CN103961365B - 低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用。将低聚甘露糖醛酸盐用于制备保护肝脏和治疗各种肝炎、肝纤维化或肝硬化的药物中，低聚甘露糖醛酸盐是以褐藻胶为原料，经化学降解法或物理降解法或两种降解法组合得不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经中和制备得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，其分子骨架为D-甘露糖醛酸(M)通过β-1,4糖苷键连接形成的线性寡糖化合物。本发明产品来源于海藻多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化和肝硬化方面具有广阔的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用。
背景技术
肝脏作为人体内最大、功能最多的实质性腺体器官之一，被喻为“人体最大的化工厂”，体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程均有肝脏的参与，随着经济的发展、环境污染及食品药品安全事件的高发，导致肝脏功能损害的疾病发病率呈逐年上升趋势。研究表明，肝脏的病变呈现出多样化和难治愈化。目前，肝病的治疗方法主要有病因治疗、饮食治疗和药物治疗，到目前为止还没有效果十分令人满意的药物。寻求一种安全有效且副作用较小防治肝脏功能损害的药物成为临床亟待解决的问题，也是目前各国研究的热点之一。
肝损伤的发生机制颇为复杂，可划分为化学性和免疫性肝损伤。肝脏极其容易受到化学毒性物质、药物等的损害，CCl4诱导的肝损伤模型是国内外最早使用的化学性肝损伤模型，也是一个目前适用广泛的肝损伤模型。免疫性肝损伤是肝炎、肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变发生发展的重要因素之一。从正常、免疫性肝脏损伤到肝脏终末病变的发展过程中，免疫性肝损伤是一个非常重要的环节，它决定了疾病的转归或者发展。而免疫性肝损伤ConA诱导的动物模型和D-氨基半乳糖诱导的肝损伤模型，接近人HBV发生的病理过程，是目前公认的比较好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的2种实验动物模型。
低聚甘露糖醛酸是一种由海洋褐藻中提取分离获得的胞间多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronicacid,M)通过1,4-糖苷键连接组成的线性化合物。目前，国内外有文献报道低聚甘露糖醛酸具有抗氧化、抗炎、免疫调节和抗老年痴呆等多种生物学活性，但尚未见有将其应用于化学性、免疫性肝损伤和各种肝炎、肝纤维化及肝硬化方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种低聚甘露糖醛酸盐(LPM)在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，低聚甘露糖醛酸盐可用于保护肝脏和治疗肝炎、肝纤维化或肝硬化的药物中。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
一种低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，低聚甘露糖醛酸盐是以褐藻胶为原料，经化学降解法或物理降解法或化学降解法与物理降解法的组合得不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经中和制备得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，其分子骨架为D-甘露糖醛酸(M)通过β-1,4糖苷键连接形成的线性寡糖化合物，重均分子量为0.3kDa～15kDa；其中，低聚甘露糖醛酸及其盐的分子结构通式如下：
式中，R＝H或Li，Na，K，Ca，Mg，n≤60。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，该低聚甘露糖醛酸盐用于制备保护肝脏和治疗肝炎、肝纤维化或肝硬化的药物中。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，该低聚甘露糖醛酸盐抑制由化学性肝损伤、免疫性肝损伤、病毒性和非病毒性肝炎、肝纤维化引起的肝体指数升高，降低血清中AST、ALT、甘油三酯、胆固醇水平，抑制肝组织病理学改变，从而达到保护肝脏和防治肝炎、肝纤维化或肝硬化的作用。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，该低聚甘露糖醛酸盐用于制备预防、治疗和改善肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化的药物或保健品；或者，该低聚甘露糖醛酸盐用于饮食补充剂或与联苯双酯、多烯磷脂酰胆碱、甘草酸、甘草酸苷、甘草酸二铵、硫普罗宁、水飞蓟、还原型谷胱甘肽、腺苷蛋氨酸、熊去氧胆酸相关临床西药，或与枸杞、绞股蓝、茵陈、金银花相关保肝中药，和包含低聚甘露糖醛酸盐的褐藻胶及褐藻胶寡糖之一的复配制剂或低聚甘露糖醛酸为母核的硫酸化或磷酸化相关衍生应用制剂。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，褐藻胶为褐藻酸(海藻酸)或褐藻酸钠。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，化学降解法主要是酸降解法或Fenton降解法，物理降解法主要是微波或超声降解法；或者，上述化学与物理降解法的组合，硫酸化或磷酸化相关衍生取代度为0.3-2.0。
所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，低聚甘露糖醛酸盐采用下述制备工艺：将褐藻胶配成2～12wt％水溶液，采用0.5～2wt％稀盐酸加热到80～90℃后搅拌降解4～5小时，冷却后用5～20wt％的碳酸钠水溶液中和，再用3～6wt％稀盐酸调节pH到3～4，离心收集上清液，然后加入3倍体积95wt％医用乙醇，收集沉淀，无水乙醇脱水后干燥，得到聚甘露糖醛酸，Mw＝8～20kD；将聚甘露糖醛酸用纯水配置成不同浓度的水溶液，将其加入微波消解罐中进行微波降解5～60分钟，得不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁中和后，经过超滤分级得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
本发明的设计思想是：
本发明采用昆明小鼠4种肝损伤和肝炎、肝纤维化模型，即CCl4或者ConA或者D-氨基半乳糖诱导的急性模型和长期CCl4损伤诱导的肝纤维化慢性模型，探索低聚甘露糖醛酸盐对各种肝损伤和肝炎、肝纤维化的保护作用。研究证明，低聚甘露糖醛酸盐能够抑制由CCl4或者ConA或者D-氨基半乳糖引起的肝体指数升高，有效降低ALT和AST水平，明显降低甘油三酯、胆固醇的水平，显著抑制肝组织病理学改变，从而实现对肝损伤和肝炎、肝纤维化的保护作用。
本发明的优点及有益效果是：
1、本发明采用各种化学性、免疫性肝损伤和各种肝炎、肝纤维化动物模型，探索低聚甘露糖醛酸盐对各种损伤引起ALT、AST、甘油三酯、胆固醇升高的作用的影响，并考察了低聚甘露糖醛酸盐抑制肝组织病理学改变的作用，发现低聚甘露糖醛酸盐在动物水平对化学性和免疫性肝损伤以及各种肝炎、肝纤维化具有显著保护作用。
2、本发明产品来源于海洋天然多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化及肝硬化方面具有广阔的开发应用前景。
3、本发明低聚甘露糖醛酸盐对化学性和免疫性肝损伤和各种肝炎、肝纤维化的保护作用，即用于预防或治疗肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化。
附图说明
图1(a)-图1(d)为LPM对小鼠化学性肝损伤所致的病理形态学的影响。其中，图1(a)为正常组(Control)；图1(b)为模型组(CCl4)；图1(c)为联苯双酯；图1(d)为LPM。
图2(a)-图2(d)为LPM对小鼠免疫性肝损伤所致的病理形态学的影响。其中，图2(a)为正常组(Control)；图2(b)为模型组(ConA)；图2(c)为联苯双酯；图2(d)为LPM。
图3(a)-图3(d)为LPM对小鼠免疫性肝损伤所致的病理形态学的影响。其中，图3(a)为正常组(Control)；图3(b)为模型组(D-氨基半乳糖)；图3(c)为联苯双酯；图3(d)为LPM。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1：低聚甘露糖醛酸盐(LPM)的制备
将褐藻胶(本实施例为褐藻酸钠)配成10wt％水溶液，采用1wt％稀盐酸加热到80～90℃后搅拌降解4～5小时，冷却后用10wt％的碳酸钠水溶液中和，再用5wt％稀盐酸调节pH到3.65左右，离心收集上清液，然后加入3倍体积95wt％医用乙醇，收集沉淀，无水乙醇脱水后干燥，得到聚甘露糖醛酸(Mw＝10.6kD)。将聚甘露糖醛酸用纯水配置成不同浓度的水溶液，将其加入微波消解罐中进行微波降解5、10、15、20、30分钟，所得不同分子量低聚甘露糖醛酸。低聚甘露糖醛酸经氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁中和后，经过超滤分级得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
所制得的低聚甘露糖醛酸或其盐的结构式如下：
式中R＝H或Li，Na，K，Ca，Mg等药用盐，其重均分子量范围为0.3kD～15kD(优选为1kD～10kD)，n≤60(优选为1～30)。
本实施例中，用TosohTSKGel3000PWXL柱色谱(内径7.8mm*柱长300mm)和右旋糖酐标准品(中国药品生物制品检定所)作为标准，测得获得的不同低聚甘露糖醛酸钠盐的重均分子量分别为1.6kD、3.2kD、5.8kD、6.4kD、8.2kD。
实施例2：低聚甘露糖醛酸盐(LPM)对CCl4诱导的小鼠肝脏体重指数升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(Mr＝3.2kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg，1h后一次性给予0.35wt％CCl410ml/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，分离肝脏，用预冷的PBS(0.1M，pH＝7)溶液漂洗两次，再用滤纸将脏器表面的水分吸干，称重，计算脏器指数。计算公式如下：脏器指数(％)＝脏器重量(g)/体重(g)*100％，结果如表1所示。
表1低聚甘露糖醛酸盐CCl4所致肝脏指数升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 体重(g) | 肝重(g) | 肝脏指数(％) |
| 正常组 | -- | 21.3±1.2 | 0.9±0.02 | 4.3±0.3 |
| 模型组 | -- | 22.4±1.0 | 1.3±0.03## | 5.4±0.3## |
| 联苯双酯 | 100 | 20.2±3.1 | 1.0±0.05* | 4.6±0.2* |
| LPM(3.2kD) | 100 | 21.5±1.1 | 1.0±0.03* | 4.5±0.4* |
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05，与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制CCl4引起的小鼠肝脏体重指数升高，其效果与联苯双酯相当。
实施例3：低聚甘露糖醛酸盐对CCl4诱导的小鼠血清ALT、AST水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(5.8kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg，1h后一次性给予0.35wt％CCl410ml/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，3000rpm×10min制备血清，测定ALT、AST指标，实验结果如表2所示。
表2低聚甘露糖醛酸盐对CCl4所致ALT、AST水平升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 正常组 | -- | 26.4±5.1 | 109.6±21.9 |
| 模型组 | -- | 96.7±39.0### | 257.7±41.5### |
| 阳性药组 | 100 | 53.7.±11.7** | 137.8±42.2** |
| LPM(5.8kD) | 100 | 41.9±9.5** | 152.1±21.3** |
###P<0.001，与正常对照组相比；*P<0.01与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制CCl4引起的小鼠血清中ALT、AST水平的升高，表明聚甘露糖醛酸盐能够保护肝细胞，减轻炎性反应，其效果与联苯双酯相当。
实施例4：低聚甘露糖醛酸盐对CCl4诱导的小鼠血清TG、TC水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(6.4kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg，1h后一次性给予0.35wt％CCl410ml/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，4000rpm×15min制备血清，测定TG、TC指标，如表3所示。
表3低聚甘露糖醛酸盐对CCl4所致TC、TG升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | TC(U/L) | TG(U/L) |
| 正常组 | -- | 2.14±0.43 | 0.55±0.23 |
| 模型组 | -- | 7.13±0.36### | 2.43±0.49### |
| 联苯双酯 | 100 | 3.66±0.38** | 1.38±0.35** |
| LPM(6.4kD) | 100 | 3.59±0.19** | 1.12±0.29** |
###P<0.001，与正常对照组相比；**P<0.01与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制CCl4引起的小鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平的升高，即结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够减轻化学性肝损伤所致的脂肪蓄积，效果显示出优于联苯双酯的趋势。
实施例5：低聚甘露糖醛酸盐对ConA诱导的小鼠血清ALT、AST水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(1.6kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg，1h后一次性静脉注射ConA15ml/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，3000rpm×10min制备血清，测定ALT、AST指标，实验结果如表4所示。
表4低聚甘露糖醛酸盐对ConA所致ALT、AST水平升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 正常组 | -- | 21.1±5.6 | 113.8±20.1 |
| 模型组 | -- | 151.6±41.2## | 182.1±34.2## |
| 阳性药组 | 100 | 38.4.±12.1* | 137.1±35.0* |
| LPM(1.6kD) | 100 | 41.7±10.3* | 136.6±37.1* |
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05与模型组相比；(n＝15；X±SD)
刀豆蛋白(ConA)所致的小鼠特异性肝损伤模型是近年来发展起来的由T细胞介导的免疫性肝损伤模型，可以很好的模拟人类自身免疫性肝病和病毒性肝炎的致病过程。测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制ConA引起的小鼠血清中ALT、AST水平的升高。即表明聚甘露糖醛酸能够有效避免免疫性肝损伤，保护肝脏。
实施例6：低聚甘露糖醛酸盐对ConA诱导的小鼠血清TG、TC水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(8.2kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg后，一次性静脉注射ConA15ml/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，4000rpm×15min制备血清，测定TG、TC指标，如表5所示。
表5低聚甘露糖醛酸盐对ConA所致TC、TG升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | TC(U/L) | TG(U/L) |
| 正常组 | -- | 1.61±0.72 | 0.57±0.21 |
| 模型组 | -- | 8.00±0.93## | 2.19±0.60## |
| 联苯双酯 | 100 | 3.41±0.37* | 1.33±0.41* |
| LPM(8.2kD) | 100 | 3.28±0.51* | 1.36±0.42* |
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制ConA引起的小鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平的升高，即结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够减轻免疫性肝损伤所致的脂肪蓄积。
实施例7：低聚甘露糖醛酸盐LPM对D-氨基半乳糖诱导的小鼠血清ALT、AST水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg，1h后一次性腹腔注射D-氨基半乳糖800mg/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，3000rpm×10min制备血清，测定ALT、AST指标，实验结果如表6所示。
表6低聚甘露糖醛酸盐对D-氨基半乳糖所致ALT、AST水平升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 正常组 | -- | 22.6±4.3 | 112.9±11.3 |
| 模型组 | -- | 182.4±19.5## | 200.2±31.1## |
| 阳性药组 | 100 | 38.3.±6.5* | 132.7±23.2* |
| LPM(3.2kD) | 100 | 36.0±2.5* | 138.1±22.4* |
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05与模型组相比；(n＝15；X±SD)
由于D-氨基半乳糖诱发的肝损伤与病毒性肝炎的损伤相当一致，故本试验中采用此模型以及上述ConA诱导模型代表肝炎损伤模型；测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制D-氨基半乳糖引起的小鼠血清中ALT、AST水平的升高。结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够有效避免D-氨基半乳糖引起的病毒性肝炎症状，保护肝细胞。
实施例8：低聚甘露糖醛酸盐对D-氨基半乳糖诱导的小鼠血清TG、TC水平升高的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM(10.6kD)给药组每组15只。适应性喂养3～5天，实验期间小鼠自由进食普通饲料和饮水，一次给药100mg/kg后，一次性腹腔注射D-氨基半乳糖800mg/kg，禁食不禁水。16h后，将小鼠处死，眼球取血，4000rpm×15min制备血清，测定TG、TC指标，如表7所示。
表7低聚甘露糖醛酸盐对D-氨基半乳糖所致TC、TG升高的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | TC(U/L) | TG(U/L) |
| 正常组 | -- | 1.73±0.32 | 0.52±0.21 |
| 模型组 | -- | 6.94±0.47## | 1.97±0.73## |
| 联苯双酯 | 100 | 4.54±0.62* | 1.08±0.35* |
| LPM(10.6Kd) | 100 | 4.29±0.31* | 1.21±0.42* |
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制D-氨基半乳糖引起的小鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平的升高，即结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够减轻肝炎所致的脂肪蓄积。
实施例9：低聚甘露糖醛酸盐对各种肝损伤和肝炎所致肝脏组织病理学改变的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。LPM对小鼠化学性肝损伤所致的病理形态学的影响如图1所示：正常组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，结构正常；模型组能观察到严重的病理组织变化，肝细胞广泛坏死，细胞膜不清楚，有不同程度的脂肪变性，炎性细胞浸润；联苯双酯和LPM组能明显改善由CCl4造成的肝损伤，修复坏死细胞。
LPM对小鼠免疫性肝损伤所致的病理形态学的影响如图2所示：正常组肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐，肝细胞无变性；模型组可见肝细胞小灶性溶解坏死，伴大量炎症细胞浸润；联苯双酯阳性组和LPM组肝细胞水样变性明显减轻，几乎无炎症细胞浸。
LPM对小鼠肝炎损伤所致的病理形态学的影响如图3所示:正常对照组肝小叶结构完整，未见肝细胞变性；D-氨基半乳糖模型组肝小叶结构模糊，肝细胞均明显肿胀，汇管区有炎细胞浸润，肝细胞片状坏死；联苯双酯阳性组和LPM组肝细胞坏死程度明显减轻，肝细胞结构得到有效修复。
实施例10：低聚甘露糖醛酸盐对长期CCl4诱导慢性肝纤维化的抑制作用
本实施例采用实施例1所得的低聚甘露糖醛酸钠盐。18～22g昆明种小鼠60只，随机分为正常(对照)组、模型组、阳性药(联苯双酯)组和LPM给药组每组15只。除正常组外，其余各组大鼠按10mL/kg的剂量每周注射40wt％CCl4-橄榄油2次，每次给药前称重，按实际体重调整给药剂量LPM，100mg/kg，连续8周。从造模日起，正常组及CCl4模型组给予生理盐水灌胃。8周后将小鼠处死，眼球取血，4000rpm×15min制备血清，测定ALT、AST、ALB指标；同时分离肝脏，测定肝脏当中的羟脯氨酸Hyp，如表8所示。
表8低聚甘露糖醛酸盐对CCl4所致慢性肝纤维化的抑制作用
##P<0.01，与正常对照组相比；*P<0.05与模型组相比；(n＝15；X±SD)
测试结果表明，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制长期CCl4所致肝纤维化ALT、ASL的升高，显著促进血浆白蛋白的含量，即结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够减轻肝纤维化进程中的肝脏炎症和脂肪蓄积；而且，低聚甘露糖醛酸盐口服给药能明显抑制肝脏羟脯氨酸Hyp含量的升高，羟脯氨酸是胶原蛋白分子所特有，故测定肝脏羟脯氨酸的含量，可显示肝脏蛋白中胶原蛋白的含量，直接反映肝脏纤维化程度，即结果表明低聚甘露糖醛酸盐能够抑制肝纤维化进程，修复肝损伤。
由于化学性肝损伤、免疫性肝损伤和肝炎的最初的表现，ALT、AST、TG升高和肝组织病理学改变是最显著且最重要的考察指标，慢性肝纤维化中肝脏羟脯氨酸Hyp含量可直接反映肝纤维化程度，综合上述实验结果，本发明中低分子量的低聚甘露糖醛酸盐的保肝抗炎、抗纤维化效果极为显著，宜于作为护肝抗炎、抗纤维化候选药物或保健品或复配制剂应用。
本发明低聚甘露糖醛酸盐用于制备预防、治疗和改善肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化的药物或保健品；或者，该低聚甘露糖醛酸盐用于饮食补充剂或与联苯双酯、多烯磷脂酰胆碱、甘草酸、甘草酸苷、甘草酸二铵、硫普罗宁、水飞蓟、还原型谷胱甘肽、腺苷蛋氨酸、熊去氧胆酸相关临床西药，或与枸杞、绞股蓝、茵陈、金银花相关保肝中药，和包含低聚甘露糖醛酸盐的褐藻胶及褐藻胶寡糖之一的复配制剂或低聚甘露糖醛酸为母核的硫酸化或磷酸化相关衍生应用制剂。另外，本发明降解法可采用化学降解法与物理降解法的组合，硫酸化或磷酸化相关衍生取代度为0.3-2.0。
实施例结果表明，本发明将褐藻胶经分级纯化的聚甘露糖醛酸经降解获得低分子量的低聚甘露糖醛酸，分别采用CCl4和ConA诱导肝损伤模型和D-氨基半乳糖和ConA诱导肝炎模型，评价低聚甘露糖醛酸对各种肝损伤和各种肝炎、肝纤维化小鼠的保护作用。研究证明，低聚甘露糖醛酸能够显著的抑制由化学性和免疫性肝损伤和各种肝炎、肝纤维化引起的肝体指数升高，有效抑制血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平的升高，并显著降低血中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)，明显改善肝组织病变。从而，实现对肝损伤和各种肝炎、肝纤维化的保护作用。本发明产品来源于海藻多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化和肝硬化方面具有广阔的开发应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，其特征在于，低聚甘露糖醛酸盐是以褐藻胶为原料，经化学降解法或物理降解法或化学降解法与物理降解法的组合得到不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经中和制备得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，其分子骨架为D-甘露糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接形成的线性寡糖化合物，重均分子量为0.3kDa～15kDa；其中，低聚甘露糖醛酸及其盐的分子结构通式如下：
式中，R＝H或Li，Na，K，Ca，Mg，n≤60；
低聚甘露糖醛酸盐采用下述制备工艺：将褐藻胶配成2～12wt％水溶液，采用0.5～2wt％稀盐酸加热到80～90℃后搅拌降解4～5小时，冷却后用5～20wt％的碳酸钠水溶液中和，再用3～6wt％稀盐酸调节pH到3～4，离心收集上清液，然后加入3倍体积95wt％医用乙醇，收集沉淀，无水乙醇脱水后干燥，得到聚甘露糖醛酸，Mw＝8～20kD；将聚甘露糖醛酸用纯水配置成不同浓度的水溶液，将其加入微波消解罐中进行微波降解5～60分钟，得不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁中和后，经过超滤分级得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁；该低聚甘露糖醛酸盐抑制由免疫性肝损伤引起的肝体指数升高，降低血清中AST、ALT、甘油三酯、胆固醇水平，抑制肝组织病理学改变，从而达到保护肝脏和防治肝炎、肝纤维化或肝硬化的作用。
2.一种低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化保健品的应用，其特征在于，低聚甘露糖醛酸盐是以褐藻胶为原料，经化学降解法或物理降解法或化学降解法与物理降解法的组合得到不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经中和制备得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，其分子骨架为D-甘露糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接形成的线性寡糖化合物，重均分子量为0.3kDa～15kDa；其中，低聚甘露糖醛酸及其盐的分子结构通式如下：
式中，R＝H或Li，Na，K，Ca，Mg，n≤60；
低聚甘露糖醛酸盐采用下述制备工艺：将褐藻胶配成2～12wt％水溶液，采用0.5～2wt％稀盐酸加热到80～90℃后搅拌降解4～5小时，冷却后用5～20wt％的碳酸钠水溶液中和，再用3～6wt％稀盐酸调节pH到3～4，离心收集上清液，然后加入3倍体积95wt％医用乙醇，收集沉淀，无水乙醇脱水后干燥，得到聚甘露糖醛酸，Mw＝8～20kD；将聚甘露糖醛酸用纯水配置成不同浓度的水溶液，将其加入微波消解罐中进行微波降解5～60分钟，得不同分子量低聚甘露糖醛酸；低聚甘露糖醛酸经氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化镁中和后，经过超滤分级得到不同分子量的低聚甘露糖醛酸的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁；该低聚甘露糖醛酸盐抑制由免疫性肝损伤引起的肝体指数升高，降低血清中AST、ALT、甘油三酯、胆固醇水平，抑制肝组织病理学改变，从而达到保护肝脏和防治肝炎、肝纤维化或肝硬化的作用；
该低聚甘露糖醛酸盐与联苯双酯、多烯磷脂酰胆碱、甘草酸、甘草酸苷、甘草酸二铵、硫普罗宁、水飞蓟、还原型谷胱甘肽、腺苷蛋氨酸、熊去氧胆酸、枸杞、绞股蓝、茵陈或金银花，和包含低聚甘露糖醛酸盐的褐藻胶或褐藻胶寡糖组成复配制剂。
3.按照权利要求1所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，其特征在于，褐藻胶为褐藻酸或褐藻酸钠。
4.按照权利要求1所述的低聚甘露糖醛酸盐在制备防治肝损伤和各种肝炎、肝纤维化或肝硬化药物的应用，其特征在于，化学降解法是酸降解法或Fenton降解法，物理降解法是微波或超声降解法。
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