CN117731687A - 枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117731687A CN117731687A CN202410118087.6A CN202410118087A CN117731687A CN 117731687 A CN117731687 A CN 117731687A CN 202410118087 A CN202410118087 A CN 202410118087A CN 117731687 A CN117731687 A CN 117731687A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wolfberry
- polysaccharide
- cells
- bmdm
- lbp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000241838 Lycium barbarum Species 0.000 title claims abstract description 57
- 235000015459 Lycium barbarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 56
- 235000015468 Lycium chinense Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 51
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 51
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title claims abstract description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims abstract description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 title claims abstract 3
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 title description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002336 repolarization Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 85
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 20
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 abstract description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000008518 lycium barbarum polysaccharide Substances 0.000 description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 9
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 101100167135 Mus musculus Chil3 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150081923 IL4 gene Proteins 0.000 description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 101150100944 Nos2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- -1 Tnfα Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000722 protumoral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用。本发明采用特定的工艺步骤制备得到特定分子量50～100kD的枸杞多糖，该特定分子量的枸杞多糖可促进巨噬细胞LBP复极化，促进上调M1型巨噬细胞并下调M2型巨噬细胞，并且具有增加NO分泌，降低与BMDM细胞共孵育的肿瘤细胞存活率。本发明提供的枸杞功能多糖可作为促进巨噬细胞复极化的调节剂和抗肿瘤免疫增强剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药，具体涉及枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤制剂中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞，具有吞噬、加工提成抗原和激活免疫应答等功能。基于其较高的可塑性，巨噬细胞在不同刺激物的作用下可极化为两种不同的表型。一种是M1型，即经典活化的巨噬细胞，这类巨噬细胞表现出较强的抗原提呈能力并促进炎症反应，在肿瘤调节中表现为抑制肿瘤的转移和生长；另一种为M2型，即替代活化的巨噬细胞，能够抑制炎症发展，发挥基质重塑、组织修复以及血管再生等功能，在肿瘤调节中表现出促肿瘤活性的特点。因此，巨噬细胞的表型与免疫调节和肿瘤发展息息相关。
枸杞子是宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，性平、味甘，入肝、肾经，具有滋肾润肺、补肝明目的功效。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)被认为是枸杞子的主要活性成分，具有多种药理作用，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和降血糖血脂等。其中，LBP的免疫调节作用主要表现在能够调节多种免疫细胞的功能。
关于不同分子量的枸杞多糖对巨噬细胞表型的影响及其抗肿瘤效应尚未有报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的是通过研究不同分子量的LBP对巨噬细胞表型的影响及其抗肿瘤效应，筛选得到疗效最佳的枸杞多糖部位，为临床合理使用枸杞多糖和肿瘤的免疫治疗提供理论依据。
本发明将分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，利用不同分子量枸杞多糖LBP(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)处理细胞，并通过流式细胞术、qPCR等方法考察不同给药组对BMDM细胞的重塑效应。将重塑后的BMDM细胞与肿瘤细胞以不同比例共培养，通过荧光素酶实验考查BMDM复极化产生的抗肿瘤效应，实验结果表明，枸杞多促进巨噬细胞LBP复极化，促进上调M1型BMDM并下调M2型BMDM，并且具有增加NO分泌，降低与BMDM细胞共孵育的肿瘤细胞存活率。证明枸杞多糖能促使M2型巨噬细胞复极化为M1型，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，因此本发明提供的枸杞功能多糖可作为促进巨噬细胞复极化的调节剂和抗肿瘤免疫增强剂。
作为优选方案，本发明所述的枸杞功能多糖是采用以下方法制备得到的：称取10kg干燥枸杞子，按固液比10:1加入80％乙醇，加热回流提取2次，每次提取1h，得到醇提取液和醇提药渣。向醇提药渣中加入15倍体积的去离子水，加热回流提取2次，每次1h，过滤浓缩后得到枸杞粗多糖。用去离子水溶解后，将枸杞粗多糖溶液经循环泵输入到超滤设备中，经100kD纤维素膜超滤。将截流液循环超滤，收集的截流液即为分子＞100kD的枸杞多糖样品液。超滤膜透过液即为分子量＜100kD的枸杞粗多糖。同理，依次用50kD和3kD的超滤膜组件分离枸杞粗多糖，可得到50-100kD、3-50kD和＜3kD的枸杞多糖样品液。蒸发浓缩4个分子量段的枸杞多糖，冷冻干燥后备用。
本发明可将枸杞多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂剂型的药物。
本发明在制成片剂时，在枸杞多糖中添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
在制成胶囊剂时，将枸杞多糖和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时，把枸杞多糖和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果：本发明提供的枸杞多糖和现有技术相比具有以下优点：
本发明筛选不同分子量的枸杞多糖(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)对巨噬细胞复极化和抗肿瘤效应，筛选结果表明，特定分子量50～100kD的枸杞多糖可将M2型巨噬细胞重塑为M1型巨噬细胞，并且能增加BMDM细胞NO释放水平，可将特定分子量50～100kD的枸杞多糖应用于巨噬细胞重塑的领域，本发明将最优的50～100kD分子量枸杞多糖作为巨噬细胞复极化的免疫调节剂和抗肿瘤免疫增强剂。
附图说明
图1为流式细胞术圈门过程。
图2为LBP对BMDM细胞免疫表型的重塑效应。图中(A)流式细胞术分析M1、M2型BMDM在F4/80+CD11b+细胞群中占比的代表性图片；(B)M1、M2型BMDM在F4/80+CD11b+细胞群中占比的统计结果；(C)M1、M2型BMDM在F4/80+CD11b+细胞群中占比的比值；(D)CD86与CD206 MFI的统计结果。
图3为LBP对BMDM细胞基因表达水平的影响。(A)qPCR检测BMDM细胞M1型标志物(Il1β、Nos2、Tnfα)基因表达水平的统计结果；(B)qPCR检测BMDM细胞M2型标志物(Arg1、Chil3、Il4)基因表达水平的统计结果。
图4为LBP对BMDM细胞NO释放水平的影响，图中(A)NO的标准曲线及计数公式；(B)BMDM细胞上清中NO浓度的统计结果。
图5为BMDM复极化对肿瘤细胞的直接杀伤效应图，图中(A)酶标仪检测直接共培养4T1-Luc与BMDM细胞后各组荧光强度的统计结果；(B)BMDM对4T1-Luc细胞直接抑制率的统计结果；(C)酶标仪检测直接共培养B16-Luc与BMDM细胞后各组荧光强度的统计结果；(D)BMDM对B16-Luc细胞直接抑制率的统计结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1枸杞功能多糖的制备
称取10kg干燥枸杞子，按固液比10:1加入80％乙醇，加热回流提取2次，每次提取1h，得到醇提取液和醇提药渣。向醇提药渣中加入15倍体积的去离子水，加热回流提取2次，每次1h，合并水提液，在水提液中加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，室温静置过夜，4500rpm离心5min收集沉淀，用无水乙醇洗涤，冷冻干燥，得到枸杞粗多糖，将枸杞粗多糖用去离子水溶解后，将枸杞粗多糖溶液经循环泵输入到超滤设备中，经100kD纤维素膜超滤。将截流液循环超滤，收集的截流液即为分子＞100kD的枸杞多糖样品液。超滤膜透过液即为分子量＜100kD的枸杞粗多糖。同理，依次用50kD和3kD的超滤膜组件分离枸杞粗多糖，可得到50-100kD、3-50kD和＜3kD的枸杞多糖样品液。蒸发浓缩4个分子量段的枸杞多糖，冷冻干燥后备用。
实施例2活性实验
1.1试剂见表1。
表1试剂
1.2仪器设备见表2。
表2仪器设备
| 仪器设备名称 | 厂家 |
| 超净工作台 | 美国Thermo公司 |
| 细胞恒温培养箱 | 美国ThermoFisherScientific公司 |
| 高速冷冻离心机 | 北京大龙兴创实验仪器有限公司 |
| PCR仪器 | 美国ThermoFisherScientific公司 |
| 酶标仪 | 美国PerkinElmer公司 |
| 显微镜 | 德国Zeiss公司 |
| 超微量紫外分光光度计 | 美国Denovix公司 |
1.3动物与细胞
C57BL/6雄性小鼠，5-6周龄，购自南京青龙山动物场。各组分笼饲养，普通饲料喂养，自由饮食，自由饮水，正常光照，温度控制在20～25℃，按照《实验动物管理条例》进行所有的操作和研究流程。
4T1-Luc、B16-Luc细胞来源于ATCC细胞库，均使用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基(含1％双抗)，置于细胞恒温培养箱(37℃，5％CO2)中培养，1～2天传代一次。
1.4引物
qPCR相关引物由擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表3。
表3引物序列
2.实验方法
2.1BMDM细胞的提取和诱导
将C57BL/6小鼠(5-6周龄，雄性)断颈处死，置于酒精中浸泡3-5min后剪开小鼠腹腔，将股骨从周围的肌肉和纤维组织分离出来。股骨经酒精浸泡消毒后，PBS(pH 7.4)洗涤3次，将两端软骨剪去，使用1mL注射器吸取适量的RPMI 1640培养基冲出股骨中的骨髓细胞，重复冲洗至骨头呈白色。使用柱塞研磨骨髓，使其通过70μm(200目)细胞筛网，将收集得到的滤液400g离心4min，弃上清。加入红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置4min。加PBS终止反应，400g离心4min，弃上清。将分离得到的骨髓细胞保存在RPMI 1640培养基(含10％FBS和1％双抗)中。加入完全培养基(含终浓度为20ng/mL的细胞因子GM-CSF)促进细胞分化，接种于培养皿中，即为第0天。之后每2天半量换液一次。培养至第6天，换液完全培养基(含细胞因子GM-CSF、IL-4和IL-13，终浓度均为20ng/mL)继续培养2天，得到M2型BMDM细胞。
2.2流式细胞术检测LBP对BMDM细胞免疫表型的重塑效应
枸杞多糖溶液的制备方法：称取实施例1制备得到的不同分子量(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)的枸杞多糖粉末各125mg，溶解于50mLRPMI 1640培养基中，配制为2.5mg/mL的枸杞多糖溶液。给药前用RPMI 1640培养基稀释至实验所需的给药浓度，利用0.22μm滤膜过滤除菌。
LPS溶液的制备方法：将1mg LPS粉末溶解于1mL无菌水中，配制得到1mg/mL的LPS溶液。给药前用RPMI 1640培养基稀释至实验所需的给药浓度，利用0.22μm滤膜过滤除菌。
将诱导得到的BMDM接种于6孔板中，分为M0组，对照组，LPS组和四个分子量(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)的LBP组，其中M0组不加IL-4和IL-13诱导。给药0.5μg/mL LPS或250μg/mL LBP，处理2天，收集细胞上清液，用于后续NO检测。
向培养皿中加入PBS(pH 7.4)，每孔1mL。将BMDM细胞刮下并收集至Ep管中，400g离心5min洗去培养基，弃上清，重复一次。加100μL细胞悬浮缓冲液(CSB)重悬细胞。加入CD86抗体0.1μg，CD11b抗体0.25μg，F4/80抗体0.1μg，在冰上避光染色20min。每管加入1mL PBS，400g离心5min，将多余抗体洗去，重复1次。弃上清，加500μL固定液并立刻吹打以重悬细胞，室温下避光孵育20min。400g离心5min，弃上清。加入1mL 1×透化液(用DEPC水稀释10×透化液得到)重悬，离心，重复1次。用100μL CSB重悬细胞，每管加入CD206抗体2μL，置于冰上避光染色30min，加2mL 2×透化液重悬，离心，弃上清。加300μL CSB重悬，经200目筛网过滤，使用流式细胞仪进行检测。具体方法为：先通过FSC-A通道和SSC-A通道圈选活细胞，再通过FSC-A通道和FSC-H通道圈选单细胞，然后通过F4/80和CD11b标志物圈选BMDM细胞，最后通过分析F4/80+CD11b+细胞群中CD86和CD206两种标志物的表达水平，并使用Flowjo软件分析结果。
2.3qPCR检测LBP对BMDM细胞基因表达水平的影响
(1)总RNA提取：
将诱导得到的BMDM接种于6孔板中，分组给药0.5μg/mL LPS或250μg/mL LBP，处理2天。将细胞收集至Ep管中，1000rpm离心5min，弃上清。每管加入1mLTrizol试剂并猛烈吹打15s，使其充分混匀，室温下静置2-3min后，4℃旋转1-2h。加入200μL氯仿，涡旋15s左右，至液体没有明显分层，12000g离心15min。从上清液中吸取500μL加至无核酶Ep管中，加入500μL异丙醇，涡旋使其充分混匀后置于冰上，孵育5-10min，12000g离心10min。弃上清，加入DEPC水配制的75％乙醇(提前4℃预冷)1mL，轻弹混匀，7500g离心5min。弃上清，在通风橱里挥干剩余乙醇，加入25μL DEPC水，轻弹混匀，置于冰上。用超微量紫外分光光度计测定浓度后，放在-80℃冰箱储存备用。
(2)cDNA合成：
按照试剂盒说明书合成cDNA，合成体系见表4。逆转录程序如下：将体系于42℃孵育15min，95℃灭活3s。产物置于-20℃冰箱中以储存备用。
表4cDNA合成体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| RNA | 5 |
| RandomPrimer | 0.5 |
| AnchoredOligo(dT)18Primer | 0.5 |
| E-Mix | 1 |
| R-Mix | 1 |
| gDNARemover(2×) | 10 |
| RNase-freeWater | 2 |
(3)PCR扩增：
PCR扩增体系见表5。将反应体系充分混匀，加至96孔PCR板，离心，PCR机测定。PCR反应条件见表6。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。测得样本CT值后，使用2-ΔΔCT法计算样本中Il1β、Nos2、Tnfα、Arg1、Chil3、Il4的相对表达量。
表5PCR扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| cDNA | 1 |
| SYBRGreen(2×) | 25 |
| Forwardprimer | 1 |
| Reverseprimer | 1 |
| RNase-freeWater | 22 |
表6PCR反应条件
2.4Griess法检测LBP对BMDM细胞NO释放水平的影响
取2.2项中收集的BMDM细胞上清液，恢复至室温，用含10％FBS的RPMI 1640培养基稀释标准品至0.19,0.39,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50μM。在96孔板中加入标准品及样品，50μL/孔。在各孔中加入室温Griess ReagantⅠ和Griess ReagantⅡ，均为50μL/孔。酶标仪测定540nm波长下的OD值。根据标准品拟合标准曲线，换算出实际的NO浓度值。
2.5直接共培养法考察BMDM复极化的抗肿瘤效应
将BMDM细胞与4T1-Luc或B16-Luc肿瘤细胞以四种不同的比例直接共培养于96孔板培养皿中，其中，肿瘤细胞1000个/孔，BMDM细胞分为0个/孔，1×104个/孔，2×104个/孔和4×104个/孔。每个细胞比例设置对照组，LPS组和四个分子量的LBP组(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)。给药0.5μg/mL LPS或250μg/mL LBP处理2天。弃去培养基，加入PBS润洗，再将PBS尽量吸除，加入适量细胞裂解液覆盖培养皿以充分裂解细胞。将荧光素酶试剂加至全白96孔板中，每板设置1个空白孔，每个样品设置3个副孔，50μL/孔。将裂解的细胞加入荧光素酶中，20μL/孔，加完后尽快放入荧光酶标仪中检测，根据肿瘤细胞的荧光强度观察4T1-Luc、B16-Luc细胞的存活数量。
2.6Transwell法考察BMDM复极化的抗肿瘤效应
将BMDM与4T1-Luc或B16-Luc肿瘤细胞以四种不同的比例共孵育于24孔Transwell培养皿中，BMDM种在上层小室，肿瘤细胞种在下层培养皿。其中，肿瘤细胞4000个/孔，BMDM细胞分为0个/孔，4×104个/孔，8×104个/孔和1.6×105个/孔。每个细胞比例设置对照组，LPS组和四个分子量的LBP组(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)。给药0.5μg/mL LPS或250μg/mL LBP处理2天。后续操作同2.5项下步骤。
2.7统计学分析
使用GraphPad Prism 9.4.0软件进行数据分析和绘图，所有结果均以平均值±标准偏差(SD)表示，组间数据采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，P<0.05时表明差异具有统计学意义。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。
3.实验结果
3.1LBP对BMDM细胞免疫表型的重塑效应
本发明考察不同分子量的LBP对M2型BMDM细胞重塑效应的影响。通过流式细胞术分析了不同处理组中M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206的表达水平。
流式细胞术的圈门过程见图1。50～100kD LBP组为例，先圈出活细胞，再圈出单细胞，最后圈出单细胞中F4/80+CD11b+的细胞群即巨噬细胞，其占比为(95.22±1.34)％，表明BMDM诱导成功，对该细胞群进行分析。
流式实验结果见图2，图2(A)中的横纵坐标分别代表M1型标志物CD86和M2型标志物CD206分子的荧光强度，图2(B)纵坐标分别表示M1和M2型巨噬细胞在F4/80+CD11b+细胞群中所占比例，图2(C)纵坐标表示M1与M2型巨噬细胞在F4/80+CD11b+细胞群中占比的比值，图2(D)纵坐标分别为CD86和CD206的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。M0组为没有加IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞，对照组与M0组比较，CD206 MFI上升，表明巨噬细胞经IL-4和IL-13诱导向M2型极化(图2D)。
与对照组相比，LPS组和不同分子量LBP组的M1型巨噬细胞(CD86+CD206-)比例和CD86 MFI均明显上升，与此同时，M2型巨噬细胞(CD86-CD206+)比例显著降低，除分子量小于3kD的LBP组外，CD206 MFI均显著下降(图4B、D)。这说明经LPS或LBP给药处理后，BMDM中M1型表面标志物CD86表达增加，M2型表面标记物CD206表达下降。与对照组M1、M2型细胞比例(8.57±0.37)％和(46.50±0.72)％相比，LPS组复极化效应最明显，M1、M2型巨噬细胞比例为(34.73±1.50)％和(9.59±0.84)％，而在不同分子量的LBP组中，50～100kD LBP组的复极化效应最显著，M1型巨噬细胞比例可达(23.70±0.70)％，M2型细胞比例降至(20.97±0.76)％(图2B、D)。
统计M1/M2值发现，LPS组和LBP组的M1/M2值都明显高于对照组(图2C)，表明LPS和LBP总体上有促进巨噬细胞向M1型极化的趋势。
3.2LBP对BMDM细胞基因表达水平的影响
本发明考察不同分子量的LBP对M2型BMDM细胞基因表达水平的影响。通过qPCR分析不同组别中M1型巨噬细胞标志物(Il1β、Nos2、Tnfα)和M2型巨噬细胞标志物(Arg1、Chil3、Il4)的基因表达水平。
qPCR检测结果见图3，纵坐标为mRNA的相对表达量。与对照组相比，大多数LPS组和LBP组中Il1β、Nos2、Tnfα的mRNA相对表达量上升(图3A)，而Arg1、Chil3、Il4的mRNA相对表达量下降(图3B)，且分子量大于50的LBP效应较其他分子量更显著，说明LPS和LBP促进了M1型巨噬细胞标志物的基因表达，降低了M2型标志物的基因表达水平。
另外，分子量小于50kD的LBP组几乎没有上调M1型标志物的基因表达水平(图3A)，而分子量小于3kD的LBP组M2型标志物Arg1、Chil3的基因表达水平与对照组相比没有差异，其中分子量大于100kD的LBP上调了M2型标志物Il4的表达水平(图3B)。因此，总的来看，分子量50～100kD的LBP重塑巨噬细胞表型的效应优于其他分子量。
3.3LBP对BMDM细胞NO释放水平的影响
本发明考察不同分子量的LBP对M2型BMDM细胞释放NO水平的影响。通过NO检测试剂盒测定不同处理组BMDM细胞上清液中的NO浓度。
NO试剂盒检测结果见图4，图4(A)横纵坐标分别表示标准品NO浓度与540nm下的OD值，图4(B)纵坐标为样品NO浓度。与对照组相比，LPS组和50～100kD LBP组的BMDM细胞上清含有更高浓度的NO。LPS组效应最明显，NO浓度可达(2.72±0.12)μM，分子量为50～100kD的LBP效应略优于其他分子量，NO浓度为(1.61±0.19)μM，均在标准曲线的线性范围内。
3.4BMDM复极化对肿瘤细胞的直接杀伤效应
本发明在考察不同分子量的LBP重塑M2型BMDM细胞后对肿瘤的直接杀伤作用，将BMDM和肿瘤细胞直接共培养并给药，加入荧光素酶后使用酶标仪检测不同处理组肿瘤细胞的荧光强度，进而分析肿瘤细胞存活率。
荧光酶标仪检测结果见图5，图5(A、C)纵坐标为肿瘤细胞的相对荧光强度，图5(B、D)纵坐标为肿瘤细胞抑制率。对于4T1-Luc细胞而言，在没有BMDM存在的情况下，LPS组与对照组的差异无统计学意义，分子量大于3kD的LBP组荧光强度明显降低，表明单独的LPS对4T1-Luc细胞没有显著作用，而LBP自身对4T1-Luc细胞有一定的杀伤抑制作用(图5A)。BMDM与4T1-Luc细胞直接共孵育时，与对照组相比，LPS组和LBP组的荧光强度均显著降低(图5A)，表明LPS和不同分子量的LBP能加强BMDM对4T1-Luc细胞的直接杀伤作用，该作用比LPS或LBP单独作用更明显。
不同分子量的LBP(＜3kD，3～50kD，50～100kD，＞100kD)对4T1-Luc细胞抑制率最高依次为(57.05±1.48)％，(78.84±3.01)％，(98.68±0.11)％和(94.16±0.18)％，可见分子量50～100kD的LBP效应优于其他分子量(图5B)。此外，对比实验采用的3个细胞比例发现，当BMDM:4T1-Luc＝10:1时，整体的肿瘤细胞抑制率较高(图5B)，说明BMDM与肿瘤细胞的共培养比例也许会影响肿瘤细胞的存活率。
对于单独的B16-Luc细胞而言，分子量小于100kD的LBP组的荧光强度与对照组相比没有差异，LPS组和＞100kD LBP组的荧光强度反而增加(图5C)。将BMDM与B16-Luc细胞共培养时，LPS组和LBP组的荧光强度有不同程度的下降(图5C)，可见LPS和LBP能加强BMDM对B16-Luc细胞的杀伤作用。
不同分子量LBP比较发现，50～100kD LBP组对B16-Luc细胞的抑制作用更显著，抑制率最高为(46.80±6.02)％。当BMDM:B16-Luc＝20:1时，整体的肿瘤细胞抑制率高于另外两个细胞比例组(图5D)。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.枸杞功能多糖在制备免疫调节剂中的应用。
2.枸杞功能多糖在制备促进巨噬细胞复极化的调节剂中的应用。
3.枸杞功能多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的枸杞功能多糖是采用以下方法制备得到的：称取10kg干燥枸杞子，按固液比10:1加入80％乙醇，加热回流提取2次，每次提取1h，得到醇提取液和醇提药渣。向醇提药渣中加入15倍体积的去离子水，加热回流提取2次，每次1h，合并水提液，在水提液中加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，室温静置过夜，4500rpm离心5min收集沉淀，用无水乙醇洗涤，冷冻干燥，得到枸杞粗多糖。将枸杞粗多糖用去离子水溶解后，将枸杞粗多糖溶液经循环泵输入到超滤设备中，经100kD纤维素膜超滤。将截流液循环超滤，收集的截流液即为分子＞100kD的枸杞多糖样品液。超滤膜透过液即为分子量＜100kD的枸杞粗多糖。同理，依次用50kD和3kD的超滤膜组件分离枸杞粗多糖，可得到50-100kD、3-50kD和＜3kD的枸杞多糖样品液。蒸发浓缩4个分子量段的枸杞多糖，冷冻干燥后备用。
5.根据权利要求1～3任一项所述的应用，将枸杞功能多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、合剂、口服液、膏剂的药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410118087.6A CN117731687A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410118087.6A CN117731687A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117731687A true CN117731687A (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=90279639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410118087.6A Pending CN117731687A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117731687A (zh) |
-
2024
- 2024-01-29 CN CN202410118087.6A patent/CN117731687A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wei et al. | Effects of Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide on immune response of rabbit haemorrhagic disease tissue inactivated vaccine and on production performance of Rex rabbits | |
| Gajic et al. | Chokeberry (Aronia melanocarpa) fruit extract modulates immune response in vivo and in vitro | |
| CN106148282B (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养方法 | |
| Chi et al. | Immunomodulatory effects of a bioactive compound isolated from Dryopteris crassirhizoma on the grass carp Ctenopharyngodon idella | |
| Liu et al. | Immunomodulatory and antioxidant activities of a polysaccharide from Ligustrum vicaryi L. fruit | |
| US20250000923A1 (en) | Use of extracellular vesicles of rhizoma drynariae in preparation of medicine for treating orthopedic diseases | |
| Husni et al. | The effect of ethanol extract of moringa leaf (moringa oleifera lam) against the activity and capacity of phagocytosis of macrofag cells and the percentage of leukosit cells of white mice | |
| CN104762364A (zh) | 黄芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮细胞凋亡中的应用方法 | |
| Wang et al. | Cytotoxic activities of fractions of the willow bracket medicinal mushroom, Phellinus igniarius (Agaricomycetes), and the induction of cell cycle arrest and apoptosis in MGC-803 cells | |
| US20100003270A1 (en) | Whole blood cultures comprising stimulated immune cells, and use thereof as medicaments | |
| Zhong et al. | rhCNB Improves Cyclophosphamide‐Induced Immunodeficiency in BALB/c Mice | |
| CN113577086B (zh) | 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗免疫失调的药物中的应用 | |
| CN117731687A (zh) | 枸杞功能多糖在制备免疫调节剂和抗肿瘤药物中的应用 | |
| KR20120069221A (ko) | 봉독조성물 | |
| Nurhayati et al. | Total and Differential Cells of Leukocyte Mice (Mus musculus) on Evaluation in Vivo Anticancer Extracts Ethanol Marine Sponges Aaptos suberitoides | |
| CN104940245A (zh) | 一种大白栓菌水提物在制药中的应用 | |
| CN114983997B (zh) | 一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物 | |
| Li et al. | Effect of procyanidins from Pinus koraiensis bark on growth inhibition and expression of PCNA and TNF-[alpha][alpha] in mice with U14 cervical cancer | |
| WO2023134194A1 (zh) | 脆弱拟杆菌荚膜多糖a联合pd-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用 | |
| CN105726583A (zh) | 人工栽培桑黄提取物抗炎活性成分制备方法 | |
| Krishnamoorthy et al. | In vitro studies to determine the effect of boeravinone B on human dendritic cells | |
| CN116473235A (zh) | 芦荟凝胶粉及其与水苏糖的组合物的应用 | |
| CN100544736C (zh) | 一种增强免疫力的药物组合物及制备方法 | |
| WO2007137602A1 (en) | Method of producing a liquid oral or otherwise applicable composition for administration to human beings and animals, liquid oral or otherwise applicable composition and its use of the composition for the manufacture of a product for functional nutrition | |
| CN115554340B (zh) | 一种协同化疗药物治疗肝癌的牡丹籽粕提取物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |