TW200422049A - LAK activity potentiator orginating in shiitake mushroom hyphae extract and LAK activity potentiating preparations containing the same - Google Patents

Description

200422049 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於免疫的分野。本發明係有關提高免疫活 性的物質以及利用此之治療劑，更詳細說明爲，有關對 LAK活性增強有用的物質以及利用其之LAK活性增強用 製劑。 【先前技術】 作爲微生物體的防禦機制之免疫機制有細胞性免疫與 體液性免疫。所謂體液性免疫係與抗體有關聯而表現的免 疫反應。細胞性免疫爲細胞直接於目標上作用而表現的免 疫反應。 擔任此細胞性免疫反應的主要角色爲淋巴球，抗原則 以細胞上的物質居多。細胞性免疫爲腫瘤、細胞內寄生體 、對病毒的免疫反應、移植、某種藥物的過敏性、一部份 與自身免疫疾病亦有關。一般而言，以特異反應居多，但 亦有非特異作用者。 例如，關於腫瘤免疫學，已知腫瘤細胞具有腫瘤抗原 。即，已知腫瘤細胞中存在特異的抗原（TSA: Tumor Specific Antigen )，或正常細胞中存在者極微量而隨著 細胞的癌化而增強腫瘤關連抗原（TAA : Tumor Associated Antigen ) 〇 如此的腫瘤抗原隨著自身細胞的變異而產生之基因本 身或依其表現的變化而表現者。作爲具有異常的抗原性的 -5- (2) (2)200422049 腫瘤細胞治療法，免疫治療法爲一般上被使用的方法，以 腫瘤抗原進行免疫，使用增強被檢體的免疫功能的藥劑。 已知一般破壞腫瘤細胞的活性，N K (自然殺傷細胞）細 胞比正常細胞高，又NK細胞的活性亦因免疫治療法而被 增強。NK細胞爲正常個體中亦存在的細胞障礙性淋巴系 細胞，其不被MHC抗原限制而對於腫瘤細胞、病毒感染 細胞等顯示障礙活性，但現今發現有不被NK細胞殺傷的 腫瘤細胞。 美國NCI的S· Rosenberg將末梢淋巴球與IL 一 2 (人類間白素）共同培養時，發現對於含有自身癌的廣範 圍之目標癌細胞而言可誘導顯示細胞障礙性的殺傷細胞， 所謂此殺傷細胞可殺傷NK細胞不可能殺傷的癌細胞（參 考特開昭62-1 16518號）。此殺傷細胞取名爲淋巴激活素 活性化細胞（LAK 細胞：Lymphokine Activated Killer Cell) 。LAK細胞於細菌學上已知其非爲均一集團，而係 爲NK細胞系或殺傷T細胞系的細胞集團。 近年來，來自患者的末梢淋巴球於細胞培養系中使用 IL - 2使其活化後，顯示抗腫瘤活性的LAK細胞再次被移 至被患者體內，進行被動免疫治療法（LAK治療法）。 重複投與此LAK細胞的被動免疫治療法，有末期癌縮小 或抑制增殖的例子被報告。然而，使用IL 一 2的LAK治 療法，因分離大量的白血球細胞而造成肉體上的負擔，而 對於分離後的白血球細胞有著必須大量培養及使用高價的 IL - 2而造成經濟上的大負擔等種種問題點。且，因投與 -6 - (3) (3)200422049 IL 一 2而產生嚴重的副作用。 具體而言，使用IL一 2進行LAK被動免疫治療法時 ，會產生全身倦怠、寒冷、發燒、低白蛋白、貧血、好氧 球增加等症狀之副作用，已知這些副作用比單獨使用IL - 2時還強。且値得注意的事爲，對於產生幾項重大副作 用而言，可考慮其可能原因爲LAK細胞對於正常細胞具 有傷害活性。有報告指出此LAK細胞所造成的造血幹細 胞傷害，除產生貧血或血小板減少外，亦有報告出對淋巴 球、巨噬細胞或血管內皮細胞的體外（in vitro )傷害。 又，IL - 2經口投與之吸收較差，現今以直接投與的方式 進行注射投與爲主要方式。 因此，爲互補此缺點的物質，特別不使用IL - 2而可 增強淋巴球的LAK活性之物質，或含有如此物質的藥劑 的開發被期待著。 抗癌劑一般以癌細胞異常增殖性爲目標，若以阻礙對 象作分類，作爲核酸合成組礙劑，例如有烷基化劑、核酸 合成基質類似物、抗生物質、類固醇賀爾蒙等，作爲有絲 分裂阻礙劑有植物生物鹼等。 然而，這些抗癌劑顯示對同時增殖的正常細胞之骨髓 、胃腸管上皮、毛囊有著顯著的副作用。即，不拘限於投 與方式，以一般症狀而言，有噁心、嘔吐、口腔以及小腸 的潰瘍、拉肚子、脫毛、引起降低血液的有效成分之生產 而引起骨髓抑制等。 自過去，知道細菌類或食品等具有抗癌作用。由具此 (4) (4)200422049 抗癌作用的細菌類或食品等副作用較少且具安全性的事’ 可試著探索來自這些細菌類或食品等的抗癌作用物質，例 如有報告指出使用沙雷氏菌與溶連菌的培養濾液之Coley s毒素（1964) 、BCG的白血病治療（Mathe，G, Adv.

Cancer Res.，14，1，1971)以及 morumot 對癌腫瘤的退縮 (Zbar, B·，et al.? J· Natl. Cancer Inst., 4 8, 8 3 1, 1 97 1 ) ’以及對酵母菌多醣體投與之肉瘤1 80等移植癌具有效性 等。 特別關於多醣體，酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖、其他 菌體的多醣體、地衣類以及擔子菌類的多醣體等對於抗癌 的效果，已進行很多硏究。這些中作爲抗癌免疫增強藥， 現今被販賣的有，擔子菌類的靈芝科之來自河原培養菌絲 體的乙酸間甲苯酯（吳羽化學，三共製藥：宿主的免疫機 能賦活劑）以及香菇多醣類的香菇多糖以及suehiro香菇 多醣類等。 又，香蘇（Lentinus edodes)爲日本與中國的代表性 食用菇，於日本早在300年前便實行人工栽培，其藥理效 果與藥效成分僅於最近才解明，例如有報告指出，對於白 老鼠的大腸與肝臟等的移植腫瘤細胞之增値抑制效果（ Sugano，N. et al·，Cancer Letter, 27: 1，1 9 8 5;鈴木康將 等，日本大腸肛門病會誌，4 3 : 1 7 8、1 9 9 0 )以及促進細 胞分裂劑效果（Tabata· T. et al·，Immunopharmacology， 24:57，1992; Hibino，et al·，Immunopharmacology，28: 77, 1 994 )等。 (5) (5)200422049 【發明內容】 本發明者不僅可提供一種副作用少且便宜可取得的之 免疫療法劑，且著眼於香菇具有的免疫賦活活性、抗腫瘤 活性以及/或抗癌活性。 本發明者對於香菇的生活史之可食用型態的子實體前 型態，其菌絲中萃取成分裡，發現其子實體中具有驚人的 免疫賦活活性與抗腫瘤活性以及/或抗癌活性。而且發現 該萃取物具有LAK活性增強物質，於是完成本發明。 即，本發明的其中一方面而言，提供一種含有香菇菌 絲體萃取物的LAK活性增強物質。 所謂「LAK活性」，意味著可攻擊擔任NK活性的淋 巴球所不能辨識的腫瘤，且對自身的正常細胞幾乎無影響 之細胞障礙性T淋巴球所示的活性。所謂「LAK活性增 強」，意味著爲增強如此LAK活性，直接或間接地提高 由淋巴球誘導之LAK細胞活性，或已存在的LAK細胞之 活性等。 因LAK活性的增強，使得LAK細胞的抗腫瘤活性可 提高，此爲導致細胞性免疫系的提高。因此，可使用於期 待抗腫瘤活性的治療外，亦可使用於以提高免疫系爲目的 的治療。 本發明的LAK活性增強物質可於來自末梢血的淋巴 球起作用使得LAK活性增強。亦可來自末梢血的淋巴球 直接作用，此時香菇菌絲體萃取物的濃度對約1 0 6個淋巴 -9- (6) (6)200422049 球而言爲l//g以上或對的古侦 7 4的末梢血而言爲l//g以上爲 佳。本發明的 LAK活件增強蜘哲·^ w " 伯丨王增®物質可取代IL 一 2使用於 L A K療法中。 又’本發關LAK活性增強物質，可直接爲香菇菌 絲體萃取@ ’或含有香薛菌絲體萃取物以外的物質亦可。 僅不損害香菇菌絲體萃取物的LAK活性增強範圍，含有 任何物質皆可。 本發明的LAK活性增強物質，可與具免疫賦活活性 與抗腫瘤活性以及/或抗癌活性的其他物質等混合並用。 本發明的第2方面爲，提供一種含有具香菇菌絲體萃 取物的LAK活性增強物質之LAK活性增強用製劑。 本發明的LAK活性增強用製劑可直接爲香菇菌絲體 萃取物’或含有香菇菌絲體萃取物的L A K活性增強物質 以及含有藥學上可容許的載體之醫藥或獸醫藥用製劑。 本發明的LAK活性增強用製劑可使用於經口投與、 或注射或經皮投與用。 本發明的LAK活性增強用製劑，可爲食品、飮料、 或飼料。 本發明的LAK活性增強用製劑爲可使用於腫瘤以及 /或癌的治療。本發明的LAK活性增強用製劑因係可誘 導LAK細胞者，故非對特定腫瘤細胞有者特異性傷害者 ，可使用於無論係上皮性、非上皮性的各腫瘤的治療。 又，可使用於腫瘤或癌以外的治療’例如可使用於以 提升免疫系爲目的之治療。具體而言’對因放射線照射等 -10- (7) (7)200422049 引起的免疫係低下之治療或意外，或自身免疫疾病、感染 症等引起的免疫系的降低狀態之改善所使用者。 本發明的LAK活性增強用製劑亦可作爲各種疾病的 預防藥使用，例如，可爲預防腫瘤以及/或癌，或細菌或 病毒性感染症的預防之投與。 且，本發明的LAK活性增強製劑，例如可與免疫賦 活性劑等的抗腫瘤劑以及/或抗癌劑、抗生素、止痛劑、 抗炎症等其他藥劑混合並用。 本發明的第3方面爲，提供投與如此LAK活性增強 用製劑的有效量之腫瘤以及/或癌的治療方法。 且本發明的腫瘤以及/或癌的治療方法，例如可與其 他藥劑治療方法、外科處理、放射線照射、溫熱療法等其 他治療方法並用。 本發明的第4方面，提供用於腫瘤以及//或癌治療所 使用的醫藥品的LAK活性增強用物質的使用。 爲取得腫瘤以及/或癌的治療所使用的醫藥品，本發 明的LAK活性增強用物質可與免疫賦活活性與抗腫瘤活 性以及/或具抗癌活性的其他物質混合使用。 【實施方式】 實施發明的最佳型態 本發明爲含於LAK活性增強物質的香菇菌絲體萃取 物’其由香菇菌以固體培養基上培養所得的菌絲體，較佳 爲含有困體的固體培養基於水以及酵素的存在下粉碎、 -11 - (8) (8)200422049 分解所得的萃取物而言。 香菇菌絲體萃取物，較佳使用以下的方法所得者，但 不特別被限定。即，蔗渣（甘蔗的榨粕）與脫脂米糠爲基 材的固定培養基上接種香菇菌，菌絲體增殖後，含有菌絲 體增殖的固體培養基通過1 2篩孔（每平方英吋孔眼數） 使其解開成3 0重量％以下的通過量。 此解開的固體培養基中將水與選自於碳水化合物分解 酵素、蛋白質分解酵素或葡糖苷酶中的一種或種以上的酵 素保持3 0 - 5 5 t的溫度，添加於前述的固體培養基中， 同時前述固體培養基於前述酵素存在下絞碎、禱碎至少以 70重量％以上通過12篩孔的程度。其次加熱至80至100 °C溫度使酵素失去活性，同時進行滅菌。最後所得的懸浮 狀液體經過濾而得到香菇菌絲體萃取物。 所得的香菇菌絲體萃取物可直接作爲本發明的LAK 活性增強物質或LAK活性增強用製劑使用，又可將此濃 酸、凍結乾燥做成粉末保存，使用時可以種種方便的型態 使用。凍結乾燥所得的粉末爲褐色粉末，具吸濕性與特異 味道。 如此得到的含香菇菌絲體萃取物的LAK活性增強物 質（直接爲香菇菌絲體萃取物即可），以治療對象的腫瘤 免疫活性增強爲目的，可代替IL 一 2而使用LAK療法。 LAK療法一般爲由治療對象取得的淋巴球與IL 一 2共 同組織培養由淋巴球中誘導L A K細胞，再回收至治療對 象的體內之步驟。對於回收至治療對象的步驟可同時與 -12- (9) (9)200422049 IL 一 2並用投與（直接投與）。 含有本發明的香菇菌絲體萃取物之L A K活性增強物 質，可與治療對象（患者、家畜等）的淋巴球共同作組織 培養而誘導L A K細胞，培養後的淋巴球回收至治療對象 的步驟時可對治療對象作其他藥劑並用投與（直接投與） 。與其他抗腫瘤劑以及/或抗癌劑並用亦無發生障礙現象 〇 含有本發明的香菇菌絲體萃取物的LAK活性增強物 質，可對直接由治療對象中採出的末梢血直接添加，但添 加前最好進行丙酮的無菌處理。 含有本發明的香菇菌絲體萃取物的LAK活性增強物 質，由治療對象所採取的末梢血中直接添加時之濃度，香 菇菌絲體萃取物最佳爲l/ig/ΙΟ6淋巴球至1 mg/106淋 巴球，更佳爲l〇//g/l〇6淋巴球至l〇〇/zg/l〇6淋巴球 ，特佳10 /i g/ 106淋巴球至50 // g / 106淋巴球。對於1 4末梢血的投與量，雖會受末梢血中的淋巴球之含有率的 影響，但約l#g至2· 5 mg，較佳爲10//g至250//g， 更佳爲10// g至125// g。 含有具本發明的香菇菌絲體萃取物之L A K活性增強 物質之LAK活性增強用製劑爲提供一種，爲使治療對象 的腫瘤免疫活性增強，以直接投與於治療對象，而與使用 IL一 2的LAK療法對抗效果的製劑。 因對治療對象的患者或家畜作直接投與，僅可誘導治 療對象的LAK細胞’可減輕因大量白血球的分離對於肉 -13- (10) (10)200422049 體的負擔或關於大量培養的經濟負擔。且，由治療對象血 液中分離再回收的污染的危險性亦會減輕。 作爲本發明的LAK活性增強用製劑的投與方法，考 慮到對治療對象的負擔，雖經口投與爲最佳，但不限定於 此。可作血管內投與、皮內投與、皮下投與、肌肉投與等 注射投與，其他亦有經皮投與、經鼻投與、經腸投與等。 作爲本發明的LAK活性增強用製劑的劑型，可舉例 出錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑 、注射劑、乳液、軟膏、貼藥、噴霧劑、塞藥劑等，不限 於此。 作爲本發明的LAK活性增強用製劑可任意混合醫藥 上容許的載體，對於業者所公知的賦形劑（例如，乳糖、 葡萄糖、澱粉、結晶纖維等）、結合劑（澱粉、明膠、甲 基纖維、聚乙烯吡咯烷酮等）、分解劑（澱粉、羧基甲基 纖維鈣、羧基甲基澱粉等）、滑澤劑（滑石、硬脂酸鹽等 )、塗佈劑（白糖、滑石、明膠等）等，且各種光澤化劑 、香料、著色劑、矯味劑、溶解輔助劑、安定化劑、懸濁 劑、吸收促進劑等爲目的可因應添加，但不受限定。又， 作爲注射劑使用時，對於此分野所慣用的各種稀釋劑（例 如水、甲基醇等）皆可使用。 本發明的LAK活性增強用製劑的投與來源、投與量 、投與回數等以考慮治療對象的年齡、體重、症狀等而決 定。 含於本發明的LAK活性增強用製劑中香菇菌絲體萃 -14- (11) (11)200422049 取物’係自古以來做爲食品使用者，故極爲安全。因此， 無須對投與量有著嚴厲的限制，但通常換算成香菇菌絲體 萃取物粉末時，1日分2至3次程度以1次1〇〇111§至 10000 mg’且較佳爲1日分爲3次以一次500 mg至5000 mg，特佳爲1日分爲3次以一次1〇〇〇 mg至1500 mg。且 ，與其他藥劑，例如其他免疫賦活劑等的抗腫瘤劑以及/ 或抗癌劑、抗生劑、止痛劑、抗炎症劑等並用投與時亦無 產生障礙。 本發明的LAK活性增強用製劑，可以食品的形式提 供。作爲較佳的食品型態可舉出粉末、顆粒、麵團狀、果 膠狀。且當顆粒等時因欲加上甜味，可加入乳糖等糖類。 又，本發明的LAK活性增強用製劑可以飮料的形式提供 。如此的食品或飮料中，香菇菌絲體萃取物及其他，維他 命劑、鈣等無機成分、醇類 '聚苯酚等消臭成分等可追加 。此食品或飮料即使爲特定保健用食品、病者用食品等的 範圍者亦無關緊要。 本發明的LAK活性增強用製劑，作爲飼料或加入飼 料的添加劑的形式提供亦可。作爲家畜的飼料或作爲飼料 的添加劑，使用本發明的LAK活性增強用製劑，可預防 家畜腫瘤以及/或癌的治療或預防，或可治療或預防家畜 的細菌或病毒性的感染症。 其結果，現今對家畜使用的治療藥，例如抗生物質等 的使用量可減少，隨之可降低飼料的成本。且，具有減短 因抗生物質的投與而生產物無法出廠的期間之效果。 -15- (12) (12)200422049 本發明的LAK活性增強物質之LAK活性增強’例如 可依照高木們的方法（臨床免疫，1 9 : 2 4 5 - 2 4 9 ’ 1 9 8 7 ) ，以再來的步驟可確認之，但不限定於此。 L A K活性試驗 LAK活性的測定爲可進行51Cr釋出測定法、〔3H〕 尿定法等方法。對於本發明，由簡便性以及客觀性的觀點 看來，使用51 Ci*釋出測定法較佳。 51 Cr釋出測定法爲測定經LAK活性增強物質處理的 淋巴球，其所誘導出的LAK細胞所引起的目標細胞傷害 於體外下測定之方法之一。51 Cr釋出測定法爲以下的步驟 (I )目標細胞中添加51 Cr所標識的酪酸鈉而標識目 標細胞。 (II )標識後的目標細胞，與被誘導的LAK細胞進 行反應； (III )測出被LAK細胞破壞的目標細胞於細胞培養 液的上淸液中釋出的51Cr量； 對於51 Cr釋出測定，使用作爲目標細胞的傳代培養 細胞，較佳爲使用Daiidi細胞或Raji細胞。回收培養錐 形瓶等中培養的目標細胞以離心分離方法進行集菌，添加 100〜150# CI的51 Ci* —酪酸鈉後，於5% C02培養器中

3 7 °C下培養1至2小時以51 Cr標識。作爲標識細胞的培 養液，使用適合細胞增殖者，例如可使用 R Ρ ΜI 1 6 4 0、F (13) 200422049 - 12等的培養液中適宜地追加血淸、抗生物質等者。 培養後的目標細胞以PB S洗淨3次後，欲將其尽 X 1 〇6/ J而懸濁於培養液中作爲測定時使用。 爲使誘導LAK細胞，由被驗者的末梢血中分離 巴球。由被驗者採血下的末梢血中加上肝素， Ficoll-Conary液（S.g.= 1.07 7 )的比重離心分離法 界面的單核球分離。被分離的單核球以p B S ( P Η 7 含Ca以及Mg)洗淨2至3次，欲將其成爲lxlO6/ 懸濁於培養液（較佳爲RP Μ I 1 6 4 0培養基（G i b c 〇 ) 宜地加上FBS (非活性化血淸）或抗生物質等者）中 此移至自身血淸（血漿）以3 7。(：下1 5分鐘處理且塗 培養皿中，以3 71下培養1小時。回收非附著性細 作爲淋巴部分。 所得的淋巴球於如上述培養液所定的濃度中使其 ’此時的細胞浮游濃度爲，調整成1 X 1 0 5 / 至1 X 1 m£爲佳 與調製出淋巴球浮游液相同的培養液中，加入香 絲體萃取物使其最終濃度約1至1 00 // g/ J。 培養皿中的洞穴中，加入所定量的淋巴球浮游液 有萃取物的培養液。此時，作爲無添加誘導之對照組 準備未添加所定量淋巴球浮游液與香菇菌絲體萃取物 養液加入洞穴中。再將培養皿以碳酸氣體培養器中於 下靜置3天進行培養。 例如，使用96穴U底微量實驗皿時，各洞穴中 的淋 使用 而將 m£而 中適 。將 佈的 胞， 浮游 〇V 菇菌 與含 ，以 之培 室溫 添加 -17- (14) (14)200422049 淋巴球浮游液100 β L，使得細胞數成1 X 1 04/穴至l x 1 Ο5 /穴爲佳。一穴中的細胞數，斯業者可由穴的容量、 LAK細胞的活性、對目標細胞的LAK細胞感受性等適宜 地決定。 如此下被驗者的淋巴球以種種的濃度（含濃度爲零） 與本發明香菇菌絲體萃取物的存在下培養，作爲效應細胞 。對於本說明書中，所謂效應細胞係指進行3天上述培養 處理的細胞而言，包含與LAK活性增強物質共同培養的 淋巴球（LAK活性增強物質添加處理之淋巴球）以及不 含LAK活性增強物質的培養液，僅以培養液進行培養的 淋巴球（無添加誘導處理的淋巴球）雙方。 培養後的淋巴球（效應細胞）於洞穴中回收，再以添 加新鮮的10% FBS的RPMI 1 640培養基而懸濁（1 X 1 06 / m£ )。 對於測定細胞傷害活性的測定方法，分別注入目標細 胞於各個穴中，實驗解離組添加所定量的含有上述各種效 應細胞（添加LAK活性增強物質或無添加之誘導處理的 淋巴球）1 xlO5/^至1 xlO6/ J浮游液。最大解離組中 添加與效應細胞浮游液同量的1 Ν - HCL，自然解離組則 添加與效應細胞浮游液同量的培養液。再以板面離心分離 機等，將細胞集中於培養皿的洞穴底部後，以5% C02 培養器於37°C下所定時間（例如2至5小時）培養。培 養終了後，測量於各個洞穴中的培養液上淸液中所釋放的 5]Cr放射量。可使用閃煉計數器（sintillation counter ) -18- (15)200422049 等測定。 在此，所謂最大解離係指，全目標細胞被破壞時所釋 放出的51Cr之全量。例如，可由添加in— HCL於培養液 中，而不添加效應細胞，於一定條件下，測定藉培養目標 細胞而溶解、於培養上淸液中所釋出的51 Cr量之測定方 法。

所爲實驗解離係指，對於目標細胞，添加效應細胞時 ，因效應細胞對目標細胞的細胞障礙以及目標細胞的自然 死所釋出的51 Cr量而言，例如，於添加效應細胞的培養 液中，不添加1N — HCL而求得最大解離時的相同條件下 培養目標細胞，測定培養上淸液所釋出的51 Cr量。 所謂自然解離係指，目標細胞因自然死而釋出51 Cr 的量，例如，不添加1 N — HCL以及效應細胞而求得最大 解離時的相同條件下培養目標細胞，測定培養上淸液所釋 出的51 C r量。

LAK細胞的活性程度可由以下式子（1 )算出LAK活 性値作爲指標進行評估。 LAK活性％ =里曼角變(卿)-自然角轉〒所j x 1〇〇式⑴ 最大解離自然解離 本發明於說明書中所引用的，皆爲作爲本申請案的優 先權主張之申請案特願平1 0-3 5 3 92 7號以及特願平 1 0 - 3 5 3 9 2 8號中所揭示者。 實施例 本發明雖由以下的實施例作更詳細的說明，但其僅爲 -19- (16) (16)200422049 示例，非作爲限定本發明的範圍者。其未脫離本發明的精 神，對於本發明的各種變更或修飾爲斯業者可理解者。 實施例1 :調製香菇菌絲體萃取物 蔗渣90重量份，米糠10重量份所成的固體培養基使 其含適當水後，接種香菇種菌，放置於調整溫度以及濕度 的培養室內，使菌絲體增殖。菌絲體於固體培養基下聚集 後，解開蔗渣基材的纖維素束，使其成爲1 2篩孔（每平 方英吋孔眼數）可通過份量爲2 4重量％以下。此解束之 後的培養基1 · 〇 k g中，純水3 · 5 L以及純化的纖維酵素 2. 〇g，以邊保持固體培養基爲40 °C邊加入，成爲含有培養 基的混合物。 其次，含有培養基的混合物以附有變速齒輪的幫浦一 邊將其循環，一邊將固體培養基於齒輪部分進行粉碎以及 揆爛作用200分鐘的程度，使其蔗渣纖維能約以80重量 %作爲1 2篩孔的通過份量，含有培養基的混合物進行粉 碎與揆爛爲，邊徐徐上升該混合物的溫度邊實施。其後， 含有培養基的混合物更加溫至9 0 °C使酵素失去活性同時 進行滅菌，於90 °C下放置30分鐘。所得的含有培養基混 合液以60篩孔濾布過濾作爲香菇菌絲體萃取物，濃縮後 得到凍結乾燥粉末。 如此所得的香菇菌絲體萃取物以苯酚-硫酸法進行糖 値分析得知含有糖値爲2 5 · 3 % (重量/重量）、以洛瑞法 (Lowry法）進行蛋白質分析得知含有蛋白質1 9.7% (重 -20- (17) (17)200422049 量/重量），以沒食子酸爲基準的佛隆-丹尼斯法（ Folon-Denis法）得知含有聚苯酚2.6% (重量/重量）。 香菇菌絲體萃取物中亦含有其他粗脂肪8¾ 、粗灰份22% ，糖質以外的可溶性無氨物約20% 。 其中香菇菌絲體萃取物中所構成的糖組成物如以下所 示：XyL : 15.2 ; ARa : 8.2 ; MaN : 8.4 ; GUL ·· 39.4 ; GaL : 5.4 ; GLCN : 1 2 · 0 ; G L U U a : 1 1 · 3。 實施例2 :香菇菌絲體萃取物與IL - 2的LAK活性之比較 實施例1所得的香菇菌絲體萃取物直接添加於由被驗 者採取的末梢血時的LAK活性增強效果與IL - 2作比較 〇 來自被驗者A中所採血的末梢血中加入肝素、使用 Ficoll-Conary液（S.g· = 1.077 )以比重離心分離法進行 界面單核球的分離，再將分離的單核球以PBS ( PH 7.4， 不含Ca以及Mg)洗淨2次，欲使其成1 xlO6/ m«懸濁於 添加10% FBS (非活性化血淸）的RPMI 1 640培養基（ GIB CO)中。所得的細胞懸浮液移至使用自身血淸（血獎 )於3 7 °C下處理1 5分鐘塗佈後的培養皿中，3 7 °C下培養 1小時後，回收非附著性的細胞作爲淋巴球部分。 所得的淋巴球欲使其細胞濃度成1 X 1 〇6/ W，而浮游 於添加10% FBS (非活性化血淸）的RPMI 164〇培養液（ G i b c 〇 )中。 添加10% FBS (非活性化血淸）的RPMI 1 640培養液 (18) (18)200422049 中，調製IL一 2的最終濃度爲25U/ 、實施例1所得的 香菇菌絲體萃取物的最終濃度爲1、1 〇、I 〇 〇以及1 0 0 0 # g/ W的LAK活性增強物質含有液。 96穴U底微量實驗皿的各個穴中將淋巴浮游液100 //L與IL— 2或含有含各濃度的香菇菌絲體萃取物的LAK 活性增強物質100 " L之合計2 00 # L分別注入。作爲無 添加誘導之對照組，添加不含淋巴球浮游液1 00 μ L與香 菇菌絲體萃取物的培養液（添加1 〇% FB S (非活性化血淸 )的RPMI 1640培養基（Gibco))。再將培養皿於碳酸 器培養器中室溫下進行3天的靜置培養。 培養後的淋巴球（效應細胞）由穴中回收，欲使其細 胞濃度成1 X 1 06/ m£，而再次浮游於新鮮的添加10% FBS 的RPMI 1640培養液中。 培養目標細胞之連續培養細胞（Daudi，由大日本製 藥所獲得）以添加10% FBS的RPMI 1 640培養液中培養 後，以離心分離方式回收，1 06細胞中添加1 00〜1 50 // CI 的 5 iCr - 酪酸鈉（New England Nuclear) ，5% CO2 培養 器中37°C下培養1小時。以51Cr標識的培養細胞以PBS 洗淨3次後，欲成1 x 1 〇6/ 而懸濁於添加10% FBS的 RPMI 1640培養液。 微量實驗皿的最大解離群、自然解離群、實驗解離群 的各個穴中分別注入標識後的目標細胞50 /i L ( 5 X 1 04/ 穴），而且最大解離群爲分別注入100//L的1N — HCL，

自然解離群爲分別注入1 〇〇 μ L的添加1 〇% FBS的RPMI -22- (19) 200422049 1 6 4 0培養液，於是實驗解離群中以1、1 0、1 0 0以及1 0 0 0 // g / m£濃度的本發明之香菇菌絲體萃取物，分別注入 25U/ 濃度的11^—2或以如此不含1^1^活性增強物質的 培養液進行處理的效應細胞1 〇〇 # L。此使用於實驗解離 _ '最大解離群、自然解離群的各個穴不設置於培養皿的 周圍附近位置。 再將微量實驗培養皿以板面離心分離機進行800 RPm ’ 5分鐘離心處理將細胞及終於穴底部後，以5% C02培 養器中3 7 °C下培養3 · 5小時。 培餐後的培養皿中以 SOKEN— ΡΕΤΣ -96採各穴中 白勺培養上淸液，以r -閃煉計數器測定放射活性。依據上 述式（1 )算出L A K活性。 結果如表1與圖1所示。 表1 -ΜΛΜΜ 誘導物質 LAK活性 1 j \ \\ 11% 2 IL-2(最終濃度：25U/m£) 5 5% 3 香菇菌絲體萃取物（最終濃度：1 // g/W ) 14% 4 香菇菌絲體萃取物（最終濃度：1 0 // g/m£ ) 20% 5 香菇菌絲體萃取物（最終濃度MOO// g/W) 14% 且，爲對於香菇菌絲體萃取物的淋巴球的毒性作調查 實施例1所得的香菇菌絲體萃取物的最終濃度作爲1 -23- (20) (20)200422049 mg / m£，如上述相同方法處理淋巴球後以顯微鏡觀察時 ’淋巴球約有100%存在（結果未表示）。 實施例3 :香菇菌絲體萃取物的l A K活性最適濃度 檢討由被驗者所採取的末梢血中直接加入香菇菌絲體 萃取物時的最適濃度。使用採自於被驗者B以及C的末 梢血’貫施例1所得的香蘇菌絲體萃取物的最終灌度爲1 、5、1 〇以及1 0 0 # g / 之外，其他與實施例2的方法相 同算出LAK活性。 結果如表2以及圖2所示。 如表2與圖2顯示，本發明的香菇菌絲體萃取物以最 終濃度爲1 0 // g / 或5 0 // g / j (對1 〇6個淋巴球而言 投與l〇#g或50//g)添加時，得知顯示更高的LAK活 性。對於末梢血的投與量，雖被驗者的末梢血淋巴球的比 率等亦受影響，對一般1 W的末梢血而言約1 〇至2 5 μ g 或相當於添加5 0至1 2 5 // g的香菇菌絲體萃取物。 -24- (21) (21)200422049 表2 實驗番號_誘導物質_LAK活性

被驗者B被驗者C 1 Μ ^ \ \\ 13% 27% 2 香菇菌絲體萃取物(最終濃度:1 // g/m£) 18% 28% 3 香菇菌絲體萃取物(最終濃度:5 // gAn£) 19% 29% 4 香菇菌絲體萃取物(最終濃度:10 /i g/m£) 21% 34% 5 香菇菌絲體萃取物(最終濃度:50 # g/m£) 19% 36% 6 香菇菌絲體萃取物(最終濃度:100 // g/m£) 15% 30% 比較例1 : Crest in的LAK活性 爲與本發明的香菇菌絲體萃取物作比較，對作爲免疫 賦活劑的ere stin的LAK活性增強效果作檢討。使用採血 自被驗者D的末梢血，使用最終濃度1 m g / m£的c r e s t i η (取自於吳羽化學）以外，其他與實施例2的方法相同， 評估c r e s t i η的L A Κ活性增強效果。 且，最終濃度11^/^爲crestin使用於LAK細胞誘 導時，被認爲最具效果的濃度。 結果如表3以及圖3所示。 如表3以及圖3顯示，即使ere stin係最佳濃度的1 mg / W，但與不含LAK活性增強物質的對照組比較其 LAK增強活性較爲低。 · -25- (22) (22)200422049 實驗番號 誘導物質 LAK活性 1 4πτ. 無 14% 2 C r e s t i η (最終濃度：1 m g / ”』） 13% 實施例4 :投與香菇菌絲體萃取物含有製劑的LAK活性 測定 各個被驗者B、C、E以及F ’投與與實施例1相同 方法取得的含有香菇菌絲體萃取物之LAK活性增強用製 劑，進行評估LAK活性的增強效果。 此LAK活性增強用製劑係，製劑3 g含有香菇菌絲體 萃取物0.6 g以及乳糖2 . 4 g者，一次6 g (香菇菌絲體萃 取物爲1 · 2 g )每天3次’以香薛菌絲體萃取物合計爲3.6 /曰’進行1星期的投與。開始服藥前與最終投與的約2 生期後採各個被驗者的末梢血，與實施例2相同的方法測 定LAK活性。 結果如表4以及圖4所示。 如表4以及圖4顯示，本發明的香菇菌絲體萃取物對 被I者B、C、E以及F而言，顯示任一的l a K活性皆顯 著地上昇。 •26- (23) 被驗者 B C E F 香菇菌絲體萃取物服用前 13% 2 7% 14% 18% 香菇菌絲體萃取物服用後 40% 43% 18% 2 8% 200422049 又，爲檢查服用香菇菌絲體萃取物的副作用時，實施 對於被驗者B、C以及E的血液生化學檢查。其結果如表 5所示。且，服用香菇菌絲體萃取物期間，被驗者B、C 、E以及F無產生全身倦怠、惡寒、發燒、消化器官疾病 等症狀之副作用。 由表5以及圖5顯示，服用本發明的香菇菌絲體萃取 物並無顯示副作用的產生。

-27- (24)200422049 表5 被 驗者B 被驗者c 被者E 服用前 服用1週後 服用前 服用】週後 服用前 服用1週後 WBQxlO^l/) 5.45 5.94 5.85 5.08 8.0】 ΊΑΊ RBC(xlO】//l/) 4.56 4.61 4.99 4.85 4.89 4.65 Hb(g/dl) 14.2 14.2 14.4 13.8 15.5 14.8 Ht(%) 42.2 42.8 43.6 42.1 44.8 42.9 MCV(il) 92.5 92.8 87.4 86.8 91.6 92.3 MCH(pg) 31.1 30.8 28.9 28.5 31.7 31.8 MCHC(g/dl) 33.6 33.2 33.0 32.8 34.6 34.5 PLT(x(103//iL) 19.1 18.5 23.9 19.3 29.2 29.7 RDW-SD(fl) 43.7 44.6 43.5 43.6 43.7 44.8 RDW-CV(%) 12.8 13.0 13.4 13.6 13.0 13.3 PDW(il) 14.0 13.4 11.6 12.6 13.3 13.2 MPV(fl) 11.1 10.9 10.0 10.2 10.6 10.4 P-LCR(%) 34.1 32.5 24.9 27.6 30.1 28.8 Stab 0.5 0.5 1.0 0.0 0.5 0.0 Seg 54.0 48.5 56.0 43.5 46.5 38.5 Lvm 37.5 40.5 38.0 45.5 28.5 35.0 Mono 4.5 7.5 3.0 9.5 11.5 8.5 Eo 2.5 3.0 1.5 1.0 12.0 15.5 Baso 1.0 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 TP(g/dl) 6.6 6.9 7.7 7.5 8.0 7.7 ALB(g/dl) 3.9 4.1 4.4 4.3 4.8 4.7 A/G 1.44 1.46 1.33 1.34 1.50 1.57 TTT(SHU) 3.9 5.0 8.0 8.1 5.3 3.0 ZTT(Kunk) 8.6 8.4 12.6 12.4 6.3 4.9 U-N(mg/dl) 10.4 10.3 10.2 11.2 11.8 11.6 U-A(mg/dl) 5.6 5.9 5.4 5.2 6.1 5.9 肌酸內醯胺(mg/dl) 0.67 0.71 0.84 0.82 0.67 0.72 總 BIL(mg/dl) 0.6 0.7 0.5 0.6 0.5 0.5 直接 BlL(mg/dl) 0.1 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 間接 BIL(mg/dl) 0.5 0.6 0.5 0.6 0.4 0.4 CUL(mg/dl) 124 104 94 111 115 114 AST(GOT)(IU/l) 15 13 18 16 33 33 ALT(GPT)(IU/1) 29 30 20 20 45 57 LD(LDH)(IU/1) 142 139 171 152 380 343 CK(CPK)(IU/1) 121 131 227 177 317 224 ALP(IU/1) 13】 136 156 148 174 162 r -GT(IU/1) 12 14 23 23 225 240 LAP(IU/1) 45 40 80 73 134 120 CHE(IU/1) 2358 2593 2779 2749 3191 3299 AMY(IU/1) 78 87 107 93 59 54 丁-CHO(mg/dl) 208 232 206 200 255 243 HDLCHO(mg/dl) 50 50 44 40 47 47 T-G(mg/dl) 135 210 270 303 451 359 Na((mEq/dl) 141 142 140 141 139 141 K((mEq/dl) 3.7 3.9 4.1 3.8 4.0 4.2 Cl((mEq/dl) 106 107 105 107 103 104 Ca((mEq/dl) 4.4 4.4 4.6 4.4 4.9 4.7 l-P((mg/dl) 3.3 3.1 3.0 2.7 3.5 3.2 H 0 0 0 0 1 0 L 0 0 0 1 1 0 I 0 ] 1 1 1 1 RA測試 (·) (-) ㈠ (-) ㈠ ㈠ CPR(mg/m£) 0.03 0.06 0.02 0.01 0.07 0.12 ANA <40 <40 <40 <40 <40 <40 ANA測試 (-) (-) (，） (-) ㈠ (·) CH50(CH50/m£) 33.0 33.0 45.0 42.0 53.0 52.0 -28- (25) (25)200422049 產業上的利用性 含有本發明的香菇菌絲體萃取物的LAK增強物質， 於末梢血中直接添加時顯不與I L - 2相同的效果，且，對 於淋巴球亦無直接毒性。又，與IL - 2比較其可以相當便 宜的價格取得。因此’與副作用強且高價的IL - 2相比較 ，其可利用於LAK治療法中。 又’本發明的香菇菌絲體萃取物含有製劑，即使直接 投與時其LAK活性亦可顯著上昇，且無副作用。因此含 有本發明的香菇菌絲體萃取物製劑不僅可實施LAK療法 ，且直接投與，例如經口投與幾乎無副作用產生且可使 LAK活性上昇，可作爲免疫活性化劑使用。 【圖式簡單說明】 圖1爲表示於末梢血中直接添加香菇菌絲體萃取物時 的LAK活性增強效果，與IL 一 2作比較而以柱狀圖形表 示0 圖2爲表示於末梢血中直接添加香菇菌絲體萃取物時 ，隨著香菇菌絲體萃取物的濃度變化之LAK活性變化而 以柱狀圖形表示。 圖3爲表示於末梢血中直接添加crestin時LAK活性 而以柱狀圖形表示。 圖4爲表示香菇菌絲體萃取物於經口投與前與後的末 梢淋巴球之LAK活性而以柱狀圖形表示。

Claims (1)

1. (1) (1)200422049 九、申請專利範圍 1 · 一種使用於增強淋巴激活素活性化細胞（L a K ) 活性的醫藥組成物’其特徵爲含有經由含香薛菌絲體及以 含庶澄做爲基材之固體培養基爲原料的以下步驟： 解束a有庶瘡爲基材的固體培養基； 經解束的固體培養基中添加水及一種或一種以上選自 於纖維酶、蛋白酶、或葡萄糖酶之酵素； 該酵素存在下粉碎、搗爛該固體培養基； 使該酵素失去活性； 再過濾所得之懸浮狀液體； 所得之香薛菌絲體萃取物的食品、飮料或飼料者。

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