ser ut til å være normalt i portvaktslymfeknuter som drenerer betente tarmsegmenter fra pasienter med IBD, de ser ut til å være lite effektive når det gjelder å inhibere responsen av stimulerte T-celler. Ved å stimulere og ekspandere naive T-celler kan effektive T-regulatoriske egenskaper oppnås.

EKSEMPEL 10. Gjenkjenning av antigener avledet fra det betente setet ved regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter.

Regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter, negative knuter, tarmepitel og leukocytter fra perifert blod ble inkubert i forskjellige konsentrasjoner av tarmcellehomogenater i fra 5-7 dager. Proliferasjon ble observert for Treg fra portvaktslymfeknuter stimulert med antigenekstrakt fra et betent område (fig. 5).

Når regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter ble stimulert med antigenekstrakter avledet fra ikke-betente seter ble imidlertid ingen eller en svært svak respons observert (ikke vist). Funnene hos pasienter med Crohns sykdom lignet funnene fra pasienter med ulcerøs kolitt.

Portvaktslymfeknuter som drenerer rammede områder i blindtar og i colon sigmoideum både gjenkjenner og prolifererer mot det samme antigenekstrakt avledet fra det betente setet (fig. 6). Disse funnene viser at det er et felles antigen som er ansvarlig for klonal ekspansjon av T-celler. Den høye spontane proliferasjon som ble observert skyldes in vivo klonal T-celleekspansjon i portvaktslymfeknuten. Regulatoriske T-celler avledet fra en portvaktslymfeknute responderer proporsjonalt med dosen av antigenekstrakt.

Regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter viser forhøyet ekspresjon av cytokiner. CD4<+->T-celler fra portvaktslymfeknuter er CD45RO<+>/CCR5<+>i pasienter med UC, noe som tyder på en tilstand med overdreven Th2-inflammatorisk respons mot de betente slimhinnene (fig. 7).

Portvaktslymfeknuter fra pasienter med UC utskiller forhøyede mengder av IL-4, et Th2-cytokin, etter aktivering med et antigenekstrakt fra det betente setet (fig. 8).

Regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter fra pasienter med Crohns sykdom responderer med forhøyet dannelse av Ttil-cytokinet IFN-y etter antigenspesifikk aktivering (fig. 9).

Disse funnene indikerer at T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter fra pasienter med UC har en overdreven proliferativ respons mot antigener fra det betente setet, og at de regulatoriske T-cellene avledet fra portvaktslymfeknuter reagerer med en TH2-respons, som antydet av den forhøyede CCR5-ekspresjonen (fig. 7) og den forhøyede dannelsen av TH2-cytoknet, f.eks. IL-4 (fig. 8). T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter fra pasienter med Crohns sykdom viser et motsatt aktiveringsmønster, med hovedsakelig dannelse av ThI-cytokiner, f.eks. IFN-y.

Endotelceller fra såret i UC eller det betente setet i tarmen hos pasienter med US eller Crohns sykdom går inn i apoptose eller nekrose, og endocytoseres så av profesjonelle antigenpresenterende celler (APC). APC endocyterer disintegrerte endotelceller og migrerer via lymfekar til den drenerende lymfeknuten, portvaktslymfeknuten, hvor APC prosesserer og presenterer proteiner (antigener) avledet fra endotelcellene for T-celler. T-cellene blir aktivert, gjennomgår klonal ekspansjon og forlater lymfeknuten for oppsøking av betente områder, hvor de blir effektorceller og bidrar til betennelsen.

EKSEMPEL 11. Behandling av IBD

IBD, fortrinnsvis Crohns sykdom og/eller ulcerøs kolitt, kan behandles ved å høste regulatoriske T-celler fra portvaktslymfeknuter fra en pasient som drenerer det betente området, ekspandere dem og aktivere dem in vitro og tilbakeføre dem til pasienten ved infusjon. Nærmere bestemt drar in v/fro-ekspansjon av regulatoriske T-celler på en antigenspesifikk måte fordel av klonalt ekspanderte Treg som akkumuleres i portvaktslymfeknuter. Treg fra portvaktslymfeknuter fra pasienter med IBD ekspanderes under GMP-betingelser og aktiveres ved anvendelse av en cytokinblanding som inneholder IL-2, IL-7, IL-10, TGF-P sammen med antigenekstrakt fra det betente tarmsegment, for oppnåelse av antigenspesifikk ekspansjon av Treg. Aktiveringseffektiviteten evalueres med RT-PCR, FACS og in v/fro-inhiberingsanalyser som beskrevet (fig. 4). Ytterligere aktivering med anti-CD3, anti-CD28 og rapamycin kan anvendes for å oppnå optimal ekspansjon og funksjonalitet av IBD-Treg-cellene. Dersom Treg-cellene fra portvaktslymfeknuter som drenerer et betent tarmsegment ikke er tilfredsstillende med hensyn til celletall og/eller cellefunksjon kan alternativt ekspansjon av Treg fra portvaktslymfeknuter som drenerer ikke-betente segmenter ved anvendelse av de samme fremgangsmåtene tas i betraktning. Tankegangen bak denne alternative tilnærmingen er at man kan anse et ikke-inflammatorisk segment som regulert på egnet vis, følgelig er Treg-cellene funksjonelle, om enn for få i antall til å kunne opprettholde reguleringen i nabotarmsegmenter. Ekspanderte Treg av én av disse typene tilbakeføres som en autotransfusjon for å gjenoppnå en ordnet immunregulering.

Tekster til figurene

Fig. 1. Treg-celler, påvist ved ekspresjonen av overflatemarkørene CD4<+>og høyt nivå av IL-2-reseptoren CD25, CD4<+>CD25<hi>. Fig. 2. Funksjonell Treg-analyse. Rensede Treg fra portvaktslymfeknuter som drenerte et betent tarmsegment (åpne sirkler) og et ikke-betent segment (fylte sirkler) ble inkubert med CD4<+>CD25"-T-hjelperceller renset fra perifert blod og aktivert med anti-CD3 og anti-CD28. 3H-tymidin ble tilsatt til kulturene under de siste 16 timene. Fig. 3. Ekspansjon av Treg-celler. CD4<+>CD25--celler ble aktivert med IL-2, TGF-P, anti-CD28 og mateceller for stimulering av ekspansjon av Treg-celler. mRNA ble ekstrahert fra ekspanderte CD4<+>CD25<+->Treg-celler, og FoxP3-transkriptet ble påvist ved RT-PCR, noe som identifiserer den ekspanderte populasjonen som Treg. Fig. 4. Regulering av stimulerte responder-T-hjelperceller. En pre-ekspansjonspopulasjon inneholdende CD4<+>CD25"-celler er ute av stand til å regulere (fylte sirkler), mens adekvat regulering oppnås med ekspanderte CD4<+>CD25<+->celler (åpne sirkler). Fig. 5. Aktivering av humane immunologiske celler. Celler erholdt fra portvaktslymfeknuter, ikke-portvaktslymfeknuter og tarm, så vel som lymfocytter fra perifert blod ble aktivert med et endogent antigenekstrakt erholdt fra et betent tarmsegment hos en pasient med ulcerøs kolitt. Fig. 6. Doseresponsdiagram. Doseresponsen for regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter som drenerte blindtarm og colon sigmoideum, aktivert med et endogent antigenekstrakt avledet fra den samme betente tarmseksjonen, vises. Fig. 7. Ekspresjon av CCR5 som en markør for Th2. Regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter fra en pasient med UC har forhøyet ekspresjon av CCR5 på CD4<+>CD45RO<+->hukommelsesceller som et tegn på TH2-aktivering. Fig. 8. Sekresjon av TH2-cytokinet IL-4 i regulatoriske T-celler fra pasienter med UC. Celler fra ikke-portvaktslymfeknuter (nSLN) og fra portvaktslymfeknuter (SLN) ble stimulert i 48 timer med betennelsesantigenekstrakter. Utskilt IL-4 ble målt i dyrkningssupernatanter med anvendelse av "sandwich"-ELISA. Fig. 9. Sekresjon av Tid-cytokinet IFN-y fra regulatoriske T-celler avledet fra portvaktslymfeknuter fra pasienter med Crohns sykdom. Celler fra ikke-portvaktslymfeknuter (nSLN) og fra portvaktslymfeknuter (SLN1 og SLN2) ble stimulert i 48 timer med et betennelsesantigenekstrakt. Utskilt IFN-y ble målt i dyrkningssupernatanter ved anvendelse av "sandwich"-ELISA.

Claims

1. Anvendelse av ett eller flere cytokiner i et farmasøytisk akseptabelt bærestoff for in v/fro-aktivering av regulatoriske T-celler oppsamlet fra en portvaktslymfeknute fra en pasient med IBD.

2. Anvendelse ifølge krav 2, hvori IBD er Crohns sykdom.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori IBD er ulcerøs kolitt.

4. Fremgangsmåte for isolering av regulatoriske T-celler fra en utskåret portvaktslymfeknute som drenerer et tarmsegment med IBD, karakterisert vedat den omfatter (a) utøvelse av et trykk på portvaktslymfeknuten, (b) oppsamling av cellesuspensjonen som presses ut fra knuten, og (c) isolering av regulatoriske T-celler fra cellesuspensjonen.

5. Regulatorisk T-celle, karakterisert vedat den er isolert fra en portvaktslymfeknute som drenerer et tarmsegment som lider av IBD.

6. Regulatorisk T-celle ifølge krav 5, karakterisert vedat IBD er Crohns sykdom.

7. Regulatorisk T-celle ifølge krav 5, karakterisert vedat IBD er ulcerøs kolitt.

8. Fremgangsmåte for ekspansjon av regulatoriske T-celler som er anvendbare ved behandling av IBD, karakterisert vedat den omfatter (a) erholdelse i et egnet dyrkningsmedium av regulatoriske T-celler oppsamlet fra en portvaktslymfeknute fra en IBD-pasient, (b) aktivering av cellene ved å sette dem i forbindelse med et cytokin, og (c) ekspansjon av de aktiverte cellene.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert vedat noe eller all aktivering utføres under ekspansjonen.

10. Anvendelse av et cytokin utvalgt blant IL-2, IL-7, IL-10, TGF-pl og TSLP for aktivering av regulatoriske T-celler erholdt fra en portvaktslymfeknute fra en pasient som lider av IBD.

11. Anvendelse av et antigenekstrakt erholdt fra et betent tarmsegment fra en pasient som lider av IBD i kombinasjon med et cytokin for aktivering av regulatoriske T-celler erholdt fra en portvaktslymfeknute fra pasienten.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvori cytokinet er utvalgt blant IL-2, IL-7, IL-10, TGF-pl og TSLP.

13. Anvendelse ifølge krav 10 henholdsvis 11-12 i kombinasjon.