CN1240846C - 来源于木层孔菌属种类的菌株的免疫刺激多糖物质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新裂蹄木层孔菌Yoo，此蕈通过限制片段长度多态性和微生物特性分析被鉴定为新的。一种从其或其他木层孔菌属种类的子实体或菌丝体中分离的多糖物质具有一种通过刺激T-细胞的细胞毒作用和B-细胞的抗体形成能力所致的抗癌活性，而且此多糖物质具有一种有效的抗癌转移活性。此多糖物质能够刺激人体的免疫力在预防和治疗免疫相关疾病例如癌症和AIDS和研究这些疾病的基本机理方面有效。

Description

来源于木层孔菌属种类的菌株的 免疫刺激多糖物质及其应用

技术领域：

本发明涉及一种属于木层孔菌属的菌株，一种产自此菌株的多糖物质以及此多糖物质的应用。特别涉及一种新的木层孔菌属种类的菌株、一种产自此菌株的新的具有有效的免疫刺激活性的多糖物质，及其在预防和治疗免疫相关疾病例如癌症和AIDS及其机理研究方面的应用。

背景技术：

蕈，一种高级真菌，是异养生物；它们通过显微结构的菌丝从外界吸收有机营养。在生物圈中，它们充当的是一个分解者，将复杂的有机物降解为简单的无机形式并最终返回到自然界中。在真菌中，最典型的蕈属于担子菌纲，它们特征性地形成担子，每个担子在成熟期到来时在其表面均会有四个外生的担孢子。蕈可以进一步分为层菌纲，它自动地从暴露的子实层释放孢子。层菌纲的代表是多孔菌目和伞菌目。葡萄状枝瑚菌、安迪氏刺革菌、Climancodon septentrionalis、杂色革盖菌和canoderma applanatum属于多孔菌目类，糙皮侧耳、埃杜香菇、群交裂褶菌、松口蘑、捕蝇蕈(Amanitsmuscaria)和毛头鬼伞均在伞菌目类的范围内。

在过去的东方草药中已知：许多属于多孔菌目，一种担子菌纲(Basidomycetes)的蕈对多种疾病特别是肿瘤有治疗活性。在韩国，它们作为草药或民间药物代代相传，而且在属于多孔菌科的蕈，特别是裂蹄木层孔菌，被认为是一种非常贵重的药物。然而，裂蹄木层孔菌在自然界中是一种非常稀有的品种，以致于它的子实体很难得到。而且分离和人工培养裂蹄木层孔菌的菌丝体被认为是几乎不可能。因而，尽管裂蹄木层孔菌被认为是一种对肿瘤有非常有效的治疗剂，但它的作用一直没有被有效利用。

对于治疗癌症，多种方法包括化疗、放疗和外科手术治疗均是常规使用的。尽管这些治疗方法对实体癌有效，但是对于完全征服癌症是不够的。特别是，对转移肿瘤是没有用的。

通常，使用抗癌例如阿霉素剂的化疗和放疗会带来严重的副作用。为了减轻副作用，这样的抗癌剂可能会减量给药。然而在这种情况下，药物的治疗作用变差。更糟的是，甚至在使用化疗治疗癌症之后，癌转移还不能够被防止。如此看来，常规的化疗在一定程度上对抑制癌生长有效，但不能完全治愈癌症。

一种替代疗法是使用免疫抑制剂，被称作免疫疗法。具有代表性的免疫抑制剂的例子是细胞因子，例如白细胞介素-2，肿瘤坏死因子等等。白细胞介素-2显示出较好的治疗作用，特别是对癌症转移。当用于人体时，白细胞介素-2需要以大剂量使用，以致于会产生严重的副作用。最近在新免疫刺激物质方面的研究开发出蘑菇多糖和OK-432，这种新的免疫刺激物质是非细胞因子而且显示出无副作用的良好的抗癌活性。

在最近的几年中，一种化学治疗与免疫治疗联合应用的被称为免疫化学治疗的新的技术一直在积聚力量。例如，阿霉素与免疫增强剂向癌症患者共同给药，在增强抗癌作用的同时减少了化学药品的副作用。

就我们所知，到目前为止没有木层孔菌属种类的菌株的微生物和遗传特性的研究报道。微生物即使是相同种的也可能在所产生的物质种类和数量方面彼此有很大的不同，而且可能在培养条件、菌株稳定性和遗传变异频度方面显示出很大的差异。在研究真菌木层孔菌属有价值的产物时，需要作的第一件事是筛选能够产生大量产物并且能在肉汤中培养的菌株，除此之外还具有低的遗传变异。用显微镜观察裂蹄木层孔菌菌株形态多样而且有修饰，因此很难鉴定。但是，在显微镜下依靠辨别形态确定其种类是可行的。

最近，将新的DNA分析方法已经用于人口遗传和种族发育的研究。超过表型分析方法，DNA分析方法具有能够分析以进化速度和遗传趋势为基础的基因型的优点。其中，一种限制片段长度多态性(此后称作“RFLP”)技术能够推断出碱基序列突变以便进行基因型分析(Dowling等，1990，1990.核酸II：“限制位点分析”中：分子系统D.M.Hills和C.Moritz.编辑，P250-317，Sinauer联合出版社)。由于核DNA太大不容易分析，细胞器染色体组通常被用于DNA分析(White和Densmore，“1992线粒体DNA分离”中：人口的分子遗传分析：一种实际方法，A.R.Hoelzel.编辑，P29-58，牛津大学出版社)。特别是，优点是采用了线粒体DNA。一般地，线粒体DNA与核DNA相比大小较小，进化变化速度较快，并具有母性单倍体遗传性，因此线粒体DNA被广泛用于一个群体的遗传结构和历史的研究。特别是，线粒体DNA的RFLP被用于种内部突变的研究(Foster等，1988，“通过真菌线粒体DNA的分析评价Phythophothora种类间的相关性”，《真菌学》80：466-478)。

发明内容：

通过利用DNA分析方法对木层孔菌属种类的菌株进行了深入细致而且广泛的研究，本发明人发现一种新的多糖物质，它是由一种木层孔菌属菌株产生的，具有有效的免疫刺激活性。

因而本发明的一个目的是提供一种木层孔菌属种类的菌株，它能够产生一种新的具有免疫刺激活性的多糖物质。

本发明的另一目的是提供一种新的多糖物质，显示出一种有效的抗免疫相关疾病的免疫刺激活性。

本发明的另一目的是提供所述多糖物质作为一种免疫治疗剂的用途或在这些疾病基本机理研究方面的应用。

为了达到上述目的，首先培养多种木层孔菌属种类的菌株，并用SDS-苯酚方法分离它们所有的DNA。从总DNA中仅得到线粒体DNA。用限制酶BamHI、ClaI、EcoRI和PvuII消化线粒体DNA，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。按照Nei，M.和W.H.Li的方法(Mathematical model for studyinggenetic variation in terms of restriction endonucleases.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，5269-5273(1979))分析木层孔菌属的菌株间的DNA的相关性。从这些分析资料中，发现了一种新菌株，它形成与其他菌株不同的新的相关性。此菌株被命名为裂蹄木层孔菌Yoo并于1997年11月17日在韩国生物科学和生物技术研究院韩国模式培养物保藏中心保藏(保藏号KCTC0399BP)。就KCTC 0399BP菌株的微生物特性进行了一项研究。从这种新菌株的子实体和菌丝体中分离和提纯一种新的多糖物质，并对其免疫刺激活性进行实验。对此免疫刺激多糖物质的糖单位和组成进行分析，然后对其碳水化合物成分进行结构分析。相似地，培养其他多种木层孔菌属种类的菌株，并对其子实体和菌丝体进行分离和纯化，以获得同样具有免疫刺激活性的多糖物质。

进行动物实验，对被植入皮肤癌细胞的小鼠使用此免疫刺激多糖物质，以测定免疫刺激活性物质的抗癌活性。而且，测定当多糖物质与化学药品联合使用时在抗癌活性方面的变化。研究多糖物质对人癌细胞生长的影响。给尾部静脉注射了皮肤癌细胞的小鼠使用多糖物质，以便研究其对癌转移的影响。在本发明中发现此多糖物质的抗癌活性的机理与抗癌化学药物的机理有所不同。

附图说明：

参考附图从下列实施方案的描述中将会清楚地看到本发明的上述和其他目的，其中：

附图1是显示木层孔菌属种类菌株间相关性的系统树；

附图2是显示裂蹄木层孔菌菌丝体培养物特性的示意图；

附图3是从木层孔菌属的菌株纯化多糖物质的步骤；

附图4是免疫刺激多糖物质糖单位的气相色谱图；

附图5是免疫刺激多糖物质的HW 65F凝胶色谱图；

附图6是免疫刺激多糖物质的碳NMR谱；

附图7是显示按照给药方式多糖物质抗小鼠癌细胞的抗癌活性的示意图；

附图8a是显示多糖物质和0.1mg/kg阿霉素联合使用的抗小鼠癌细胞的抗癌活性的示意图；

附图8b是显示多糖物质和0.3mg/kg阿霉素联合使用的抗小鼠癌细胞的抗癌活性的示意图；

附图9a是显示按照用多糖物质和阿霉素治疗人癌细胞的变化的示意图；

附图9b是显示按照多糖物质和阿霉素治疗人癌细胞的最终重量的示意图；

附图10a是显示阿霉素对癌转移的预防作用的示意图；

附图10b是显示该多糖物质和阿霉素联合使用对癌转移的预防作用的示意图；

附图11是显示阿霉素和多糖物质的细胞毒性的示意图。

具体实施方式：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上分别培养13种包括新裂蹄木层孔菌YooKCTC 0399BP在内的木层孔菌属菌株。应用SDS-苯酚技术从每种培养物的菌丝体中分离总DNA，然后从总DNA中进一步分离线粒体DNA。这些线粒体DNA可用于菌株间相关性的分析。为此分析，用限制酶消化线粒体DNA，并通过电泳在琼脂糖凝胶上分离出消化后的DNA片段。DNA片段在凝胶上移动的距离是计算限制酶片段相关值(F)和序列趋异值(p)的数据。依据这些数值，可以发现一种具有相关性的新的菌株，将它命名为“裂蹄木层孔菌Yoo(Phellinus linteus Yoo)”，并在韩国生物科学和生物技术研究院韩国模式培养物保藏中心保藏(保藏号KCTC 0399BP)。对裂蹄木层孔菌YooKCTC 0399BP子实体微生物特性的研究有助于这种蕈的增殖。

为了提取这种被认为具有有效治疗作用的物质，培养和增殖这种蕈。通过热水提取得到一种新物质，通过苯酚硫酸和福林-苯酚技术分析证实此物质是一种多糖。另外，通过NMR技术可以揭示此多糖物质的结构特征。

给一种动物使用后，通过计数和测量淋巴细胞的增殖确定所述多糖物质的免疫刺激活性。对其他木层孔菌属菌株使用与裂蹄木层孔菌Yoo相似的方法。依次进行菌株培养、菌丝体提取和物质分离。分离出的物质也被证实具有免疫刺激活性。另外，从木层孔菌属菌株的子实体中获得的多糖物质被证明具有免疫激发活性。

进行动物实验以测定多糖物质抗癌的活性。首先，将来源于小鼠的皮肤癌细胞植入小鼠，然后给小鼠单独或联合使用所述多糖物质和其他化学药品。比较每种情况小鼠的生存力。通过使用植入了人癌细胞的裸鼠测定多糖抗人癌的活性。给此裸鼠单独或联合使用所述多糖物质和阿霉素。另外，多糖物质在预防癌转移方面非常有效。为此，将小鼠皮肤癌细胞静脉注射入小鼠的尾部，然后给小鼠使用多糖物质和阿霉素。使用sulforhodaminB方法测定先前单独或联合用多糖物质和阿霉素处理过的存活小鼠皮肤癌细胞和存活人肺癌细胞。

从下列的实施例中可以更好地理解本发明，下列的实施例是用于说明本发明的，但不应该被理解为对本发明的限制。在下列的实施例中，用取自B₆C₃F小鼠的脾细胞测定从裂蹄木层孔菌Yoo和其他木层孔菌属菌株中分离的多糖物质的免疫刺激活性。首先，通过用该物质处理将脾细胞免疫2天并以脂多糖作为阳性对照。通过分光光度计测定所生成的抗体，此抗体认作免疫刺激活性的一个标准。通过一种混合淋巴细胞应答技术测定多糖物质对T-细胞的增殖作用。为检测淋巴细胞的增殖，通过使用³H-胸腺嘧啶脱氧核苷测定新近在淋巴细胞中合成的核DNA。

实施例I：木层孔菌属菌株的培养

将下表1中所给的每一木层孔菌属种类菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上、28℃恒温下培养5-12天。在450mLPD肉汤中接种后，使每种菌株在28℃、120rpm振摇下生长12天。

                    表1

      所用的木层孔菌属的种类及其来源

菌株	来源
		裂蹄木层孔菌WD 1222	日本
裂蹄木层孔菌ATCC 26710	美国
		裂蹄木层孔菌KCTC 0399BP	韩国
裂蹄木层孔菌PL5	韩国
		裂蹄木层孔菌PL4	韩国
裂蹄木层孔菌PLM	韩国
		窄盖木层孔菌ATCC32233	美国
P.johnsonianus ATCC60051	美国
		松木层孔菌ATCC12240	美国
P.tuberculosis ATCC13271	美国
		变黑色木层孔菌FP-71807-S	美国
P.chrysoloma HHB-3585-Sp	美国

实施例II：总DNA的分离

应用SDS-苯酚方法从菌丝体中分离总DNA。用20mM EDTA洗涤实施例I培养的每种菌丝体，并通过用一张滤纸(Whatman NO.1)真空过滤收集，贮存在保持-70℃的深冷藏箱中并进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的菌丝体研细，然后将2g每种粉末加入20mL提取缓冲液(0.2M Tris·HCl，pH8.5；0.25M NaCl；25mM EDTA；0.5％(w/v)SDS)，然后加入14mL苯酚和6mL氯仿。通过缓慢搅拌混合后，离心此溶液。用15μlRANase(10mg/mL)在37℃下处理所得上清液30分钟，然后用15μl蛋白酶K(10mg/mL)在60℃下再处理15分钟。此后，将酶处理过的上清液与一种等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)的混合物充分混合，随后在4℃下以12,000X离心30分钟。在重复相同的离心前，将上清液与一种等体积的氯仿和异戊醇(24∶1)的混合物充分混合。如此所得的上清液通过涡旋(voltexing)与0.54体积的异丙醇混合，并在上述相同条件下离心以获得DNA沉淀。用70％乙醇洗涤该沉淀，并在空气中干燥。将DNA溶于8mLTE缓冲液(10mM Tris·HCl，1mM EDTA，pH8.0)，并在-20℃下保存。

实施例III：线粒体DNA的分离

进行超离心，以便将线粒体DNA从总DNA中分离出来，此总DNA是从实施例II每种菌株中获得的。与8.8g氯化铯(美国Sigma公司有售)和6μl二苯甲亚胺溶液(10mg/mL)混合后，在20℃下以40,000Xg超离心所述的总DNA溶液(8mL)。

在紫外光下进一步鉴定两条DNA带后，在21号注射器针头的帮助下只回收了是线粒体DNA级分的上带。向如此获得的DNA级分加入一种等体积的CsCl饱和的异丙醇，微弱涡旋(voltexing)混合后，在4℃下以1,200Xg离心。重复洗涤步骤6-7次以便将从线粒体DNA片段中完全去掉二苯甲亚胺。通过向线粒体DNA中加入三倍线粒体DNA片段体积的70％乙醇并在4℃下以100Xg的速度离心10分钟而去除氯化铯。再重复一次洗涤步骤以获得不含二苯甲亚胺和Cs的线粒体DNA。在空气中干燥后，将线粒体DNA溶于TE缓冲液(pH8.0)，在260nm下用例如美国Beckman公司出售的商品名为“DU-64 spectrometer”的分光光度计定量。在-20℃下贮存线粒体DNA。

实施例IV：用限制酶消化线粒体DNA

从Boehringer Mannheim公司(德国)购买本实施例中所用的限制酶和缓冲液并与其识别位点一起列于下表2中。实施例III所获得木层孔菌属菌株的每种线粒体DNA样品缓冲液的浓度为1μg/10μl，将它们在37℃下消化3小时。

          表2

  限制酶及其识别位点

限制酶	识别位点
		BamHI	G↓GATCC
ClaI	AT↓CGAT
		EcoRI	G↓AATTC
PvuII	CAG↓CTG

实施例V：琼脂糖凝胶上的电泳

将用实施例IV中的限制酶处理过的DNA样品与载有缓冲液(0.25％溴酚兰、0.25％二甲苯青FF、30％甘油)的凝胶混合，并在德国BoehringerMannheim公司出售的1％琼脂糖凝胶(琼脂糖MP)上用美国BRL公司出售的平面电泳分析仪电泳4小时，其中电泳的缓冲液为TAE缓冲液(40mMTris-乙酸、1mM EDTA，pH8.0)，以50V穿过分析仪。DNA电泳后，将琼脂糖凝胶浸入溴化乙锭缓冲液(水中0.5μg/mL)以便容易在紫外线灯下检测这些DNA。将通过电泳确定的线粒体DNA的大小列于下表3中。

                  表3

 从木层孔菌属的种类中分离的线粒体DNA的大小

菌株	DNA大小
		裂蹄木层孔菌WD1222	58Kb
裂蹄木层孔菌ATCC26710	59Kb
		裂蹄木层孔菌KCTC0399BP	61Kb
裂蹄木层孔菌PL5	61Kb
		裂蹄木层孔菌PL4	73Kb
裂蹄木层孔菌PLM	63Kb
		窄盖木层孔菌ATCC32233	77Kb
P.johnsonianus ATCC60051	76Kb
		松木层孔菌ATCC12240	76Kb
P.tuberculosis ATCC13271	57Kb
		变黑色木层孔菌FP-71807-S	58Kb
P.chrysoloma HHB-3585-Sp	60Kb

实施例VI：限制片段长度多态(RFLP)分析

按照Nei和Li方法进行木层孔菌属菌株间DNA相关性的分析。在如果当在实施例V琼脂糖凝胶上电泳时移动的距离相同即被认为DNA片断彼此相同的情况下，获得限制酶片断相关值(F)和序列趋异值(p)。通过未称量配对组法算术平均数(UPGMA)群集技术，从p值中分析出裂蹄木层孔菌Yoo(KCTC 0399BP)菌株与其他木层孔菌属种类菌株之间的相关性。以下列的等式为基础，分别计算P和F值：

                    F＝2n_xy/(n_x+n_y)其中F表示两木层孔菌属种类间的相关性，n_xy是它们之间共同的片段数目，n_x和n_y分别是分离x和y所展开的片段总数目。

                    p＝-(lnF)/r

其中p是每个核苷酸位置核苷酸碱基置换比例的估计值，r是供限制性内切核酸酶识别位点的核苷酸碱基对的数目。在表4中列出当用限制酶BamHI处理时所得的F值，并一同列出它们相应的p值。在表5中列出当用限制酶ClaI处理时所得的F值，并一同列出它们相应的p值。在表6中列出当用限制酶EcoRI处理时所得的F值，并一同列出它们相应的p值。在表7中列出当用限制酶PvuII处理时所得的F值，并一同列出它们相应的p值。表8中包括共同片断的比例，和从表4-7中每张表的左上至右下延伸的对角线上方的相应于所列p值的算术平均距离。从这些数据中推断出系统树，正如附图1所示，我们可以非常明显地看到：本发明的菌株与具有明显相关性的木层孔菌属菌株相比重新有所不同。

                                                                       表4

                                                    BamHI消化的线粒体DNA的PRLP的F值和P值

	WD1222	ATCC26710	KCTC0399BP	PL5	PL4	PLM	ATCC32233	ATCC60051	ATCC12240	ATCC13271	FP-71807-S	HHB-3585-Sp
													WD1222	-							0.1921	0.4142		0.3465	0.2310
ATCC26710	NC	-	0.0257	0.2570	0.3120	0.2841	0.2310		0.2841	0.2203
													KCTC0399BP	NC	0.8571	-	0.0000	0.3120	0.2841	0.2310		0.2841	0.3358
PL5	NC	0.8571	1.0000	-	0.3120	0.2841	0.2310		0.2841	0.3358
													PL4	NC	0.1538	0.1538	0.1538	-		0.3358			0.3243		0.3120
PLM	NC	0.1818	0.1818	0.1818	NC	-						0.2841
													ATCC32233	NC	0.2500	0.2500	0.2500	0.1333	NC	-	0.3753	0.2987	0.1735		0.3465
ATCC60051	0.3158	NC	NC	NC	NC	NC	0.1052	-	0.4209	0.3666	0.2411	0.3567
													ATCC12240	0.0833	0.1818	0.1818	0.1818	NC	NC	0.1666	0.0800	-	0.2915	0.3996	0.2165
ATCC13271	NC	0.2666	0.1313	0.1333	0.1428	NC	0.3530	0.1111	0.1739	-	0.2203
													FP-71807-S	0.1250	NC	NC	NC	NC	NC	NC	0.2353	0.0909	0.2666	-
HHB-3585-SP	0.1250	NC	NC	NC	0.1538	0.1818	0.1250	0.1176	0.2727	NC	NC	-

                                                                     表5

                                                    CIaI消化的线粒体DNA的PRLP的F值和P值

	WD1222	ATCC26710	KCTC0399BP	PL5	PL4	PLM	ATCC32233	ATCC60051	ATCC12240	ATCC13271	FP-71807-S	HHB-3585-Sp
													WD1222	-	0.1155	0.1351	0.1527	0.2841	0.2987	0.3243	0.0372	0.1412		0.2310	0.2507
ATCC26710	0.5000	-	0.0196	0.0851	0.1686	0.1831	0.2088	0.1527			0.1155	0.2570
													KCTC0399BP	0.4444	0.8888	-	0.0531	0.1831	0.1288	0.2203	0.1686			0.1351	0.2682
PL5	0.4000	0.6000	0.7272	-	0.1964	0.1412	0.3465	0.1831			0.1527	0.2841
													PL4	0.1818	0.3636	0.3333	0.3077	-	0.1047	0.2411	0.1964	0.1736	0.1256	0.1686	0.2987
PLM	0.1666	0.3333	0.4615	0.4285	0.5333	-	0.3666	0.3243	0.1831	0.1831	0.1831	0.3120
													ATCC32233	0.1428	0.2587	0.2666	0.1250	0.2353	0.1111	-	0.2310	0.2006	0.2006	0.2088	0.2203
ATCC60051	0.8000	0.4000	0.3636	0.3333	0.3077	0.1428	0.2500	-		0.3465	0.1682	0.2841
													ATCC12240	0.4285	NC	NC	NC	0.3529	0.3333	0.3000	NC	-	0.2682	0.3243	0.2203
ATCC13271	NC	NC	NC	NC	0.4706	0.3333	0.3000	0.1250	0.2000	-	0.3243
													FP-71807-S	0.2500	0.5000	0.4444	0.4000	0.3636	0.3333	0.2857	0.2000	0.1428	0.1482	-	0.2507
HHB-3585-Sp	0.2222	0.2222	0.2000	0.1818	0.1666	0.1538	0.2666	0.1818	0.2666	NC	0.222	-

                                                                  表6

                                                EcoRI消化的线粒体DNA的PRLP的F值和P值

	WD1222	ATCC26710	KCTC0399BP	PL5		PL4		PLM	ATCC32233	ATCC60051	ATCC12240	ATCC13271	FP-71807-S	HHB-3585-SP
															WD222	-	0.3837	0.1921	0.2006		0.2764		0.2597	0.3302	0.0175	0.4339	0.1899	0.4071	0.2987
ATCC26710	0.1000	-	0.1442	0.2006		0.1608		0.2597	0.3302	0.3837	0.3183	0.3054	0.4071	0.4142
															KCTC0399BP	0.3158	0.4210	-	0.0509		0.2006		0.2507	0.2567	0.4275	0.3120	0.2310	0.2165	0.2915
PL5	0.3000	0.3000	0.7368	-		0.2764		0.2597	0.1470	0.2682	0.3183	0.2378	0.2240	0.2987
															PL4	0.1904	0.3809	0.3000	0.1904		-		0.3837	0.2682	0.2764	0.4399	0.3120	0.2987	0.3054
pLM	0.2105	0.2105	0.2222	0.2105		0.1000		-	0.3243	0.2597	0.3120	0.4142		0.1964
															ATCC32233	0.1397	0.1379	0.2143	0.4318		0.2000		0.1428	-	0.3302	0.3662	0.1256	0.3465	0.2362
ATCC60051	0.9000	0.1000	0.0769	0.2000		0.1904		0.2105	0.1379	-	0.4339	0.2738	0.2915	0.4142
															ATCC12240	0.0740	0.1481	0.1538	0.1481		0.0714		0.1538	0.1111	0.0740	-	0.3465	0.2203	0.2737
ATCC13271	0.3200	0.1600	0.2500	0.2400		0.1538		0.0833	0.4705	0.2400	0.1250	-	0.2568	0.2915
															FP-71807-S	0.0869	0.0869	0.2727	0.2680		0.1666		NC	0.1250	0.1739	0.2666	0.2142	-	0.4339
HHB-3585-SP	0.1666	0.0833	0.1739	0.1666		0.1600		0.3077	0.2424	0.0833	0.1935	0.1379	0.0740	-

                                                                  表7

                                                PvuII消化的线粒体DNA的PRLP的F值和P值

	WD1222	ATCC26710	KCTC0399BP	PL5	PL4	PLM	ATCC32233	ATCC60051	ATCC12240	ATCC13271	FP-71807-S	HHB-3585-SP
													WD1222	-	0.2507				0.2682	0.2411	0.0851	0.3567	0.2987	0.3358	0.3465
ATCC26710	0.2222	-	0.1155	0.1155	0.2987	0.2507	0.3465		0.3465		0.3243
													KCTC0399BP	NC	0.5000	-	0.0479					0.3465		0.3243
PL5	NC	0.5000	0.7500	-					0.3465
													PL4	NC	0.1666	NC	NC	-	0.1968	0.2682			0.3358
PLM	0.2000	0.2222	NC	NC	0.3070	-	0.3567	0.2682
													ATCC32233	0.2353	0.1250	NC	NC	0.2000	0.1176	-		0.2310		0.3996	0.4071
ATCC60051	0.6000	NC	NC	NC	NC	0.2000	NC	-	0.567	0.2987	0.3358	0.3465
													ATCC12240	0.1176	0.1250	0.1250	0.1250	NC	NC	0.2500	0.1176	-	0.2597	0.1010	0.1760
ATCC13271	0.1666	NC	NC	NC	0.1333	NC	NC	0.1666	0.2105	-	0.1256	0.2507
													FP-71807-S	0.1333	0.1428	0.1428	NC	NC	NC	0.0909	0.1333	0.5454	0.4706	-	0.2088
HHB-3585-SP	0.1250	NC	NC	NC	NC	NC	0.0869	0.1250	0.3478	0.2222	0.2857	-

                                                          表8

                                        共同片段的比例和相应于P值的算术平均距离

	WD1222	ATCC26710	KCTC0399BP	PL5	PL4	PLM	ATCC32233	ATCC60051	ATCC12240	ATCC13271	FP-71807-S	HHB-3585-SP
													WD1222	-	4/53	5/53	5/55	3/60	4/54	5/78	9/59	6/82	5/68	5/62	6/65
ATCC26710	0.2499	-	6/50	4/52	8/60	6/51	7/75	3/56	5/79	4/65	4/59	2/62
													KCTC0399BP	0.1636	0.0762	-	21/52	6/57	6/51	7/75	3/56	5/79	4/65	6/59	3/62
PL5	0.1766	0.1645	0.0379	-	5/59	6/51	9/77	4/58	5/81	4/67	5/61	3/64
													PL4	0.2802	0.2350	0.2393	0.2616	-	7/58	8/82	4/63	4/86	8/72	4/66	4/69
PLM	0.2755	0.2444	0.2212	0.2283	0.2284	-	4/76	4/57	5/80	4/66	2/60	6/63
													ATCC32233	0.2985	0.2791	0.2360	0.2415	0.2783	0.3490	-	5/81	10/104	14/90	5/74	8/87
ATCC60051	0.0823	0.2682	0.2980	0.2256	0.2364	0.2840	0.3121	-	3/85	6/71	6/65	4/68
													ATCC12240	0.3365	0.3163	0.3142	0.3163	0.3067	0.2475	0.2741	0.4038	-	6/94	12/88	12/91
ATCC13271	0.2443	0.2628	0.2834	0.2868	0.2744	0.2986	0.1665	0.3123	0.2914	-	10/74	4/77
													FP-71807-S	0.3301	0.2823	0.2253	0.1883	0.2336	0.1831	0.3183	0.2591	0.2613	0.2317	-	5/71
HHB-3585-SP	0.3817	0.3324	0.2498	0.2914	0.3053	0.2641	0.3025	0.3503	0.2216	0.2711	0.2978	-

实施例VII：裂蹄木层孔菌Yoo菌株KCTC 0399BP的微生物特性

研究裂蹄木层孔菌Yoo KCTC 0399BP菌株的微生物特性，此菌株被鉴定为一种重新区别于具有很大相关性的木层孔菌属的新菌株。它的子实体，无芽孢、多年生，含有半圆形菌盖的木质部分，半圆形菌盖宽约10cm，厚约4cm。在采摘时，蕈表面为深褐色，但是随着时间的流逝，表面会有许多裂隙而且颜色变深直至黑褐色，同时其子实层在颜色方面发生变化，由鲜红色变为黄褐色。子实层的菌管为带有圆形小孔的多层结构。其孢子长3-4cm，近球形，淡黄褐色。而且，有许多蒴柄和一个大小为15-30×8-10μm的壁。我们发现本发明的菌株几乎与如下记载的裂蹄木层孔菌的所有方面均相同，此裂蹄木层孔菌记载在Imazeki，R.和Hongo，T.编辑，Hoikusha Imazeki出版的“日本蕈的颜色说明”p189中，被命名为裂蹄木层孔菌Yoo。我们于1997年11月17日在韩国生物科学和生物技术研究院韩国模式培养物保藏中心保藏该新型菌株，我们得到的保藏号为KCTC 0399BP。

实施例VIII：裂蹄木层孔菌Yoo KCTC 0399BP的培养

给一种每1L蒸馏水中含有50g淀粉、胨10g和酵母提取物10g的培养肉汤补充KH₂PO₄0.8g，MgSO₄·7H₂O0.5g和CaCl₂0.3g，将其调至pH6.0，并进行高压灭菌。在5升发酵池的3.5升培养肉汤中培养裂蹄木层孔菌YooKCTC 0399BP菌丝体并在28℃下培养11天，同时，以2vvm向肉汤池中通气，并以160rpm旋转发酵池。培养5天后，得到最高的菌丝体收率(30g/l)，如附图2所示。从培养5天后的菌丝体中，多糖物质的热水提取收率为0.873％每重量单位的干燥菌丝体。

                        表9

          裂蹄木层孔菌的菌丝及多糖的产率

项目	培养5天的裂蹄木层孔菌的菌丝体
		干燥菌丝体重量(g/L)	30
干燥粗多糖重量	262
		粗多糖产率(％)	0.873

实施例IX：裂蹄木层孔菌Yoo菌株菌丝体培养物的提取

对裂蹄木层孔菌Yoo菌株的菌丝体培养物进行提取和纯化，以获得粗免疫刺激物质。首先，对280g实施例VIII中所获得的菌丝体培养物进行热水提取，然后浓缩，得到3g热水提取物。向提取物中加入乙醇至最终浓度为80％，在4℃下放置24小时，然后离心。将沉淀溶于水中，然后在10℃下用一个纤维素管(例如Nippon Junko Jun Yaku Seihing出售的)透析72小时，同时每12小时重新换一次透析液。将纤维素管中的溶液冷冻干燥，得到2.45g粗提物。

实施例X：纯免疫刺激物质的分离

通过依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析完成纯化。

首先，将实施例IX中获得的粗提物溶于5mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)，上DEAE-纤维素柱，用相同的缓冲液洗涤。将一种在相同缓冲液中的NaCl溶液作为洗脱缓冲液，其浓度梯度为0-1M。它以5mL/min的速度流过柱，每实验试管收集洗脱液15mL。通过一种苯酚-硫酸法测定洗脱部分的糖含量，通过Bradford’s法测定洗脱部分的蛋白含量。将含糖的部分上柱的顶部，此柱由多孔颗粒组成，例如市售的商品名为Toyopearl HW 65F的柱，通过凝胶过滤层析含水洗脱液进一步纯化，得到在分子量和特性方面相似的纯的活性级分。按照上述相同的方法测定其糖和蛋白的含量。如此获得的纯免疫刺激物质被命名为“PL”。

实施例XI：多糖物质的免疫刺激活性

来源于担子菌(Basidomycetes)的多糖物质对增殖或活化淋巴细胞具有积极影响，并由此增强对外在因素和甚至癌细胞的免疫，这是已知的。多糖物质的这种作用不是由直接细胞毒性产生的，而是免疫增强所造成的。因此，其优点是在体内产生很小的副作用。正是担子菌(Basidomycetes)的多糖物质导致细胞毒作用的增强和淋巴细胞、B-细胞和T-细胞形成抗体而因此显示出抗癌免疫活性。由此，通过对形成抗体淋巴细胞计数和测量T-细胞的增殖间接地证明此多糖物质具有抗癌免疫活性。

在此实施例中，通过利用形成抗体细胞的方法对B-细胞计数，通过混合淋巴细胞应答技术测定T-细胞的增殖。另外，为了检测此多糖物质对淋巴细胞增殖的作用，通过使用³H-胸腺嘧啶核苷测定新近合成的核DNA。结果显示于下表10中。

                                表10

                        各种物质的免疫刺激活性

物质	淋巴细胞增殖作用(DPM×104)	T细胞活性(DPM×104)	B细胞抗体形成(Abs576mm)
				裂蹄木层孔菌Yoo	8.4±0.5	2.5±0.1	0.66±0.01
LPS	-	-	0.81±0.23
				对照	1.6±0.5	0.5±0.05	0.00±0.00

^*每种物质的使用浓度为10μg/ml。

从表10的数据中可以明显地看出，从本发明的新的木层孔菌属菌株中提取的多糖物质在淋巴细胞增殖和T-细胞活性方面优于对照组，两者之比均大约为5倍。本发明的多糖物质具有与脂多糖相似的高的B-细胞形成抗体能力。脂多糖是非常有效的免疫抑制剂，但是由于它在体内具有严重的副作用而不能随便使用。

实施例XII：免疫刺激多糖物质的糖单位和组成

将从实施例X中获得的多糖物质进行气相色谱分析以分析其糖单位(附图4)。分别用苯酚-硫酸方法和福林-苯酚方法测定它的碳水化合物和蛋白成份。在下列条件下，在一个Hewlett Packard出售的名为“HP 5890 GC”的仪器上进行分析，此仪器装有一个熔融二氧化硅毛细管柱sp-2330(0.32mm×30m)。首先，将此柱在200℃下保持2分钟，然后以每分钟升高4℃的速度加热直至250℃，然后在250℃维持2分钟。分别将由仪器提供的检测器和注射器维持在260℃和250℃。将2mg取自实施例XI所得的每份提取级分的多糖物质用2N TFA水解，用NaBH₄还原并用无水乙酸乙酰化，得到供气相色谱分析的aditol acetate。结果显示于下表11中。

                                       表11

                            免疫活性级分的糖单位和组成

多糖提取物	碳水化合物(％)	蛋白(％)	糖单位(mol％)
						葡萄糖	甘露糖(Monnose)	半乳糖(Gatactose)
			PL	82.7	17.3				78.6	18.0	3.4

实施例XIII：免疫刺激多糖物质的结构分析

对免疫刺激多糖物质进行结构分析。

首先，用65F凝胶柱层析证实其纯度。附图5是层析结果。正如我们所看到，每种碳水化合物和蛋白成分呈现单对称峰，这说明PL是纯的。

从碳核磁共振波谱(附图6)中，PL被鉴定为一种半乳甘露葡聚糖(glactomannoglucan)，其中葡萄糖单位通过α(1→4)和β(1→6)键连接形成一个长链，甘露糖和半乳糖结合作为长链的支链。

按照组成结果的结构分析表明PL是一种在结构上与β-葡聚糖有很大差异的新的多糖。

实施例XIV：多糖物质从木层孔菌属种类的菌丝体中提取、其纯化及其免疫刺激活性。

将木层孔菌属种类的菌株包括火绒状木层孔菌、鲍姆氏木层孔菌、松木层孔菌、淡黄色木层孔菌和变黑色木层孔菌进行培养得到它们的菌丝体。从它们中提取并纯化多糖物质，然后用于诱导增强细胞毒作用和淋巴细胞、B-细胞和T-细胞形成抗体，正如实施例VIII至实施例11中所述。通过对形成抗体淋巴细胞计数和测定T-细胞的增殖间接地评价此多糖物质的抗癌免疫活性。所得结果与实施例XI中的结果相似。

实施例XV：多糖物质从木层孔菌属种类子实体中的提取、其纯化及其免疫激发活性

将木层孔菌属种类的菌株，包括火绒状木层孔菌、鲍姆氏木层孔菌、松木层孔菌、淡黄色木层孔菌和变黑色木层孔菌进行培养得到它们的子实体。从它们中提取并纯化多糖物质，然后用于诱导增强细胞毒作用和淋巴细胞、B-细胞和T-细胞形成抗体，正如实施例VIII至实施例11中所述。通过对形成抗体淋巴细胞计数和测定T-细胞的增殖间接地评价此多糖物质的抗癌免疫活性。所得结果与实施例XI中的结果相似。

实施倒XVI：根据给药时间的多糖物质抗癌细胞的治疗活性

用来源于小鼠的B16F10皮肤癌细胞测定多糖物质的抗癌活性。在补充了10％血清的RPMI 1640培养基中培养B16F10皮肤癌细胞，并且每周继代培养2次。在每只小鼠的腹膜腔中植入多如100,000的B16F10细胞。记录植入小鼠30天的存活力。对从癌细胞植入前一周至植入后12天向腹膜内给多糖物质(预治疗)的小鼠和癌细胞植入后12天向腹膜内给多糖物质(治疗后)的小鼠进行记录。结果显示于附图7中，总结于下表12中。我们看到：预治疗小鼠组平均生存力最高，其次是后治疗小鼠组，未治疗小鼠组最低。实验鼠在体重方面没有变化。

                                表12

                        多糖物质的免疫治疗

实验组(mg/kg)	平均存活力	比例(％)	第30天存活鼠的数目
				未治疗	20.8	100	0/10
预治疗(100)	29.0	139	8/10
				治疗后(100)	25.8	124	2/10

实施例XVII：随不同免疫化学治疗而变化的多糖物质抗癌细胞的活性

实验例1：随多糖物质和阿霉素不同的联合给药而变化的抗癌活性

使用B16F10皮肤癌细胞的相似的植入实验系统测定多糖物质和阿霉素联合给药的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮肤癌细胞。阿霉素在肿瘤植入12天后通过腹膜给药，而多糖物质从植入前一周至植入后12天通过腹膜给药。60天后，每天记录小鼠的生存力。使用低剂量阿霉素不会损害小鼠。

结果显示于附图8a和8b中，总结于下表13中。从资料中可以明显看到：没有用药剂治疗的小鼠生存力很低，单独用多糖物质治疗的小鼠的生存力远远优于未治疗的小鼠。在附图8a和附图8b中显示了当小鼠分别使用剂量为每公斤体重0.1mg/kg阿霉素和0.3mg/kg阿霉素时的结果。给药剂量为0.3mg/kg的小鼠的生存力明显好于给药剂量为0.1mg/kg的小鼠的生存力。在与多糖物质联合使用的情况下，阿霉素给药剂量为0.3mg/kg的小鼠的生存力也远远好于阿霉素给药剂量为0.1mg/kg的小鼠的生存力。量化表示，植入B16F10皮肤癌细胞的小鼠平均存活18.1天。单独使用多糖物质治疗时，小鼠的平均存活时间延长到31天。当单独以0.1mg/kg的给药剂量使用阿霉素时，小鼠的平均存活时间为35.4天。而当单独以0.3mg/kg的给药剂量使用阿霉素时，小鼠的平均存活时间为40.1天。如果阿霉素与多糖物质联合使用，那么小鼠的平均存活时间显著延长，由阿霉素0.1mg/kg的给药剂量下的46.9天廷长到阿霉素0.3mg/kg的给药剂量下的57.8天。实验中小鼠的体重没有减轻。

                                   表13

                    阿霉素和多糖物质联合应用的免疫治疗

实验组(mg/kg)	平均存活力	比例(％)	第60天存活鼠的数目
				未治疗	18.1	100.0	0/10
P.S.1(100)	31.0	171.3	0/10
				Am2(0.1)Am(0.1)+P.S.(100)	35.446.9	195.6259.1	0/104/10
Am(0.3)Am(0.3)+P.S.(100)	40.157.8	240.9319.3	2/109/10

¹多糖物质

²阿霉素

实验例2：随多糖物质和丝裂霉素C不同的联合给药而变化的抗癌活性

如实验例1所述，使用B16F10皮肤癌细胞的相似植入实验系统测定多糖物质和丝裂霉素C联合给药的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮肤癌细胞。丝裂霉素C在肿瘤植入12天后通过腹膜给药，而多糖物质从植入前一周至植入后12天通过腹膜给药。60天后，每天小鼠的生存力。使用低剂量丝裂霉素C不会损害小鼠。

得到与实验例1相似的结果，并总结于下表14中。从资料中可以明显看到：没有用药剂治疗的小鼠生存力很低，单独用多糖物质治疗的小鼠的生存力远远优于未治疗的小鼠。量化表示，植入B16F10皮肤癌细胞的小鼠平均存活18.1天。单独使用多糖物质治疗时，小鼠的平均存活时间延长到31天。当单独以0.2mg/kg的给药剂量使用丝裂霉素时，小鼠的平均存活时间为32.5天。而当单独以0.6mg/kg的给药剂量使用丝裂霉素C时，小鼠的平均存活时间为38.0天。如果丝裂霉素C与多糖物质联合使用，那么小鼠的平均存活时间显著延长，由丝裂霉素C0.2mg/kg的给药剂量下的43.5天延长到丝裂霉素C0.6mg/kg的给药剂量下的51.5天。实验中小鼠的体重没有减轻。

                              表14

               丝裂霉素C和多糖物质联合应用的免疫治疗

实验组(mg/kg)	平均存活力	比例(％)	第60天存活鼠的数目
				未治疗	18.1	100.0	0/10
P.S.1(100)	31.0	171.3	0/10
				M.C2(0.2)M.C(0.2)+P.S.(100)	32.543.5	179.6240.3	0/103/10
M.C(0.6)M.C(0.6)+P.S.(100)	38.051.5	209.9284.5	1/107/10

¹多糖物质

²丝裂霉素C

实验例3：随多糖物质和顺铂不同的联合给药而变化的抗癌活性

如上述实验例所述，使用B16F10皮肤癌细胞的相似植入实验系统测定多糖物质和顺铂联合给药的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮肤癌细胞。顺铂在肿瘤植入12天后通过腹膜给药，而多糖物质从植入前一周至植入后12天通过腹膜给药。60天后，每天记录小鼠的生存力。使用低剂量顺铂不会损害小鼠。

得到与上述实验例相似的结果，并总结于下表15中。从资料中可以明显看到：没有用药剂治疗的小鼠生存力很低，单独用多糖物质治疗的小鼠的生存力远远优于未治疗的小鼠。量化表示，植入B16F10皮肤癌细胞的小鼠平均存活18.1天。而单独使用多糖物质治疗时，小鼠的平均存活时间延长到31天。当单独以0.5mg/kg的给药剂量使用顺铂时，小鼠的平均存活时间为33天。而当单独以1.5mg/kg的给药剂量使用顺铂时，小鼠的平均存活时间为40.5天。如果顺铂与多糖物质联合使用，那么小鼠的平均存活时间显著延长，由顺铂0.5mg/kg的给药剂量下的44.0天延长到顺铂1.5mg/kg的给药剂量下的52.6天。实验中小鼠的体重没有减轻。

                                       表15

                        顺铂和多糖物质联合应用的免疫治疗

实验组(mg/kg)	平均存活力	比例(％)	第50天存活鼠的数目
				未治疗	18.1	100.0	0/10
P.S.1(100)	31.0	171.3	0/10
				C.P2(0.5)C.P(0.5)+P.S.(100)	33.044.0	182.3243.0	0/103/10
C.P(1.5)C.P(1.5)+P.S.(100)	40.552.6	223.8290.6	2/107/10

¹多糖物质

²顺铂

实验例4：随多糖物质和5-氟尿嘧啶不同的联合给药而变化的抗癌活性

如上述实验例所述，使用B16F10皮肤癌细胞的相似植入实验系统测定多糖物质和5-氟尿嘧啶联合给药的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮肤癌细胞。5-氟尿嘧啶在肿瘤植入12天后通过腹膜给药，而多糖物质从植入前一周至植入后12天通过腹膜给药。60天后，每天记录小鼠的生存力。使用低剂量5-氟尿嘧啶不会损害小鼠。

得到与上述实验例相似的结果，并总结于下表16中。从资料中可以明显看到：没有用药剂治疗的小鼠生存力很低，单独用多糖物质治疗的小鼠的生存力远远优于未治疗的小鼠。量化表示，当单独以1mg/kg的给药剂量使用5-氟尿嘧啶时，小鼠的平均存活时间为34.2天，而当5-氟尿嘧啶与多糖物质联合使用时，小鼠的平均存活时间为45.5天。当单独使用5-氟尿嘧啶时，3mg/kg的给药剂量可以使小鼠平均存活40.2天，而与多糖物质联合使用时，3mg/kg的给药剂量可以使小鼠平均存活54.8天。实验中小鼠的体重没有减轻。

                                表16

实验组(mg/kg)	平均存活力	比例(％)	第60天存活鼠的数目
				未治疗	18.1	100.0	0/10
P.S1.(100)	31.0	171.3	0/10
				5-FU2(1)5-FU(1)+P.S.(100)	33.044.0	187.8251.4	0/104/10
5-FU(3)5-FU(3)+P.S.(100)	40.552.6	222302.6	2/108/10

¹多糖物质

² 5-氟尿嘧啶

实施例XVIII：多糖物质对来源于人体的癌细胞的抗癌活性

应用NC1-H23(一种肺癌细胞系)检测多糖物质抗人肿瘤的活性。给裸鼠皮下植入NC1-H23肺癌细胞。在癌细胞植入后的12天里将多糖物质和阿霉素经腹膜给予裸鼠。在癌细胞植入后的第19天测量癌细胞团块的大小，然后分离癌细胞并称重。由于裸鼠缺乏T细胞，所以它们的免疫活性通常归于自然杀伤细胞和巨噬细胞的活性。因此，在给予多糖物质后所获得的免疫增强作用是通过这两类细胞而介导的。

结果显示在下面的附图9a和附图9b中，并且在表17和18中用数字进行了表示。从这些数据中可明显地看出，既没有用阿霉素也没有用多糖物质治疗的癌细胞的尺寸最大，用多糖物质治疗的癌细胞其次，而用阿霉素治疗的癌细胞最小。称重后的结果也是如此。这些实验鼠的体重没有增加或减少。

                          表17

              人癌细胞的免疫治疗(细胞大小mm³)

实验组	第14天	第17天	第18天	第19天
					未治疗	43	105	131	158
P.S1(100mg/kg)Am2(1mg/kg)	2012	3927	4034	4333

¹多糖物质

²阿霉素

                表18

         人癌细胞的免疫治疗

实验组	癌细胞终重量
		未治疗P.S1(100mg/kg)阿霉素(1mg/kg)	25911395

¹多糖物质

实施例XIX：多糖物质对鼠癌细胞转移的作用

为了实验多糖物质对癌细胞转移的抑制作用，将B16F10皮肤癌细胞种植在C57BL/6鼠的尾静脉中。在种植后的第14天，切除鼠的肺以研究是否有癌转移发生或者转移发生至何种程度。在肿瘤种植后的12天里将阿霉素经腹膜给予此鼠，同时在种植前的1周至种植后的12天里将多糖物质经腹膜给药。经静脉注射至鼠尾的B16F10皮肤癌细胞发生易位，在肺上形成黑点。结果显示在下面的附图10a和附图10b中，并且数字总结在表19中。如附图10a所示，未用任何药物治疗的鼠组中发现大约有272个癌斑点，按1mg/kg的剂量用阿霉素治疗后斑点减少至197个，按3mg/kg的剂量用阿霉素治疗后斑点进一步减少至172个。阿霉素0.1-0.3mg/kg的剂量在抑制癌细胞生长方面显示出潜在的活性，但是其1-3mg/kg的剂量抑制癌转移的作用很弱。在单独应用多糖物质治疗后，这些癌斑点的数目减少至83个。在多糖物质与阿霉素联合应用的鼠组中，当阿霉素的剂量为1mg/kg和3mg/kg时，所发现的癌斑点分别为136个和131个。因此在抑制癌转移方面多糖物质比阿霉素更有效。

                    表19

实验组	斑点数
		未治疗P.S1(100mg/kg)阿霉素(1mg/kg)阿霉素(1mg/kg)+P.S(100mg/kg)阿霉素(3mg/kg)阿霉素(3mg/kg)+P.S(100mg/kg)	27283197136172131

¹多糖物质

实施例XX：多糖物质对癌细胞的直接细胞毒作用的实验

对多糖物质的抗癌活性进行实验，以观察它是通过免疫增强作用来表达，还是通过对癌细胞的直接细胞毒作用来表达。用多糖物质和剂量为0.3-30μg/kg的阿霉素对B16F10鼠皮肤癌细胞和NC1-H23人肺癌细胞进行直接治疗。在治疗后的第2天根据sulforhodamin B方法测定尚存活的癌细胞。结果显示在下面的附图11中，数字总结在表20中。将没有用任何化学药品治疗的实验组的细胞数量表示为“100％”，用这个标准对治疗实验组的细胞数量进行比较。从此数据中可清楚地看到，阿霉素对这两类癌细胞均表现出潜在的细胞毒作用，而多糖物质并没有作用。综合来看，上面实施例中所获得的数据显示阿霉素是通过细胞毒作用来发挥抗癌活性，而多糖物质是通过免疫增强作用来表现其抗癌活性。

                                表20

                     多糖物质的直接细胞毒作用

实验组	阿霉素		多糖物质
					B16F10	NC1-H23	B16F10	NC1-H23
	未治疗0.3μg/ml1μg/ml3μg/ml10μg/ml30μg/ml	10056299-10-10	10010071397-1	1009389807877					1009389807877

实施例XXI：作为AIDS的预防和治疗辅助用药(Aid)的实验

对本发明的多糖物质进行实验，以观察其作为AIDS的预防和治疗辅助用药的可行性，并且发现它是有效的。

综合来看，实施例的数据显示，按照RFLP分析，本发明的蕈是一种与木层孔菌属的种类具有相关性的新的菌株，并且从木层孔菌属种类的菌丝体获得的多糖物质具有抗癌活性，它是通过刺激T细胞的细胞毒作用和B细胞的抗体形成能力来表现的。另外，本发明的多糖物质表现一种有效的抗癌转移的活性。结果，可刺激机体免疫的这种多糖物质在对诸如肿瘤和AIDS的免疫相关疾病的预防和治疗方面是有效的，而且因此它在生物医药工业中是非常有用的。

已对本发明进行了举例说明，并且可以认识到所用的术语是为了进行描述，而不是限制于此。

根据上面的描述，可对本发明进行许多修改和变动。因此可以认为在所附权利要求的范围内可对本发明进行实施，而不拘泥于具体的说明。

Claims (5)

1.一种菌株，裂蹄木层孔菌Yoo KCTC 0399BP，其能够产生一种免疫刺激多糖物质并且具有大小为61kb的线粒体DNA。

2.一种天然免疫刺激物质，它是从裂蹄木层孔菌Yoo KCTC 0399BP的菌丝体或子实体的培养物中提取和纯化的，该物质由18.0摩尔％的甘露糖、3.4摩尔％的半乳糖和78.6摩尔％的葡萄糖组成。

3.一种治疗癌症的药物组合物，其含有治疗有效量的从裂蹄木层孔菌Yoo KCTC 0399BP的菌丝体或子实体中获得的多糖物质，该多糖物质具有免疫刺激活性。

4.权利要求2所述的免疫刺激物质在制备免疫抗癌剂中的用途。

5.权利要求2所述的免疫刺激物质在制备免疫相关疾病的治疗辅助剂中的用途。

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