CN110693893A

CN110693893A - 来自地黄的提取物作为多发性硬化症的治疗剂

Info

Publication number: CN110693893A
Application number: CN201910619330.1A
Authority: CN
Inventors: 沈剑刚; 李雯婷
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-07-10
Also published as: CN110693893B

Abstract

本申请涉及来自地黄的提取物作为多发性硬化症的治疗剂。本申请还涉及地黄提取物、毛蕊花糖苷或由梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D组成的组合在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途。本发明还涉及地黄提取物、毛蕊花糖苷或由梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D组成的组合在制备用于预防或治疗抑制有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。

Description

来自地黄的提取物作为多发性硬化症的治疗剂

技术领域

本发明公开了治疗多发性硬化症的组合物和方法。

背景技术

多发性硬化症(MS)是一种炎性自身免疫疾病，其特征在于中枢神经系统(CNS)中的局灶性脱髓鞘，轴突和神经元损伤。目前，免疫调节和免疫抑制是MS的主要治疗策略，但具有严重的副作用。由于全球250万MS患者的患病率和治疗效果不佳，大多数MS患者最终发展为残疾。寻求新的MS治疗策略具有适时的重要性。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种广泛采用的动物模型，其模仿MS的关键特征，包括CNS指导的白细胞浸润和炎性微环境诱导，这破坏CNS结构并导致进行性麻痹。

自噬/线粒体自噬密切参与MS发病机理。线粒体功能障碍是MS的标志(Campbell,G.等人，2018和Kazantseva,I.A.,等人,2018)。线粒体自噬，选择性自噬去除受损/功能障碍的线粒体，是EAE小鼠的CNS中的一种主要自噬类型。基础自噬/线粒体自噬维持细胞内稳态并促进神经元存活，而过度自噬/线粒体自噬在EAE病理学期间加重脱髓鞘和轴突破坏(Broadwater,L.,等人，2011、Campbell,G.R.,等人，2011、和Patergnani,S.,等人，2017)。在EAE小鼠和临床MS患者中已经发现广泛地活化的自噬/线粒体自噬。EAE中的大多数上运动神经元具有线粒体缺陷，诱导线粒体自噬活化，驱动轴突变性，凋亡和神经功能障碍(Campbell,G.R.等人，2014、Witte,M.E.,等人，2013、Mahad,D.等人，2008、和Kamat,P.K.,等人，2014)。临床研究还揭示MS患者的脑脊液(CSF)中ATG5和Parkin的水平升高(Patergnani,S.,等人，2017)。因此，介导过度自噬/线粒体自噬活化可能是EAE或MS的重要治疗策略。

发明内容

以下呈现了本发明的简要概述，以便提供对本发明的一些方面的基本理解。这个概述不是对本发明的广泛综述。它既不旨在鉴定本发明的关键或重要元素，也不旨在描绘本发明的范围。相反，这个概述的唯一目的是以简化的形式呈现本发明的一些构思，作为在下文中呈现的更详细描述的序言。

多发性硬化症是中枢神经系统中的神经炎症疾病，尚没有有效的治疗或药物。由于全球MS患者的患病率高且治疗效果差，寻求新的MS治疗策略具有适时的重要性。作为典型的中草药，地黄(Radix Rehmanniae,RR)在中医中用于神经炎症性疾病已有数百年。然而，RR用于MS的科学证据和基本机理尚不清楚。在本申请中，通过使用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型模拟MS病理学，测试了RR可以通过抑制巨噬细胞衍生的硝化损伤和炎症来减轻MS的进展和严重程度。结果显示RR治疗有效改善临床疾病严重程度，抑制脊髓中的炎症/脱髓鞘，并且减轻致脑炎T细胞和活化巨噬细胞的CNS浸润。同时，RR具有清除ONOO^-并降低EAE小鼠脊髓中iNOS和NADPH氧化酶表达的生物活性。此外，RR治疗抑制EAE小鼠脾细胞中的核因子-κB(NF-κB)信号转导通路。对巨噬细胞和神经元细胞的体外实验产生与体内动物实验一致的结果。总之，可以得出结论，地黄提取物具有改善EAE/MS病理过程和疾病严重程度的治疗价值，并且其基本机理与抗炎和抑制巨噬细胞衍生的硝化损伤有关。进一步的研究可以产生新的有希望的治疗多发性硬化症的药物。

此外，毛蕊花糖苷又称为麦角甾苷(β-(3,4-二羟基苯基)乙基-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→3)-β-D-(4-O-咖啡酰)-吡喃葡萄糖苷，Acteoside,AC)是一种咖啡酰苯乙醇苷糖苷，这是RR中的活性化合物之一。AC发挥各种生物活性，包括抗癌(Cheimonidi,C.,等人，2018和Hwang,T.W.,等人，2019)，抗病毒(Song,X.,等人，2016)等。在本申请中，测试了AC可以减弱EAE病理并通过在EAE病理学期间抑制ONOO-介导的过度线粒体自噬来改善神经缺陷评分的假设。

为了实现前述和相关目的，本发明包括在下文中充分描述并在权利要求中特别指出的特征。以下描述和附图详细阐述了本发明的某些说明性方面和实施方式。然而，这些仅仅是可以采用本发明原理的各种方式中的一些。当结合附图考虑时，本发明的其他目的，优点和新颖特征将从本发明的以下详细描述而变得显而易见。

附图说明

图1：在LCMS-IT-TOF上分析RR提取物的代表性色谱图。(A)210nm的UV色谱图；(B)总阴离子谱图；(C)总阳离子谱图。

图2：RR通过抑制炎症和脱髓鞘来改善活跃EAE。从EAE诱导日(A)或疾病发作(C)开始，每天通过口服(o.p.)向小鼠施用媒介物(n＝8)或RR(n＝8-10)。计算直至30dpi(dpi:dayspostimmunization,免疫后天数)的预防方案(B)或治疗方案(D)的累积临床评分。在30dpi(治疗方案)，获得来自正常小鼠或用媒介物或RR处理的EAE小鼠的脊髓，并用H&E(E)和LuxolFastBlue(LFB)(F)(比例尺100μm)染色。(G)炎症和脱髓鞘的病理学评分表示为平均值±SEM(n＝4)，*p<0.05,**p<0.01。

图3：RR在活跃EAE中降低CD3⁺和CD11b⁺细胞的群体。在30dpi(治疗方案)，从RR或媒介物处理的EAE小鼠的脑或脊髓中分离MNC。(A)通过流式细胞术，在淋巴细胞门控中分析细胞的CD3或CD4表达，以及在总MNC门控中分析细胞的CD11b表达。CD11b⁺CD45^高细胞定义为巨噬细胞，CD11b⁺CD45^中定义为活性小胶质细胞，且CD11b⁺CD45^低定义为常驻小胶质细胞。描述脑(B)或脊髓(C)中阳性细胞的百分比(n＝4)。(D)在30dpi，脊髓(左侧)和脑(侧脑室内侧脉络丛附近，右侧)中，CD3⁺(绿色)和CD11b⁺(红色)细胞与核(蓝色)的免疫荧光共染色(比例尺50μm)。

图4：RR减少活跃EAE脊髓中的ONOO^-产生。在18dpi(治疗方案)，获得正常小鼠和RR或媒介物处理的EAE小鼠(n＝3)的脊髓。使用HKYellow-AM探针检测ONOO^-水平。(A)在18dpi，脊髓中HKYellow-AM(红色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光图像(比例尺，10μm)。进行Western印迹，以分析3-NT(B)和iNOS,p67^phox,p47^phox(C)的表达。

图5：RR通过在体内和体外抑制NF-κB信号转导而抑制ONOO^-生成。(A)通过Western印迹试验，分析来自正常，RR或媒介物处理的EAE小鼠(n＝3)的脾细胞在18dpi(治疗方案)的p65表达和磷酸化的IKKα/β，IκBα和p65。将巨噬细胞系RAW264.7与RR(50ug/mL)预孵育或假处理1小时，然后LPS(1ug/mL)攻击30分钟(B-D)。进行Western印迹以分析iNOS,p67^phox,p47^phox(B)和NF-κB信号转导相关的蛋白质(C)的表达。通过免疫荧光染色(D)检查p65的核转位。比例尺代表5μm。

图6：RR在体外保护神经元免受硝化或炎性细胞毒作用。SH-SY5Y细胞用RR提取物(50ug/mL)预处理或假处理1小时，随后用500μMONOO^-供体SIN-1处理1小时。通过Western印迹分析(A)分析3-NT和Bax的表达。使用HKYellow-AM探针，通过免疫荧光试验检测SIN-1刺激的SH-SY5Y细胞中的ONOO^-水平(比例尺，20μm)(B)。(C)在模拟炎症环境的条件培养基(CM)的攻击下，SH-SY5Y细胞的流式图。使用MTT法，在CM或作为对照的正常培养基中测量不同浓度RR处理的SH-SY5Y细胞的存活力(D)。

图7：RR在EAE治疗中的基本机理的图。在多发性硬化症(MS)中，巨噬细胞被细菌或病毒或其他环境刺激物活化，导致通过活化NF-κB信号转导途径产生促炎细胞因子和自由基。产生的ROS/RNS直接破坏髓鞘和神经元的结构。一方面，在本申请中，RR可以直接清除代表性的RNS，即ONOO^-。另一方面，RR还通过抑制NF-κB信号转导通路，抑制ONOO^-的产生。

图8：AC经由抑制炎症和脱髓鞘来改善活性EAE。从EAE诱导日(A)或疾病发作日(C)开始，每天向小鼠经由p.o.施用媒介物(n＝8)或AC(对于预防方案，30mg/kg/天；对于治疗方案，5、10、30mg/kg，n＝8)。计算直至30dpi的预防方案(B)或治疗方案(D)的累积临床评分。在获得来自正常小鼠或18dpi用媒介物或AC(30mg/kg，治疗方案)处理的EAE小鼠的脊髓并通过H&E(E)、Luxol坚牢蓝(LFB)(F)(比例尺，100μm))和电子显微镜(EM)(比例尺，200nm)染色。(G)炎症和脱髓鞘的病理学评分表示为平均值±SEM(n＝4)，*p<0.05，**p<0.01。

图9：AC抑制具有减弱的炎性环境的活性EAE小鼠的外周脾中CD4⁺、Ly6G⁺和CD11b⁺细胞的早期活化。在dpi第11天(预防方案)在AC或媒介物处理的EAE小鼠中从脾分离MNC。(A)通过流式细胞术分析细胞的CD11b、B220或Ly6G的表达。CD11b⁺细胞被定义为巨噬细胞，B220⁺被定义为B细胞，且Ly6G⁺被定义为中性粒细胞。(B)在淋巴细胞门控中检测CD3⁺T细胞的亚群，在辅助T细胞门控中检测CD4⁺细胞的亚群，并且在细胞毒性T细胞门控中检测CD8⁺细胞的亚群。(C)代表脾脏中阳性细胞的百分比(n＝4)。(D)通过定量实时PCR检测促炎细胞因子和趋化因子(IL-1β、IFN-γ、IL-6、CCL-20、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-11、CXCL-12、iNOS和TLR4)的表达(n＝3)。

图10：AC减少具有减弱的炎性环境的活性EAE小鼠的CNS中浸润的CD4⁺、CD11b⁺和Ly6G⁺细胞的群体。在dpi第18天(治疗方案，30mg/kg/天)在AC或媒介物处理的EAE小鼠中从脑或脊髓分离MNC。(A)通过流式细胞术分析细胞的CD11b、B220或Ly6G的表达。(B)在淋巴细胞门控中检测CD3⁺T细胞的亚群，在辅助T细胞门控中检测CD4⁺细胞的亚群，并且在细胞毒性T细胞门控中检测CD8⁺细胞的亚群。(C)代表脑或脊髓中阳性细胞的百分比(n＝4)。(D)显示通过媒介物或AC处理的方案的脊髓中的基于膜的蛋白质组阵列测定的促炎细胞因子和趋化因子的表达谱的代表性图像。(E)D的统计分析

图11：AC经由介导活性EAE小鼠的脊髓中的线粒体途径缓解氧化/硝化应激。通过蛋白质组学测定分析在dpi第18天(治疗方案，30mg/kg/天)来自正常对照、媒介物或AC处理的EAE小鼠的分离的脊髓。(A)显示用功能研究的三组中的共同差异表达的蛋白(n＝3，一式两份)的热图。(B)显示氧化和线粒体相关标志物的变化(n＝3，一式两份)的热图。(C)在途径分析下通过AC处理介导的线粒体途径。

图12：AC减少活性EAE脊髓中的ONOO^-产生。在18dpi获得正常小鼠和媒介物或AC处理的EAE小鼠(30mg/kg/天，治疗方案)中的脊髓(n＝3)。使用HKYellow-AM探针检测ONOO^-水平。(A)脊髓中的HKYellow-AM(红色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光图像(比例尺，10μm)。进行Western印迹分析3-NT(B)和iNOS、p67^phox、p47^phox(C)的表达。

图13：AC经由抑制活性EAE小鼠的脊髓中过量的ONOO^-诱导的线粒体自噬减弱凋亡细胞死亡。在dpi第18天从对照、AC(30mg/kg，治疗方案)或媒介物处理的EAE小鼠分离脊髓。(A)免疫荧光图像显示凋亡细胞死亡的代表性TUNEL染色(绿色)(比例尺，100μm)。(B)通过TEM评估腰脊髓区域(L4-L6)的灰质中线粒体的超微结构(比例尺，200nm)。(C)用于线粒体自噬的共染色线粒体标志物ATPB(红色)、自噬体标志物LC3(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光图像(比例尺，50μm)。(D)通过Western印迹检测LC3II/I、Drp1和胞质Drp1的线粒体蛋白表达。

图14：AC在体外通过抑制过量ONOO^-诱导的线粒体自噬活化保护神经元免于硝化细胞毒性。(A)分别1mg/mlAC以及4mMONOO^-和1mg/mlAC的混合物的HPLC色谱图(λ＝210nm)。为了评估AC的ONOO^-清除能力，将SH-SY5Y细胞用AC(50μM)预处理1小时，且然后用ONOO^-(80mM)共处理30分钟，随后与10μMHKYellow-AM在黑暗中再孵育30分钟。PDC(50μM)用作阳性对照药物。(B)用CarlZeiss荧光显微镜捕获HKYellow-AM探针的荧光图像(红色)。为了检测AC对神经元细胞死亡和线粒体自噬的影响，将SH-SY5Y细胞用80μM ONOO^-和媒介物处理2小时。免疫荧光图像显示凋亡细胞死亡的代表性TUNEL染色(绿色)(C)，对于线粒体自噬共染色线粒体标志物ATPB(红色)与自噬体标志物LC3(绿色)(D)，ATPB(红色)与Drp1线粒体易位的Drp1(E)。

图15：AC降低活性EAE小鼠的腰脊髓中CD11b⁺巨噬细胞的浸润。在疾病峰值时间18dpi(30mg/kg，治疗方案)获得来自正常小鼠或用媒介物或AC处理的EAE小鼠的腰脊髓(L4-L6)，并通过免疫荧光分析中的具有细胞核(蓝色)的CD11b⁺(红色)细胞染色(比例尺，100μm)。

图16：组合A改善活性EAE症状，其表明与使用RR、单独的梓醇或组合B相比显著更好的治疗效果。从疾病发作开始直至30dpi，每天向小鼠经由p.o.施用媒介物(n＝10)，梓醇(n＝6，40mg/kg/天)，组合A(梓醇：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)和组合B(松果菊苷：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)。计算每日临床评分(A)和累积临床评分(B)，直至27dpi。从疾病发作开始直至30dpi，每天向小鼠经由p.o.施用媒介物(n＝8)，RR(n＝8，3.7g/kg/天)、组合A(梓醇：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)和组合B(松果菊苷：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)。计算每日临床评分(C)和累积临床评分(D)，直至27dpi。(数据表示为平均值±SEM(n＝4)，**p<0.01.)。

图17：组合A在体外改善炎性白介素IL-6释放至培养基中。在LPS刺激(1μg/ml)1小时之前，将BV2细胞用媒介物或组合A(分别为25μM，总共100μM)或梓醇(100μM)预处理24小时。通过由Abcam公司提供的ELISA试剂盒检测IL-6的释放量。

图18：组合A改善活性EAE症状，其表明与使用RR或单独的梓醇相比显著更好的治疗效果。从疾病发作开始直至30dpi，每天向小鼠经由p.o.施用媒介物(n＝10)，梓醇(n＝6，40mg/kg/天)，RR(n＝8，3.7g/kg/天)和组合A(梓醇：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)。计算每日临床评分(A)和累积临床评分(B)，直至26dpi。数据表示为平均值±SEM，**p<0.01。

图19：组合A抑制LPS刺激的BV2细胞中iNOS的蛋白表达。在LPS刺激(1μg/ml)1小时之前，将BV2细胞用益母草苷、地黄苷、毛蕊花糖苷、梓醇(浓度：100μM)或组合A(组合A：梓醇：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共100μM)预处理24小时。通过Western印迹用iNOS抗体(Abcamab3523)分析全细胞裂解物中iNOS的蛋白表达。

详述

自由基，包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，与MS发病机制密切相关。在MS患者和EAE动物模型中均发现了氧化应激介导的CNS损伤。少突胶质细胞和神经元都非常容易受到氧化/硝化损伤。源自巨噬细胞的过量ROS/RNS引发氧化损伤，加重脱髓鞘，轴突降解和神经细胞死亡。作为代表性的RNS，过氧亚硝基(ONOO^-)通过超氧化物(O₂ ^·-)和一氧化氮(NO)的反应快速产生。ONOO^-对CNS发挥强的膜透性和高细胞毒性。成人CNS衍生的少突胶质细胞和运动神经元都极易受到ONOO^-介导的损伤。在以少突胶质细胞死亡为特征的MS样品的少突胶质细胞中鉴定出ONOO^-的足迹标记物3-硝基酪氨酸(3-NT)的增加。通过5,10,15,20-四(4-磺酸基苯基)卟啉基(III)氯化物(FeTPPS；代表性的过氧亚硝酸盐分解催化剂(PDC))的治疗，改善了EAE的急性和慢性复发发病机理。此外，MS患者在血清和CSF中具有低水平的尿酸(ONOO^-清除剂)，其与疾病活动或治疗响应相关。因此，认为靶向ONOO^-是对EAE或MS的重要治疗策略。

中药(TCM)已被用于包括MS在内的神经退行性疾病。地黄(RR)是MS患者TCM配方中最常用的草药项目之一。RR发挥各种生物活性，例如抗骨质疏松，抗炎，免疫调节和神经保护作用。RR的神经保护作用可归因于抗氧化和抗炎的特性。RR减弱顺铂诱导的HEI-OC1听觉细胞损伤，并且基本机理可归因于其通过抑制脂质过氧化和清除自由基(包括超氧自由基，羟自由基和过氧化氢)的抗氧化特性。然而，文献/领域中缺乏RR对MS或EAE的神经保护作用的直接证据。在本申请中，测试了RR可以通过抑制致脑炎T细胞和活化巨噬细胞的浸润和防止ONOO^-介导的神经毒性，而减弱EAE中的神经炎症和脱髓鞘的提议。

本公开首次直接证明，在EAE小鼠模型的CNS中的ONOO^-产生。此外，还首次证实，RR有效地抑制EAE和其基本机理涉及经由减少ONOO^-诱导硝化应激的其抗炎和抗氧化特性。本文的发现揭示了MS的基本机理的新见解，并为MS治疗中的药物发现提供了线索。

氧化/硝化应激与MS发病机制中的炎症和免疫调节密切相关，导致脱髓鞘，轴突降解和神经细胞凋亡(Li等人，2011)。过氧亚硝基促成MS病理学中的氧化/硝化损伤(Smith等人，1999)。MS患者(Dujmovic等人，2009)以及EAE小鼠(Bolton等人，2008)的血清和CSF中发现3-NT增加。然而，由于具有高活性且寿命短，ONOO^-难以在生物系统中准确地检测。目前，关于ONOO^-在MS病理中的作用的知识主要是从间接证据获得。希望获得直接的证据，以检测MS/EAE发病机制中的ONOO^-产生。在本申请中，通过使用HKYellow-AM，发明人使EAE小鼠的脊髓中的ONOO^-产生直接可视化，支持了ONOO^-在MS/EAE发病机制中的作用。

为了探索RR对MS病理学的潜在影响，发明人采用限制性方案进行RR提取并进行质量控制研究。通过使用LCMS-IT-TOF或HPLC-DAD系统，发明人建立了用于RR质量控制的两种可靠的定性和定量方法。共鉴定了24种化合物。具体地，梓醇(Catalpol)显示改善EAE小鼠的病理过程(Yang等人，2017；Li等人，2018)。因此，发明人定量检测了梓醇含量作为质量控制的标记化合物。进一步鉴定RR提取物中涉及保护免于EAE发病机制的其他生物活性成分是有价值的。

在药理学研究中，RR提取物在预防和治疗策略中减轻了EAE小鼠的疾病严重性和进展，表明RR对于多发性硬化症治疗的价值。以往的研究显示，RR对系统性自身免疫性疾病具有抗炎和神经保护作用，并且其抗氧化特性可能有助于其药理作用(Li等人，2005；Tian等人，2006)。这里，发明人分别通过使用HKYellow-AM探针和3-NT检测，检测了RR提取物在EAE小鼠的脊髓中清除并且ONOO^-并且抑制酪氨酸硝化的作用。RR在18dpi(dpi:dayspostimmunization,免疫后天数)(EAE的峰值时间)显示其ONOO^-清除作用，并且抑制3-NT在EAE小鼠的脊髓中的表达。RR提取物还抑制NADPH氧化酶亚基p47^phox和p67^phox和iNOS在EAE小鼠脊髓中的表达。同时，RR减少SIN-1处理的SH-SY5Y细胞中的ONOO^-诱导的硝化损伤，SIN-1是通过产生NO和O₂ ^·-而生成ONOO^-的内源ONOO^-供体。此外，以避免来自其它自由基的人为结果，并直接观察RR提取物对ONOO^-诱导的硝化损伤的影响，发明人还进行了使用外源合成的ONOO^-和PDC作为阳性对照的实验。RR处理通过其ONOO^-清除特性，抑制了神经元的凋亡(参见图1)。这些结果表明，RR不仅具有直接的ONOO^-清除作用，而且还可以抑制EAE小鼠中的ONOO^-产生。此外，氧化/硝化应激导致线粒体功能障碍并放大氧化/硝化损伤(Facecchia等人，2011)。因此，发明人在体内和体外实验中观察了线粒体的形态(参见图2)。RR在EAE小鼠的CNS和ONOO^-攻击的培养的SH-SY5Y细胞中，保护防止线粒体断裂。因此，RR提取物可能经由清除ONOO^-并抑制ONOO^--介导的神经毒性，而具有针对EAE发病剂量的强神经保护作用。

巨噬细胞是ROS/RNS的主要生产者，促成MS/EAE中的氧化/硝化损伤(Nikic等人，2011)。至关重要地，CD4⁺辅助T细胞参与各种自身免疫疾病的进展，包括MS和EAE(Zhu等人，2010；Mills,2011)。为了研究RR的抗炎作用，发明人在30dpi，从EAE小鼠的脑和脊髓分离MNC，并且分析病变中T细胞和巨噬细胞/小胶质细胞的浸润。RR显著降低EAE小鼠脑实质和脊髓白质中CD3⁺T细胞和CD11b⁺CD45^高巨噬细胞的比率。同时，NF-κB在EAE/MS病理学中的炎症和氧化损伤中起重要作用(McGuire等人，2013)。活化的NF-κB途径刺激巨噬细胞分泌促炎因子并产生ROS和RNS(Glass等人，2010)，而NF-κB途径是由ROS/RNS调节的正反馈(Zhang等人，2016)。发明人的数据显示RR抑制从具有显著的巨噬细胞和淋巴细胞的EAE小鼠脾脏分离的脾细胞中磷酸化的IKKα/β，IκBα和p65的表达。这些结果表明，RR可以抑制EAE小鼠的免疫细胞中的NF-κB信号转导。进一步研究RR对EAE病理学的免疫抑制作用是有价值的。RR在免疫系统调节和释放促炎细胞因子的微环境中的潜在作用可以是进一步研究的潜在方向。

值得注意的是，RR提取物含有多种成分，本申请中鉴定了其中24种化合物。其中，梓醇是RR提取物中鉴定的主要成分。梓醇有效抑制NF-κB信号转导，减少NO和ROS产生，并且减轻LPS诱导的巨噬细胞活化和中脑神经元-神经胶质细胞培养物中的神经毒性(Tian等人，2006)。梓醇减轻认知障碍并保护免受源自氧化/硝化损伤的海马CA1区神经细胞死亡(Li等人，2004；Li等人，2005)。梓醇治疗改善EAE的发病机制(Li等人，2018；Yang等人，2017)。因此，发明人使用梓醇作为生物活性标记化合物用于RR提取物的质量控制。具有RR提取物中的24种已鉴定的化合物和其他潜在的未鉴定化合物，发明人应进一步探索有助于用于改善EAE的发病机制的抗氧化和抗炎活性的其他生物活性化合物及其相应的分子靶点。例如，毛蕊花糖苷(Acteoside)显示抑制NO产生并保护卡介苗(BacillusCalmette-Guerin)加LPS诱导的小鼠中的免疫性肝损伤(Zhao等人，2009)。毛蕊花糖苷对SHSY5Y细胞中β-淀粉样蛋白诱导的氧化损伤具有神经保护作用(Wang等人，2009)并抑制LPS处理的巨噬细胞中的iNOS表达(Lee等人，2005)。重要的是，鉴于MS的发病机制涉及多种因子或多种信号转导通路的复杂网络，RR提取物对MS/EAE发病机制的神经保护作用可以通过多种化合物对所涉及的多个分子靶标的网络调节的协同作用来实现。与基于MS治疗中的一种目标方法的单一化合物或药物开发的治疗策略相比，具有多种化合物的草药或TCM配方可能更有效地调节免疫系统。

总之，RR提取物通过其抗炎和抗氧化作用减弱了EAE的进展和严重程度，如图7中所示。基本机理可归因于经由抑制NF-κB信号转导和iNOS，NADPH氧化酶，在EAE小鼠的CNS中的ONOO^-清除活性和巨噬细胞衍生的硝化应激的抑制。因此，本申请为进一步探索RR的生物活性化合物及其用于MS治疗的分子靶点提供了线索。

从未报道单独的RR提取物对多发性硬化症的应用及其抑制硝化损伤的机制。RR组合物含有RR提取物的一种或多种组分，任选地含有载体或稀释剂。RR组合物在EAE期间的硝化损伤中的ONOO^-抑制机制是显著的。免疫调节和免疫抑制是目前MS的主要治疗策略，但具有严重的副作用。RR组合物的使用可用于免疫调节和/或免疫抑制，而对患者没有显著的副作用。因此，RR通过改善EAE/MS病理过程和疾病严重性，抑制巨噬细胞衍生的硝化损伤和抑制NF-κB信号转导介导的炎症，而显示出成为多发性硬化新候选药物的巨大潜力。

在一个方面，本申请涉及以下实施方案：

1.预防或治疗多发性硬化的方法，其包括：

向有此需要的患者施用有效量的地黄(RadixRehmanniae)组合物或者毛蕊花糖苷，以预防或减少ONOO^-衍生的硝化应激。

2.实施方案1或2的方法，其中所述地黄组合物或者毛蕊花糖苷通过对多种靶标的不同活性化合物的网络调节，减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化。

3.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含地黄提取物。

4.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少两种组分。

5.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少三种组分。

6.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含毛蕊花糖苷，或由其组成。

7.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含：梓醇(catalpol)，氯化梓醇(glutinoside)，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸(2-(dibenzo[ghi,mno]fluoranthen-1-ylcarbonyl)benzoicacid)，单密力特苷(danmelittoside)，地黄苷D(rehmanniosideD)，地黄皂苷A/地黄皂苷B(rehmaionosideA/rehmaionosideB)，美利妥双苷(melittoside)，地黄苦苷(rehmapicroside)，益母草苷(leonuride)或异构体，京尼平苷酸(geniposidicacid)，二咖啡酰-毛蕊花苷(decaffeoyl-verbascoside)，8-表番木鳖酸(8-epiloganicacid)，28-去氧代印苦楝内酯(28-deoxonimbolide)，洋地黄叶苷C/松果菊苷(purpureasideC/echinacoside)，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2(cistanosideA/JonosideA1/Jionoside A2)，毛蕊花糖苷(acteoside)，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2(jionoside B1/jionosideB2)，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A(isoacteoside/forsythosideA)，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷(jionosideD/leucosceptosideA/leucosceptoside)，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇(6-O-E-feruloylajugol)，角胡麻苷/角胡麻苷异构体(martynoside/martynosideisomer)，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷(strophanthidin arabinoside)，和十八烯酸(octadecenoicacid)。

8.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含以下中的至少三种：梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。

9.上述实施方案中任一项的方法，其中所述地黄组合物包含以下中的至少五种：梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。

10.预防或治疗多发性硬化的方法，其包括：

向有此需要的患者施用有效量的地黄组合物或者毛蕊花糖苷，以通过a)抑制致脑炎的T细胞和活化巨噬细胞或小胶质细胞的浸润，和2)预防ONOO^-介导的神经毒性中的至少一种，来减轻神经炎症和脱髓鞘。

11.实施方案10的方法，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少三种组分。

12.抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法，其包括：

向有此需要的患者施用有效量的地黄组合物或者毛蕊花糖苷。

13.实施方案12的方法，其中所述有效量的地黄组合物或者毛蕊花糖苷足以提供抗炎和抗氧化特性。

14.实施方案12或13的方法，其中所述有效量的地黄组合物或者毛蕊花糖苷足以减少ONOO^-衍生的硝化应激。

15.实施方案12-14中任一项的方法，其中所述有此需要的患者具有多发性硬化。

在一个方面，本申请涉及地黄组合物在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及地黄组合物在制备用于预防、治疗或抑制有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及地黄组合物在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中多发性硬化或实验性自身免疫性脑脊髓炎的具体症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途，所述具体症状、病症、或生物学状况或变化包括：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如神经损伤，例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；或促炎细胞因子和趋化因子的产生中的一种或多种。在另一方面，本申请涉及地黄组合物在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中神经系统的以下症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；或促炎细胞因子和趋化因子的产生中的一种或多种。

本文所述的地黄通常是指生地黄。

本申请所述的地黄组合物可以指来源于地黄的制品或物质，包括干燥的地黄材料、地黄材料的切块或粉末、地黄材料的提取物、地黄提取物的组分(通常是活性组分)、或者所述组分与药学上可接受的辅料或溶剂(例如水)的混合物等。在一个实例中，地黄组合物是地黄提取物，其通过用乙醇和水的混合物提取得到。在该实例中，在作为提取剂的乙醇和水混合物中，乙醇含量可以为1％至99％，例如30％至95％，例如50％至90％，例如70％至85％，例如75％至80％，例如80％。在该实例中，可以在超声下进行提取，并且任选通过蒸发来去除提取物中的溶剂，并任选将获得的水溶液冷冻和冷冻干燥。因此，所述地黄提取物可以是水溶液形式或冻干形式。在地黄提取物是冻干粉的实例中，每1g的干燥地黄材料获得的冻干粉量为0.2g至0.8g，例如0.3g至0.5g，例如0.35g至0.45g，例如约0.4g。

在一个方面，地黄组合物可以包含地黄提取物的组分中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种。在一个方面，地黄提取物的组分包括梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。在一个方面，本申请的表1列举了地黄提取物的组分。

在一个方面，地黄组合物可以包含毛蕊花糖苷或者由其组成。在该方面中，地黄组合物可以包含毛蕊花糖苷作为唯一的地黄提取物组分。

在另一个方面，地黄组合物可以包含梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D，或者由这些组分组成。在所述地黄组合物中，以地黄提取物的组分总重量计算，梓醇的量可为5％至85％，毛蕊花糖苷的量可为5％至85％，益母草苷的量可为5％至85％，并且地黄苷D的量可为5％至85％。在该方面中，以地黄提取物的组分总重量计算，梓醇的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以地黄提取物的组分总重量计算，毛蕊花糖苷的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以地黄提取物的组分总重量计算，益母草苷的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以地黄提取物的组分总重量计算，地黄苷D的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。本领域技术人员知晓，在由梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D组成的地黄组合物中，基于四种物质的总重量计算，它们的含量之和不超过100％。在一个方面，在所述地黄组合物中，梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D的重量比是1:1:1:1。

在一个方面，地黄组合物或地黄提取物按以下剂量给予患者例如人：0.01g/kg至10g/kg、0.05g/kg至5g/kg、0.1g/kg至1g/kg，例如0.2g/kg、0.3g/kg、0.4g/kg、0.5g/kg、0.6g/kg、0.7g/kg、0.8g/kg或0.9g/kg。本领域技术人员知晓，对于给药量而言，人的剂量(mg/kg)＝小鼠的剂量(mg/kg)×0.08。以上剂量可以是治疗患者中上述疾病的有效量。成人的平均体重例如是60kg。因此，本发明的药物可包含地黄组合物或地黄提取物的量为：0.6g至600g、3g至300g、6g至60g，例如12g、18g、24g、30g、36g、42g、48g或54g。

毛蕊花糖苷(AC)，一种来自RR的活性化合物，具有抗炎/神经保护作用，但其对MS病理学的影响不清楚。在本申请中，发明人使用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型来模拟MS病理学并且测试了AC可以通过抑制炎症和ONOO-介导的线粒体自噬活化来减轻EAE病理进展的假设。结果显示AC治疗在EAE小鼠中有效地改善神经缺陷评分并推迟疾病发作。AC治疗在EAE小鼠中抑制脊髓中的炎症/脱髓鞘，减轻致脑炎的CD4+T细胞和CD11b+活化的巨噬细胞的外周活化和CNS浸润。同时，AC保护神经元免于凋亡细胞死亡，氧化剂/硝化应激和线粒体损伤，同时减少EAE小鼠的脊髓中的ONOO-产生和iNOS和NADPH氧化酶的表达。此外，AC降低线粒体级分中LC3-II与LC3-I的比率，并抑制Drp1向线粒体的转运。体外研究证明，AC具有强烈的ONOO-清除能力，并经由抑制ONOO-介导的过度线粒体自噬来保护神经细胞免于硝化细胞毒性。总之，AC可通过其在EAE病理学中的抗炎和抗氧化特性来减轻疾病进展和神经缺陷严重程度。ONOO-诱导的过度线粒体自噬活化的抑制可以是促成抗炎和抗脱髓鞘特性的关键机制之一。

在一个方面，本申请涉及毛蕊花糖苷在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及毛蕊花糖苷在制备用于预防、治疗或抑制有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及毛蕊花糖苷在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中多发性硬化或实验性自身免疫性脑脊髓炎中的具体症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途，所述具体症状、病症、或生物学状况或变化包括：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如神经损伤，例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种。在另一方面，本申请涉及毛蕊花糖苷在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中神经系统的以下症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种。

在一个方面，毛蕊花糖苷按以下剂量给予患者例如人：0.01mg/kg至10mg/kg、0.05mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至2.5mg/kg、例如0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg或2.4mg/kg。本领域技术人员知晓，对于给药量而言，人的剂量(mg/kg)＝小鼠的剂量(mg/kg)×0.08。以上剂量可以是治疗患者中上述疾病的有效量。成人的平均体重例如是60kg。因此，本发明的药物可包含毛蕊花糖苷的量为：0.6mg至600mg、0.3mg至300mg、6mg至150mg，例如12mg、24mg、36mg、48mg、60mg、90mg、120mg或144mg。

本申请的目的还在于选择与分离自RR的活性化合物的最佳组合配方，并验证组合配方对MS治疗的神经保护作用。发明人挑选了两种组合配方来阐明从RR鉴定和分离的活性化合物的协同作用，其中使用梓醇和RR的标准化提取物作为对照组用于比较。组合A(Comb.A)含有梓醇(Catalpol)、毛蕊花糖苷(Acteoside)、益母草苷(Leonuride)和地黄苷D(RehmanniosideD)(比率为1:1:1:1，各自为10mg/kg/天)，并且组合B(Comb.B)用梓醇、松果菊苷(Echinacoside)、益母草苷和地黄苷D构成，比率为1:1:1:1。在实验中，发明人根据实验设计在不同组中用组合A(40mg/kg/天)、组合B(40mg/kg/天)、梓醇(40mg/kg/天)和RR提取物(3.7g/kg/天)处理EAE小鼠。根据治疗方案，从疾病发作开始直至30dpi(dayspostimmunization,免疫后天数)，每天将所有药物口服施用于动物。用等体积的盐水作为对照处理媒介物和正常对照组。在设计的时间点，在麻醉下处死动物。将CNS组织切成切片用于病理学研究。CNS切片用标准方案用LFB和H&E染色以评价脱髓鞘和炎性病变。轴突变性将通过APP(轴突损伤标志物)检测。通过TUNEL试剂盒、Bcl-2/Bax和裂解的胱天蛋白酶-3检测凋亡。浸润入EAE小鼠的CNS的脑炎单核细胞(MNC)将通过针对CD4、CD8和CD11b的表面表达的IHC染色来分析，以区分T-细胞和巨噬细胞/小胶质细胞浸润。

在一个方面，本申请涉及地黄提取物组分的组合在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及地黄提取物组分的组合在制备用于预防、治疗或抑制有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。在另一方面，本申请涉及地黄提取物组分的组合在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中多发性硬化或实验性自身免疫性脑脊髓炎中的具体症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途，所述具体症状、病症、或生物学状况或变化包括：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如神经损伤，例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种。在另一方面，本申请涉及地黄提取物组分的组合在制备用于抑制、缓解、治疗或清除有需要患者中神经系统的以下症状、病症、或生物学状况或变化的药物中的用途：炎症；脱髓鞘；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)引发的氧化或硝化损伤(例如中枢神经系统损伤、神经元损伤或轴突损伤)；自由基(例如活性氧或活性氮，例如ONOO^-)介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞(例如致脑炎T细胞、活化巨噬细胞或小胶质细胞)对神经系统的浸润(例如CNS浸润)或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种。在该方面中，所述地黄提取物组分的组合是梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D。在该组合中，以全部地黄提取物组分的总重量计算，梓醇的量可为5％至85％，毛蕊花糖苷的量可为5％至85％，益母草苷的量可为5％至85％，并且地黄苷D的量可为5％至85％。在该方面中，以全部地黄提取物组分的总重量计算，梓醇的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以全部地黄提取物组分的总重量计算，毛蕊花糖苷的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以全部地黄提取物组分的总重量计算，益母草苷的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。在该方面中，以全部地黄提取物组分的总重量计算，地黄苷D的量可为10％至70％、15％至55％、20％至40％、25％至35％、例如25％或30％。本领域技术人员知晓，在梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D的组合中，基于四种物质的总重量计算，它们的含量之和不超过100％。在一个方面，在所述组合中，梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D的重量比是1:1:1:1。

在一个方面，地黄提取物组分的组合按以下剂量给予患者例如人：0.01mg/kg至10mg/kg、0.05mg/kg至5mg/kg、0.1mg/kg至4mg/kg、例如0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.4mg/kg或3.2mg/kg。本领域技术人员知晓，对于给药量而言，人的剂量(mg/kg)＝小鼠的剂量(mg/kg)×0.08。以上剂量可以是治疗患者中上述疾病的有效量。成人的平均体重例如是60kg。因此，本发明的药物可包含毛蕊花糖苷的量为：0.6mg至600mg、0.3mg至300mg、6mg至240mg，例如12mg、24mg、36mg、48mg、60mg、90mg、144mg或192mg。

在一个方面，本发明的地黄组合物、地黄提取物、毛蕊花糖苷、地黄提取物组分的组合、或者药物按一下方式给予患者：每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次，每三天一次，每四天一次、每五天一次，每六天一次，每周一次、每两周一次，或者每月一次。

本文所述的神经系统可以包括中枢神经系统和周围神经系统，其中中枢神经系统可以包括脑和脊髓，其中脑通常包括大脑、小脑、脑干和间脑。

本文所述的免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，通常是指白细胞，包括淋巴细胞(例如T淋巴细胞包括细胞毒T细胞或辅助性T细胞等，或B淋巴细胞)、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞(例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细)、肥大细胞、小胶质细胞等。

本文所述的患者或接受治疗者通常指人。

本本文所述的地黄组合物、地黄提取物、地黄提取物组分、地黄提取物组分的组合、毛蕊花糖苷或者药物可以制备成本领域熟知的常规制剂，例如口服制剂(例如片剂、口服液、胶囊剂等)或注射剂(例如皮下注射、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、鞘内注射等)。用于制备所需药物组合物或制剂的药学上可接受的辅料或溶剂是本领域技术人员熟知的。

以下实施例说明了本发明。除非另有说明，在以下实施例和说明书和权利要求中的其他地方，所有份数和百分比均以重量计，所有温度均为摄氏度，且压力为大气压或接近大气压。

实施例

实施例1

试剂

地黄购自KANG MEI Pharmaceutical Co.,Ltd(中国广东)。纯度超过96％(wt/wt)的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(35-55)肽(MOG_35-55,MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购自Chinese Peptide Company(中国浙江)，弗氏不完全佐剂来自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，结核分枝杆菌H37RA来自BD Biosciences(Difco,BD)，且百日咳毒素来自ListBiological Laboratories(CA,USA)。Percoll梯度购自GE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh,PA,USA)。细胞表面染色抗体得自于eBioscience(San Diego,CA,USA)，包括CD45-PE(30-F11)、CD3e-FITC(145-2C11)、CD4-Pacific Blue(RM4-5)，和CD11b-APC(M1/70)。3-NT和iNOS的一抗得自于Abcam(Cambridge,UK)；Bax,p-p65^Ser536,p65,p-IKKα/β^Ser176/180,IKKβ,p-IκBα^Ser32,IκBα和GAPDH来自Cell signaling Technology(Beverly,USA)；p47^phox和p67^phox来自Santa Cruz(Dallas,TX,USA)。对于HPLC分析，所用的所有溶剂均为HPLC级。所有化学标准品(梓醇、地黄苷D、地黄苷A、地黄苦苷、洋地黄叶苷C、刺五加叶苷A1、毛蕊花糖苷、刺五加叶苷B1和角胡麻苷)纯度超过98％，购自Shanghai TautoBiotech.Co.,Ltd(中国上海)。ONOO^-供体3-吗啉代斯德酮亚胺(SIN-1)自Cayman Chemical(Ann Arbor,MI,USA)，来自大肠杆菌O111:B4的脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich。ONOO^-选择性探针HKYellow-AM得自于YangDan教授的实验室(Chemical Biology,HKU,HK)。

RR提取物的制备

将干燥的RR材料切成小块(约0.2×0.2×0.2cm)。将切块样品(400.0g)浸渍过夜，并用80％乙醇/水(3×4L)反复超声提取，每次40分钟。然后，在真空(30℃)下蒸发提取的溶液以除去乙醇，将剩余的水溶液冷冻并冷冻干燥，以得到RR提取物粉末(162.8g)。出于质量一致性，RR提取的过程被限制性地标准化。

定性分析

为了表征RR的化学特征，采用LCMS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)。该系统配备SIL-20AC自动注射器，两个LC-20AD泵，CTO-20A柱温箱，SPD-M20A DAD和电喷雾电离(ESI)接口。使用与TOF质谱仪耦合的QIT进行质谱分析。

在AQ-C18柱(5mm,4.6mm×250mm,ACE,Scotland)上实现色谱分离。色谱条件如下：流速0.8mL/min，样品注射体积10mL，柱温25℃，和流动相A(0.1％甲酸-水)和流动相B(乙腈)。梯度谱优化如下：0-10分钟，1％B；10-20分钟，1-2％B；20-25分钟，2-5％B；25-55分钟，5-15％B；55-65分钟，15-25％B；65-80分钟，25-45％B；80-85分钟，45-70％B；85-90分钟，70-90％B。

MS的电喷雾源以正/负离子模式操作，且操作参数为：雾化气体流速，1.5L/min；加热毛细管温度，200℃；CDL温度，200℃；毛细管电压，4000V；探测器TOF电压，1600V。获得m/z100到m/z1000Da的全扫描质谱，和所有质量峰的精确质量测量。通过LCMSsolution软件3.0版(Shimadzu,Kyoto,Japan)处理和分析数据。

定量分析

据报道，梓醇可改善EAE小鼠的病理过程(Yang等人，2017；Li等人，2018)。因此，发明人选择梓醇作为RR定量质量控制的标记化合物。使用UHPLCUltiMate3000(ThermoFisherScientific,USA)，在210nm波长下测定梓醇。色谱条件与前面描述的定性实验相同。精确称量RR提取物粉末，通过超声处理溶解在70％MeOH中，并通过0.45mm过滤器过滤用于定量分析。

为了验证定量方法，如此前所述检测线性，灵敏度，精密度，准确度和稳定性(Liu等人，2013)。简而言之，在50％MeOH中制备梓醇的储备溶液(1mg/mL)。在HPLC中一式三份地分析六种浓度的梓醇标准品以制备校准曲线。通过测量日内和日间变化和标准化合物的回收率来评估准确度和精密度。通过在2小时，4小时，6小时，8小时，12小时和24小时的时间段内分析RR提取物来进行稳定性测定。在当前条件下的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别在约3和10的S/N(信号/噪声)下测定。通过Chromeleon Version7.2(Thermo,USA))监测，记录和分析数据。

动物

雌性C57BL/6N小鼠(8-10周龄)获自香港大学实验动物中心。所有动物护理和实验程序均得到University Committee on the Use of Live Animals in Teaching andResearch(CULATR)批准。将小鼠圈养具有12小时黑暗/光照循环的无病原体环境中。

EAE诱导和治疗

如此前所述，对雌性C57BL/6N小鼠进行免疫以主动诱导EAE(Wu等人，2016)。简言之，给小鼠皮下注射含有5mg/ml热灭活的结核分枝杆菌H37RA的完全弗氏佐剂中的200μgMOG35–55。在免疫后0天和2天(dpi)，两次静脉内注射百日咳毒素(200ng)。每天测量体重和临床评分。为评估临床严重性，对EAE症状评分如下：0，无临床症状；0.5，部分跛尾；1，尾部瘫痪；1.5，后肢麻痹或协调运动丧失；2，协调运动丧失和后肢麻痹；2.5，一后肢瘫痪；3，两后肢都瘫痪；4，后肢瘫痪，前肢无力；5，前肢瘫痪。

对于药物施用，RR的剂量根据小鼠对人受试者的等效剂量(60g生药/60kg)确定。将RR提取物粉末溶于0.3％(wt/vol)的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的盐水溶液中。从2dpi(用于预防方案)或11dpi(用于治疗方案)开始，将RR提取物(3.7g/kg/天)每天口服施用于EAE小鼠。用等体积的0.3％CMC-Na盐水作为对照，处理媒介物和正常组。

细胞系

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞购自American TypeCulture Collection(ATCC,Manassas,VA)。将细胞在高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，所述培养基含有10％热灭活的胎牛血清(FBS,Gibco)，1％青霉素/链霉素(PS,Gibco)和1％2mM L-谷氨酰胺(Gibco)。对于传代培养，通过胰蛋白酶消化收集SH-SY5Y细胞，并使用无菌细胞刮刀(Corning,USA)收集RAW264.7细胞，并以1:10的分流比传代。

细胞实验

SH-SY5Y细胞用于测试RR的ONOO^-清除能力，并且将细胞暴露于ONOO^-供体SIN-1。简而言之，将SH-SY5Y细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板上，并与500m M SIN-1一起温育1小时。在RR组中，在SIN-1攻击之前，用50mg/mL RR提取物处理细胞1小时，或用PBS处理作为对照组。

为了评估RR的抗炎作用，用脂多糖(LPS)活化RAW264.7巨噬细胞。将细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板上，并用LPS(1mg/mL)攻击30分钟。在RR组中，在LPS暴露之前，将细胞与50ug/mlRR提取物预孵育1小时。收集培养基作为条件培养基(CM)用于以下实验。

MTT测定

根据制造商的说明，用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定法检测细胞存活力。SH-SY5Y细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度在37℃，5％CO₂气氛中培养24小时，并且然后在37℃与MTT(0.5mg/mL)温育4小时。除去培养基，并向每个孔中添加150ml DMSO。通过Multi-plate Reader(Model 680，Bio-Rad)测量490nm处的吸光度。通过吸光度值计算细胞存活力并归一化至对照。

ONOO^-评估

HKYellow-AM是发明人新开发的具有高灵敏度和选择性的ONOO^-荧光探针(Peng等人，2016；Gong等人，2015)。发明人检测了体内和体外实验中的ONOO^-产生。对于体内研究，在处死前15分钟，向18dpi的小鼠静脉内注射HKYellow-AM(10mM,1mL/kg)。用PBS灌注后，立即将新鲜的L4-L6脊髓切片，包埋到O.T.C.中，切成30mm切片，用DAPI对细胞核进行复染，并用共聚焦激光扫描显微镜LSM780，在543nm的激发波长和567nm的发射波长的条件下成像。对于体外研究，将细胞用10mM HKYellow-AM染色30分钟并用PBS洗涤。荧光图像由配备AxioVision数字成像系统的Carl Zeiss荧光显微镜捕获。

Western印迹分析

通过使用含有1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液，提取组织或细胞的蛋白质。通过11％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白质裂解物，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并单独地使用一抗：包括3-NT(1:1000)，iNOS(1:1000)，p47^phox(1:1000)，p67^phox(1:1000)，p-p65^Ser536(1:1000)，p65(1:1000)，p-IKKα/β^Ser176/180(1:1000)，IKKβ(1:1000)，p-IκBα^Ser32(1:1000)，IκBα(1:1000)和GAPDH(1:2000)，随后使用HRP-缀合的二抗(1:2000)，进行免疫印迹。通过化学发光ECL Select Kit(GE Healthcare,IL,USA)检测信号，由Gel-Doc系统(Bio-Rad,CA,USA)捕获并通过Image Lab软件(Bio-Rad，CA，USA)分析。

组织病理学

用PBS灌注小鼠，且然后用4％多聚甲醛(PFA)固定。将分离的L4-L6脊髓在4％PFA中在4℃下固定过夜，在梯度乙醇中脱水，用二甲苯透化，包埋在石蜡中并切成5μm切片。将载玻片用H&E或Luxol fast blue(LFB)染色以分别评估炎症和脱髓鞘。如此前所述，对炎症和脱髓鞘进行评分(Li等人，2010a)。简言之，炎症评分如下：0，无；1，少数炎症细胞；2，血管周围浸润的组织；和3，血管套严重性增加，并延伸到邻近组织中；脱髓鞘得分如下：0，无；1，稀有病灶；2，少数几个脱髓鞘区域；3，大的(汇合的)脱髓鞘区域。

免疫荧光

对于体内免疫荧光，将固定后的脑和脊髓浸入4℃的30％蔗糖溶液中以完全脱水，包埋在O.C.T中并切成30mm切片。将切片与一抗CD3(1:400)和CD11b(1:400)共染色。对于体外免疫荧光，将细胞接种到12mm玻璃盖片上。在不同的实验后，将细胞在4％PFA中固定20分钟并用一抗p65(1:400)染色。用PBS洗涤后，用荧光染料缀合的二抗染色切片或细胞，用DAPI对细胞核进行复染，并用抗变色介质封装。通过共焦激光扫描显微镜LSM800(CarlZeiss)捕获免疫荧光图像。

流式细胞术

在30dpi处死小鼠。解剖出脾脏，脑和脊髓组织，匀浆并悬浮至单细胞。使用基于密度的Percoll梯度离心收获单核细胞(MNC)。用表面标志物CD45-PE、CD3e-FITC、CD4-Pacific Blue，和CD11b-Alexa700染色分离的MNC。在FACS LSR II(BD Biosciences,CA,USA)上进行流式细胞术分析，并用FlowJo软件(Treestar,Ashland,OR)分析数据。

统计分析

数据表示为平均值±SEM。对于两组设计比较使用非配对Student氏t检验，或者对于多组比较使用单向ANOVA，然后进行Dunnett多重比较检验进行统计分析的评估。使用GraphPad Prism6.0版软件(GraphPad Software Inc.,CA,USA)进行所有分析。p<0.05被认为是统计学显著性。

结果

RR的定性和定量分析

对于质量控制研究，发明人通过LCMS-IT-TOF鉴定了RR提取物的化学成分。优化色谱条件并获得良好分离的指纹图谱(图1A)。在正离子和负离子模型中，通过将它们的紫外光谱，匹配诊断离子和片段化途径与参考化合物比较，共鉴定出24种化合物(Xu等人，2013；Li等人，2010b)(图1B,C)。如表1所示，总结了所鉴定化合物的结构和片段离子。RR提取物中鉴定的化合物为环烯醚萜糖苷和苯乙醇糖苷，其中12种为环烯醚萜糖苷(1,2,4-10,12,15和21)，8种为苯乙醇糖苷(11,14,16-20和22)。其他是三萜类化合物或酚酸

表1：在RR提取物中鉴定的化合物

发明人进一步定量分析了作为RR中生物活性化合物的梓醇。HPLC用于验证以下项目：线性，LOD，LOQ，精密度，准确度和稳定性。标准曲线的线性为y＝0.0337x+6.7212，其中相关系数(r)为0.9999。所有分析物的LOD和LOQ分别为0.1025mg/mL和0.3413mg/mL。通过一式三份的三种浓度的分析物的日内和日间变化(RSD)测定精密度，其分别为1.02％和2.31％。分析方法具有准确度，且总回收率为97.8-101.4％。对于稳定性测定，梓醇在24小时内的峰面积的RSD为0.32％。这些结果表明HPLC-DAD方法具有良好的灵敏度，准确度和稳定性。随后，应用经验证的HPLC-DAD方法测量梓醇的含量，且RR样品中的浓度为4.32mg/g。

RR缓解EAE进展

然后，发明人研究了RR对EAE模型的抗炎作用。以3.7g/kg/天的剂量向小鼠口服施用RR提取物。对于预防方案，从2dpi开始RR处理。与媒介物组相比，RR处理显著降低EAE小鼠的每日和累积临床评分(P<0.01，图2A，B)。同时，RR有效减轻EAE进展，降低EAE症状严重性(P<0.01)和延迟疾病发作(P<0.05)(表2)。对于治疗方案，在疾病发作时(11dpi)开始RR处理。类似地，RR处理组显示比媒介物对照组更低的每日临床评分，尤其是在慢性期(25-30dpi)(图2C)。此外，从11dpi开始的RR处理也显示减轻疾病严重性，如通过平均最大和累积临床评分证实的(P<0.05，图2D，表2)。因此，结果表明RR可以作为预防剂或治疗策略，减轻EAE的疾病严重性和进展。为了模拟临床治疗情况，在以下EAE实验中使用治疗方案进行了进一步的研究。

表2：EAE在施用媒介物或RR的小鼠中的临床特征

平均值±SEM*P＜0.5，**P＜0.01

RR减少EAE小鼠脊髓中的炎症和脱髓鞘

然后，发明人研究了RR对EAE诱导的CNS病理学的神经保护作用。按治疗方案接受RR的EAE小鼠在30dpi后，通过H&E和LFB染色检测腰椎脊髓切片。如图2E,F所示，与媒介物处理的EAE小鼠相比，RR处理的EAE小鼠具有显著较低的炎性浸润评分和较小的脱髓鞘区域(P<0.05，图2G)。结果表明RR可以减弱EAE小鼠中的CNS脱髓鞘和炎症。

RR减少EAE小鼠脊髓和脑中CD3⁺和CD11b⁺细胞的群体

随后，发明人研究了媒介物和RR处理的EAE小鼠之间的不同炎症细胞群体。在30dpi(治疗方案)，从EAE小鼠的脑和脊髓分离单核细胞(MNC)，并使用流式细胞术分析。研究CD3，CD4和CD11b的表面表达以鉴定病变中的T细胞和巨噬细胞/小胶质细胞浸润。与媒介物EAE小鼠相比，RR处理小鼠在脊髓和脑组织中具有显著降低的CD3⁺T细胞和CD11b⁺CD45^高巨噬细胞的比率(P<0.01，图3A，B，C)。此外，免疫荧光结果进一步揭示RR处理的小鼠在脑实质和脊髓白质中具有较少数量的浸润的CD3⁺T细胞和CD11b⁺巨噬细胞(图3D)。

RR降低EAE小鼠脊髓中的ONOO-水平

然后，发明人分别通过使用HKYellow-AM探针和测量3-NT表达，检测RR提取物清除ONOO-和抑制EAE小鼠的脊髓中酪氨酸硝化的作用。HKYellow-AM是高选择性的ONOO-探针，并且用于在不同的实验系统检测ONOO-(Peng等人，2016；Gong等人，2015)。对于治疗方案，EAE小鼠在11dpi开始接受RR处理，并在18dpi收集脊髓。荧光成像研究显示，媒介物EAE小鼠具有显著增加HKYellow-AM-阳性染色荧光，表明脊髓切片中ONOO-产生增加。与媒介物EAE小鼠相比，RR处理的小鼠在脊髓中显示少得多ONOO-阳性荧光染色的细胞(图4A)。还使用Western印迹分析检测3-NT的表达。一致地，在18dpi，EAE媒介物小鼠在脊髓中具有比正常对照组显著更高的3-NT表达。RR处理EAE小鼠在脊髓中具有比媒介物处理的EAE小鼠显著降低的3-NT表达(图4B)。此外，通过使用Western印迹分析，检测iNOS和NADPH氧化酶亚基p47^phox和p67^phox的表达。媒介物处理的EAE小鼠在脊髓中具有比正常对照小鼠更高的iNOS，p47^phox和p67^phox表达水平，其在RR处理的EAE小鼠中被逆转(图4C)。这些结果表明，RR不仅具有ONOO^-清除作用，而且还抑制iNOS和NADPH氧化酶的表达，随后降低了EAE病理中ONOO^-的产生。

RR抑制EAE小鼠脾细胞中的NF-κB信号转导

转录因子NF-κB是调节参与EAE炎症过程的ROS/RNS产生的关键信号转导(McGuire等人，2013)。在MS/EAE中，通过活化NF-κB途径，活化的巨噬细胞诱导促炎细胞因子的产生，包括ROS和NO(Glass等人，2010)。在环式正反馈炎症过程中，ROS/RNS反向活化NF-κB途径(Zhang等人，2016)。因此，发明人检测了RR调节NF-κB信号转导，对于抑制巨噬细胞衍生的ROS/RNS产生的影响。按照治疗方案，在以18dpi，从正常，媒介物-或RR-处理的EAE小鼠的脾中分离脾细胞，主要为巨噬细胞和淋巴细胞。通过Western印迹分析，检测磷酸化的IKKα/β，IκBα和p65的表达。媒介物处理的EAE小鼠显示与正常对照小鼠相比增加的磷酸化IKKα/β，IκBα和p65的表达，其在RR处理的EAE小鼠中显著降低(图5A)。这些结果表明RR可以抑制EAE小鼠中的NF-κB信号转导。

RR抑制LPS活化的RAW264.7巨噬细胞中iNOS，NADPH氧化酶的表达和NF-κB信号转导

然后，发明人测试了RR对LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬细胞中iNOS，NAPDH氧化酶的表达和NF-κB信号转导的影响。LPS活化NF-κB信号转导并诱导iNOS和NADPH氧化酶的表达产生ROS/RNS，随后介导硝化应激(Xie等人，1994)。如图5B所示，LPS刺激显著上调巨噬细胞中iNOS，p47^phox和p67^phox的表达，其通过RR处理逆转。此外，在巨噬细胞中，LPS刺激诱导IKK/IκBα/p65的磷酸化，但抑制IκBα的表达。RR处理降低LPS诱导的IKK/IκBα/p65的磷酸化并抑制IκBα降解(图5C)。免疫荧光成像研究还显示RR处理改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中p65至细胞核中的易位(图5D)。这些结果共同表明，RR可以抑制LPS活化的巨噬细胞中NF-κB信号转导的活化和iNOS和NADPH氧化酶的表达。

RR具有对ONOO^-攻击的SH-SY5Y细胞的神经保护作用

发明人终于解决了RR是否可以在ONOO^-处理的SH-SY5Y细胞中具有神经保护作用。采用ONOO^-供体SIN-1以诱导对细胞硝化损伤。免疫印迹分析显示SIN-1处理上调细胞中3-NT和Bax的表达，而RR处理抑制3-NT和Bax的增加(图6A)。免疫荧光研究显示RR处理减少经SIN-1处理的培养的SHSY5Y细胞中的HKYellow-AM阳性染色细胞(图6B)。然后，发明人研究了RR对巨噬细胞衍生的炎症攻击的影响。为了模拟炎症环境，从LPS刺激的巨噬细胞中收集条件培养基(CM)30分钟，其含有炎性细胞因子或自由基(Vijayan等人，2017)。然后，进行MTT测定，以测试用RR或媒介物处理的SH-SY5Y细胞在与条件培养基或正常培养基温育下的细胞存活力。所述方案描述在图6C中。如图6D所示，RR处理剂量依赖性地增加SH-SY5Y细胞中的细胞存活力。这些结果表明，RR具有针对ONOO^-诱导的神经元细胞死亡的神经保护作用。

实施例2

方法

动物

雌性C57BL/6N小鼠(10-14周龄)获自香港大学实验动物单位。所有动物护理和实验程序均由大学教学和研究中使用活体动物委员会(CULATR)批准。将动物圈养在具有12小时黑暗/光照循环的无病原体的环境中。

活性EAE诱导和药物治疗

如发明人先前所述，对雌性C57BL/6N小鼠进行免疫以主动诱导EAE(Li,W.,等人,2018)。简而言之，用完全弗氏佐剂(5mg/ml，Sigma-Aldrich)中的200μg MOG_35-55皮下注射小鼠。在免疫后0天和2天(dpi.)静脉内注射百日咳毒素(200ng，List BiologicalLaboratories)。用体重测量和临床评分评估每天监测免疫的小鼠。为了评估临床严重程度，EAE症状如下评分：0，无临床体征；0.5，部分软尾；1，麻痹的尾巴；1.5，后肢麻痹或协调运动丧失；2，协调运动丧失和后肢麻痹；2.5，一个后肢麻痹；3，两个后肢都麻痹；4，后肢麻痹，前肢无力；5，前肢麻痹。

对于药物施用，AC的剂量参考先前的研究。在预防方案中，从dpi第2天直至第30天，将AC(30mg/kg/天)每天口服施用于免疫的EAE小鼠。在治疗方案中，从疾病发作(11dpi)直至第30天，采用不同剂量的AC(5、10和30mg/kg/天)。用等体积的生理盐水作为对照处理媒介物。

细胞培养

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系购自美国典型培养物保藏中心(目录号CRL-2266^TM)。SH-SY5Y细胞在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS,Gibco)、2mM 1％L-谷氨酰胺(L-g,Gibco)加1％青霉素/链霉素(PS,Gibco)的高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中培养。

细胞处理

为了检测AC的ONOO^-清除能力并探索其对ONOO^-诱导的线粒体自噬的影响，在体外，将SH-SY5Y细胞暴露于合成的过氧亚硝酸钠(81565；Cayman)以诱导硝化应激并活化线粒体自噬。简而言之，将SH-SY5Y细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种至6孔板上，并与80μM过氧亚硝酸盐孵育1小时。在AC处理组中，所述细胞在ONOO^-攻击前用50μMAC处理1小时或用PBS处理作为对照组。采用过氧亚硝酸盐分解催化剂(PDC，50μM)作为阳性对照。

组织病理学

对于H&E或Luxol坚牢蓝(LFB)染色，将小鼠(18dpi)用PBS灌注，且然后用4％多聚甲醛(PFA)固定。将分离的L4-L6脊髓在4％PFA中在4℃下固定过夜，在梯度乙醇中脱水，用二甲苯透化，包埋至石蜡中并切成5μm切片。将载片用H&E或LFB染色以分别评价炎症和脱髓鞘。如先前所述对炎症和脱髓鞘进行评分(Li,H.,等人,2010)。简而言之，炎症如下评分：0，无；1，炎性细胞较少；2，血管周围浸润的组织；3，血管周围套囊的严重程度增加，并延伸至邻近组织；脱髓鞘如下评分：0，无；1，病灶稀有；2，脱髓鞘的几个区域；和3，大的(汇合的)脱髓鞘的区域。

对于透射电子显微镜(TEM)处理，将18dpi的L4-L6脊髓切成1.0mm厚的矢状块，并在4℃下在EM固定剂(0.01MPB溶液中的2％PFA和2.5％戊二醛)固定72-96小时，随后在4℃下在1％锇酸中后固定过夜。然后，将该块在梯度乙醇中脱水，浸润于环氧丙烷(P.O.)中，包埋在EPON中，聚合并切成具有3％乙酸铀和1％柠檬酸铅染色的90nm超薄切片。通过电子显微镜(TEM,PhillipsCM100)捕获数字图像。

TUNEL测定

通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定检测凋亡细胞死亡。对于体内实验，在疾病的峰值时间(18dpi)收集分离的L4-L6脊髓并用4％PFA固定。在梯度乙醇中脱水并用二甲苯透化之后，将组织包埋在石蜡中并切成5μm切片。对于体外实验，在不同处理之后，将细胞接种在切片中并用PBS洗涤并固定20分钟。然后，将组织或细胞载片用TUNEL试剂(Roche Diagnostics,IN,USA)染色用于标记凋亡细胞且用DAPI染色用于标记细胞核。通过使用共聚焦激光扫描显微镜LSM800(CarlZeiss)观察荧光图像。

过氧亚硝酸根评价

HKYellow-AM，发明人新开发的灵敏和选择性ONOO^-探针，用于在体内检测ONOO^-水平(Peng,T.,等人,2016、和Gong,J.,等人,2015)。如先前所述，在处死前15分钟，向18dpi的小鼠静脉内注射HKYellow-AM(10μM，1mL/kg)。用PBS灌注之后，立即切出新鲜的L4-L6脊髓，包埋入O.T.C.中，切成30μm切片，用DAPI复染细胞核，并通过共聚焦激光扫描显微镜LSM800成像，激发波长为543nm/发射波长为567nm。为了在体外检测ONOO^-水平，将预处理的细胞用10μM HKYellow-AM染色30分钟。用PBS洗涤之后，通过具有Axio Vision数字成像系统的CarlZeiss荧光显微镜捕获活细胞的荧光成像。

AC的ONOO^-清除特性的HPLC测量

HPLC用于鉴定AC和过氧亚硝酸根之间是否存在任何直接反应。为了测试AC是否可以直接与ONOO^-反应，发明人使用UHPLC UltiMate 3000(Thermo Fisher Scientific,USA)在化学系统中检测AC(1mg/mL)和ONOO^-(4mM)与AC的混合物的HPLC色谱图。色谱条件如前所述。

免疫荧光

对于体内免疫荧光，将固定后的组织在4℃下在30％蔗糖溶液中完全脱水，包埋于O.C.T中，作为冷冻切片切成30μm切片并储存在-20℃。对于体外免疫荧光，将细胞接种至12mm显微镜载片(0111500；GmbH&Co.KG,Germany)上。将细胞在室温下在4％PFA中固定20分钟，并在4℃下在PBS中储存。对于染色，将冷冻切片样品的表位通过使用微波炉用10mM柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)修复10分钟。然后，通过PBS洗涤之后，将切片或细胞在5％山羊血清中封闭，与一抗孵育并用荧光染料缀合的二抗染色，用DAPI复染细胞核并用抗褪色介质(Dako)封固。使用共聚焦激光扫描显微镜LSM800(CarlZeiss)使免疫荧光图像可视化。

流式细胞术

进行流式细胞术分析以鉴定炎性细胞的细胞类型。为了评估AC对外周或CNS炎症的预防和治疗效果，发明人分别收集来自在疾病发作时(11dpi)用预防方案的小鼠的脾脏的组织和来自在疾病峰值时间时(18dpi)用治疗方案的小鼠的脑和脊髓的组织。简而言之，将分离的组织匀浆并悬浮成单细胞。使用基于密度的Percoll梯度离心收获单核细胞(MNC)。分别用两种亚组表面标志物(eBioscience)、CD45-Alexa700、CD3-FITC、CD4-V450、CD8a-PEcy7和CD45-Alexa700、B220-FITC、Ly6G-V450、CD11b-PEcy7染色分离的MNC。在FACSLSR II(BD Biosciences,CA,USA)上进行流式细胞术分析，并用FlowJo软件(Treestar,Ashland,OR)分析数据。

定量实时PCR(qPCR)

为了测试AC在外周中的抗炎作用，促炎细胞因子和趋化因子(包括IL-1β、IFN-γ、IL-6、CCL-20、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-11、CXCL-12、iNOS和TLR4)的表达通过qPCR检查。详细地，分离媒介物或AC预防性治疗EAE小鼠的疾病发作(11dpi)时的脾脏。遵循制造商的说明，用Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取总RNA。用分光光度计分析RNA定量和纯度。使用ReverseAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)通过逆转录物合成互补DNA。使用Maxima SYBR Green qPCR主混合物(Thermo FisherScientific)进行定量PCR，并通过Lightcycler 480 II(Roche)检测。通过2^-ΔΔCt方法进行基因表达的相对定量。结果表示为针对内部对照基因GAPDH归一化的相对倍数变化。

蛋白质组细胞因子阵列检测

通过使用proteome profiler小鼠XL细胞因子阵列(R&D Systems,MN,USA)测量CNS中的细胞因子/趋化因子产生。详细地，将从媒介物或AC处理EAE小鼠(18dpi)分离的脊髓在含有1％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)和1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的冷PBS中匀浆，随后在-80℃下冷冻并解冻回室温两次。在离心后收集上清液并检查浓度。将具有等量蛋白的组织裂解物与生物素化的检测抗体的混合物混合，并与膜在4℃下孵育过夜。洗去一抗之后，将膜与链霉抗生物素蛋白-HRP孵育30分钟，并通过Gel-Doc系统(Bio-Rad,CA,USA)中的化学发光ECL Select试剂盒(GE Healthcare)使信号斑点可视化。

蛋白质组学

将来自对照、媒介物和AC处理的EAE小鼠(18dpi)的脊髓悬浮于RIPA裂解缓冲液中。使用Precellys匀浆器从细胞裂解物中提取蛋白，随后在4℃下以15000g离心25分钟。收集上清液级分用于使用BCA测定的蛋白定量。简而言之，在使用过滤辅助样品制备(FASP)方法还原和烷基化之后，对200μg蛋白进行胰蛋白酶消化。使用C18阶段尖端清洁LysC-胰蛋白酶肽并进行speedvac干燥。为了增强蛋白覆盖，将来自每个样品的肽用高pH反相肽分级分离试剂盒(Thermo)分级分离成4种串联的级分。使用C18ZipTips将洗脱的肽脱盐，然后提交用于LC-MS/MS分析。

对于MS/MS处理，用与Thermo Fisher Orbitrap Fusion Tribid Lumos偶联的Dionex Ultimate 3000 nanoRSLC系统分析洗脱的肽。在粒径为1.9μm的商业C18柱(75μmi.d.×50cm长度)(Thermo Fisher)上分离肽。使用300nL/min的递增缓冲液B(80％ACN和0.1％甲酸)和递降缓冲液(0.1％甲酸)的线性梯度实现分离。分析分离方案如下：5％B持续10分钟，在148分钟时线性增加至32％B，从158分钟至168分钟进行95％B洗涤，并从169分钟至180分钟在5％B下再平衡。质谱仪以正极性模式操作，毛细管温度为300℃。全MS测量扫描分辨率设置为120 000，自动增益控制(AGC)目标值为2×10⁶，最大离子注入时间(IT)为100ms，且扫描范围为350-1700m/z。操作依赖于数据的前10种方法，在此期间使用更高能量的碰撞解离(HCD)。在30000 MS2分辨率下获得光谱，其中AGC目标为1×10⁵，且最大离子注入时间(IT)为100ms，分离宽度为1.6m/z，且归一化碰撞能量为30。将对于HCD靶向的先前前体离子动态排除50秒。

发明人通过使用Maxquant 1.6.0.1版以高分辨率和高精度获得MS数据，其中通过使用Andromeda算法针对含有近似23,000个条目的小鼠UniProt FASTA数据库(2018年8月)收集数据。使用具有反向数据库的靶标-诱饵方法鉴定有信心的蛋白，在肽和PSM水平上严格的错误发现率<0.001。通过使用肽LFQ强度及其用于标记自由定量以计算倍数变化的比率来定量从两种条件鉴定的蛋白。数据可视化和统计数据分析由Perseus软件1.6.0.2版进行。

线粒体分离

通过使用商业线粒体分离试剂盒(89801；Thermo,IL,USA)进行线粒体分离。详细地，分离小鼠脊髓，并将组织用玻璃匀浆器小心研磨成均质的悬浮液。通过使用提取试剂和差速离心将线粒体与胞质级分分离。用Tris缓冲盐水(TBS)中的2％CHAPS(C9426；Sigma)提取线粒体蛋白。然后，分别收集线粒体和胞质蛋白用于进一步研究。通过使用线粒体标志物VADC1/孔蛋白(ab15895；Abcam,Cambridge,UK)进行Western印迹分析以测定分离的线粒体的完整性和纯度。

Western印迹

遵循不同的实验条件，通过使用含有1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液提取来自组织的蛋白样品。在线粒体分离之后制备来自脊髓的线粒体和胞质蛋白。所有程序均参考标准western印迹方案。蛋白裂解物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用一抗、然后HRP缀合的二抗进行免疫印迹。通过化学发光ECL Select试剂盒(GEHealthcare,IL,USA)检测信号，通过Gel-Doc系统(Bio-Rad,CA,USA)捕获并通过Image Lab软件(Bio-Rad,CA,USA)分析。

统计分析

数据表示为平均值±S.E.M。统计分析通过如下评价：使用未配对的Student氏t检验用于两组设计的比较或单因素ANOVA，随后进行Dunnett氏多重比较检验用于多组比较。使用的小鼠数量描述于相应的附图说明中，并且将所有实验重复三次或更多次。使用GraphPad Prism 6.0版软件(GraphPad Software Inc.,CA,USA)进行所有分析。p<0.05的值被认为统计学显著性。

结果

AC延迟疾病发作并减轻EAE进展

发明人首先评估AC对多发性硬化的免疫的EAE小鼠中的疾病发作和神经缺陷的进展的影响。在预防性处理方案中，从免疫后第2天开始口服施用AC(30mg/kg/天)。当与媒介物处理EAE组相比时，AC处理有效地减轻EAE进展，显著延迟疾病发作，降低疾病发生率并降低临床评分(图8A，B)。在治疗方案中，以5、10、30mg/kg/天的剂量将AC口服施用于活性EAE小鼠，在疾病发作时(11dpi)开始，直至30dpi。如图8C和D中所示，与媒介物组相比，AC施用剂量依赖性地降低EAE小鼠中的每日和累积临床评分。同时，AC处理还显示行为障碍严重程度的显著缓解，通过平均最大临床评分降低所指示。这些结果表明AC可以作为预防剂或治疗策略减轻疾病的严重程度和EAE的进展。考虑到临床实践情况和30mg/kg/天的更好效力，发明人设计了剂量为30mg/kg/天的治疗方案，用于以下EAE实验。

AC减少EAE小鼠的脊髓中的炎症和脱髓鞘

然后，发明人在EAE进展的峰值时间(18dpi)时研究CNS内AC的抗炎和抗脱髓鞘特性。在组织学研究中，媒介物处理的EAE小鼠揭示在腰脊髓损伤的白质中的特征性炎性病灶和脱髓鞘，而AC处理的EAE小鼠具有显著减少的脱髓鞘、炎性浸润和它们的病理评分(图8E，F，G)。一致地，EM图像揭示AC处理的小鼠具有比媒介物EAE小鼠更少的白细胞外渗和更好保存的髓鞘结构。

AC抑制活性EAE小鼠的外周中的免疫应答

在免疫之后，在迁移至CNS之前，在外周中引发致脑炎细胞。预防性AC施用有效地延迟疾病发作并推迟EAE进展，表明AC可以调节外周淋巴组织中自身反应性免疫应答的早期引发/活化。因此，发明人在疾病发作(11dpi)时用预防性治疗方案通过使用流式细胞术研究AC对免疫应答的影响，所述免疫应答包括EAE小鼠的早期免疫活化和来自脾脏的单核细胞(MNC)侵入。B220、CD11b和LyG6的表面表达分别用于鉴定外周免疫器官脾脏中的B细胞、巨噬细胞/小胶质细胞和中性粒细胞群体。AC处理显著降低疾病发作时脾脏中Ly6G⁺中性粒细胞和CD11b⁺巨噬细胞的百分比(图9A)。发明人还测量脾脏(11dpi)中的CD3⁺T细胞、其亚型CD4⁺辅助T细胞(Th)和CD8⁺细胞毒性T细胞(Tc)的群体。如图9B中所示，与媒介物相比，预防性AC施用显著降低脾脏中的病理性CD3⁺T细胞、主要是CD4⁺辅助T细胞的百分比。因此，AC处理损害外周脾中上调的免疫应答，其中中性粒细胞、巨噬细胞和辅助T细胞减少(图9C)。

然后，发明人通过Q-PCR检查源自脾细胞(11dpi)中的致脑炎性免疫细胞的促炎性细胞因子和趋化因子的表达。一致地，当与媒介物组相比时，AC处理显著降低脾脏(11dpi)中的病理性细胞因子/趋化因子(包括IL-6、TLR4、INF-γ、iNOS、IL1-β、CCL-20、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-11和CXCL-12)的水平(图9D)。总之，这些结果表明AC在早期引发阶段针对外周的免疫活化发挥保护作用。

AC减少活性EAE小鼠的CNS中的CD4⁺和CD11b⁺细胞的浸润。

在外周中引发之后，致脑炎的白细胞穿过BBB转迁移至CNS实质并破坏神经元，随后导致运动障碍。发明人接下来研究疾病峰值时间(30mg/kg，治疗处理方案)的媒介物和AC处理的EAE小鼠之间的CNS中的不同炎性细胞群体。FACS分析显示，在18dpi时，与媒介物组相比，AC处理的小鼠具有CNS中浸润的LyG6⁺中性粒细胞、CD4⁺辅助T细胞、尤其是CD11b⁺巨噬细胞的百分比的显著降低(图10A-C)。因此，免疫荧光结果进一步揭示AC处理的小鼠在脊髓的白质中具有较少量的浸润的CD11b⁺巨噬细胞(图15)。

浸润的白细胞和促炎细胞因子/趋化因子一起构成复杂的致脑炎环境，促成免疫的EAE小鼠的CNS中的神经元损伤。发明人接下来通过使用基于膜的蛋白质组阵列确定在疾病峰值时(18dpi)的媒介物或AC处理的团组的CNS组织中的促炎细胞因子/趋化因子的表达谱。发明人发现AC处理在18dpi显著抑制活性EAE小鼠的CNS中的各种病理细胞因子/趋化因子的上调(图10D，E)。总之，这些结果表明AC处理改善CNS的炎性环境，导致EAE进展的减弱。

AC经由介导活性EAE小鼠的脊髓中的线粒体途径来减轻氧化/硝化应激。

为了进一步发现AC在EAE病理学中的潜在机制，发明人进行蛋白质组学研究，以分析在疾病峰值时间18dpi来自对照、媒介物和AC处理的EAE小鼠(30mg/kg/天，治疗处理方案)的脊髓的蛋白表达谱。如图11A中所示，将具有显著变化的所有蛋白质组使用热图可视化。在功能分析中，发明人发现，当与媒介物EAE组相比时，AC施用上调与紧密连接、突触信号传导和神经系统发育相关的蛋白，同时其下调与免疫/炎性应答的生物过程相关的蛋白的表达，抑制氧化应激和线粒体功能障碍，并减轻程序性细胞死亡。

氧化/硝化应激与MS发病机制密切相关，促成线粒体病理学，这是多发性硬化症的标志(Nikic,I.,等人,2011)。发明人具体从这个角度进一步鉴定AC对相关蛋白的影响。AC处理显著降低或阻断疾病峰值时间丰富的氧化相关蛋白的上调，尤其是在EAE小鼠中的脑和脊髓的EAE病变中的NADPH氧化酶亚基p67phox(Ncf2)和p47phox(Ncf1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS或NOS2)和NOS1AP的表达(图11B)。AC处理减弱凋亡细胞死亡和线粒体损伤，通过Bax的下调表达和线粒体功能相关蛋白(包括NADH脱氢酶和ATP合成酶和呼吸链蛋白)的上调表达所证明。因此，生物信息学分析表明AC可以经由调节线粒体途径抑制氧化应激(图11C)。因此，可以得出结论，AC可以经由介导活性EAE小鼠的脊髓中的线粒体途径来抑制氧化/硝化应激。

AC在活性EAE小鼠的脊髓中抑制ONOO^-诱导的过度线粒体自噬活化并减弱神经元细胞死亡。

然后发明人解决AC的神经保护作用是否可归因于活性EAE小鼠的脊髓中的ONOO^-介导的过度线粒体自噬的抑制。首先，发明人评价AC对清除活性EAE小鼠中的ONOO^-的影响。发明人通过使用名为HKYellow-AM的高选择性ONOO^-探针检测活性EAE小鼠的脊髓中的ONOO^-水平(Peng,T.,等人，2016和Gong,J.,等人，2015)。荧光成像研究揭示媒介物EAE小鼠(18dpi)具有显著增加的HKYellow-AM阳性染色荧光，表明脊髓的切片中的ONOO^-产生增加。治疗性AC处理的小鼠(30mg/kg/天)显示在脊髓中比媒介物处理的EAE小鼠少得多的ONOO^-阳性荧光染色细胞(图12A)。一致地，AC处理降低3-NT(免疫的EAE小鼠的脊髓中的ONOO^-的足迹生物标志物)的表达(图12B)。与蛋白质组学分析中的结果一致，western印迹分析揭示免疫的EAE小鼠的脊髓中iNOS、NADPH氧化酶亚基p47phox和p67phox的表达水平增加，其在AC处理的EAE小鼠中被逆转(图12C)。那些数据表明AC降低EAE病理学中的ONOO^-水平，归因于其ONOO^-清除特性和抑制ONOO^-生成。

发明人接下来检查AC可以缓解ONOO^-介导的过度线粒体自噬活化(其随后促成EAE小鼠中的神经保护和运动功能的促进)的假设。采用TUNEL检测以评估神经元凋亡。TUNEL染色显示在18dpi时EAE小鼠的脊髓中的凋亡细胞死亡升高，而AC显著降低阳性点(图13A)。发明人分别通过使用TEM、IF染色和WB分析评估线粒体自噬。TEM成像揭示EAE小鼠的脊髓中的明显受损的线粒体，具有模糊破裂的嵴和广泛的线粒体断裂，其通过AC施用减弱，具有较少的线粒体形式和更好的线粒体结构(图13B)。同时，AC干预逆转线粒体周围的LC3色斑聚集，如通过共免疫染色LC3与ATPB(线粒体标志物)所示(图13C)。与免疫荧光结果一致，western印迹分析还显示AC降低线粒体级分中LC3-II与LC3-I的比率，并抑制Drp1从细胞质至线粒体的转运(图13D)。总之，发明人的结果表明AC是通过抑制ONOO^-介导的过度线粒体自噬活化来减弱EAE损伤的潜在药剂。

AC在体外在培养的SH-SY5Y细胞中在ONOO^-攻击下经由抑制ONOO^-诱导的线粒体自噬活化而发挥神经保护作用

发明人进行了体外细胞实验，以排除其他病理因素在ONOO^-介导的过度线粒体自噬活化中的潜在影响。在体外将SH-SY5Y细胞暴露于合成的ONOO^-钠以诱导硝化应激。发明人首先研究了AC在化学和生物系统中清除ONOO^-的能力。如HPLC色谱图中所示(图14A)，AC与合成的ONOO^-钠直接反应，如通过一旦添加ONOO^-，AC峰就消失所证明。同时，揭示AC在ONOO^-攻击的SH-SY5Y细胞中降低HKYellow-AM探针的荧光，类似于阳性对照PDC处理(图14B)。然后发明人检查AC是否可以经由抑制SH-SY5Y细胞中过度的线粒体自噬活化来针对ONOO^-诱导的神经元细胞死亡进行保护。在TUNEL测定中，AC针对ONOO^-诱导的细胞死亡发挥神经保护作用(图14C)。与体内结果一致，免疫荧光图像揭示ONOO^-诱导LC3色斑和线粒体标志物ATPB的共定位增加，表明SH-SY5Y细胞中的线粒体自噬活化。AC显著减弱线粒体周围的LC3色斑聚集，其作用类似于PDC处理(图14D)。此外，AC处理还抑制暴露于ONOO^-的SH-SY5Y细胞中Drp1的线粒体易位，如Drp1和ATPB的共定位较少所指示(图14E)。这些结果表明，AC抑制ONOO^-诱导的线粒体自噬活化，促成神经元细胞死亡减轻。

组合A延迟疾病发作并减轻EAE进展

然后，发明人还评估组合A和组合B对用于多发性硬化症治疗的免疫的EAE小鼠中的疾病发作的影响。发明人比较相同剂量的组合配方与梓醇(一种来自RR的众所周知的活性化合物)的神经保护作用。标准RR提取物也用作阳性对照。从疾病发作11dpi开始口服施用梓醇(40mg/kg/天)、组合A(梓醇：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)，组合B(松果菊苷：毛蕊花糖苷：益母草苷：地黄苷D，1:1:1:1，总共40mg/kg/天)和RR(3.7g/kg/天)。结果显示组合A处理有效地减弱EAE进展，显著延迟疾病发作和降低临床评分，这比媒介物、梓醇治疗和组合B处理组中的EAE小鼠好得多(图16A)。组合A同样显示比RR提取物更好的神经保护作用。如图16B中所示，组合A治疗显著降低EAE小鼠中的每日和累积临床评分。同时，与RR提取物相比，组合A具有更好的效果，以推迟神经缺陷的发作和发病率，其临床评分相似(图16C-D)。

与体内结果一致，发明人还发现，组合A具有比梓醇好得多的效果，其中LPS刺激的BV2细胞中的IL-6细胞因子水平显著降低(图17)。总之，这些结果表明，组合A可以是作为治疗策略的减轻EAE的疾病严重程度和进展的一种有价值的治疗配方。

讨论

发明人先前的研究揭示，RR提取物通过预防和治疗策略减轻EAE小鼠的疾病严重程度和进展，表明RR对于多发性硬化症治疗的价值(Li,W.,等人，2018)]。然而，用RR提取物中鉴定的24种化合物，RR提取物如何减轻疾病严重程度和进展以及何种活性化合物促成该效力仍然未知。在本研究中，发明人进一步探索AC作为RR生物活性化合物的潜力，并研究促成改善EAE发病机制的抗氧化和抗炎活性的其相应的分子靶标。发明人首次表明AC通过其抗炎和抗氧化作用有效地减轻免疫的EAE小鼠中的疾病进展和神经缺陷严重程度。此外，发明人的研究表明AC通过抑制ONOO^-介导的过度神经元线粒体自噬的抗氧化特性促成针对EAE病理学的神经保护作用。因此，AC具有成为用于MS治疗的有希望的治疗剂的潜力。鉴于AC是药用植物地黄的活性化合物之一，发明人的研究可能提供科学参考文献，以及为AC作为RR的质量控制的成分标志物奠定基础。

EAE是一种广泛采用的动物模型，其模拟MS的关键特征，包括CNS定向的白细胞浸润和炎性微环境诱导，其破坏CNS结构并导致进行性麻痹(Denic,A.,等人,2011和Bjelobaba,I.,等人,2018)。通过使用免疫的EAE小鼠，发明人先前探索了膜支架蛋白窖蛋白(caveolin)-1对脑脊髓炎发病机制和CNS定向的淋巴细胞运输的关键贡献(Wu,H.,等人,2016)。EAE动物模型提供了一种可靠的工具，其不仅用于理解MS的机制，而且用于药理学研究和药物发现。在本文，发明人发现AC不仅用治疗方案减轻活性EAE小鼠的疾病严重程度和进展，而且当它用作预防剂时延迟EAE的发作和发病，表明AC对于多发性硬化症治疗的潜在价值。因此，期望进一步探索AC在减弱EAE病理学中的深入潜在机制。

炎症驱动的突触异常正在成为MS病理学中突出的致病机制。最重要地，它们是潜在地可逆的，并且因此，抗炎代表一种有吸引力的治疗靶标(Mandolesi,G.,等人,2015)。AC的抗炎和抗氧化作用在体外和/或体内已在免疫性肝损伤、D-半乳糖胺和脂多糖诱导的肝损伤和脂多糖诱导的肺损伤中得到充分记录(Jing,W.等人，2015、Xiong,Q.,等人，1999、和Zhao,J.,等人，2009)。然而，AC在CNS疾病中的抗炎和免疫调节仍然未知。在EAE期间，在免疫后，致病性炎性/免疫细胞在迁移至CNS之前在外周引发。相应地，在发明人用预防方案的研究中，预防性AC治疗减弱外周脾中炎性细胞的早期引发/活化，导致推迟的EAE进展和延迟的疾病发作。值得注意的是，AC治疗减少中性粒细胞、巨噬细胞和CD4⁺Th细胞(其关键地参与MS/EAE的进展)的群体。中性粒细胞似乎是粒细胞的关键群体，其在MS中引发早期炎性应答(Woodberry,T.,等人,2018)。CD4⁺Th细胞通过活化和引导其他免疫细胞在适应性免疫系统中发挥重要作用(Zhu,J.,H.Yamane，2010和Mills,K.H.，2011)。巨噬细胞是促成MS/EAE中的CNS脑脊髓炎的关键因素(Lassmann,H.等，2011)。同时，预防性AC治疗显著减轻炎性环境，其中在疾病发作时(11dpi)的脾脏中促炎细胞因子和趋化因子的产生受损，其进而控制致病性白细胞向CNS的迁移和浸润。这些结果表明AC在EAE小鼠中的神经保护作用可以部分地解释对外周免疫/炎性应答的抑制作用。因此，AC可用作MS的预防剂。重要地，探索AC的治疗价值将导致一种用于MS治疗的新的治疗剂。鉴于预防和治疗方案都需要大量动物(这是动物伦理学关注的)，在本研究中，发明人主要聚焦于EAE病理学期间AC在CNS中的治疗效果和潜在机制。AC治疗保护EAE病变，其中炎性病灶减少，中性粒细胞、巨噬细胞和CD4⁺Th细胞浸润减少，以及免疫小鼠的脊髓中的神经炎症减少(18dpi)。因此，AC治疗可以经由抑制EAE病理期间的炎性活化/浸润和改善炎性环境来预防EAE。

在MS患者以及EAE动物模型中均已发现氧化/硝化应激介导的CNS损伤(Smith,K.J.,等人，1999；和Cross,A.H.,等人，1997)。少突胶质细胞和运动神经元极易受氧化/硝化损伤影响。源自巨噬细胞的过量ROS/RNS触发氧化损伤，加重脱髓鞘、轴突降解和神经细胞死亡。作为RNS的代表，ONOO^-与MS发病机理中的炎症和免疫调节密切相关，导致脱髓鞘、轴突降解和神经元凋亡(Li,S.,等人,2011)。在MS患者(Dujmovic,I.,等人,2009)以及EAE小鼠(Bolton,C.,等人,2008)的血清和脑脊液中发现3-NT(ONOO^-的足迹)升高。因此，寻找靶向ONOO^-的特异性药剂对MS疗法具有临床意义。先前的研究表明，AC通过抑制iNOS表达和减少NO产生而具有针对氧化损伤的神经保护作用。在本文中，发明人推测AC可以清除ONOO^-，促成其在EAE小鼠中的药理作用。ONOO^-由O₂ ^·-和NO的快速反应产生，所述O₂ ^·-和NO通过活化NADPH氧化酶和iNOS产生。蛋白质组学研究和western印迹分析均揭示，AC处理下调EAE小鼠(18dpi)的脊髓中iNOS，NADPH氧化酶亚基p47phox和p67phox的表达。HKYellow-AM是发明人新开发的用于使活细胞和组织中的过氧亚硝酸根产生成像的高灵敏度和特异性探针(Peng,T.,等人,2016)。通过使用HKYellow-AM，发明人使EAE脊髓的病变中ONOO^-的产生可视化。结果揭示，与媒介物EAE小鼠相比，AC抑制HKYellow-AM荧光并下调EAE脊髓中3-NT的表达，表明ONOO^-清除特性。一致地，体外研究揭示AC直接与合成的ONOO^-反应并且抑制ONOO^-处理的SH-SY5Y细胞中的HKYellow-AM荧光。因此，AC可以是ONOO^-清除剂以及经由下调iNOS和NADPH氧化酶和随后减少其母体自由基O₂ ^·-和NO形成的ONOO^-产生的抑制剂。

线粒体是自由基的主要来源，以及氧化/硝化应激的靶标。线粒体功能障碍是EAE/MS的标志，触发自噬活化并随后导致轴突损伤和神经细胞死亡。蛋白质组学研究揭示通过经由介导线粒体途径在活性EAE小鼠的脊髓中的AC治疗处理减轻程序性细胞死亡和线粒体应激。重要的是，在EAE小鼠中，线粒体蛋白易受ONOO^-诱导的硝化应激影响。发明人最近的研究表明，ONOO^-诱导的过度线粒体自噬活化经由将Drp1募集至损伤的线粒体而加重脑缺血再灌注损伤(Feng,J.,等人,2018)。在本文中，发明人测试AC是否可以抑制活性EAE小鼠中的ONOO^-介导的线粒体自噬。如所预期，AC处理降低线粒体级分中LC3-II与LC3-I的比率，并且抑制Drp1从细胞质向线粒体的转运。类似地，体外实验也显示AC抑制ONOO^-诱导的线粒体自噬活化，其中神经细胞死亡和Drp1线粒体募集减少，其作用类似于PDC。因此，发明人得出结论，AC经由抑制ONOO^-诱导的过度线粒体自噬活化而在EAE中发挥保护作用。

值得注意的是，MS发病机制涉及具有多种因子或多种调节途径的复杂网络。蛋白质组学结果显示，AC用网络调节改善神经缺陷，所述网络调节包括抑制免疫、炎性、氧化/硝化、线粒体应激，以及增强紧密连接和突触功能。从这个角度来看，AC可以是用MS治疗的多种分子靶标调节免疫系统的有效治疗剂，其仍有待进一步阐明。

总之，AC可以通过其在EAE病理学中的抗炎和抗氧化特性来减弱疾病进展和神经缺陷严重程度。ONOO^-诱导的过度线粒体自噬活化的抑制可以是促成AC针对EAE病理学的抗炎和抗脱髓鞘特性的重要潜在机制之一。总之，AC不仅是用于抑制外周免疫/炎症应答和致病性白细胞浸润至CNS中用于减少发病率和发作时间的有希望的预防剂，而且还是减轻多发性硬化症中的疾病进展和神经缺陷严重程度的有用治疗剂。

通过使用化学和生物系统，发明人快速筛选了五种具有强抗氧化和抗炎能力的生物活性化合物，包括来自RR的毛蕊花糖苷、松果菊苷、梓醇、益母草苷和地黄苷D。因此，发明人将这5种化合物选择为2种组合，用于优化RR的EAE治疗效果。组合A(Comb.A)包括毛蕊花糖苷、梓醇、益母草苷和地黄苷D；组合B(Comb.B)包括松果菊苷、梓醇、益母草苷和地黄苷D.

组合A在治疗策略中减轻EAE小鼠的疾病严重程度和进展，其表明比组合B或单独的梓醇显著更好的治疗结果。组合A可以是减轻多发性硬化症中的疾病进展和神经缺陷的严重程度的有用的治疗剂。

对于给定特征的任何数字或数值范围，来自一个范围的数字或参数可以与来自用于相同特征的不同范围的另一数字参数组合以产生数值范围。

除了在操作实例(如果有)中或者以其他方式指出，在说明书和权利要求中使用的涉及参数，测量，条件等的所有数字，值和/或表达应被理解为在所有情况下通过术语“约”修饰。

虽然结合某些实施方案解释了本发明，但应理解，在阅读本说明书后，其各种修改将对本领域技术人员变得显而易见。因此，应该理解，本文公开的发明旨在覆盖落入所附权利要求范围内的这些修改。

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Claims

1.毛蕊花糖苷在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途。

2.毛蕊花糖苷在制备用于预防或治疗有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。

3.毛蕊花糖苷在制备用于缓解、治疗或清除有需要患者中多发性硬化或实验性自身免疫性脑脊髓炎中的症状、病症或状况的药物中的用途，所述症状、病症或状况包括：炎症；脱髓鞘；自由基引发的对神经系统或神经细胞的氧化或硝化损伤；自由基介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞对神经系统的浸润或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种。

4.地黄提取物组分的组合在制备用于预防或治疗有需要患者中多发性硬化的药物中的用途，所述组合是梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D。

5.地黄提取物组分的组合在制备用于预防或治疗抑有需要患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途，所述组合是梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D。

6.地黄提取物组分的组合在制备用于缓解、治疗或清除有需要患者中多发性硬化或实验性自身免疫性脑脊髓炎中的症状、病症或状况的药物中的用途，所述症状、病症或状况包括：炎症；脱髓鞘；自由基引发的对神经系统或神经细胞的氧化或硝化损伤；自由基介导的神经毒性；氧化或硝化应激；免疫细胞对神经系统的浸润或损伤；促炎细胞因子和趋化因子的产生；线粒体自噬过度或活化；或者线粒体功能障碍中的一种或多种，所述组合是梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D。

7.权利要求4-6中任一项的用途，其中以全部地黄提取物组分的总重量计算，梓醇的量为5％至85％，毛蕊花糖苷的量为5％至85％，益母草苷的量为5％至85％，并且地黄苷D的量为5％至85％。

8.权利要求4-7中任一项的用途，其中梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D的重量比是1:1:1:1。

9.地黄组合物或者毛蕊花糖苷在制备用于预防或治疗有需要的患者中多发性硬化的药物中的用途，所述地黄组合物或毛蕊花糖苷预防或减少ONOO^-衍生的硝化应激。

10.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物或毛蕊花糖苷通过对多种靶标的不同活性化合物的网络调节，减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化。

11.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含地黄提取物。

12.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少两种组分。

13.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少三种组分。

14.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含毛蕊花糖苷，或者由其组成。

15.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含：梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D(rehmannioside D)，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷(leonuride)或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。

16.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含以下中的至少三种：梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。

17.权利要求9的用途，其中所述地黄组合物包含以下中的至少五种：梓醇，氯化梓醇，2-(二苯并[ghi,mno]荧蒽-1-基羰基)苯甲酸，单密力特苷，地黄苷D，地黄皂苷A/地黄皂苷B，美利妥双苷，地黄苦苷，益母草苷或异构体，京尼平苷酸，二咖啡酰-毛蕊花苷，8-表番木鳖酸，28-去氧代印苦楝内酯，洋地黄叶苷C/松果菊苷，地黄皂苷A/地黄皂苷B，肉苁蓉苷A/焦地黄苯乙醇苷A1/焦地黄苯乙醇苷A2，毛蕊花糖苷，焦地黄苯乙醇苷B1/焦地黄苯乙醇苷B2，异毛蕊花糖苷/连翘酯苷A，焦地黄苯乙醇苷D/天人草苷A/天人草苷，6-O-E-阿魏酰筋骨草醇，角胡麻苷/角胡麻苷异构体，毒毛旋花子苷元阿拉伯糖苷，和十八烯酸。

18.地黄组合物或毛蕊花糖苷在制备用于预防或治疗有需要的患者中多发性硬化的药物中的用途，所述地黄组合物，通过a)抑制致脑炎的T细胞和活化巨噬细胞的浸润，和2)预防ONOO^-介导的神经毒性中的至少一种，来减轻神经炎症和脱髓鞘。

19.权利要求18的用途，其中所述地黄组合物包含地黄提取物的至少三种组分。

20.地黄组合物或毛蕊花糖苷在制备用于抑制有需要的患者中实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物中的用途。

21.权利要求20的用途，其中所述地黄组合物或毛蕊花糖苷足以提供抗炎和抗氧化特性。

22.权利要求20的用途，其中所述地黄组合物或毛蕊花糖苷足以减少ONOO^-衍生的硝化应激。

23.权利要求20的用途，其中所述有需要的患者中患者具有多发性硬化。

24.权利要求9-23中任一项的用途，其中所述地黄组合物由梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D组成。

25.权利要求24的用途，其中以全部地黄提取物组分的总重量计算，梓醇的量为5％至85％，毛蕊花糖苷的量为5％至85％，益母草苷的量为5％至85％，并且地黄苷D的量为5％至85％。

26.权利要求25的用途，其中梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷和地黄苷D的重量比是1:1:1:1。