CN1678335A - 预防癌诱发或者癌转移的姬松茸提取物 - Google Patents

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Abstract

提供预防癌诱发或癌转移的食品素材。含有预防癌诱发或癌转移的成分的姬松茸提取物。所述成分是分子量为100～2000的主要层析洗脱流分，该成分是通过将姬松茸的子实体进行热水提取的步骤、透析处理所得提取液的步骤以及对所得透析外液进行层析处理的步骤制备而成的。或者所述成分是通过将姬松茸的子实体进行热水提取的步骤、向所得提取液中添加乙醇得到沉淀的步骤以及将该沉淀溶解于水中进行透析处理的步骤制备而成的透析外液。

Description

预防癌诱发或者癌转移的姬松茸提取物
技术领域
本发明涉及姬松茸提取物，该提取物含有预防癌诱发或者癌转移的成分。进一步详细地说，本发明涉及姬松茸提取物，该提取物用于预防由存在于发酵食品和酒精饮料中的尿烷(EC(氨基甲酸乙酯))、存在于烟草烟雾中的致癌物质NNK[{(4-N-甲基-N-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}]或AOM(氧化偶氮甲烷)所引发的癌，或者预防由氨基甲酸乙酯、NNK或AOM所引发的癌的转移。
背景技术
已知氨基甲酸乙酯和NNK可诱发多种癌症。
氨基甲酸乙酯对于小鼠以剂量依赖模式诱发肺癌和肝癌，计算出氨基甲酸乙酯对于人的安全剂量(虚拟安全剂量，VSD)为：肺癌1.8×10-4mg/kg体重、肝癌7.2×10-5mg/kg体重(K.Inai等、Jpn.J.CancerRes.，82，第380～385页，1991年4月)。
在妊娠和哺乳期用氨基甲酸乙酯处理过的小鼠的后代，通过胎盘传递会显著增加畸胎瘤、肺癌和卵巢囊肿的发病，并且母体的妊娠小鼠也会发生子宫内膜增生和子宫血管瘤(T.Nomura，CancerResearch，33，第1677-1683页，1973年7月)。
经口给予氨基甲酸乙酯可诱发小鼠的肺癌、淋巴瘤、肝癌、胃乳头状瘤、皮脂腺瘤、乳腺癌、肺腺癌、偏平状上皮细胞癌、白血病、间叶瘤等癌症(IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OFTHE CARSINOGENIC RISC RISK OF CHEMICALS TO MAN(国际癌症研究机构关于化学药品对人体致癌风险评估)，第7卷，111～131页，the views of two IARC Working Groups on the Evaluation of theCarcinogenic Risks of Chemicals to Man which met in Lyon(两个国际癌症研究机构的工作小组在里昂集会发表的关于化学药品对人体致癌风险评估的观察结论)，1974年2月4日～11日以及1974年6月18日～24日)。
此外，在加拿大氨基甲酸乙酯成为限制对象，因为其由酒精发酵生成，葡萄酒等酿造制品中含有一定水平的氨基甲酸乙酯(EthylCarbamate in Alcoholic Beverages and Fermented Foods(酒精类饮料和发酵食品中的氨基甲酸乙酯)，ACS Symposium Series(美国化学学会讨论会系列)第484号，Food Safety Assessment(食品安全评定)，JohnW.Finley等编，419～428页，美国化学学会，1992年；Identificationof Volatile Constituents from Grapes(葡萄挥发性成分的鉴定)，J.Agric.，Food Chem.(食品化学)，第24卷，第2号，329～331页，1976年；RATIONALE FOR THE ESTABLISHMENT OF GUIDELINES TOLIMIT ETHYL CARBAMATE LEVELS IN ALCOHOLICBEVERAGES(限制酒精类饮料中氨基甲酸乙酯的指导原则)，BUREAU OF CHEMICAL SAFETY FOOD DIRECTORATE HEALTHPROTECTION BRANCH(化学安全食品署健康保护协会)，HEALTH& WELFARE CANADA(加拿大健康与福利部)，1-8页；Ethylcarbamatein Fermented Beverages and Foods(发酵饮料和食品中的氨基甲酸乙酯)，Cornelius等，S.Ough、J.Agric.食品化学，第24卷，第2号，323～327页)。
NNK是烟草烟气中含有的潜在致癌物质之一(Djor.dijevic，M.V.等的A Comparison of selected components in the mainstream smoke ofthe leading U.S.and Japanese cigarettes(主要美国和日本烟草主流烟气中选定成分的对比)，Proceedings of the CORESTA smoke andTechnology Meeting(CORESTA烟草技术会议论文集)，200～217页，1996年，11月3日～8日)。不论男女，肺癌的发病率都显著增加。
肺癌的发病与吸烟和酒精摄食高度相关。国际癌研究所(TheInternational agency for Research on Cancer)指出吸烟量和酒精摄食量有协同增加人体发病的倾向，因而通过吸烟和酒精摄食摄入的NNK和氨基甲酸乙酯是肺癌发病的原因。
肺癌占男性癌死亡的45％、占女性癌死亡的21.5％，在美国，如今肺癌正取代心脏疾患成为吸烟者死亡的第一原因。
因此，人们希望能够找到一种食用成分，该成分可以预防因吸烟或者酒精摄食而诱发的癌症。
一般情况下，所谓姬松茸是学名为“Agaricus blazei Murill”、日本名为“カワリハラタケ(草地姬松茸)”的属于担子菌门伞菌科的蘑菇。在位于巴西圣保罗州的Piedade山区，姬松茸(以下本说明书中一般情况下称为姬松茸或ABM或蘑菇)被当作传统医药使用。据说姬松茸具有多种免疫激活活性、防癌作用、肿瘤增殖抑制作用，现在，广泛用作内服的健康食品。
姬松茸中所含的多糖有β-1、6-吡喃葡萄糖基残基，对肉瘤180具有抗肿瘤活性(Ebina T等(1986)、Jpn.J.Cancer Res.77：1034-1042)。
姬松茸提取物含有具(1→6)-β支链的(1→4)-α-D-葡聚糖，具有自然杀伤细胞激活活性和由细胞凋亡介导的选择性抗肿瘤活性(FujimiyaY等(1998)，Cancer Immunol Immunother 46：147-159)。
姬松茸中所含的肽聚糖在双种植肿瘤系统中对Meth A肿瘤细胞具有直接的细胞毒性作用，而且对肿瘤小鼠具有间接的免疫增强作用(Ebina T等(1998)，Biotherapy 11：259-265)。
姬松茸中所含的多糖类能够改变小鼠T细胞亚群中脾脏Thy1，2-、L3T4阳性细胞的比率(Mizuno M等(1998)，Biosci.Biotechnol.Biochem.62：434-437)。
这些报告表明姬松茸中含有的多糖，通过免疫调节活性对肿瘤细胞具有细胞毒性作用。
虽然有很多类似这种关于姬松茸提取物的免疫增强活性和抗肿瘤活性的报道，但是这些都是在体外进行的试验或者以患癌动物为对象进行的研究姬松茸提取物影响的试验，而不是研究姬松茸提取物对以吸烟或者饮酒这样生活习惯为主要原因诱发的肺癌、大肠癌等癌症的癌诱发过程或者癌转移过程的影响试验。据本发明者所知，没有关于食用成分对癌诱发过程或者癌转移过程的影响的报道。认为这可能是因为没有评价癌诱发过程或者癌转移过程的可靠的分析系统。
发明内容
提供能够潜在预防癌诱发或者癌转移的药品素材和食品素材。
本发明涉及能够预防癌诱发(发病)和癌诱发后的癌转移的姬松茸提取物及其中含有的食用成分。本发明者们发现，姬松茸提取物及其中含有的食用成分能够显著抑制由给予致癌物质氨基甲酸乙酯或NNK而诱发肺癌的过程中A/J小鼠的异常表达的基因或基因产物，以及能够显著抑制由给予致癌物质AOM而诱发大肠癌的过程中大鼠的异常隐窝病灶的形成，从而完成了本发明。
尽管不希望被拘泥于特定的理论，但是人们认为姬松茸提取物能够预防癌诱发和癌诱发后的癌转移是由于姬松茸提取物中含有有效成分(单数或者复数)或者是由于这些成分的协同作用，这些成分能够抑制致癌物质的活化，或者除去致癌物质代谢产生的潜在自由基，或者除去致癌物质中产生自由基的物质，或者抑制癌发病基因的表达。
本发明提供含有可预防癌诱发和癌转移成分的姬松茸提取物。本发明的一个方面涉及通过溶剂提取姬松茸来制备上述提取物。
本说明书中使用的用语“姬松茸”一般是指姬松茸原料，该原料包括学名为“Agaricus blazei Murill”、日本名为“草地姬松茸”的属于担子菌门伞菌科的蘑菇的子实体、菌丝体、培养液等。用语“姬松茸”典型的是指姬松茸的子实体。并且，以下本说明书中“姬松茸”、“ABM”和“蘑菇”可能互换使用，而且是作为描述同一种姬松茸原料的用语使用。
上述提取物最好是姬松茸经热水提取制备而成。
优选上述成分最是通过热水提取姬松茸的步骤、透析处理所得提取液的步骤、以及对所得透析外液进行层析处理的步骤制备而成的分子量为100～2000的色谱主要洗脱流分，
优选上述成分是通过用热水提取姬松茸子实体的步骤、向所得提取液中添加乙醇得到沉淀的步骤、以及将该沉淀溶解于水中后进行透析处理的步骤制备而成的透析外液。
上述癌可以是由氨基甲酸乙酯、(4-N-甲基-N-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮或者氧化偶氮甲烷诱发的癌。上述癌的代表性示例为肺癌或者大肠癌。
本发明还涉及能够预防癌诱发或者癌转移的组合物，该组合物含有上述姬松茸提取物和药学上可接受的载体。
该组合物可以是选自粉末、液体、片剂、胶囊剂和丸剂的剂型。
附图简述
图1表示本发明的姬松茸提取物预防由NNK诱发的肺癌。
图2表示本发明的姬松茸提取物剂量依赖性地预防由NNK诱发的肺癌。
图3表示本发明的姬松茸提取物抑制由给予NNK所诱导的基因或者基因产物。
图4表示本发明的姬松茸提取物剂量依赖性地抑制由给予NNK所诱导的基因或者基因产物。
图5表示本发明的姬松茸提取物预防由氨基甲酸乙酯诱发的肺癌。
图6表示本发明的姬松茸提取物抑制由给予氨基甲酸乙酯所诱导的基因或者基因产物。
图7表示本发明的姬松茸提取物预防由AOM诱发的大肠癌。
实施发明的最佳方式
本发明的姬松茸提取物是姬松茸原料经溶剂提取制备而成。姬松茸原料的代表性例子有天然或者栽培的姬松茸的子实体。也可以使用培养箱等培养的姬松茸的菌丝体。通常，将姬松茸洗净干燥后利用。市售的子实体的干燥物也可以便利地获取利用。通常，将干燥后的姬松茸用标准方法制成粉末，以此作为提取原料使用。
本发明的姬松茸提取物是在上述子实体的干燥物或其粉末中添加各种溶剂后经提取操作制备而成。一般情况下，以相对于上述干燥子实体或其粉末重量的2～10倍重量添加上述溶剂，进行提取操作。上述溶剂可以使用水、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮，1，3-丁二醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇或者这些物质的混合物。具有代表性的是用水制备姬松茸提取物。
将姬松茸粉末和任何上述溶剂的混合物，在0℃～100℃温度，优选室温～80℃的温度下，用磁力搅拌器(100～500rpm的转数)等搅拌或者振荡10分钟～数日，优选1～24小时，进行提取操作。具有代表性的例子是将去离子水添加至姬松茸粉末中，在70℃连续搅拌24小时而制得本发明的姬松茸提取物。将所得溶液用离心分离法、滤过等标准方法除去残渣后冷冻干燥。得到的粉末即为姬松茸提取物。
这样制得的姬松茸提取物中所含的预防癌诱发或癌转移的成分，可以用业内人士公知的HPLC(高效液相色谱法)等方法得到。可以用NMR法(核磁共振分析法)等方法鉴定所得成分的结构。
以下为本发明的姬松茸提取物的一个制备方法例。
往干燥子实体中添加5至10倍重量的水，加热提取或者加热回流1～3小时。该姬松茸的热水提取可以根据需要对热水提取残渣反复进行。将这样制得的热水提取液用冷冻干燥、喷雾干燥等业内人士公知的方法制成干燥物(以下称干燥物A)。将干燥物A悬浮或溶解于5～20倍容量的水中，然后将其装入透析管中，用数倍容量的蒸馏水透析10～15小时。将所得透析外液经冷冻干燥后，得到含有预防癌诱发或者癌转移成分的干燥物(以下称干燥物C)。
接下来，将透析内液进一步在流水中透析20～40小时，然后将用蒸馏水两次各数小时透析后得到的透析内液，通过与上述同样的方法制备成干燥物，得到含有预防癌诱发或者癌转移成分的姬松茸热水提取物的干燥物(以下称干燥物B)。
然后，将所得上述干燥物C溶解于约10倍重量的蒸馏水中，以蒸馏水作为洗脱溶剂进行凝胶过滤分析，每次20mL地收集大部分流分。用所收集流分的中段的主要洗脱流分，经凝胶滤过法测定分子量为100～2000的流分是本发明的预防癌诱发或者癌转移的成分。
将这些流分进一步通过用ODS(十八烷基硅烷化硅胶)进行的反相层析、用DEAE-TOYOPEAREL 650进行的离子交换层析等进行分析，确定含有精氨酸、赖氨酸、甘露醇等数种其它成分。
此外，将等量乙醇添加至上述方法所得热水提取液中混合，经离心分离处理后分成沉淀和上清液，向所得上清液中再添加其1～3倍容量的乙醇混合，再一次离心分离，将得到的沉淀溶解于蒸馏水中，对所得溶液进行透析处理，得到透析外液，该透析外液也是本发明的预防癌诱发或者癌转移的成分。
这样制备而成的姬松茸提取物或其中含有的预防癌诱发或者癌转移的成分，可以直接使用，或者与各种载体一起用于制备医药制剂。
这样制备而成的姬松茸提取物或其中含有的预防癌诱发或者癌转移的成分，通常可以与机体适宜的药学载体(例如生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖和水等)一起制成用于口服的组合物。
上述可药用载体是业内人士公知的，例如有林格溶液、汉克溶液或缓冲生理盐水等缓冲溶液；芝麻油等脂肪酸、油酸乙酯或者甘油三酯等合成脂肪酸酯；乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等糖类；来自玉米、小麦、水稻、马铃署等的植物淀粉；甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等纤维素；阿拉伯胶、西黄蓍胶等树胶；明胶、胶原等蛋白；交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐等。
如上制备而成的姬松茸提取物或其中含有的预防癌诱发或者癌转移的成分，可以单独或者与其他药剂或食品素材混合后服用。
如上制备而成的姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或者癌转移的成分以及含有该成分的组合物，可以经口给予或胃肠外给予。非经口可通过向静脉内、肌肉内、腹腔内或鼻孔内给予来实现。本发明的药学组合物的处方以及给药的详细内容可参见本领域教科书中记载的方法进行，例如“REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES(雷明顿药物科学)”(Maack出版有限公司，伊斯顿，PA)。
用于经口给予的姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或癌转移的成分，可以制成含有本领域公知的可药用载体且具有适宜摄食的给予形态的混合物制剂。这种载体能够将组合物制成适于患者摄食的片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬剂等剂型。
本发明的组合物以对预防癌诱发或转移有效的量含有姬松茸热水提取物或其中所含的预防癌诱发或转移的成分。业内人士可以充分理解和认知“对预防癌诱发或转移有效的量”的含义。“对预防癌诱发或转移有效的量”首先可通过利用细胞培养的试管内测定或者适当的动物模型评价得到。其次，利用这些资料可以决定人体摄食的有效量。“对预防癌诱发或转移有效的量”例如可以利用本说明书中记载的采用给予致癌物质NNK而诱发肺癌的A/J小鼠的试验系统来确定。
实际摄食姬松茸提取物的量依赖于应用个体的健康状态等情况，使用量最佳化，以达到所期望的效果。对业内人士来说用来决定药学或者营养学有效量的方法已是常规使用的手段。
上述姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或者癌转移的成分，可以以充分发挥其功效的量，与一种或多种选定的食品素材混合。所选定的一种或多种食品素材，以业内人士公知的形态，通常为粉末形态，与所述具有免疫激活活性的成分混合。此外，该组合物还可以根据用途或者喜好制成液体状的食品。或者制成硬胶囊、软胶囊等胶囊剂、片剂或丸剂、或者粉末状、颗粒状、茶状、茶包状或糖果等形状。
上述姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或者癌转移的成分，可以阻止由NNK或氨基甲酸乙酯诱发的肺癌及其转移。本发明是基于姬松茸提取物治疗方面的研究，该提取物以多种给予剂型对抗发酵食品中存在的致癌物质、以及烟草烟气中存在的致癌物质。参照本说明书中公示的方法或者方案，可以非常容易地证实上述姬松茸提取物或其中所含预防癌诱发或癌转移的成分在对抗由其他致癌物质诱发的癌症方面的效力。
即，采用含有不同浓度的上述姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或癌转移的成分的食物，通过检测该食物对给予致癌物质小鼠肺组织中的细胞周期蛋白D1基因的表达水平的影响，以及对肺组织中的PCNA(增殖细胞的抗原)的表达水平的影响，可以非常容易地证实预防癌诱发或癌转移的成分的有效性。
同样，采用含有不同浓度的上述姬松茸提取物或其中所含的预防癌诱发或癌转移的成分的食物，通过检测该食物是否能够阻止给予致癌物质小鼠的肺癌的发病、是否能够抑制给予致癌物质小鼠的肺组织中细胞周期蛋白D1基因的表达水平、以及是否能够抑制肺组织中PCNA(增殖细胞的抗原)的表达水平，可以非常容易地证实预防癌诱发或癌转移的成分的有效性。
下面，通过使用致癌物质氨基甲酸乙酯和NNK的实施例进一步详细地说明本发明，但以下实施例只是本发明的示例，并非是对本发明的限制。
实施例
以下举出实施例说明本发明。
(实施例1)姬松茸提取物的制备
(1)将上述干燥物A作为姬松茸热水提取物应用。该干燥物是姬松茸的干燥子实体(协和巴西蘑菇)经沸水提取、以1800×g离心分离10分钟后去除残渣、然后冷冻干燥后的产物。将该干燥物溶解于纯净水中，制备成3.7mg/ml浓度的溶液作为试料I，制备成8mg/ml浓度的溶液作为试料II。
(2)将2L蒸馏水添加至300g协和巴西蘑菇中，加热回流2小时。过滤所得溶液，分成滤液(热水提取液)和残渣。向残渣中再添加2L蒸馏水，将混合物再一次加热回流2小时进行热水提取，得到滤液。再对剩余残渣进行一次同样的热水提取。合并所得滤液后进行冷冻干燥，得到干燥物A(153g；提取率51％)。
将500ml蒸馏水添加至50g干燥物A中，将混合物装入透析管(Spectra/Por Membrane 50×31、内径8mm×长30cm、FE-0526-65)中。用3L蒸馏水将其透析12小时。所得透析外液经冷冻干燥后得到干燥物C(27g；提取率53％)。将透析内液进一步用流水透析30小时，之后用蒸馏水透析2次(每次4小时，合计8小时)，然后将透析内液冷冻干燥，得到干燥物B(11g；提取率22％)。接下来，将3g干燥物C溶解于30ml蒸馏水中，用TOYOPEARL HW 40C(内径40mm×长420mm)进行层析。洗脱溶剂全部使用蒸馏水。各段流分分别取20mL，得到流分1-30。参考这些流分的薄层色谱，将其分成以下5组。干燥重量如下。流分1～11(75mg、2.5％)、流分12～15(920mg、30.7％)、流分16～17(1570mg、52.3％)、流分18～19(270mg、9％)、流分20～28(97mg、3.2％)。
流分16(以下称作1SY-16)的红外线吸收光谱(IR)数据如下。流分16：IR(KBr)3390、3325、3285、2940、2920、1641、1634、1622、1615、1600、1595、1405、1394、1084、1020；分子量(凝胶过滤法)100～2000。
(3)实施与上述(2)项同样的热水提取，合并后得滤液(热水提取液)6L。将该滤液减压浓缩成1L，向其中添加1L乙醇并混合，离心分离得到沉淀和上清液。向该上清液中再次加入3L乙醇并混合，然后离心分离，将所得沉淀溶解于蒸馏水中，进行透析处理。所得透析外液经冷冻干燥后得到粉末(以下称作ABMK22)。
(实施例2)应用姬松茸提取物预防由NNK诱发的肺癌
将50只A/J小鼠(雄性，7周龄)按每组10只分成5组，分别为给予实施例1中记载的试料I、试料II、ABMK22和1SY16的试验组以及对照组。各组小鼠采用一次性管饲法(强饲法)，每1kg小鼠体重给予4mg的NNK。这里给予小鼠的NNK量，若换算成人体，则相当于每天吸1箱烟连续吸100年(Djor.dijevic，M.V.等的AComparison of selected components in the mainstream smoke of theleading U.S.and Japanese cigarettes(主要美国和日本烟草主流烟气中选定成分的对比)，Proceedings of the CORESTA smoke and TechnologyMeeting(CORESTA烟草技术会议论文集)，200～217页，1996年，11月3日～8日)。
接下来，将姬松茸提取物用下述方法给予各组小鼠。
对照组：让小鼠自由摄食常规饮用水。
试料I组：让小鼠自由摄食含有30％(v/v)试料I的饮用水16周。
试料II组：让小鼠自由摄食含有60％(v/v)试料II的饮用水16周。
上述各组小鼠各饮用水的平均摄食量为5ml/只/日。
ABMK22组：将ABMK22以100mg/kg体重的剂量，用管饲法给予七天。
1SY16组：将1SY16以100mg/kg体重的剂量，用管饲法给予七天。
将各组小鼠在给予NNK 16周后处死并解剖，用解剖显微镜检查肺癌的发病率。结果如图1所示。图1所示图表的横轴代表各试验组，纵轴代表肺癌的发病率(对照组癌症发病率为100％时各组小鼠的癌症发病率)。
如图1所示，姬松茸提取物与对照组相比，能够显著降低肺癌的发病率(与对照组相比，试料I的P＜0.05，试料II的P＜0.01，两者有显著差异。图1中分别用*和**表示)。并且，姬松茸提取物中的成分ABMK22和1SY16，与姬松茸提取物相比可以进一步降低肺癌的发病率(与对照组相比，AMBK22的P＜0.01，1SY16的P＜0.001，两者有显著差异。图1中分别用**和***表示)。若用抑制率(100-发病率)表示试验结果，则试料I、试料II、ABMK22及1SY16的肺癌抑制率如图1所示，分别为约30％、约35％、约50％、约82％。
上述结果表明：摄食或者给予姬松茸提取物及其中所含的成分，能够抑制由NNK诱发的癌的发病。
(实施例3)应用姬松茸提取物预防由NNK诱发的肺癌
设置对照组和3个试验组，使各试验组自由摄食分别含有15％(v/v)、30％(v/v)和60％(v/v)浓度上述试料II的饮用水。与实施2一样给予NNK诱发肺癌。同实施2一样，将各试验组小鼠在给予NNK的16周后处死并解剖，用解剖显微镜检查肺癌的发病率。结果如图2所示。图2所示图表的横轴代表各试验组、纵轴代表肺癌发病率(对照组癌症发病率为100％时各组小鼠的癌症发病率)。
如图2所示，姬松茸提取物与对照组相比，能够显著降低肺癌的发病率(与对照组相比，自由摄食分别含有15％(v/v)和30％(v/v)试料II的饮用水的组P＜0.05，自由摄食含有60％(v/v)试料II的饮用水的组P＜0.01，两者有显著差异。图1中分别用*和**表示)。
上述结果表明：摄食姬松茸提取物及其中所含的成分，能够剂量依赖性地抑制由NNK诱发的癌的发病。
(实施例4)应用姬松茸提取物抑制由给予NNK所诱导的基因或基因产物
除未设置上述给予试料II的试验组外，与实施例2一样将A/J小鼠分组，同实施例2一样给予上述试料I、ABMK22和1SY16。与实施例2一样，将各组小鼠在给予NNK的16周后处死。检查肺组织中细胞周期蛋白D1的表达、增殖细胞核抗原(PCNA)及依赖于细胞周期蛋白的激酶4(CDK4)的表达。细胞周期蛋白D1、PCNA和CDK4用2000年4月15日第91次癌学会发表论文的第5313号：I.P.Lee，Pulmonary cyclin D1-induction by Fumonisin B1 in Female A/J mice(福莫尼新B1引起的雌性A/J小鼠肺组织中的细胞周期蛋白D1)中记载方法测定。
通常，增殖细胞具有由分裂期(M期)和分裂间期(G1期、S期及G2期)组成的细胞周期。DNA合成在分裂间期的一部分(S期)进行。S期成倍增加的遗传信息在M期等分后细胞被复制。
CDK4是控制细胞周期进行的蛋白磷酸化酶家族中的一员，换言之，是细胞周期进行的发动机。细胞周期蛋白D1与CDK4结合，具有促进G1期细胞向S期转变的作用。换句话说，细胞周期蛋白D1作为CDK4的调节因子起到了相当于加速器的作用。PCNA是促进细胞周期向S期转变的DNA聚合酶δ的亚基，它也相当于细胞周期转化的发动机。这些蛋白的异常表达可诱发癌，所以编码这些蛋白的基因被称为癌基因。通过分析这些基因产物，可以评判是否处于癌诱发过程。
图3表示各组A/J小鼠的肺组织中PCNA、细胞周期蛋白D1和CDK4的测定结果。图3的右侧为将各组的肺组织试样进行电泳时显现的PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带。电泳带的浓淡表示表达水平的强弱。如图3右侧所示，对照组中PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带都很浓，表明这些蛋白被高水平异常表达，诱导癌症的发病。但是，给予试料I、ABMK22及1SY16的试验组，PCNA及细胞周期蛋白D1的电泳带薄，显示这些蛋白没有被异常表达。图3的左侧是将各组的测定结果定量用立方图表示。纵轴为对照组表达量为100％时的表达量，横轴表示测定的PCNA、细胞周期蛋白D1、CDK4，各测定项中的4个立方图，从左到右依次分别为对照组、试料I组、ABMK22组和1SY16组。如图所示，试料I组、ABMK22组和1SY16组中，PCNA和细胞周期蛋白D1的表达水平约为对照组表达水平的10％以下(统计学上有显著差异，P＜0.01)。
上述结果表明：摄食或者给予姬松茸提取物及其中所含的成分，能够抑制由NNK诱导的癌基因的表达。
(实施例5)应用姬松茸提取物抑制由给予NNK所诱导的基因或者基因产物。
除设置自由摄食分别含有15、30和60％(v/v)试料II的饮用水的试验组外，与实施例4一样，检查肺组织中细胞周期蛋白D1、增殖细胞核抗原(PCNA)和依赖于细胞周期蛋白的激酶4(CDK4)的表达。
图4表示各组小鼠中PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的测定结果。图4的右侧为各组的肺组织试样进行电泳时显现的PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带。电泳带的浓淡表示表达水平的强弱。如图4右侧所示，对照组中PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带都很浓，表明这些蛋白被高水平异常表达，诱导癌症的发病。但是，给予分别含有15、30和60％(v/v)试料II的饮用水的组中，试料II的浓度越高，各表达蛋白的电泳带颜色越淡，表明试料II浓度依赖性地抑制这些蛋白的异常表达。图4的左侧是将各组的测定结果定量用立方图表示。纵轴为对照组表达量为100％时的表达量，横轴为测定的PCNA、细胞周期蛋白D1和CDK4，各测定项中的4个立方图，从左至右依次分别表示对照组、摄食含有15、30和60％试料II的饮用水的组中小鼠的测定结果。如图所示，试料II浓度依赖性地抑制这些蛋白的异常表达(摄食含有15、30和60％试料II的饮用水的组中的细胞周期蛋白D1和PCNA表达，与对照组的细胞周期蛋白D1的PCNA表达相比，统计学上有显著差异，P＜0.01)。
上述结果表明：摄食或者给予姬松茸提取物及其中所含的成分，能够浓度依赖性地抑制由NNK所诱导的癌基因的表达。
(实施例6)应用姬松茸提取物预防由氨基甲酸乙酯诱发的肺癌。
设置自由摄食含有30％(v/v)上述试料I及30％(v/v)上述试料II的饮用水的组，设置与实施例2一样给予ABMK22的组，并且不用NNK，而是对各组小鼠通过一次性管饲法给予相当于人体氨基甲酸乙酯曝露水平约20,000倍的氨基甲酸乙酯(250mg/kg小鼠体重)，除此之外，与实施例2一样进行。
与实施例2一样，将各试验组小鼠在给予氨基甲酸乙酯的16周后处死并解剖，用解剖显微镜检查肺癌的发病率。结果图5所示。图5所示图表的横轴代表各试验组，纵轴代表肺癌的发生率(对照组癌症发病率为100％时各组小鼠的癌症发病率)。
如图5所示，姬松茸提取物与对照组相比，能够显著降低肺癌的发病率(与对照组相比，试料I的P＜0.05，试料II的P＜0.01，两者有显著差异。图5中分别用*和**表示)。并且，姬松茸提取物中的成分ABMK22与姬松茸提取物相比，可以进一步降低肺癌的发病率(与对照组相比有显著差异，P＜0.001。图5中用***表示)。若用抑制率(100-发病率)表示试验结果，则试料I、试料II和ABMK22的肺癌抑制率如图5所示，分别为约30％、约60％和约82％。
上述结果表明：摄食或者给予姬松茸提取物及其中所含的成分，能够抑制由NNK诱发的癌的发病。
(实施例7)应用姬松茸提取物抑制由给予氨基甲酸乙酯所诱导的基因或基因产物
设置自由摄食含有30％(v/v)上述试料I及30％(v/v)上述试料II的饮用水的组，设置与实施例2一样给予ABMK22的组，并且不用NNK，而是对各组小鼠通过一次性管饲法给予相当于人体氨基甲酸乙酯曝露水平约20,000倍的氨基甲酸乙酯(250mg/kg小鼠体重)，除此之外，与实施例2一样进行。
与实施例4一样，检查各组肺组织中细胞周期蛋白D1的表达、增殖细胞核抗原(PCNA)及依赖于细胞周期蛋白的激酶4(CDK4)的表达。
图6表示各组A/J小鼠中PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的测定结果。图6的右侧为各组的肺组织试样进行电泳时显现的PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带。电泳带的浓淡表示表达水平的强弱。如图6右侧所示，对照组中PCNA、细胞周期蛋白D1及CDK4的电泳带都很浓，表明这些蛋白被高水平异常表达，诱导癌症的发病。但是，摄食含有试料I、试料II的饮用水的组以及给予ABMK22的组，其各自的电泳带与对照组相比颜色都较淡，表明这些基因的异常表达受到抑制。图6的左侧是将各组的测定结果定量用立方图表示。纵轴为对照组表达量为100％时的表达量，横轴表示测定的PCNA、细胞周期蛋白D1和CDK4，各测定项中的4个立方图，从左到右依次分别为对照组、给予试料II的组、给予试料I的组以及给予ABMK22的组中小鼠试验的测定结果。如图所示，特别是ABMK22显示能够抑制这些基因的异常表达(统计学上有显著差异，P＜0.05)。
上述结果表明：摄食或者给予姬松茸提取物，能够抑制由氨基甲酸乙酯诱导的癌基因的表达。
(实施例8)应用姬松茸提取物预防由AOM诱导的大鼠结肠癌
已知氧化偶氮甲烷(AOM)是诱发大肠癌、形成异常隐窝病灶(aberrant crypt foci(ACF))的致癌物质(Carcinogenesis 21(6)：1149-1155、2000)。在小鼠和大鼠由AOM诱导的结肠癌中，可以发现β-连环蛋白基因发生突变(Takahashi M.等，Carcinogenesis，21：1117-1120，2000)。在异型增生的ACF中可以检测出β-连环蛋白的变异细胞定位和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)两者表达增多，但是在增生的ACF中没有发现这种情况。(Takahashi M.等，Carcinogenesis，21：1319-1327、2000)。因此，由AOM诱导的大鼠或者小鼠中的ACF可以作为试验系统，用来评价癌诱发过程或者癌转移过程。
用由AOM诱导的ACF作为试验系统，评价姬松茸提取物中所含的成分是否能够预防癌的诱发。
与实施例2一样，将30只大鼠(雌性，8-9周龄)按每组10只分成3组，分别是给予1SY16的组(120mg/kg体重及60mg/kg体重)和对照组。对各组大鼠一周内二次皮下注射AOM，每1kg大鼠体重注射15mg的AOM。
接下来，如下所述给予各组大鼠姬松茸提取物。将1SY16溶解为0.1％羧甲基纤维素溶液，以体重的0.5％的用量给予。给予次数为每周二次，连续4周。
120 1SY16组：将1SY16以120mg/kg体重的剂量，通过管饲法给予。
60 1SY16组：将1SY16以60mg/kg体重的剂量，通过管饲法给予。
对照组：将羧甲基纤维素以体重的0.5％的用量，通过管饲法给予。
将各组大鼠在给予AOM的13周后处死并解剖，用解剖显微镜检查ACF数量。结果如图7所示。图7所示图中横轴代表各试验组、纵轴为每只大鼠产生ACF个数的平均值。
如图7所示，1SY16与对照组相比，能够显著降低ACF的产生数量(P＜0.05，有显著差异。图7中用*表示)。若用抑制率表示试验结果，与对照组相比，给予60mg/kg体重及120mg/kg体重的1SY16的组中大肠癌发病的抑制率分别为72％、82.5％，显示摄食或者给予1SY16能够抑制由AOM诱发的癌的发病。
如上所述，摄食或者给予姬松茸提取物或其中所含的成分，可以浓度依赖性地抑制由给予NNK和氨基甲酸乙酯所诱导的增多的基因或基因产物表达，所以认为姬松茸提取物中含有特定成分(单数或者复数)，该成分可抑制由致癌物质诱导的癌症的发病。
产业实用性
提供能够潜在地预防癌诱发或癌转移的药品素材和食品素材。进一步详细地说，提供药品素材和食品素材，该素材能够预防由以肺为靶器官的致癌物质所诱发的肺癌的发病以及由此所引起的癌转移。

Claims (11)

1.姬松茸提取物，该提取物含有预防癌诱发或癌转移的成分。
2.权利要求1的提取物，该提取物通过溶剂提取制备而成。
3.权利要求2的提取物，该提取物通过热水提取制备而成。
4.权利要求1的提取物，其中所述成分是分子量为100～2000的主要层析洗脱流分，该成分是通过将姬松茸的子实体进行热水提取的步骤、透析处理所得提取液的步骤、以及对所得透析外液进行层析处理的步骤制备而成的。
5.权利要求1的提取物，其中所述成分是通过将姬松茸的子实体进行热水提取的步骤、向所得提取液中添加乙醇得到沉淀的步骤、以及将该沉淀溶解于水中进行透析处理的步骤制备而成的透析外液。
6.权利要求1的提取物，其中所述癌由氨基甲酸乙酯、(4-N-甲基-N-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮或氧化偶氮甲烷诱导产生。
7.权利要求1的提取物，其中所述癌为肺癌。
8.权利要求1的提取物，其中所述癌为大肠癌。
9.一种预防癌诱发或癌转移的组合物，该组合物含有姬松茸提取物和药学上可接受的载体。
10.权利要求9的组合物，该组合物形态选自粉末、液体、片剂、胶囊剂和丸剂。
11.姬松茸提取物用于制备预防癌诱发或癌转移的组合物的用途。
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