WO2000032212A1

WO2000032212A1 - Potentialisateur de l'activite lak obtenu a partir d'un extrait d'hypes du champignon shiitake, et preparations de potentialisation de l'activite lak contenant ledit potentialisateur

Info

Publication number: WO2000032212A1
Application number: PCT/JP1999/006616
Authority: WO
Inventors: Kenji Asano; Yukiko Matsuda; Yutaka Tajima
Original assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd.; Nagaoka, Hitoshi
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2000-06-08
Also published as: HK1042651A1; HK1042651B; TW200422049A; TWI224006B; HK1041435A1; GB2359561B; US6919081B1; GB2359561A; GB0113000D0; KR20010101065A; CN1332633A; CN1171630C

Description

菌糸体抽出物由来の L AK活性増強物質およびこれを含む L AK活性増強用製剤技術分野

本発明は、免疫の分野に関する。本発明は、免疫活性を高める物質およびこれを利用する治療製剤に関し、さらに詳しく述べれば、 L AK活性増強に有用な物資およびそれを利用する L AK活性増強用製剤に関する。背景技術

生体の防御機構としての免疫機構としては、細胞性免疫と体液性免疫とがある。体液性免疫は、抗体が関与して発現する免疫反応をいう。細胞性免疫は細胞が直接標的に作用して発現される免疫反応をいう。

この細胞性免疫反応の担い手は主としてリンパ球であり、抗原は細胞上の物質であることが多い。細胞性免疫は、腫瘍、細胞内寄生体、ウィルスに対する免疫反応、移植、ある種の薬物アレルギー、一部の自己免疫疾患にも関与していると考えられている。一般には、特異的な反応が多いが、非特異的に作用するものもある。

例えば、腫瘍免疫学においては、腫瘍細胞が腫瘍抗原を有することが知られている。即ち、腫瘍細胞に特異な抗原（TSA： Tumor Specific Antigen) 、または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA： Tumor Associated Antigen) の存在がわかっている。

このような腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法が一般的に用いられており、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は正常細胞よりも N K (ナチュラルキラー）細胞の方が高く、また N K細胞の活性も免疫療法により増強されることが知られている。 N K細胞は正常個体中にも存在する細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウィルス感染細胞等に対して MH C抗原に拘束されずに障害活性を示すことが知られているが、最近では、 N K細胞でも殺傷し得ない腫瘍細胞の存在も明らかとなった。

米国 N C Iの S . Rosenbergは、末梢リンパ球をインターロイキン 2 (IL-2) と共に培養すると、自家ガンを含む広い範囲の標的ガン細胞に対して細胞障害性を示すキラー細胞を誘導することができ、このキラー細胞によれば NK細胞では殺傷不可能なガン細胞をも殺傷することができることを発見した（特開昭 62- 116518号参照）。このキラー細胞は、リンホカイン活性化キラ一細胞（L AK 細胞、 Lymphokine Activated Killer Cell) と命名された。 LAK細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、 NK細胞系やキラー T細胞系の細胞集団であることが知られている。

近年は、患者由来の末梢リンパ球を細胞培養系中で IL-2を用いて活性化した後、抗腫瘍活性を示す LAK細胞を再び患者体内に移入する、養子免疫の方法が試みられている（LAK療法）。このような L AK細胞の繰り返し投与により末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。しかしながら、 I L— 2を使用した L AK療法には、多量の白血球を分離することによる肉体的負担、分離した白血球細胞を大量培養したり高価な I L— 2を使用したりするための経済的負担が大きいことなど、種々の問題点がある。また、 I L _ 2投与により重篤な副作用が伴うことが多い。

具体的には、 IL-2を用いた LAK養子免疫療法を行う場合、全身倦怠、悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加などの症状を副作用として生じ、これらの副作用は IL-2 を単独で用いた場合よりも強いことが知られている。さらに注目すべきは、重大ないくつかの副作用の発現に、 L AK細胞の正常細胞に対する傷害活性が関与している可能性が高いことである。このような LAK細胞による造血幹細胞傷害により、貧血や血小板減少が生じるほか、リンパ球、マクロファ一ジゃ血管内皮細胞に対する in vitro傷害も生じることも報告されている。また、 I L一 2は経口投与による吸収が悪く、現在のところ、直接投与に際しては注射投与が主流である。そこで、このような欠点を補う物質、特に I L— 2を用いることなくリンパ球の L AK活性を増強することのできる物質、あるいはそうした物質を含む薬剤の開発が望まれている。

抗癌剤は一般に癌細胞の異常な増殖性を標的としており、阻害対象により分類すれば、核酸合成阻害剤として、例えばアルキル化剤、核酸合成基質アナログ、抗生物質、ステロイドホルモン等があり、有糸分裂阻害剤として植物アル力ロイド等がある。

しかしながら、これらの抗癌剤は、同時に増殖性の正常細胞である骨髄、胃腸管上皮、毛嚢に対して著しい副作用を示す。即ち、投与形態に拘わらず、一般的な症状として、悪心、嘔吐、口腔および小腸の潰瘍、下痢、脱毛、血液の有効成分産生の低下をきたす骨髄抑制等を引き起こす。

従来から、細菌類あるいは食品等が抗癌作用を有することが知られている。これらの抗癌作用を有する細菌類あるいは食品等は副作用が少なく安全であることから、これらの細菌類あるいは食品等からの抗癌作用物質の探索が試みられてきた。これまでに細菌類により癌を制圧しょうとする多くの試みが行われており、例えばセラチア菌と溶連菌の培養濾液を用いた Coley's トキシン（1964) 、 BCGによる白血病治療（Mathe, G.， Adv. Cancer Res., 14， 1, 1971) およびモルモットにおける癌腫瘤の退縮（Zbar， B.,et al., J. Natl. Cancerlnst., 48, 831, 1971) 、および酵母壁多糖体の投与によるサルコ一マ 180等の移植癌に対する有効性等が報告されている。

特に、多糖体に関しては、酵母ダルカン、酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担子菌類の多糖体における抗癌効果について多くの研究が行われてきた。これらのうちで抗癌免疫増強薬として現在市販されているものとしては、担子菌類のサルノコシカケ科の力ワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン（呉羽化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）およびシィタケ多糖体のレンチナン並びにスェヒロ夕ケ多糖体などがある。

また、シィタケ（Lentinus edodes) は日本並びに中国を代表する食用キノコであって日本では約 300年も前から人工栽培が行われてきたが、その薬理効果並びに薬効成分が最近解明されつつあり、例えば、ラット 'マウスにおける大腸および肝臓等の移植腫瘍細胞の増殖抑制効果（Sugano, N, et al.， Cancer Letter, 27: 1, 1985；鈴木康将ら、日本大腸肛門病会誌、 43: 178、 1990) およびマイトジェン効果（Tabata, T. et al.， Immunopharmacology, 24: 57, 1992； Hibino, et al., Immunopharmacology, 28: 77, 1994) などが報告されている。発明の開示

本発明者らは、副作用が少なくて安価に入手可能な免疫療法剤を提供すべく、シィタケの持つ免疫賦活活性、抗腫瘍活性および Zまたは抗癌活性に着目した。本発明者らは、シィタケの食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並びに抗腫瘍活性およびノまたは抗癌活性があることを見いだし、しかも当該抽出物が、 L AK活性増強活性を有することを見いだして、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の第 1の側面によれば、シィタケ菌糸体抽出物を含有する L AK 活性増強物質が提供される。

「； L AK活性」とは、 NK活性を担うリンパ球では認識できない腫瘍を攻撃でき、かつ自己の正常細胞にはほとんど影響を与えない細胞障害性 Tリンパ球の示す活性を意味する。「： L AK活性増強」とは、こうした L AK活性を強めることであり、直接的あるいは間接的にリンパ球から L AK細胞を誘導するあるいはすでに存在する L AK細胞の活性をさらに高めること等を意味する。

L AK活性を増強することで、 L AK細胞の抗腫瘍活性を高めることができるが、これは細胞性免疫系の向上を導く。したがって、抗腫瘍活性の向上を期待する治療以外にも、免疫系の向上を目的とする治療に用いることができる。

本発明の L AK活性増強物質を、末梢血由来のリンパ球に作用させることにより L AK活性を増強させてもよい。末梢血由来のリンパ球に直接作用させてもよく、その場合には、シィタケ菌糸体抽出物の濃度が約 1 0 ⁶個のリンパ球に対して 1 g以上あるいは末梢血 l m 1に対して 1 g以上であることが好ましい。本発明の L AK活性増強物質は、 I L一 2の代わりに L AK療法に使用してもよレ^

本発明の L A K活性増強物質は、シィ夕ケ菌糸体抽出物そのものであってもよく、あるいはシィタケ菌糸体抽出物以外の物質をさらに含んでもよい。シィタケ菌糸体抽出物の L AK活性増強を損なわない範囲であれば、任意の物質を含むことができる。

本発明の L A K活性増強物質は、免疫賦活活性並びに抗腫瘍活性およびノまたは抗癌活性を有する他の物質等と混合して併用してもよい。

本発明の第 2の側面によれば、シィタケの菌糸体抽出物を含む L AK活性増強物質を含有する L A K活性増強用製剤が提供される。

本発明の L AK活性増強用製剤は、シィタケ菌糸体抽出物そのものであってもよく、あるいは、シィタケの菌糸体抽出物を含む L AK活性増強物質および薬学上許容可能な担体を含有する医薬または獣医薬用の製剤であってもよい。

本発明の L AK活性増強用製剤は、経口投与用であってもよく、あるいは注射または経皮投与用であってもよい。

本発明の L AK活性増強用製剤は、食品、飲料、または飼料であってもよい。本発明の L AK活性増強用製剤は、腫瘍および Zまたは癌の治療に用いてもよレ^ 本発明の L AK活性増強用製剤は、 L AK細胞を誘導するものであるから、特定の腫瘍細胞を特異的に傷害するものではなく、上皮性、非上皮性を問わず各種腫瘍の治療に対して使用することができる.

また、腫瘍や癌以外の治療に用いてもよく、例えば、免疫系の向上を目的とする治療に用いることができる。具体的には、放射線照射等の免疫系低下を生じる治療や事故、あるいは自己免疫疾患、感染症等により免疫系が低下している状態を改善するために用いることができる。

本発明の L AK活性増強用製剤は、各種疾病の予防薬として使用することもできる。例えば、腫瘍および Zまたは癌を予防するため、あるい細菌またはウィルス性の感染症を予防するために投与してもよい。

さらに、本発明の L AK活性増強製剤は、例えば、免疫賦活剤等の抗腫瘍剤および Zまたは抗癌剤、抗生剤、鎮痛剤、抗炎症剤等の他の薬剤と混合して併用してもよい。

本発明の第 3の側面によれば、こうした L AK活性増強用製剤の有効量を投与する、腫瘍および/または癌の治療方法が提供される。さらに、本発明の腫瘍および/または癌の治療方法は、例えば、他の薬剤治療方法、外科的処置、放射線照射、温熱療法等の他の治療方法と併用してもよい。本発明の第 4の側面によれば、腫瘍および/または癌の治療に用いる医薬品を得るための、 L AK活性増強用物質の使用が提供される。

腫瘍および Zまたは癌の治療に用いる医薬品を得るために、本発明の L AK活性増強用物質を、免疫賦活活性並びに抗腫瘍活性および/または抗癌活性を有する他の物質と混合して使用してもよい。図面の簡単な説明

図 1は、シィタケ菌糸体抽出物を末梢血に直接添加した場合の L AK活性の増強効果を I L一 2と比較した棒グラフである。

図 2は、シィタケ菌糸体抽出物を末梢血に直接添加した場合の、シィタケ菌糸体抽出物の濃度変化に伴う L AK活性の変化を示す棒グラフである。

図 3は、クレスチンを末梢血に直接添加した場合の L A K活性を示す棒グラフである。

図 4は、シィタケ菌糸体抽出物を経口投与する前と後の末梢リンパ球の L AK 活性を示す棒グラフである。発明を実施するための好ましい形態

本発明による、 L AK活性増強物質に含まれるシイタケ菌体抽出物とは、シィタケ菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、分解して得られる抽出物を言う。

シィタケ菌糸体抽出物は、好ましくは以下の方法により得られたものを使用するが、特にこれに限定されるものではない。

即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシィ夕ケ菌を接種し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体培地を 1 2メッシュ通過分が約 3 0重量％以下となるように解束する。

この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテア一ゼまたはダルコシダーゼから選択される酵素 1種またはそれ以上を約 3 0〜5 5 °Cの温度に保ちながら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくとも 70重量％以上が 12メッシュ通過分であるようにする。次に 80〜100°Cまでの温度に加熱することにより酵素を失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過することによりシィタケ菌糸体抽出物を得る。

得られたシィタケ菌糸体抽出物を、そのまま本発明の L A K活性増強物質あるいは LAK活性増強用製剤に用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特異な味と匂いを有する。

こうして得られたシィタケ菌糸体抽出物を含む LAK活性増強物質（シィ夕ケ菌糸体抽出物そのままでもよい）を、治療対象の腫瘍免疫活性増強のために、 LAK療法において I L_ 2の代わりに使用してもよい。

LAK療法は、一般には、治療対象から得たリンパ球を I L一 2と共に組織培養してリンパ球から LAK細胞を誘導し、そして治療対象の体内に戻す工程からなる。治療対象に戻す工程において I L一 2を併用投与（直接投与）する場合もある。

本発明のシィ夕ケ菌糸体抽出物を含有する L AK活性増強物質は、治療対象 (患者、患畜等）のリンパ球と共に組織培養して LAK細胞を誘導することも可能であり、培養したリンパ球を治療対象に戻す工程において治療対象に併用投与 (直接投与）することも可能である。他の抗腫瘍剤および/または抗癌剤と併用しても支障はない。

本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含有する LAK活性増強物質は、そのまま治療対象から採取した末梢血に対して直接添加してもよいが、添加の前にアセトンによる無菌処理を行うことが好ましい。

本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含有する LAK活性増強物質を、治療対象から採取した末梢血に直接添加する際の濃度は、好ましくはシィタケ菌糸体抽出物として 1 g/10⁶リンパ球〜 lmgZl 0⁶リンパ球であり、さらに好ましくは 10 /X g/ 10⁶リンパ球〜 100 gZ 10⁶リンパ球であり、特に好ましくは 10 gZ 10⁶リンパ球〜 50 μ gZ 1 0⁶リンパ球である。末梢血 1 P m lに対する投与量は、末梢血中のリンパ球の割合などにも影響される力おおよそ、 l z g〜2 . 5 m g、好ましくは 1 0 g〜2 5 0 g、さらに好ましくは、 1 0 g〜 1 2 5 gである。

本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含有する L AK活性増強物質を含有する L AK活性増強用製剤は、治療対象の腫瘍免疫活性増強のために、治療対象に直接投与することにより、 I L一 2を用いた L AK療法に匹敵する効果を提供できる。治療対象である患者あるいは患畜等に直接投与することで、治療対象の L AK 細胞を誘導できれば、多量の白血球分離に対する肉体的負担や、大量培養に関する経済的負担を軽減することができる。さらには、治療対象から血液を分離してから戻すまでの汚染の危険性も軽減できる。

本発明の L AK活性増強用製剤の投与方法としては、治療対象に対する負担などを考慮すると、経口投与が最も好ましいが、特にこれに限定されない。血管内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与等の注射投与の他、経皮投与、経鼻投与、経腸投与なども可能である。

本発明の L AK活性増強用製剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、粉薬、溶液剤、シロップ剤、注射剤、クリーム、軟膏、貼薬、スプレー、座薬等が例示されるが、これらに限定されない。

本発明の L AK活性増強用製剤に任意に混合可能な薬学上許容できる担体としては、当業界において公知の賦形剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース等）、結合剤（デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（デンプン、カルポキシメチルセルロースカルシウム、カルポキシメチルスターチ等）、滑沢剤（タルク、ステアリン酸塩等）、コーテイング剤（白糖、タルク、ゼラチン等）等があり、さらに各種の光沢化剤、着香剤、着色剤、矯味剤、溶解補助剤、安定化剤、懸濁剤、吸収促進剤等を目的に応じて加えてもよいが、これらに限定されない。また、注射剤として使用する場合には、この分野において慣用されている各種希釈剤（例えば、水、ェチルアルコール等）を使用できる。

本発明の L AK活性増強用製剤の投与ルート、投与量、投与回数等は、治療対象の年齢、体重、症状等を考慮して決定される。本発明の L AK活性増強用製剤に含まれるシィタケ菌糸体抽出物は、古くから食品として使用されてきたものであり、極めて安全である。したがって、投与量を厳しく制限する必要はないが、通常はシィタケ菌糸体抽出物粉末に換算して、 1日 2〜3回程度に分けて 1回 100mg〜l 0000mg、さらに好ましくは 1日 3回に分けて 1回 500mg〜5000mg、特に好ましくは 1日 3回に分けて 1回 1000mg〜l 50 Omgである。さらに、他の薬剤、例えば、他の免疫賦活剤等の抗腫瘍剤および/または抗癌剤、抗生剤、鎮痛剤、抗炎症剤等と併用して投与しても支障はない。

本発明の LAK活性増強用製剤は、食品の形で提供することもできる。好ましい食品の形態としては、粉末、顆粒、ペースト状、ゼリー状などが挙げられる。さらに顆粒等する場合には、甘味を加えるため、乳糖などの糖類を加えることが望ましい。また、本発明の LAK活性増強用製剤は、飲料の形で提供することもできる。このような食品または飲料には、シィタケ菌糸体抽出物の他に、ビタミン剤、カルシウムなどの無機成分、アルコール類、ポリフエノールなどの消臭成分などを追加してもよい。この食品または飲料は、特定保健用食品、病者用食品等の範疇にあるものでもかまわない。

本発明の LAK活性増強用製剤は、飼料としてまたは飼料への添加剤の形で提供することもできる。家畜の飼料としてまたは飼料への添加剤として本発明の L AK活性増強用製剤を使用することにより、家畜に発生する腫瘍および Zまたは癌を治療または予防し、あるいは家畜に対する細菌またはウィルス性の感染症を治療または予防することができる。

その結果、家畜について現在使用されている治療薬、例えば抗生物質などの使用量を減少することができ、それに伴って飼育コストを低下することができる。さらに、抗生物質を投与したために生産物を出荷できない期間を、より短くできるというさらなる効果もある。

本発明の LAK活性増強物質による LAK活性増強は、例えば、高木らの方法に従い（臨床免疫、 19 : 245— 249， 1987) 、次の工程により確認することができるが、これに限定されない。

LAK活性試験 LAK活性の測定は、 ⁵¹Cr放出アツセィ法、〔³H〕ゥリジン法などの方法により行うことができる。簡便性および客観性の観点から、 ⁵¹Cr放出アツセィを使用することが好ましい。

⁵¹Cr放出アツセィは、 LAK活性増強物質で処理されたリンパ球から誘導された LAK細胞による標的細胞傷害活性を in vitroにおいて測定する方法の一つであり、以下の工程からなる。

(i) 標的細胞に ⁵¹Crで標識したクロム酸ナトリウムを添加することにより標的細胞を標識すること；

(ii) 標識された標的細胞を、誘導された LAK細胞と反応させること； (iii) LAK細胞により破壊された標的細胞力細胞培養上清中に放出する ⁵¹Cr の量を測定すること。

⁵¹Cr放出アツセィにおいて使用する標的細胞である継代培養細胞としては、好ましくは Dandi細胞あるいは Raji細胞を使用する。培養フラスコ中等で培養した標的細胞を遠心分離により集菌し、 100 L50 Ciの⁵¹ C r—クロム酸ナトリウムを添加後、 5%C0₂培養器にて 37°Cにおいて 1 2時間培養して⁵¹ Cr で標識する。標的細胞の培養液としては、使用する細胞が増殖するために適したものを使用し、例えば RPMI 1640 F-12などの培養液に血清、抗生物質などを適宜追加したものを使用する。

培養標的細胞を P B Sにより 3回洗浄後、 1 X 10 Vm 1になるように培養液に懸濁しアツセィに使用する。

LAK細胞を誘導するために、被験者の末梢血からリンパ球を分離する。被験者から採血した末梢血にへパリンを加え、 Ficoll-Conary液（s.g. = 1.077) を用いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離する。分離された単核球を PBS (pH7. 4 Caおよび Mgを含まず）により 2 3回洗浄したのち、 I X 10⁶ノ m 1になるように培養液（好ましくは、 RPMI 1640培地（Gibco) に、 FBS (非働化血清）や抗生物質などを適宜加えたもの）に懸濁する。これを、自己血清（血漿）を 37°C 15分処理してコートしたペトリ皿に移し、 37°C1 時間培養する。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画とする。

得られたリンパ球を上記培養液に所定の濃度で浮遊させる。このときの細胞浮 P 16

遊濃度は、 1 X 10⁵〜10⁶/mlに調節することが好ましい。

リンパ球浮遊液を調製した培養液と同じ培養液に、シィタケ菌糸体抽出物を最終濃度約 1〜100 zg/mlになるように加える。

培養プレートのゥエルに、所定量のリンパ球浮遊液と抽出物含有培養液を入れる。このとき、無添加誘導コントロールとして、所定量のリンパ球浮遊液とシィタケ菌糸体抽出物を含まない培養液とを加えるゥエルも用意する。次いで、培養プレートを炭酸ガス培養器中で 3日間室温において静置し培養を行う。

例えば、 96穴 U底マイクロテストプレートを使用する場合には、各ゥエルに、リンパ球浮遊液 100 を添加することにより、細胞数が 1X10⁴ /ゥエル〜 1X1 0⁵ /ゥエルとなるようにすることが好ましい。 1ゥエル当たりの細胞数は、当業者が、ゥエルの容量、 LAK細胞の活性、標的細胞の LAK細胞に対する感受性などにより適宜定めることができる。

このようにして、被験者のリンパ球を種々の濃度（濃度ゼロを含む）の本発明のシィタケ菌糸体抽出物の存在下で培養しエフェクター細胞とする。本明細書においては、エフェクター細胞とは、 3日間上記の培養処理を行った細胞を指し、 LAK活性増強物質と共に培養されたリンパ球（LAK活性増強物質添加処理されたリンパ球）および LAK活性増強物質を含まない培養液のみで培養されたリンパ球（無添加誘導処理されたリンパ球）の両方を含む。

培養後のリンパ球（エフェクター細胞）をゥエルから回収し、再び新鮮な 1 0% 83添加! ?1^ 1 1640培地に懸濁する（i x i 0⁶/ml) 。

細胞傷害活性を測定するためのアツセィにおいては、標的細胞を分注した各ゥエルに、実験解離用には上記の各種エフェクター細胞（LAK活性増強物質添加あるいは無添加誘導処理されたリンパ球） ixio⁵ /ml〜lX10⁶ /mlを含有する浮遊液を所定量添加する。最大解離用にはエフェクター細胞浮遊液と同量の 1N- HC1 を添加し、自然解離用にはエフェクター細胞浮遊液と同量の培養液を添加する。次いで、プレート遠心分離機等により、細胞を培養プレートのゥエル底部に集めた後、 5%C0₂培養器にて 37°Cにおいて所定の時間（例えば、 2〜5時間）培養する。

培養終了後に、各ゥエルの培養上清中に放出された ⁵¹Cr による放射線量を測定する。測定には、シンチレーシヨンカウンターなどを使用できる。

ここで、最大解離とは、全標的細胞が破壊された場合に放出される ⁵¹Cr の全量のことをいい、例えば、 1N— HC1 を添加した培養液中で、エフェクター細胞を添加せずに、一定条件下、標的細胞を培養することにより溶解させ、培養上清中に放出された ⁵¹Cr量を測定することにより計測することができる。

実験解離とは、標的細胞に対してェフエクタ一細胞を添加した場合に、ェフエクタ一細胞による標的細胞の細胞障害および標的細胞の自然死により放出される ⁵¹Cr量のことをいい、例えば、エフェクター細胞を添加した培養液中で、 1N— HC1 を添加せずに、最大解離を求める場合と同様の条件下、標的細胞を培養することにより、培養上清中に放出された ⁵¹Cr量を測定することにより計測することができる。

自然解離とは、標的細胞の自然死により放出される ⁵¹Cr量のことをいい、例えば、 IN— HC1およびエフェクター細胞をともに添加せずに、最大解離を求める場合と同様の条件下で標的細胞を培養することにより、培養上清中に放出された ⁵¹Cr量を測定することにより計測できる。

L AK細胞の活性化の度合いは、以下の式（1 ) に従って算出した L AK活性値を指標として評価する。実験解離（cpm) —自然解離（cpm)

LAK活性％== X 100 式（1 ) 最大解離（cpm) —自然解離（cpm) 本出願が主張する優先権の基礎となる出願である特願平 1 0— 3 5 3 9 2 7号および特願平 1 0— 3 5 3 9 2 8号の開示は、すべて引用により本明細書の中に取り込まれる。実施例

本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。実施例 1 ：シィタケ菌糸体抽出物の調製

バカス 90重量部、米糠 10重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シィタケ種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材の繊維素を解束し、 12メッシュ通過分が 24重量％以下となるようにした。この解束された培地 1. 0kgに、純水 3. 5 1および精製セルラ一ゼ 2, 0 gを、固体培地を 4 0 °cに保ちながら加えて培地含有混合物とした。

次いで、培地含有混合物を変速付ギヤ一ポンプにより循環させながら、固体培地にギヤ一部分において粉砕および攉潰作用を 200分間程度加えて、バカス繊維の約 80重量％が 12メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地含有混合物をさらに 90°Cまで加熱して酵素を失活せしめると同時に滅菌して、 90 °Cに 30分間放置した。得られた培地含有混合液を 60メッシュ濾布により濾過してシィタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥粉末を得た。

このようにして得られたシィタケ菌糸体抽出物は、フエノールー硫酸法による糖質分析により糖質を 25. 3% (重量/重量）、ローリー法によるタンパク質分析によりタンパク質を 19. 7% (重量 Z重量）、没食子酸を規準とする Fol on-Denis法によりポリフエノールを 2. 6% (重量 Z重量）含んでいた。シィタケ菌糸体抽出物は、その他に粗脂肪 8 %、粗灰分 22%、糖質以外の可溶性無窒素物を約 20 %含んでいた。

また、シィタケ菌糸体抽出物の構成糖組成は以下のとおりであった。

Xy l : 15. 2、 Ar a : 8. 2、 Man : 8. 4、 Gu 1 : 39. 4、 Ga l : 5. 4、 G 1 c N : 12. 0、 GLuUA : l l. 3。実施例 2 ：シィタケ菌糸体抽出物と I L一 2との L AK活性の比較

実施例 1で得られたシィタケ菌糸体抽出物を被験者から採取した末梢血に直接添加した場合の LAK活性の増強効果を I L— 2と比較した。

被験者 Aから採血した末梢血にへパリンを加え、 Ficoll-Conary液（s.g. = 1.07 7) を用いた比重遠心分離法により界面の単核球を分離した。分離された単核球を PBS (pH7. 4、 Caおよび Mgを含まず）により 2回洗浄したのち、 1 X 10⁶ノ m 1になるように 10%FBS (非働化血清）を加えた RPMI 164 0培地（Gibco) に懸濁した。得られた細胞懸濁液を、自己血清（血漿）を 3 7°C5分処理してコートしたペトリ皿に移し、 37°C1時間培養後、非付着性細胞をリンパ球分画として回収した。

得られたリンパ球を 10 % F B S (非働化血清）を加えた R PM I 1640培地 (Gibco) に細胞濃度が 1 X 1 O m 1となるように浮遊させた。

10%FBS (非働化血清）を加えた RPMI 1640培地（Gibco) に、 I L 一 2を最終濃度 25U/m K 実施例 1で得られたシィタケ菌糸体抽出物を最終濃度 1、 10、 100および 1000 g/m 1になるように加え、 LAK活性増強物質含有液を調製した。

96穴 U底マイクロテストプレートの各ゥエルにリンパ球浮遊液 100 1と I L— 2あるいは各濃度のシィタケ菌糸体抽出物を含む LAK活性増強物質含有液 100 1との合計 20 0 u 1ずつを入れた。無添加誘導コントロールとして、リンパ球浮遊液 100 1とシィタケ菌糸体抽出物を含まない培養液（ 10 % F BS (非働化血清）を加えた RPMI 1640培地（Gibco) ) とを加えた。次いで、培養プレートを炭酸ガス培養器中で 3日間室温において静置し培養を行った。培養後のリンパ球（エフェクター細胞）をゥエルから回収し、 i x i 0⁶/m 1の濃度で再び新鮮な 10%FBS添加 RPMI 1640培地に懸濁した。

標的細胞である継代培養細胞（Daudi 大日本製薬より入手）を 10%FBS添加 RPMI 1640 ±咅養液中で培養後、遠心分離により回収し、 10⁶細胞当たり 100 〜150 Ciの⁵¹ Cr—クロム酸ナトリウム（New England Nuclear) を添加し、 5%C0₂培養器にて 37°Cにおいて 1時間培養した。 ⁵¹Crにより標識された培養細胞を PBSにより 3回洗浄後、 1 X 10⁶ /mlになるように 10%FBS添加 RPMI 1 640培養液中に懸濁した。

マイクロテストプレートの最大解離用、自然解離用、実験解離用の各ゥエルに、標識した標的細胞を 50^1 (5X10⁴ /ゥエル）ずつ分注した。さらに、最大解離用ゥエルには 1N-HC1を 100 lずつ分注し、自然解離用ゥエルには 10%FBS 添加 RPMI 1640培養液を 100 1ずつ分注した。そして実験解離用ゥエルには 1、 1 0、 1 0 0および 1 000 g/m 1の濃度の本発明のシィタケ菌糸体抽出物、 2 5UZm 1の濃度の IL-2、または、こうした LAK活性増強物質を含まない培養液により処理したエフェクター細胞を 100 1ずつ分注した。この際、実験解離用、最大解離用、自然解離用の各ゥエルがプレートの外周付近に位置しないようにした。

次いで、マイクロテストプレートを、プレート遠心分離機により 800 rpmで 5分間遠心処理して細胞をゥエル底部に集めた後、 5%C0₂培養器にて 37°Cにおいて 3.5時間培養した。

培養後のプレートから SOKEN-PET Σ-96にて各ゥエルの培養上清を採取し、ァ一シンチレーシヨンカウンタ一により放射活性を測定した。

上述した式（1) に従って LAK活性を算出した。

結果を表 1並びに図 1に示す。

LAK活性

1 なし 1 1 %

2 I L- 2 (最終濃度： 25 U/ml) 5 5%

3 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度： 1 β≠ηύ 14% 4 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度： 1 0 g/ml) 2 0 % 5 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度： 1 00 zg/ml) 14% なお、シィタケ菌糸体抽出物のリンパ球に対する毒性を調べるため、実施例 1 で得られたシィタケ菌糸体抽出物の最終濃度を lmgZm lとして、上記と同様の方法でリンパ球を処理してから顕微鏡観察したところ、リンパ球はほぼ 1 0 0 %生存していた（結果は示さず）。実施例 3 ：シィタケ菌糸体抽出物の LAK活性至適濃度

シィタケ菌糸体抽出物を被験者から採取した末梢血に直接添加する場合の至適濃度を検討した。被験者 Bおよび Cから採血した末梢血を用いて、実施例 1で得られたシィタケ菌糸体抽出物の最終濃度を 1、 5、 10および 1 O O zgZm l としたこと以外は、実施例 2の方法と同様にして LAK活性を算出した。

結果を表 2並びに図 2に示す。

表 2並びに図 2から明らかなように、本発明のシィタケ菌糸体抽出物は、最終濃度 10 g/m 1あるいは 50 g/m 1 (リンパ球 10⁶個に対して 1 Q gあるいは 50 gを投与）で添加する場合において、もっとも高い LAK活性を示すことがわかった。末梢血に対する投与量は、被験者の末梢血中のリンパ球の割合などにも影響されるが、おおよそ末梢血 lm lに対して約 10〜25 g あるいは 50〜125 gのシィタケ菌糸体抽出物を添加することに相当する。表 2

誘導物質 LAK活性

被験者 B―被験者 C

1 なし 13 % 27% 2 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度 1 gml) 18% 28% 3 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度 5 gml) 19% 29 % 4 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度 1 0〃 g/ml) 21 % 34% 5 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度 50 g/ml) 19% 36 % 6 シィタケ菌糸体抽出物（最終濃度 100 g/ml) 15 % 30 % 比較例 1 ：クレスチンの LAK活性

本発明のシィ夕ケ菌糸体抽出物と比較するために、免疫賦活剤であるクレスチンの LAK活性増強効果を検討した。被験者 Dから採血した末梢血を用いて、最終濃度 lmgZmのクレスチン（呉羽化学から入手）を用いたこと以外は、実施例 2の方法と同様にして、クレスチンの LAK活性増強効果を評価した。

なお、最終濃度 lmg/mlは、クレスチンを L AK細胞誘導に用いた場合に、最も効果的であると言われている濃度である。

結果を表 3並びに図 3に示す。

表 3並びに図 3から明かであるように、クレスチンは、その至適濃度である 1 mg /mlであっても、 LA K活性増強物質を含まない対照より L A K増強活性が低かった。表 3

誘導物質 LAK活性

なし 14%

2 クレスチン（最終濃度： lmgZm l ) 13% 実施例 4 ：シィタケ菌糸体抽出物含有製剤投与による LAK活性の測定

被験者 B、 C、 Eおよび F各々に、実施例 1と同様の方法で得られたシィタケ菌糸体抽出物を含む LAK活性増強用製剤を投与し、 LAK活性の増強効果を評価した。

この LAK活性増強用製剤は、製剤 3 gあたりシィタケ菌糸体抽出物 0. 6 g および乳糖 2. 4 gを含むものであり、一回 6 g (シィタケ菌糸体抽出物として 1. 2 g) を毎日 3回、シィタケ菌糸体抽出物として合計 3. 6 gZ日、で 1週間投与した。服用開始前と最終投与の約 2時間後に各被験者から末梢血を採血し、実施例 2と同様の方法で LAK活性を測定した。

結果を表 4並びに図 4に示す。

表 4並びに図 4から明らかなように、本発明のシィタケ菌糸体抽出物は、被験者 B、 C, Eおよび Fにおいて、何れも LAK活性の著しい上昇を示した。表 4

LAK活性

被験者 B C E F シィタケ菌糸体抽出物服用前 13% 27% 14% 18%

—菌糸体抽出物服用後 40% 43% 18% 28% また、シィタケ菌糸体抽出物の服用による副作用を検査するために、被験者 B、 Cおよび Eに対して血液生化学検査を実施した。その結果を表 5に示す。なお、シィタケ菌糸体抽出物服用期間中、被験者 B、 C , Eおよび Fには、全身倦怠、悪寒、発熱、消化器症状等の副作用は認められなかった。

表 5からも明らかなように、本発明のシィタケ菌糸体抽出物の服用による副作用は認められなかった。

産業上の利用性

本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含む L AK増強物質は、末梢血直接添加に際して I L— 2と同様の効果を示し、かつ、リンパ球に対する直接毒性はなかった。また、 I L一 2に比較してはるかに安価に入手可能である。したがって、副作用が強くかつ高価な I L一 2に代えて、 L AK療法に利用することができる。

また、本発明のシィタケ菌糸体抽出物含有製剤は、直接投与によっても L AK 活性を著しく上昇させることができ、かつ、副作用は認められなかった。したがつて、本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含む製剤は、 L AK療法を実施することなく、直接投与、例えば、経口投与により、ほとんど副作用なく L AK活性を上昇させることができ、免疫活性ィヒ剤として有用である。

Claims

請求の範囲

1. シィタケ菌糸体抽出物を含有する L AK活性増強物質。

2. 末梢血由来のリンパ球に作用させることにより LAK活性を増強させる、請求項 1記載の L A K活性増強物質。

3. シィタケ菌糸体抽出物の濃度がリンパ球 10⁶個に対して 1 g以上である、請求項 2記載の L A K活性増強物質。

4. 請求項 1記載の L A K活性増強物質を含有する L A K活性増強用製剤。

5. 請求項 1記載の L AK活性増強物質および薬学上許容可能な担体を含有する、医薬または獣医薬用の LAK活性増強用製剤。

6. 経口投与用である、請求項 4または 5記載の L A K活性増強用製剤。

7. 食品、飲料、または飼料である、請求項 4記載の LAK活性増強用製剤。

8. 注射または経皮投与用である、請求項 4または 5記載の LAK活性増強用

9. 腫瘍および Zまたは癌の治療に用いる、請求項 4乃至 8の何れか 1項記載の LAK活性増強用製剤。

10. 請求項 4乃至 8の何れか 1項記載の LAK活性増強用製剤の有効量を投与する、腫瘍および Zまたは癌の治療方法。

1 1. 腫瘍および Zまたは癌の治療に用いる医薬品を得るための、請求項 1記載の LAK活性増強物質の使用。